Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность ингибиторов экзогенных протеиназ в клубнях и листьях картофеля в связи с устойчивостью к колорадскому жуку

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Активность ингибиторов экзогенных протеиназ в клубнях и листьях картофеля в связи с устойчивостью к колорадскому жуку"

На правах рукописи

Хабибуллин Салават Ильнурович

АКТИВНОСТЬ ИНГИБИТОРОВ ЭКЗОГЕННЫХ ПРОТЕИНАЗ В КЛУБНЯХ И ЛИСТЬЯХ КАРТОФЕЛЯ В СВЯЗИ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К КОЛОРАДСКОМУ ЖУКУ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА - 2003

Работа выполнена в Башкирском государственном университете.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Ибрагимов Ринат Исмагилович;

доктор биологических наук,

профессор Ахметов Радик Рахимьянович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кудоярова Гузель Радомесовна; кандидат биологических наук, доцент Исаев Рустем Фидаевич

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И.Вавилова РАСХН (г.Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится " Сг/^ги^^АЯ 2003 г. в " часов на заседании диссертационного Совета К 212.(Й3.04 при Башкирском государственном университете (450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета

Автореферат разослан "¿3 " л/ьус+тиь 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук, профессор I. Кузяхметов Г.Г.

Zoo?-J,

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Белки-ингибиторы протеолитических ферментов обнаружены в тканях животных, растений и в микроорганизмах (Мосолов, 1971; 1983; Ryan, 1973; 1981; Laskowski, Kato, 1980; Richardson, 1977; Валуева, Мосолов, 1999, 2002). Содержание ингибиторов в семенах культурных растений достигает до 5-10 % растворимых белков (Micola, Kirsi, 1972). Общим свойством этих молекул является способность образовывать с протеолитическими ферментами устойчивые комплексы, что приводит к обратимому подавлению их активности.

Широкое распространение ингибиторов и их содержание в значительных количествах в тканях растений позволяют предположить, что они являются одним из важнейших компонентов регуляции различных физиологических процессов.

Способность растительных белков подавлять активность протеиназ млекопитающих, насекомых и микроорганизмов легли в основу представлений об их защитных функциях. Так, в семенах сельскохозяйственных культур были обнаружены специфические ингибиторы протеолитических ферментов пищеварительного тракта насекомых. Оказалось, что эти ингибиторы были неактивны по отношению ни к трипсину и ни к химотрипсину (Конарев, Вилкова, 1984; Конарев, 1984, 1987, 1991, 2000). В растительных тканях обнаружены ингибиторы, подавляющие активность протеиназ патогенных микроорганизмов (Кладницкая и др., 1994; Конарев, 2000, Валуева, Мосолов, 2002).

Большое количество ингибиторов содержится в тканях картофеля. Особенно высоким содержанием белков-ингибиторов характеризуются клубни картофеля, где на их долю приходится до 15-20% всех водорастворимых белков (Ryan С. A. et al.,1976). Среди белков-ингибиторов, присутствующих в клубнях картофеля, обнаружены ингибиторы протеолитических фермеЕггов различных классов - сериновых, цистеиновых и аспартильных протеиназ, а также металлсодержащих карбоксипептидаз (Garsia-Olmedo F. et al.,1987).

Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata является особо опасным вредителем картофеля. Установлено, что личинки колорадского жука за 2 недели могут уничтожить до 45 % листовой поверхности растений (Теняев, 2000). Изучение физиолого-биохимических и молекулярных механизмов взаимодействия этих насекомых с растениями является актуальной задачей. В этом плане весьма перспективным представляется исследование функционирования системы «протеиназы насекомых - белковые ингибиторы растений».

Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в оценке значения ингибиторов экзогенных протеиназ в формировании

устойчивости картофеля к колорадскому жуку. Нами были поставлены следующие задачи:

- разработка новых методов определения активности протеиназ и их ингибиторов;

- изучение активности протеиназ личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata;

- изучение активности ингибиторов протеиназ у сортов картофеля с различной устойчивостью к колорадскому жуку;

- изучение влияния защитных препаратов и биостимуляторов на активность ингибиторов протеиназ в растениях картофеля. Научная новизна. Разработаны новые методы определения активности

протеолитических ферментов и их ингибиторов. Показано, что уровень активности ингибиторов экзогенных протеиназ (ферментов личинок насекомых) в тканях картофеля зависит от степени устойчивости сорта к колорадскому жуку.

Практическая значимость. Разработанные методы и полученные данные могут быть использованы в селекции картофеля на устойчивость к неблагоприятным факторам среды, в том числе и к насекомым-вредителям.

Апробация результатов. Результаты исследований были представлены на VII Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (Симферополь,

1998), на V Молодежной научной конференции (Сыктывкар, 1998), на VI Молодежной научной конференции (Сыктывкар, 1999), на конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии" (Челябинск, 1999), на IV Съезде физиологов растений России (Москва,

1999), на конференции «Химия и технология применения регуляторов роста растений» (Уфа, 2001), на конференции «Актуальные проблемы современной генетики» (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в т.ч. 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературных данных, описания объектов и методов исследований, изложения и обсуждения результатов исследований, выводов. Список цитируемой литературы содержит 149 ссылок (66 отечественных и 83 зарубежных источников). Работа изложена на 110 страницах и содержит 11 таблиц и 20 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЙ

Для исследований использовались сорта и линии картофеля. Клубни получали из селекционно-семеноводческих и научных учреждений: Башкирского НИИ сельского хозяйства РАСХН и учебно-опытного хозяйства Башгосагроуниверситета.

В полевых условиях растения выращивали по принятой дня зоны агротехнике, в лабораторных условиях - на светоплощадке при комнатной температуре.

Белки из растений экстрагировали 0,05 М трис-НС1-буфером, рН-8,2, дистиллированной водой. Объем экстрагента для каждого обьекта подбирали экспериментально.

Активность протеолитических ферментов определяли по гидролизу Ка-беюоил-ОЬ-аргинин-4-нитроа[шлида (БАПА) (Erlanger, Kokowski, Cohen, 1961) и гидролизу желатинового слоя фотопластинок (см. глава 1). Активность ингибиторов протеиназ определяли по торможению скорости гидролиза субстрата БАПА (Гофман, Вайсблай, 1976) и желатина соответствующими протеиназами.

Для определения концентрации белка в растворах использовали метод М. Бредфорд (Bradford, 1976). Калибровочную кривую составляли по а-химотрипсину.

Для исследования активности ингибиторов протеиназ насекомых-вредителей использовали экстракты личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata и вредителя бобовых — фасолевой зерновки Acanthosceiides obtectus.

Личинки колорадского жука собирали на разных стадиях их развития, в нескольких районах Республики Башкортостан. Фасолевую зерновку выращивали на семенах фасоли в лабораторных условиях. Протеиназы из насекомых экстрагировали 0,05 М трис-НС1-буфером, рН-8,2, очищали и хранили при температуре - 24 °С.

Статистичес кую обработку полученных данных проводили с помощью программы Exel пакета Microsoft Office.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Методы определения активности протеолитических ферментов и их ингибиторов по гидролизу желатинового слоя фотопластины (разработка методов)

1.1. Метод определения активности протеолитических ферментов

Денатурированная форма коллагена (желатин) представляет хороший субстрат для протеолитических ферментов и может использоваться для определения их активности. В литературе описаны методы, использующие желатиновый слой фотоматериалов для качественного обнаружения протеиназ, а также для выявления локализации ферментов и их ингибиторов после электрофоретического разделения (Ambrose, Patrick, Vincent, 1991; Конарев, Фомичева, 1991).

Нами разработан метод, позволяющий количественно оценить активность протеолитических ферментов по гидролизу желатинового слоя фотоматериалов.

Принцип метода заключается в том, что пробу ферментного раствора вносили в лунку, вырезанную в слое агарозного геля, которым покрывали фотопластинку. Объем одной лунки составляет 50 мкл. Для предотвращения высыхания раствора в лунке на гель накладывали целлулоидную пленку. Готовую пластину помещали во влажную камеру и инкубировали при 37°С в течение 3-6 час. Молекулы фермента из раствора диффундируют в гель и гидролизуют желатину вокруг лунки. Скорость диффузии молекул в геле пропорциональна исходной концентрации фермента в растворе. После окончания инкубации агарозный гель снимали и пластину промывали водой. Гидролизованные участки желатинового покрытия хорошо смываются и проявляются на темном фоне в виде светлых участков округлой формы.

Определение ферментативной активности проводили путем измерения интенсивности светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатина. Для этой цели был разработан и сконструирован прибор, позволяющий измерять интенсивность света, проходящего через пластину. Это устройство состоит из источника света, фотоприемника и измерительного прибора. Для проведения замеров фотопластинка помещалась между источником света и фотоприемником устройства. Активность фермента определяли по интенсивности светового потока, проходящего через гидролизованные участки желатинового слоя фотопластинки.

За единицу активности фермента принимали такую активность, которая в стандартных условиях гидролизует площадь слоя желатина, размером, повышающим интенсивность светового потока на 1% по сравнению с негидролизованным участком фотопластины.

На рисунке 1 показан гидролиз желатинового слоя фотопластинки трипсином.

10 мкг/мл -8 мкг/мл -

6 мкг/мл -

4 мкг/мл -

2 мкг/мл -1 мкг/мл -0,5 мкг/мл

1 2 Рис.1. Зависимость активности фермента трипсина от его концентрации.

1 - фотопластина с гидролизованными участками желатины;

2 - график зависимости интенсивности светового потока от концентрации трипсина.

По оси абцисс - С - концентрация фермента (мкг/мл);

по оси ординат - I - интенсивность светового потока, проходящего

через гидролизованный участок желатинового слоя (е)

Как видно, величина участка гидролизованного желатина, соответственно, и интенсивность светового потока, зависит от концентрации фермента в растворе. Активность фермента повышается пропорционально с увеличением концентрации в инкубационной среде. Соответственно, при этих условиях активность фермента можно

определять по интенсивности света, проходящего через участок гидролизованного желатина.

Нами были проанализированы экстракты тканей из различных объектов с целью выявления желатингидролизующей активности. На рисунке 2 и в таблице 1 представлены результаты эксперимента по определению активности желатингидролизующих протеиназ из семян пшеницы, гречихи и культурального фильтрата патогенных грибов Fusarium sp.

Таблица 1

Экстракт Интенсивность светового потока, е Активность протеиназ, емкл/мин

1 2 3 4 АХ

Семена пшеницы, зараженной пыльной головней (сорт Жница) 20 22 20 19 20,25 0,307

Семена гречихи (сорт Казанская) 0 0 0 0 0 0

Культуральный фильтрат РшагЫт зр. 14 19 17 15 16,25 0,246

Как видно, протеолитическая активность определяется в экстрактах из семян пшеницы и в культуральном фильтрате грибов. Оказалось, что в данных условиях опыта покоящиеся семена гречихи не обладали желатингидролизующей активностью.

Предложенный метод характеризуется высокой воспроизводимостью. Ошибка метода в серии повторов не превышает 5 %. Полученные результаты показывают, что его можно использовать для определения активности желатингидролизующих ферментов из различных источников. Более того, этот метод можно применять и для измерения активности ингибиторов протеолитических ферментов.

Рис.2 Фотография фотопластины после гидролиза желатинового слоя растительными и грибными протеин азами

1 - семена пшеницы, зараженные пыльной головней;

2 - семена гречихи;

3 - культуральная жидкость Fusarium sp.

1.2. Метод определения активности ингибиторов протеиназ

Как отмечалось выше, разработанный метод можно использовать и для определения активности белков-ингибиторов, подавляющих желатингидролизующую способность протеиназ.

Измерение активности ингибиторов желатингидролизующих протеиназ проводили аналогично описанной выше процедуре определения протеолитической активности

Активность ингибиторов рассчитывали по разности активности фермента в лунке без ингибитора и в лунке с ингибитором. Ингибиторную активность выражали в ингибиторных единицах (ИЕ) и миллиингибиторных единицах (мИЕ): за 1 ИЕ принимали такую активность ингибитора, которая при стандартных условиях полностью подавляет 1 Е активности фермента.

Как видно из рисунка 3, этот метод позволяет определять активность ингибиторов протеиназ из различных источников.

Таким образом, предложенные методы позволяют обнаружить и измерить активность желатингидролизующих протеиназ и их ингибиторов из различных источников. Процедура проведения экспериментов проста и доступна, поскольку не требует сложного оборудования и приборов. Методы характеризуются высокой чувствительностью. Нижний предел

определения активности коммерческих препаратов протеиназ (трипсин, проназа Е, химотрипсин) составил 0,5-1 мкг/мл.

Ф # • ^

О • ф

Активность

Объект ингибиторов

трипсина

1 2 3

Клубни картофеля 4 3,8 4

Семена гороха 3,6 3,6 2,7

Листья картофеля 2,3 1,8 1,8

12 3 4

Рис. 3. Активность ингибиторов трипсина из клубней и листьев картофеля, семян гороха

1 - клубни картофеля (сорт Романо)

2 - семена гороха (сорт Чишминский)

3 — листья картофеля (сорт Романо)

4 - бычий трипсин (10 мкг/мл)

По сравнению с широко используемыми методами определения (Erlanger, Kokowski, Cohen, 1961; Гофман, Вайсблай, 1976) в описанных процедурах используются микрообъемы инкубационных растворов (5-50 мкл), что снижает расход реактивов в несколько десятков раз. Описанные методы позволяют варьировать составом инкубационной среды и измерять активность всех протеиназ, гидролизующих желатин, а также определять активность их ингибиторов.

2. Активность ингибиторов протеиназ в тканях картофеля

2.1. Активность ингибиторов трипсина в покоящихся и прорастающих клубнях картофеля

Растения семейства пасленовых характеризуются высокой активностью ингибиторов протеиназ (Ryan et al., 1976; Мосолов, Валуева, 1993). Ранее было показано, что в покоящихся клубнях картофеля различных сортов активность ингибиторов трипсина колеблется от 6,1 до 16,6 ИЕ/г массы ткани (Ибрагимов и др., 1999). Известно также, что при прорастании клубней активность ингибиторов в них снижается, а в проростках - возрастает (Ryan et al., 1976). Представляет интерес

исследование уровня активности ингибиторов протеиназ в клубнях и проростках картофеля у сортов, различающихся по устойчивости к болезням и действию насекомых-вредителей.

В таблице 2 представлены данные об активности ингибиторов трипсина (с использованием субстрата БАЛА и желатина) в прорастающих клубнях картофеля. Видно, что исследованные сорта характеризуются неодинаковым уровнем ингибиторной активности в клубнях. Наибольшая активность ингибиторов трипсина выявлена у сорта Белореченский (в расчете на сырую массу клубней). Значительно меньшей активностью ингибиторов трипсина обладают клубни сортов Невский, Гатчинский, Ева. Однако, вследствие низкого содержания растворимого белка в клубнях сорта Ева, удельная активность ингибиторов в клубнях этого сорта обнаруживается на высоком уровне. В клубнях сорта Ева удельная активность ингибиторов самая высокая из исследованных сортов. Так, по субстрату БАПА значение удельной активности у этого сорта составляет 20,5 мИЕ, по желатину - 384 мИЕ/мг белка.

Таблица2

Активность ингибиторов трипсина в прорастающих клубнях картофеля

Сорт Хар-ка сорта Субстрат БАПА Субстрат желатин

мИЕ/г мИЕ/мг ИЕ/г мИЕ/мг

массы. белка массы белка

Ашкадар У 185 ±30,7 12,3 3,4±0,3 226

Гатчинский НУ 162 ±21 5,6 2,5±0,3 86

Невский НУ 163 ± 15,7 3,8 2,8±0,2 66

Ева У 160 ± 19,1 20,5 3,0±0,2 384

Акросия НУ 175 ±22,5 5,5 3,2±0,2 101

Луговской НУ 175 ± 18,2 5,5 3,0±0,3 94

Пушкинец НУ 175 ± 25,2 6,07 3,0±0,2 104

Фреско У 188 ±27,2 12 3,2±0,3 205

Пригожий СУ 204 ± 39,7 8,5 3,5±0,2 145

Томич НУ 210 ±34,2 6,1 3,7±0,2 108

Тулунский СУ 210 ±41,4 8,7 3,5±0,2 145

Уральский СУ 204 ±29,8 8,1 3.5±0,2 140

ранний

Сантэ СУ 205 ± 29,2 7,1 3,75±0,2 128

Белореченский У 218 ±35,5 8,7 4,0±0,3 160

Примечание: У- устойчивый сорт, СУ - среднеустойчивый сорт,

НУ - неустойчивый сорт

Следует отметить, что значение показателя ингибиторной активности с использованием желатины значительно выше, чем аналогичные показатели с субстратом БАЛА.

По активности ингибиторов трипсина в проросших клубнях исследуемые сорта картофеля можно разделить на 3 группы:

1 - с высокой активностью ингибиторов (Ева, Ашкадар, Фреско, Белореченский),

2 - со средними значениями активности ингибиторов (Пригожий, Тулунский, Уральский ранний, Сантэ),

3-е низкой активностью (Томич, Акросия, Пушкинец, Луговской, Невский, Гатчинский). 1

Уровень активности ингибиторов трипсина в клубнях исследованных |

сортов картофеля коррелируют с показателем их устойчивости к неблагоприятным факторам, в т.ч. к действию патогенных микроорганизмов и наскомых-вредителей. Из таблицы видно, что сорта с высокой устойчивостью характеризуются повышенным уровнем активности ингибиторов. Сорта с низкой устойчивостью обладают невысокими показателями антипротеолитической активности.

2.2, Активность ингибиторов протеиназ в проростках картофеля

Большой практический интерес представляет исследование активности ингибиторов протеиназ в стеблях и листьях картофеля, которыми питаются личинки колорадского жука. В связи с этим, мы изучали динамику активности ингибиторов трипсина в растениях нескольких сортов картофеля, различающихся по устойчивости к колорадскому жуку (рис. 4).

Видно, что на стадии молодых простков (длина проростков не более 5 см) наибольшей активностью ингибиторов трипсина обладает устойчивая к колорадскому жуку линия 089-5 (1,68 ИЕ/г массы ткани), у среднеустойчивого сорта Пушкинец этот показатель составляет 0,93 ИЕ/г. Активность ингибиторов у сортов Гатчинский, Лиу и линии 1-3-1 определяется примерно на среднем уровне. Неустойчивый сорт Невский характеризуется низкой активностью этих ингибиторов в проростках этого возраста.

Аналогичная картина наблюдается и при исследовании проростков на следующем этапе развития (для проростков длиной 15-20 см). В этом случае высокая активность ингибиторов трипсина характерна для устойчивых к колорадскому жуку сортов. Как видно, показатель активности ингибиторов протеиназ в листьях картофеля положительно коррелирует с уровнем устойчивости сорта к колорадскому жуку.

Б

Рис. 4. Изменение активности ингибиторов трипсина в проростках I А - активность ингибиторов трипсина на массу ткани (ИЕ/г);

Б - удельная активность ингибиторов трипсина на (ИЕ/г белка)

В то же время, измерение активности ингибиторов проназы Е в проростках не выявило такой закономерности. Уровень активности ингибиторов этого фермента в листьях не зависит от степени устойчивости сорта картофеля к колорадскому жуку. Однако, нужно отметить, что наибольшая активность ингибиторов проназы Е выявляется у устойчивого сорта Пушкинец, а наименьшая активность - у неустойчивого сорта Невский.

Из рисунка 4 видно, что активность ингибиторов в проростках по мере их развития снижается. Активность ингибиторов трипсина и ингибиторов проназы Е в проростках позднего возраста значительно ниже, чем в молодых проростках. Особенно четкие различия между проростками разного возраста выявляются по удельной активности ингибиторов.

Полученные данные позволили выявить положительную связь между устойчивостью сортов картофеля к колорадскому жуку и уровнем активности ингибиторов трипсина в проростках. Чем выше активность ингибиторов трипсина в листьях, тем устойчивее сорт к действию пищеварительных протеиназ насекомых, в т.ч. и личинок колорадского жука.

3. Активность ингибиторов протеолитических ферментов насекомых-вредителей (личинок колорадского жука и фасолевой зерновки) в тканях картофеля

3.1. Активность протеолитических ферментов личинок колорадского жука и фасолевой зерновки

Как известно, значительная часть ингибиторов в семенах и других органах растений представлена ингибиторами чужеродных протеиназ: ферментов животных, насекомых, микроорганизмов (Appelbaum, Konjin, 1966; Мосолов, 1983; Конарев, 1987; Валуева, Мосолов, 1995; 2002). Это позволяет предполагать, что ингибиторы являются важной частью защитного механизма растений от поражения их гетеротрофными организмами.

Среди молекулярных факторов, обеспечивающих пищевые связи фитофагов с растениями, ключевая роль принадлежит пищеварительным гидролазам (амилазам, протеиназам и т.д.). В процессе коэволюции с растениями насекомые приобрели наборы пищеварительных гидролаз, в той или иной степени приспособленные к усвоению питательных веществ из определенных видов растений и их отдельных органов (Дунаевский и др., 1995; Konarev et all., 1999). Особенно ярко специализация и адаптивность ферментативной системы проявляется у колорадского жука. В его кишечнике найдены химотрипсиноподобные и цистеиновые ферменты (Ryan, 1990; Konarev and Fasulati, 1996), но ведущая роль в пищеварении принадлежит кислой аспартильной протеиназе типа катепсина D (Brunelle et al., 1999). Последняя инициирует процесс расщепления белков, который продолжают остальные протеиназы. В связи с вышесказанным, особый интерес представляет исследование роли ингибиторов во взаимоотношениях растений и насекомых-вредителей.

Как известно, питаются растениями картофеля жуки и личинки, но наиболее вредоносны последние. Личинки колорадского жука за 2 недели могут уничтожить до 45 % листовой поверхности растений (Теняев, 2000)

Нами показано, что ткани личинок содержат ферменты, гидролизующие желатиновый субстрат. Молодые личинки характеризуются невысокой активностью ферментов. Так, в гомогенате молодых личинок (размер личинки до 3 мм) протеолитическая активность составила 0,14 Е-мкл/мин или 280 Е/г сырой массы (рис. 5), что соответствует активности 1,3 мкг коммерческого препарата бычьего трипсина. В гомогенате личинок размером 3-8 мм протеолитическая активность составила 0,167 Е мкл/мин или 334 Е/г массы личинок, что соответствует активности 1,5 мкг трипсина. Как видно, с ростом личинок активность протеолитических ферментов в тканях повышается. У личинок с размером тела больше 8 мм активность протеиназ доходит до 0,217 Емкг/мин или 434 Е/г.

А, Е/г

<3 мм 3-8 мм >8 мм

Рис.5. Зависимость активности желатингидролизующих протеолитических ферментов личинок колорадского жука от их размеров

Таким образом, в процессе роста и развития личинок колорадского жука имеет место увеличение активности протеолитических ферментов, что свидетельствует о повышении способности насекомых к расщеплению белковых субстратов. В дальнейшем, для получения препаратов с протеиназной активностью мы использовали личинки 3-й стадии развития.

3.2. Активность ингибиторов протеиназ насекомых-вредителей (фасолевой зерновки и личинок колорадского жука) в тканях картофеля

Виды насекомых существенно отличаются по компонентному составу гидролаз и, соответственно, по относительной активности и роли отдельных молекулярных компонентов. У них обнаружены трипсино-, эластаза-, химотрипсин- подобные, цистеиновые и другие ферменты. У видов с широкой пищеварительной специализацией, например Tenebrio molitor L., в кишечнике выявляется широкий спектр протеолитических ферментов. У более специализированных видов может преобладать по активности один тип фермента, например, трипсинподобный фермент у Rhyzopertha dominica F. (Конарев, Фомичева, 1991; Zhu and Baker, 1999). Особенно ярко специализация и адаптивность ферментативной системы проявляется у колорадского жука. В его кишечнике найдены химотрипсиноподобные, трипсиноподобные и цистеиновые ферменты (Ryan, 199.0; Konarev and Fasulati, 1996; Конарев Ал.В., 2000).

Как видно из таблицы 3, активность ингибиторов протеолитических ферментов личинок колорадского жука и активность ингибиторов трипсина значительно варьируют в зависимости от сорта картофеля.

Таблица 3

Активность ингибиторов протеиназ (ИЕ/г массы) в клубнях сортов

картофеля, различающихся по устойчивости к колорадскому жуку.

Сорт, линия Характе- Активность ингибиторов

протеиназ протеиназ

ристика трипсина личинок фасолевой

сорта колорадского зерновки

жука

Ашкадар У 5,6±0,3 8,5±0,9 4,2±0,3

Белореченский У 5,5±0,3 8,9±0,9 4,2±0,3

1-3-1 У 6,0±0,3 8,1±0,7 4,3±0,3

Сантэ У 5,6±0,5 8,1±0,8 4,2±0,3

Пушкинец СУ 4,2±0,2 7,8±0,6 4,2±0,3

Гатчинский СУ 4,5±0,2 6,0±0,3 4,1 ±0,3

Невский НУ 3,9±0,2 5,2±0,4 4,2±0,3

Ева НУ 3,5±0,2 3,0±0,3 4,2±0,3

Акросия НУ 3,6±0,2 4,1 ±0,2 4,2±0,3

Луговской НУ 3,3±0,2 5,0±0,3 4,1±0,3

Примечание: У- устойчивый сорт, СУ - среднеустойчивый сорт,

НУ - неустойчивый сорт

Причем, устойчивые к колорадскому жуку сорта характеризуются высокой активностью этих ингибиторов, а неустойчивые - низкой активностью. Так, в группе устойчивых сортов активность ингибиторов трипсина выявляется в пределах 5.5 - 6,0 ИЕ/г массы, активность ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука - 8,1-8,9 ИЕ/г массы. У неустойчивых сортов эти показатели значительно ниже - 3,3-3,9 ИЕ/г и 4,1-5,2 ИЕ/г соответственно. Эти результаты позволяют утверждать, что уровень активности ингибиторов пищеварительных протеиназ положительно коррелирует с устойчивостью сорта к колорадскому жуку.

Интересно отметить, что активность ингибиторов протеиназ фасолевой зерновки в клубнях всех сортов определяется на примерно одинаковом уровне (-4,2 ИЕ/г массы). Полученные данные свидетельствуют о том, что в клубнях картофеля содержатся специфические ингибиторы, проявляющие активность только к ферментам личинок колорадского жука.

Связь между устойчивостью сорта к колорадскому жуку и показателем активности ингибиторов протеиназ личинок в растительных тканях обнаруживается и при исследовании листьев картофеля (рис. 6).

А, ИЕ/г

4

Рис.6. Активность ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука в листьях картофеля

У устойчивых сортов (Ашкадар и линии 1-3-1) активность ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука самая высокая и составляет, соответственно, 2,7±0,2 и 3,4±0,3 ИЕ/г массы. У среднеустойчивых сортов (Пушкинец и Гатчинский) активность ингибиторов трипсина составляет 2,2±0,2 и 2,0±0,1 ИЕ/г массы. У неустойчивых сортов (Невский и Акросия)

активность ингибиторов протеиназ личинок самая низкая - 1,3±0,1 и 1,8± 0,1ИЕ/г массы.

Можно предположить, что появление специфичных к ферментам личинок колорадского жука ингибиторов в тканях картофеля является результатом коэволюции насекомого и растительного организма. Это факт также свидетельствует в пользу предположения, что ингибиторы гидролаз представляют один из эффективных механизмов приспособления растений к действию неблагоприятных факторов, в том числе, и к действию насекомых вредителей и микроорганизмов-патогенов.

Таким образом, высокая активность ингибиторов протеиназ жука в клубнях характерна для сортов, устойчивых к колорадскому жуку. Можно утверждать, что ингибиторы протеиназ входят в число факторов, определяющих устойчивость картофеля к колорадскому жуку и уровень их активности и молекулярной гетерогенности в тканях могут служить показателями такой устойчивости.

4. Активность ингибиторов протеиназ в тканях картофеля, обработанных физиологически активными веществами

Большой практический интерес представляет создание препаратов, стимулирующих защитные механизмы растений к действию патогенов и насекомых-вредителей. В этом плане актуальным представляется исследование активности ингибиторов протеиназ в вегетирующих органах картофеля при обработке их физиологически активными соединениям. На рисунке 7 представлены данные об активности ингибиторов трипсина (субстрат желатин) в проростках различных сортов, выращенных из клубней, обработанных 0,001% раствором препарата Рифтал. В качестве контроля служили клубни, обработанные дистиллированной водой.

Обработка клубней 0,001% раствором Рифтала у большинства исследованных нами сортов картофеля вызывает повышение активности ингибиторов трипсина в проростках. Причем, такая закономерность обнаруживается при использовании в качестве субстрата для фермента синтетического соединения БАЛА, и белка желатина. Так, активность ингибиторов трипсина в проростках, выращенных из обработанных клубней сорта Ашкадар, Тулунский повышается на 60 - 75 % по сравнению с контрольными.

Увеличение активности ингибиторов трипсина в клубнях наблюдалось при обработке их химическим препаратом ТМТД и препаратом бактериального происхождения фитоспорином. В таблице 4 представлены данные об активности ингибиторов трипсина в клубнях. Как видно, обработанные клубни характеризуются более высокой активностью

ингибиторов трипсина, чем контрольные. Так, через 10 дней после обработки фитоспорином, антитрипсиновая активность в них была выше на 14% , чем в необработанных клубнях.

2,5

Рис. 7. Активность ингибиторов трипсина в проростках картофеля (субстрат желатин)

[~~| - проростки, выращенные то клубней, обработанных 0,001%

раствором «Рифтал» | - контроль (обработка клубней водой)

Как видно, в прорастающих клубнях опытных и контрольных вариантов активность ингибиторов трипсина снижается. Однако, клубни обработанные химическими и биологическими препаратами характеризовались более высокой активностью ингибиторов, чем клубни контрольного варианта.

Таблица 4

Активность ингибиторов трипсина (ИЕ/г) в прорастающих клубнях картофеля, обработанных ТМТД и фитоспорином (субстрат желатин)

Варианты опыта Сутки после обработки

10 20 25 30

Контроль 5.01 ±0.1 4.7 ±0.1 3.52 ±0.09 3.16 ±0.08

ТМТД 5.48 ±0.1 5.51 ±0.15 3.80 ± 0.08 3.21 ±0.07

Фитоспорин 5.71 ±0.2 5.62 ±0.2 4.06 ±0.1 3.38 ±0.1

Арахидоновая кислота 8.20 ± 0.2 7.01 ±0.2 5.48 ±0,2

Таким образом, обработка клубней картофеля защитными и биостимуляторами (Рифтал, ТМТД, фитоспорин, арахидоновая кислота) стимулирует синтез белков с ингибиторной активностью, что повышает их устойчивость к действию неблагоприятных факторов. В обработанных этими препаратами клубнях имеет место 1,5 -3 кратное повышение активности ингибиторов трипсина.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые методы количественного определения активности протеолигических ферментов и их ингибиторов.

2. В личинках колорадского жука обнаружены протеолитические ферменты, гидролизуюущие субстрат желатин. Наибольшая активность протеиназ выявлена в тканях личинок поздних стадий развития.

3. В листьях и клубнях картофеля выявлены белки, подавляющие активность протеиназ личинок колорадского жука и протеиназ фасолевой зерновки. Показано, что уровень активности ингибиторов экзогенных протеиназ (ферментов личинок насекомых, трипсина) в тканях картофеля зависит от степени устойчивости сорта к колорадскому жуку.

4. Исследованные сорта картофеля существенно различаются по активности ингибиторов трипсина, протеиназ личинок колорадского жука, проназы и характеризуются одинковым уровнем ингибиторов протеиназ фасолевой зерновки.

5. Обработка клубней картофеля защитными препаратами стимулирует синтез белков с ингибиторной активностью, что повышает их устойчивость к действию неблагоприятных факторов, в т.ч. и к действию насекомых- вредителей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ибрагимов Р.И., Хабибуллин С.И. Активность протеиназ и их ингибиторов в проростках пшеницы при действии культуральных фильтратов патогенных грибов // Результаты научных исследований преподавателей биологического факультета БашГУ. - Уфа: Баш. ун-т. -1997.-С. 19-21.

2. Ибрагимов Р.И., Ахметов Р.Р., Хабибуллин С.И. Диффузия ингибиторов протеиназ из набухающих и прорастающих семян. // Результаты научных исследований биологического факультета Башкирского госуниверситета за 1996 год. Уфа.-1997.- С.З.

3. Ибрагимов Р.И., Марданшин И.С., Зайнутдинова Г.Ф., Хабибуллин С.И., Пусенкова Л.И. Механизмы индуцированной устойчивости картофеля к патогенам при обработке биопрепаратами // Материалы VII Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье-Симферополь,- 1998.-c.408.

4. Зайнутдинова Г.Ф., Хабибуллин С.И. Протеиназы и амилазы патогенных грибов Fusarium и Helminthosporium // Тезисы докладов V Молодежной научной конференции.-Сыктывкар.-1998.-С.67.

5. Хабибуллин С.И., Зайнутдинова Г.Ф. Ингибиторы экзогенных пртеиназ в тканях культурных растений // Тезисы докладов V Молодежной научной конференции.-Сыктывкар.-1998.-С.203-204.

6. Ибрагимов Р.И., Зайнутдинова Г.Ф., Хабибуллин С.И. Протеолитические ферменты патогенных грибов р. Fusarium // Тезисы докладов IV Съезда физиологов растений России.-1999.-с. 216.

7. Ибрагимов Р.И., Хабибуллин С.И., Ахметов P.P. Изменение активности ингибиторов протеолитических ферментов в тканях растений при обработке их защитными препаратами // Материалы конф. «Химия и технология применения регуляторов роста растений» 20.12.01. Уфа.-2001.- С. 126-127.

8. Ибрагимов Р.И., Хабибуллин С.И. Измерение активности протеиназ с использованием желатинового слоя фотопластинок. // Итоги биол. исследований. Сборник научн. трудов Башгосуниверситета. - 2000. -Уфа. - С. 108-109.

9. Ибрагимов Р.И., Хабибуллин С.И., Ахметов P.P. Способ определения активности протеолитических ферментов. Патент РФ на изобретение №2175134.-2001.

10. Хабибуллин С.И., Женин Р.И. Изучение активности протеолитических ферментов личинок Leptinotarsa decemlineata и их ингибиторов в

листьях Solanum tuberosum. II Итоги биол. исследований. Сборник научн. трудов Башгосуниверситета. - 2001. - Уфа. - С.116-117.

11. Женин Р.И., Хабибуллин С.И. Способ измерения активности амилаз из тканей насекомых. // Итоги биол. исследований. Сборник научн. трудов Башгосуниверситета. - 2001. - Уфа. - С. 118.

12. Хабибуллин С.И., Ибрагимов Р.И. Метод определения активности ингибиторов желатингидролизующих ферментов. // Итоги биол. исследований. Сборник научн. трудов Башгосуниверситета. - 2002. -Уфа. - С.37-39

13. Женин Р.И., Хабибуллин С.И., Ибрагимов Р.И. Использование пластины с полиакриламидным гелем для определения активности амилазы слюны. // Итоги биол. исследований. Сборник научн. трудов Башгосуниверситета. - 2002. - Уфа. - С.40-41

14. Ибрагимов Р.И., Марданшин И.С., Хабибуллин С.И. Активность ингибиторов протеиназ у сортов картофеля, различающихся по устойчивости к фитопатогенам и насекомым-вредителям И Материалы конф. «Актуальные проблемы современной генетики»,- 2003.- М.-С.81-82.

Хабибуллин Салават Ильнурович

АКТИВНОСТЬ ИНГИБИТОРОВ ЭКЗОГЕННЫХ ПРОТЕИНАЗ

В КЛУБНЯХ И ЛИСТЬЯХ КАРТОФЕЛЯ ^ В СВЯЗИ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К КОЛОРАДСКОМУ ЖУКУ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия на издательскую деятельность . ЛРNs 021319 от 05.01.99 г.

Подписано в печать 21.08.2003 г. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Отпечатано на ризографе. Усл.печ. л. 1,26. Уч.-издл. 1.38. Тираж 100 экз. Заказ 544.

Редакционно-издателъский отдел Башкирского государственного университета 450074, РБ, г.Уфа,ул.Фрунзе, 32.

Отпечатано на множительном участке Башкирского государственного университета 450074, РБ, г.Уфа, ул.Фрунзе, 32.

goo?-A P13259 x

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хабибуллин, Салават Ильнурович

Введение.

• 1. Природа и физиологическая роль белковых ингибиторов протеиназ (аналитический обзор).

1.1. Биохимическая характеристика белковых ингибиторов протеиназ растений.

1.2. Содержание, активность и физиологические функции ингибиторов протеиназ у растений.

1.2.1. Ингибиторы протеиназ как составная часть системы защиты от вредителей и болезней.

1.2.2. Ингибиторы протеиназ в тканях растений семейства пасленовых. 33 1.3. Методы определения протеиназ и их ингибиторов.

• 2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Материалы и реактивы.

2.3. Методы исследований.

2.3.1. Определение активности протеолитических ферментов.

2.3.2. Определение активности ингибиторов протеиназ.

2.3.3. Определение концентрации белка.

2.3.4. Математическая обработка результатов.

3. Экспериментальная часть

3.1 Методы определения активности протеолитических ферментов и их ингибиторов по гидролизу желатинового слоя фотопластины разработка методов).

3.1.1. Метод определения активности протеолитических ферментов.

3.1.2. Метод определения активности ингибиторов протеиназ.

3.2. Активность ингибиторов протеиназ в тканях картофеля.

3.2.1. Активность ингибиторов трипсина в прорастающих клубнях картофеля.

3.2.2. Активность ингибиторов протеиназ в проростках картофеля.

3.3. Активность ингибиторов протеолитических ферментов насекомых-вредителей в тканях картофеля.

• 3.3.1. Активность протеолитических ферментов личинок колорадского жука и фасолевой зерновки.

3.3.2. Активность ингибиторов протеиназ насекомых-вредителей в тканях картофеля.

3.4. Влияние защитных препаратов и биостимуляторов на антипротеолитическую активность в тканях картофеля.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активность ингибиторов экзогенных протеиназ в клубнях и листьях картофеля в связи с устойчивостью к колорадскому жуку"

Белки-ингибиторы протеолитических ферментов обнаружены в тканях животных, растений и в микроорганизмах (Мосолов, 1971; 1983; Ryan, 1973; 1981; Laskowski, Kato, 1980; Richardson, 1977; Мосолов, Валуева, 1993, Конарев, 2000). Особенно высоким содержанием ингибиторов протеиназ характеризуются семена и другие запасающие органы растений. Так, содержание ингибиторов в семенах бобовых и злаковых культур составляет 5-10 % растворимых белков (Micola, Kirsi, 1972; Ryan, 1981). Общим свойством этих молекул является способность образовывать с протеолитическими ферментами устойчивые комплексы, что приводит к обратимому подавлению их активности.

Широкое распространение ингибиторов и их содержание в значительных количествах в тканях растений позволяют предположить, что они являются одним из важнейших компонентов регуляции различных физиологических процессов. Полагают, что подавление активности ферментов белковыми ингибиторами является и наиболее древним в эволюционном отношении способом регуляции протеолиза (Мосолов, 1983). Уже более 40 лет ингибиторы у бобовых, злаков, пасленовых и других растений находятся под пристальным вниманием исследователей. Однако, даже при впечатляющих успехах в изучении молекулярной структуры и биосинтеза многих ингибиторов, клонированию и переносу их генов, роль, закономерности организации и функционирования, а также возможности их практического применения при создании новых форм устойчивых растений остаются до конца не выясненными.

Большинство ранних работ были посвящены изучению растительных ингибиторов как антипитательных веществ, подавляющих активность пищеварительных ферментов. В них было показано, что высокое содержание ингибиторов в пище и в корме животных не только снижает усвояемость белков, но и приводит к нарушению процессса пищеварения у человека и животных (Мосолов, 1983; Richardson, 1977).

В дальнейшем были получены сведения о том, что ингибиторы трипсина и химотрипсина из семян способны подавлять активность протеиназ насекомых-вредителей (Appelbaum, Konijn, 1966; Mitsunaga, 1974; Балаян, 1982; Конарев, 2000). Более того, в семенах сельскохозяйственных культур обнаружены специфические ингибиторы протеолитических ферментов пищеварительного тракта насекомых (Конарев, Вилкова, 1984; Конарев, 1984, 1987; Конарев, Фомичева, 1991). В растительных тканях были обнаружены и ингибиторы, способные подавлять активность протеиназ патогенных микроорганизмов (Кладницкая, Валуева, Домаш и др., 1994; Ибрагимов, 1997). Эти молекулы не только подавляют ферментативную активность микроорганизмов, но и угнетают рост мицелия гриба при добавлении их в питательную среду (Бенкен, Мосолов, Федуркина, 1976; Дунаевский, Павлюкова, Белякова и др., 1995). Способность растительных белков подавлять активность протеиназ млекопитающих, насекомых и микроорганизмов легла в основу представлений об их защитных функциях.

В пользу этого предположения свидетельствуют данные об изменении активности ингибиторов протеиназ в растениях при действии на них различных факторов. С. Рианом и его сотрудниками (Green, Ryan, 1972; Ryan, 1973; Walker-Simmons, Hadwiger, Ryan, 1983) было обнаружено, что поранение тканей личинками колорадского жука приводит к повышению активности ингибиторов протеиназ в листьях томатов и картофеля. Механическое, химическое, термическое повреждение одного листа вызывало активацию ингибиторов по всем органам растений. Оказалось, что многие виды растений способны к накоплению ингибиторов в ответ на повреждение тканей (Ryan, An, 1988; Brown, Takio, Titani et all., 1985; Конарев A.B., 2002).

Насекомые-вредители наносят значительный ущерб сельскому хозяйству. Для успешной борьбы с болезнями растений и выведения устойчивых сортов необходимо исследование физиолого-биохимических механизмов взаимоотношений растений и гетеротрофных организмов. Механизмы формирования защитных реакций растений на повреждение насекомыми остаются пока малоизученными. Агрессивность насекомых-вредителей в значительной степени обусловлена их способностью к синтезу и использованию гидролитических ферментов (Рубин, Арциховская, 1975). В тканях растений содержатся белки, способные взаимодействовать с чужеродными ферментами и подавлять их активность. Интенсивное исследование таких белков-ингибиторов протеиназ растительного происхождения началось в 50-е годы. К настоящему времени они обнаружены у всех исследованных представителей растений (Мосолов, Валуева, 1995, 1999). Особенно высоким содержанием белковых ингибиторов ферментов характеризуются запасающие органы бобовых, пасленовых, злаков, здесь ингибиторы играют роль запасных белков растения. Кроме того, ингибиторы экзогенных протеиназ являются защитными белками, участвующими в формировании у растений реакций устойчивости к патогенам. Первые сведения о том, что ингибиторы трипсина и химотрипсина из семян бобовых способны подавлять активность протеиназ насекомых-вредителей, питающихся зернокультурами, были получены в 60-е годы (АрреШаиш, Копуп, 1966). В дальнейшем это свойство было обнаружено у ингибиторов из семян пшеницы, ржи и кукурузы (МкБШ^а, 1974; Балаян, 1982). Более того, в семенах сельскохозяйственных культур обнаружены специфические ингибиторы протеолитических ферментов пищеварительного тракта насекомых (Конарев, Вилкова, 1984; Конарев, 1984, 1987, 1991, 2000). Широкое распространение ингибиторов в живой природе свидетельствует о том, что подавление протеолитической активности этими молекулами может служить весьма эффективной и специфической ответной реакцией на повреждение тканей растений насекомыми-вредителями.

Большое количество ингибиторов содержится в тканях картофеля. Особенно высоким содержанием белков-ингибиторов характеризуются клубни картофеля, где на их долю приходится до 15-20% всех водорастворимых белков (Ryan С.А. et al.,1976). Среди белков-ингибиторов, присутствующих в клубнях картофеля, обнаружены ингибиторы протеолитических ферментов различных классов - сериновых, цистеиновых и аспартильных протеиназ, а также металлсодержащих карбоксипептидаз (Garsia-Olmedo F. et al.,1987).

Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata является особо опасным вредителем картофеля. Установлено, что личинки колорадского жука за 2 недели могут уничтожить до 45 % листовой поверхности растений (Теняев, 2000). Изучение физиолого-биохимических и молекулярных механизмов взаимодействия этих насекомых с растениями является актуальной задачей. В этом плане весьма перспективным представляется исследование функционирования системы «протеиназы насекомых - белковые ингибиторы растений».

Цель работы заключалась в оценке значения ингибиторов экзогенных протеиназ в формировании устойчивости картофеля к колорадскому жуку.

Нами были поставлены следующие задачи:

- разработка новых методов определения активности протеиназ и их ингибиторов;

- изучение активности протеиназ личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata;

- изучение активности ингибиторов протеиназ у сортов картофеля с различной устойчивостью к колорадскому жуку;

- изучение влияния защитных препаратов и биостимуляторов на активность протеиназ и их ингибиторов в растениях картофеля.

1. ПРИРОДА И ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ (АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР)

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Хабибуллин, Салават Ильнурович

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые методы количественного определения активности протеолитических ферментов и их ингибиторов.

2. В личинках колорадского жука обнаружены протеолитические ферменты, гидролизующие субстрат желатин. Наибольшая активность протеиназ выявлена в тканях личинок поздних стадий развития.

3. В листьях и клубнях картофеля выявлены белки, подавляющие активность протеиназ личинок колорадского жука и протеиназ фасолевой зерновки. Показано, что уровень активности ингибиторов экзогенных протеиназ (ферментов личинок насекомых) в тканях картофеля зависит от степени устойчивости сорта к колорадскому жуку.

4. Сорта картофеля существенно различаются по активности ингибиторов трипсина, протеиназ личинок колорадского жука, проназы Е и характеризуются одинаковым уровнем ингибиторов протеиназ фасолевой зерновки.

5. Обработка клубней картофеля защитными препаратами стимулирует синтез белков с ингибиторной активностью, что повышает их устойчивость к действию неблагоприятных .факторов, в т.ч. и к действию насекомых- вредителей. г

Ингибирование протеолитической активности белковыми молекулами является важным звеном в формировании защитных реакций растений на действие патогенов и других неблагоприятных воздействий. Разработанные новые методы определения активности протеолитических ферментов и их ингибиторов рекомендуется использовать в селекционном процессе на устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды, в том числе и к насекомым-вредителям, особенно на этапе подбора исходного материала для селекции и в семеноводстве, и для оценки эффективности действия защитных препаратов и иммуностимуляторов.

87

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хабибуллин, Салават Ильнурович, Уфа

1. Анисимов Б.В. Сорта картофеля, возделываемые в Российской Федерации. -М.: Информагротех, 1999.- 116 с.

2. Бенкен И.И., Мосолов В.В., Федуркина Н.В. Влияние ингибиторов про-теиназ фасоли на фитопатогенные грибы // Микология и фитопатология. 1976.- Т.10, № 3. - С.198-201.

3. Валуева Т. А., Мосолов В. В. Белки-ингибиторы по^еолитических ферментов // Прикл. биохимия и микробиол 1995. Т. 31, № 6. - С. 579-589.

4. Валуева Т. А., Ревина Т.А., Мосолов В. В. Белки-ингибиторы протеиназ из клубней картофеля, относящиеся к семейству соевого ингиибтора Ку-нитца // Биохимия.- 1997.- Т. 62, № 12. С. 1600-1.608.

5. Валуева Т.А., Зимачева A.B., Мосолов В.В. Локализация трипсинсвязы-вающего центра в молекуле ингибитора сериновых протеиназ // Докл. АН СССР. 1977.- Т. 237, № 6. - С. 1513-1516.

6. Валуева Т.А. Белки-ингибиторы протеиназ защитные белки картофеля // мат. конф. "Структура и функция протеолитических ферментов". М.S2000.- С.62-67

7. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений // Успехи биологической химии, т.42, 2002, с. 193-216.

8. Воскобойникова Н.Е., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Ингибитор метаплопротеиназы из покоящихся семян гречихи // Биохимия.- 1990.-Т.55, № 5.- С. 839 847.

9. З.Гофман Ю. Я., Вайсблай И. М. Определение ингибитора трипсина в семенах гороха. // Прикладная биохимия и микробиология. 1975. - Т. 2, №5. - С. 777-783.

10. М.Гузь А.Л. Состояние защиты картофеля от колорадского жука в условиях Адыгеи / Современные системы защиты и новые напрвления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.-С.17-19

11. Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Эндогенные ингибиторы протеаз как фактор устойчивости растений / Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.- С. 119-123

12. Ибрагимов Р.И. Влияние фунгицидов на активность протеиназ и их ингибиторов у пшеницы // Итоги научных исследований биологического факультета БашГУ за 1994 г.- Уфа: Баш. ун-т.- 1995. С. 87-88.

13. Ибрагимов Р.И. Внеклеточные протеолитические ферменты гриба Fusarium sp. и их ингибиторы из растений //Вестник Башкирского университета. 1997. - № 3 (I, II).- С. 51-54.

14. Ибрагимов Р.И. Подавление активности внеклеточных протеиназ патогенного гриба Fusarium sp. ингибиторами из семян и вегетативных органов растений //Доклады Россельхозакдемии.- 1997.- № 2.- С. 15-17.

15. Ибрагимов Р.И. Содержание ингибиторов протеиназ,в семенах сельскохозяйственных культур // Качество продукции растениеводства и приемы его повышения.- Уфа: Баш. гос. агр. ун-т. 1998.-С. 146-149.

16. Ибрагимов Р.И., Яруллина Л.Г. Изучение протеиназ и их ингибиторов у пшеницы в связи с устойчивостью к корневой гнили //Итоги научных исследований биологического факультета БашГУ за 1995 г.- Уфа: Баш. ун-т.-1996.-С. 6.

17. Ивлева Е.В., Руденская Ю.А., Дунаевский Я.Е., Мосолов В.В. 7,5 кДа-ингибитор цистеиновых протеиназ из семян тыквы // Биохимия.- 1997.Т. 62,№5.-С. 644-650.

18. Ильинская Л.И., Васюкова Н.И., Озерецковская O.A. Биохимические аспекты индуцированной устойчивости // Итоги науки и техники Сер. Защита растений. Т.7. М.: ВИНИТИ - 1991.- 102 с.

19. Кандыбин Н.В., Тихонович И.А. Микробиометод защиты растений от колорадского жука / Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.- С.50-55

20. Кладницкая Г.В., Валуева Т.А., Домаш В.И., Мосолов В.В. Экзопротеи-назы гриба Fusarium sambucinum и их взаимодействие с ингибиторами // Прикл. биохим. и микробиол.- 1994.- Т. 30, вып. I, С. 21-29.

21. Кладницкая Г.В., Валуева Т.А., Ермолова Н.В. и др. Накопление ингибиторов протеиназ в диффузатах клубней картофеля при инфицировании возбудителем фитофтороза // Физиол. растений. 1996.- Т.43, № 5.-701 -706.

22. Конарев A.B. Ингибиторы ферментов как генетические маркеры // Аграрная Россия/- 2002, № 3.- С.44-52

23. ЗККонарев Ал.В. Взаимосвязи и изменчивость ингибиторов протеиназ и а-амилаз у пшеницы и родственных ей злаков // Сельхоз. биол.- 1986.- №3. С. 46-51.

24. Конарев Ал.В. Идентификация ингибиторов тиоловых протеиназ насекомых и зерна у пшеницы и других злаков // Докл. ВАСХНИЛ.- 1984. -№ 10. С.13-15.

25. Конарев Ал.В. Изменчивость ингибиторов трипсиноподобных протеиназ у пшеницы и родственных ей злаков в связи с устойчивостью к зерновым вредителям // Сельхоз. биол. -1987.- № 5.- С. 17-24.

26. Конарев Ал.В. Ингибиторы протеиназ и устойчивость картофеля к колорадскому жуку / Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.- С.35-40

27. Конарев Ал.В. Компонентный состав ингибиторов трипсина из зерновки и листьев пшеницы // Докл. ВАСХНИЛ. -1987. -№ 12.- С. 6-9.

28. Конарев Ал.В. Методы анализа компонентного состава ингибиторов а-амилаз и протеиназ у злаков //Прикл. биохим. и микробиол.- 1985.- Т.21, № 1.- С.92-100.

29. Конарев Ал.В. Перекрестный анализ взаимодействия компонентов эндогенных а-амилаз и протеиназ с белковыми ингибиторами // Докл. ВАСХНИЛ.- 1990-. № L С.10-13.

30. Конарев Ал.В. Системы ингибиторов гидролаз у злаков организация, функции и эволюционная изменчивость // Автореф. дисс. докт. биол. наук.-М.: 1992.-38 с.

31. Конарев Ал.В. Эволюционная изменчивость и генетический контроль ингибиторов химотрипсина-субтилизина у пшеницы // Докл. ВАСХНИЛ. 1989. №5. С.8-10.

32. Конарев Ал.В., Вилкова H.A. Ингибиторы ферментов и иммунитет // Защита растений. -1984.-№ 10. С. 17-19.

33. Конарев Ал.В., Вилкова H.A. К вопросу об индентификации, компонентном составе и функционировании систем ингибиторов протеиназ у пшеницы // Сельхоз. биология. -1984. № 9.- С.39-44.

34. Конарев Ал.В., Фомичева Ю.В. Перекрестный анализ взаимодействия компонентов а-амилаз и протеиназ насекомых с белковыми ингибиторами из эндосперма пшеницы // Биохимия. -1991. -Т.56, №.4.- С.628-638.

35. Конарев В. Г. Белки пшеницы.- М.: Колос.- 1980.

36. Конарев В. Г. Белки растений как генетические маркеры. -М.: Колос.-.1983.- 231 с.

37. Конарев В. Г. Вид как биологическая система в эволюции и селекции. Биохимические и молекулярно-биологические аспекты.- Санкт-Петербург, ВИР. 1995. - 161 с.

38. Мелентьев А.И., Ямалеев A.M., Ибрагимов Р.И., Исаев Р.Ф. Сродство к углеводам и лектиноподобная активность ингибиторов трипсина из семян пшеницы в связи с устойчивостью к фитопатогенным грибам // Сельхоз. биология. 1986.- № 12. - С .52-54.

39. Метлицкий JI.B., . Дьяков Ю.Т., Озерецковская O.JI. Индукторно-супрессорная гипотеза фитоиммунитета // Журнал общ. биол. 1986.- Т. 47, №3.-С. 748-758.

40. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы протеолитических ферментовкак регуляторы процессов протеолиза.- М.: Наука.-1983.- 40 с.

41. Мосолов В.В. Белки ингибиторы протеаз и а - амилаз у растений (Обзор) // Прикл.биохим. и микробиол.- 1995.-Т. 31, № 1 .- С. 5-10.

42. Мосолов В.В. Ингибиторы протеолитических ферментов в растениях // Вопросы мед. химии. 1987.- Т. 336 № 5. - С. 52-56.

43. Мосолов В.В. Механизмы контроля протеолиза // Успехи биологической химии Т.28. -М.: Наука.- 1988.- 125 с.

44. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука,-1971.- 414 с.

45. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов. М.: ВИНИТИ.-1993.- 207 с. ,

46. Мосолов В.В., Колосова Г.В., Валуева Т.А., Дронова J1.A. Ингибитор трипсина из семян гледичии (Gleditsia triacanthos L.) // Биохимия 1982. - Т. 47, № 5. - С. 797-802

47. Мосолов В.В., Малова E.JL,Валуева Т.А., Шульмина А.И. // Биоорган-нич. химия.- 1975. Т. 1, № 10. - С. 1449-1457.

48. Практикум по биохимии. Под ред. С.Е.Северина и Г.А.Соловьевой. -М., Изд-во МГУ.- 1989.- 508 с.

49. Рубин Б.А., Арциховская Е.В., Аксенова В.А. Биохимия и физиология иммунитета. М.: Высш. школа.- 1975.- 320 с.

50. Тарчевский И.А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липи-дов // Физиология растений.- 1992. Т. 39. № 6.- С. 1215 1223.

51. Тарчевский И.А. Катаболизм и стресс у растений. 52 Тимирязевские чтения. М.: Наука. 1993. 80 с.

52. Шульгин М.И. Ингибиторы протеиназ микроорганизмов в семенах пшеницы, ржи, тритикале // Автореф. дисс. канд.биол.наук. М.- 1985.- 21 с.

53. Элпидина E.H., Воскобойникова Н.Е., Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е. Обнаружение в белковых телах семян гречихи металлопротеиназы и ее ингибитора // Биохимия.- 1990.- Т.55, № 4.- С. 734 -744.

54. Ямалеев A.M., Муксинов В.Х., Исаев Р.Ф. и др. Активность ингибиторов протеаз в семенах пшеницы в связи с устойчивостью к твердой головне // Сельхоз. биол.- 1980.- Т. 15, № 1. С.143-144.

55. Яшина И.М. Генетические и методические аспекты традиционной селекции картофеля на устойчивость к колорадскому жуку // Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.- С. 102-107

56. АЬе К., Arai S., Kato Н., Fuimaki Н. Thiol-protease inhibitors occuring endosperm of corn // Agrie. Biol. Chem. 1980.- V. 44, N 3. - P.685-687.

57. Abe K., Emori Y., Kondo H. et al. Molecular cloning of a cysteine proteinase inhibitor of rice (Oryzocystatin) // J. Biol. Chem. 1987, 262, N 35, P. 1679316797.

58. Ambrose L.Ch., PatricK Y., Vincent A. F. A method to detect proteinase activity using unprocessed X-ray films // Anal. Biochem. 1991. - V. 193, N l.-P. 20-23.

59. Appelbaum S.W., Konijn A.M. The presence of a tribolium -protease inhibitor in wheat //J. Incekt. Physiol.-1966.- V.4, N 12.- P. 665 -669.

60. Birk Y. Structure -activity relationoships of several trypsin and chymotrypsin inhibitors from legume seeds // Bayer-Symp. y. Proteinase Inhibit.- Berlin e.a.- 1974.- P. 355-361.

61. Boisen S. Protease inhibitors in cereals // Acta Agricult. Scand. 1983. - V. 33, N2.-P. 369-381.

62. Boisen S., Djurtoft R. Trypsin inhibitors from rye endosperm. Purification and properties // Cereal Chem. 1981. - V. 58, N 2. - P. 194-198.

63. BoIlerT., Vogeli U. Vacuolar localisation of ethylene-induced chitinase in bean leaves // Plant Physiol.- 1984.- V. 84, N 2. P. 442-444.

64. Bradford M.M. A rapide and sensetive method for the quantitasion of microgramm quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 172, N 1. - P. 248 - 254.

65. Brown W.E., Ryan C.A. Isolation and characterisation of wound-induced trypsin inhibitor from alfalfa leaves // Biochem. 1984.- V. 23, N 15. - P. 3418-3422.

66. Brown W.E., Takio K., Titani K., Ryan C.A. Wound-induced trypsin inhibitor in alfalfa leaves: Identify as member of the Bowman-Birk inhibitor family // Biochemistry. -1985.- V. 24, N 9 . -P. 2105 -2108.

67. Bryant J., Green T., Gurusaddaiah T., Ryan C. A. Proteinase inhibitor II from potato: Isolation and characterisation of the isoinhibitor subunits // Biochemistry. 1976. - V. 15. - P. 3418 - 3423.

68. Bryant J., Green T., Gurusaddaiah T., Ryan C.A. Proteinase inhibitor II from potatoe: Isolation and characterisation of the isoinhibitor subunits // Biochemistry. -1976.- V. 15, N .- P. 3418 3423.

69. Chrispeels M., Baumgartner B. Trypsin inhibitors in mung bean cotyledons // Plant Physiol. 1978.- V. 61, N 4. - P. 617-623.

70. Erlanger B.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes of trypsin // Arch. Biochem. Biophys.-1961.- V. 95, N2.- P. 271-278.

71. Farland P., Ryan C.A. Proteinase inhibitor inducing factor in plant leaves // Plant Physiol. 1974.- V. 54, N 5. - P. 706-711.

72. Garcia-01medo F., Salcedo G., Sanchez-Monge R. et al. // Oxf. Surv. Plant Mol. Cell Biol.- 1987.-V.4.-P.275-334.

73. Gatehouse A.M., Gatehouse I.A., Dobie P. Biochemical basis of insect resistance in Vigna Unguqulata // J. Sci. Food Agric. 1979.- V. 30, N 2. - P. 369-381.

74. Graham J.S., Hall G., Pearce G., Ryan C.A. Regulation of synthesis of proteinase inhibitors I and II mRNAs in leaves of wounded tomato plants // Planta.- 1986.-V. 169, N .-P. 399-405.

75. Graham J.S., Ryan C.A. Accumulation of metallo-carboxypeptidase inhibitor in leaves of wounded potato plants // Biochem. Biophys. Res.Commun. -1981. -V.101,N4.- P. 1164-1170.

76. Green T.R., Ryan C.A. Wound- induced proteinase inhibitor of plant leaves. A possible defence mechanism against insects //Science. 1972.- V. 175, N 5.- P. 776 -777.

77. Hadviger L., Becman Jm. Chitosan as cxomponent of pea -Fusarium -solani interactions //Plant Physiol. 1980.- V. 66, N 2. - P. 205-211.

78. Halim R.H., Mitchell H.L, Wassom C.E. Trypsin inhibitors of corn (Zea mays) // Trans. Kans. Acad. Sci. 1973.- V.76, N 2. - P. 289-293.

79. Halim R.H., Wassom C.E., Mitchell H.L., Edmans L.K. Supression of fungal growth by isolated trypsin inhibitors of corn grain //J. Agric. Food. Chem. -1973.-V. 21,N6.-P. 1118-1119.

80. Hobday S.W., Thurman D.A., Barker D.I. Proteolytic and trypsih-inhibitory activities in extracts of germination Pisum sativum seeds // Phytochem. -1973.-V. 12, N5.-P. 1041-1046.

81. Hollander Czytko H., Andersen J.K., Ryan C.A. Vacuolar localisation of wound-induced carboxypeptidase inhibitor in potato leaves // Plant Physiol. -1985.-V. 78, N1.-P. 76-79.

82. Hwang D.L.R., Yang N.K., Foard D.E. Rapid release of protease inhibitors from soybeans. Immunochemical quantitation and parallels with lectins // Plant Physiol. 1978.- V.61,N 1.- P. 30-34.

83. Johnson R., Narvaez J., An G., Ryan C.A. // Expression of proteinase inhibitors I and II in transgenic tobacco plants: Effects on natural defense against Manduca sexta larvae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 89, N 3 .-P. 9871 -9875.

84. Joubert F.I. Purification and properties of proteinase inhibitors from Erythrina coocaldendron seeds // Phytochemistry. -1988.- V. 27, N 5. P. 1297-1300.

85. Kirsi M., Micola I. Occurence of proteolytic inhibitors in various tissues of barley // Planta.- 1971. V.96, N 4. - P.281 -291.

86. Kirsi M., Micola I. Occurence and heterogenity of chymotrypsin inhibitors in vegetative tissues of barley // Physiol. Plant.- 1977. V.39, N 1. - P. 110-114.

87. Kiyochura T., Iwasaki T., Yoshikawa M. Chemical and physicjchemical characterisation of potato proteinase inhibitor I and comparison of its spesifity with those of inhibitors IIa and II b // J. Biol. Chem.- 1973 V. 73, N 1.- P. 89-95.

88. Kunitz M. Crystalline soybean trypsin inhibitor. 2. General properties I I J. Gen. Physiol. -1947. -V.30, N 2. P.291 -310.

89. Laskowski M.Jr., Kato I. Protein inhibitors of proteinases // Ann. Rev. Biochem. -1980.- V.49, N 2.- P. 593-626.

90. Lin W.N., Wittenbach W.A. Subsellular localisation of proteases in wheat and corrn mesophyl protoplasts // Plant Physiol.-1981.- V. 67, N 5. P. 969972.

91. Lyons A., Richardson M., Tatham A.S., Shewry P.R. Characterisation of homologous inhibitors of trypsin and a-amilase from seeds of rye ( Secale cereale L.)//Biochem. Biophys. Acta. 1987. - V. 915, N 2. P. 305-313.

92. Micola I., Kirsi M. Differences between endospermal and embryonal trypsin inhibitors in barley , wheat and rye . // Acta Chem. Scand. -1972.- V. 26, № 5. P. 787-795.

93. Micola I., Kirsi M. Differences between endospermal and embryonal trypsin inhibitors in barley, wheat and rye // Acta Chem. Scand. 1972. - V. 26, N 5. -P. 787-795.

94. Micola J., Suolinna E.M. Purification and properties of an inhibitor of microbial alkaline proteinases // Arch. Biochem. and Biophys. 1971. -V.144, N 2. - P. 566-575.

95. Miege M.M., Muscherpa I.M. Isolation and analysis of protein bodies from cotyledons of Labbab purpureus and Phaseolus vulgaris (Leguminose) // Physiol. Plantarum.- 1976.- V. 37, N 3. P. 229-238,

96. Mitsunaga T. Some properties of protease inhibitors in wheat grain // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1974. - V. 20, N 1. - P. 153-159.

97. Mosolov V.V., Loginova M.D., Fedurkina, Benken I.I. The biological signiticance of proteinase inhibitors in plants // Plant Sci. Lett.- 1976.- V.7, N2, P. 77-80.

98. Mundy J., Hejgaard J, Svendsen I. Characterisation of a bifunctional wheat inhibitor of endogenous a-amilase and subtilisin // FEBS Letters. 1984.- V. 167, N2.-P. 210-215.

99. Mundy J., Svendsen I, Hejgaard J. Barley a-amilase /subtilisin inhibitor. I. Isolation and characterisation // Carlsberg. Res. Communs. 1983. - V. 48, N 2.-P. 81-90.

100. Nagasue A., Fukamachi H., Ikenaka H., Funatsu C. The amino acid sequence of barley rootle trypsin inhibitors // Agric. Biol. Chem. 1988,- V. 52, N6.-P. 1505-1514.

101. Negreiros A.N., Corvalro M.M., Fillho J. et all. Studies of trypsin inhibitor in barley. Purification and properties // Phytochemistry, 1991, 30, N 9, P. 2829-2933.

102. Odani S., Ono T., Ikenaka T. Proteinase inhibitors from Mimosoideae legume. Homologues of soybean trypsin inhibitor (Kunitz) // J. Biochem.-1979.- V. 86, N6.-P. 1795- 1805.

103. Odani S., Ikenaka T. Change of inhibitory activity of Bowman -Birk inhibitor upon repllasement of the chymotrypsin reactive site serine residue by other amino-acids//J. Biochem.- 1978.- V. 84, N 1.- P. 1-9.

104. Odani S., Ikenaka T. Seission of soybean Bowman-Birk proteinase inhibitor into two small fragments having either trypsin or chymotrypsin activity // J. Biochem. 1973. - V. 74, N 4. - P. 857-861.

105. Odani S., Ikenaka T. Studies of soybean trypsin inhibitors. III. Isolation and sequence determination of tryptic peptides of Bowman -Birk soybean proteinase inhibitor // J. Biochem.- 1972.- V. 71, N 5.- P. 319-838.

106. Odani S., Ikenaka T. Studies of soybean trypsin inhibitors. IY. Complete amino acid sequence and anti-proteinase sites of Bowman -Birk soybean proteinase inhibitor//J. Biochem.- 1972.- V. 71, N 5.- P.839-848.

107. Odani S., Ikenaka T. Studies of soybean trypsin inhibitors. X. Isolation and partial characterisation of four soybean double-headed proteinase inhibitors // J. Biochem.- 1977.- V. 82, N 6.- P. 1523- 1531.

108. Odani S., Koide T., Ono T. Purification and characterisation of proteinase inhibitors from Phaseolus angularis //J.Biochem.- 1986.-V.100, N 4.- P. 975983.

109. Paulot V., Holzer F.M., Walling L.L. Differentional expression of tomato proteinse inhibitor I and II genes during pathogen invasion and wounding // Molecular Plant-Microbe Interaction.- 1991.- V. 4, N 3.- P. 284-292.

110. Pearse G., Johnson S., Ryan C.A. Purification and characterisation from tobacco (Nicotian tabacum) leaves of six small, wound-inducible isoinhibitors of the potato inhibitor II family // Plant Physiol. 1993.- V. 102, N 3.- P. 639644.

111. Pearse R.B., Ride J.P. Chitin and related compounds as elisitors of lignification response in woundeed wheat leaves // Physiol. Plant. Pathol. -1982.-V. 20, N1.-P. 119-123.

112. Plunkett G., Ryan C.A. Proteinase inhibitors from I and II from leaves of Wounded tomato plants: purification and properties // J. Biol. Chem. 1982 -V. 213, N 2.- P.463-472.

113. Plunkett G., Senear D.F., Zuroske G., Ryan C.A. Proteinase inhibitors I and II from leaves of wounded tomato plants: purification and properties //Arch.Biochem. Biophys. -1982. V. 213, N 3 . - P. 463-472.

114. Polanowski A., Otlewski J., Leluk J. et al. A new family of serine proteinase inhibitors from squash seeds // Biol. Zent. Bl. 1988. - V. 107, N 1. - P. 4549.

115. Polanowsky A., Cieslar E., Leluk et all. Protein inhibitors of trypsin from the seeds of Cucurbitaceae plants // Acta Biochem. Pol. 1987. - V. 34, N 4. -P. 395-406.

116. Richardson M. Protein inhibitors of enzymes // Food Chem.- 1981.- V. 6, N 3.- P. 325-253 (обзор)

117. Richardson M. The proteinase inhibitors of plants and microorganisms //Phytochemistry.- 1977.-V. 16, N l.-P. 159-169.

118. Richardson M., Compos F., Xavier-Tilho C. et all. Chymotrypsin inhibitor from potatoes: interactions with target ensymes // Biochem et Biophys. Acta,1986, 872, N 1, P. 184-192.

119. Richardson M., Cossins L. The protelytic inhibitory activity in potato tissues: purification of chymotrypsin inhibitor // FEBS Letters. 1975. - V. 45,N l.-P. 11-13.

120. Ryan C.A. Oligosacharide signalling in plants // Ann. Rev. Cell Biol.1987.-V.3.N2.-P. 243 -245.

121. Ryan C.A. Proteinase inhibitors // Biochemistry of plants / Ed. By A.Marcus. Orlando: Acad.Press. 1981. - P. 531-357.

122. Ryan C.A. Proteolytic enzymes and their inhibitors of plants // Ann.Rev. Plant Physiol. -1973. V. 24, N 1. P.173 -196.

123. Ryan C.A. The searh for the proteinase inhibitor-inducing factor, PIIF //t

124. Plant Mol. Biol. 1992.- V. 19, N 1. - P. 123-133.

125. Ryan C.A., An G. Molecular biology of wound-inducible proteinase inhibitors in plants // Plant Cell and Enviroment. 1988.- V.l 1, N 2. - P. 345349.

126. Ryan C.A., Kuo Т., Pearce G., Kunkel R. Variability in the consentration of thre heat stable proteinase inhibitor from potato tubers // Am. Potato J.-1976-V. 53, N12.- P.433-455.

127. Shumway L.K., Cheng V., Ryan C.A. Evidence the presence of proteinase inhibitor I in plant cell vacuolar protein bodies // Planta.- 1976.- V. 129, N 2 .-P. 161-165.

128. Shumway L. K., Cheng V., Ryan C.A. Vacuolar protein in apical and flower-petal cells//Planta.- 1972.-V. 106 , N 4 .-P. 279-290.

129. Svendsen I., Iohassen I. Amino dcid sequence homology between a serine protease inhibitor from barley and potato inhibitor I // Biochem. Soc. Trans. -1981.- V. 9, N2.- P.265-267.

130. Tashiro M., Azao T., Hirata C. et al. Purification and characterisation of major trypsin inhibitor FMTJ -II, from foxtail millet grain // J. Biochem.-1990.- V. 108, N 4.- P. 669- 672.

131. Valueva T.A., Shulgin M.N. Isolation and characterisation of protein inhibitors of microbial proteinases from cereal seeds // Biol. Zent. Bl.- 1988.-V. 107, N 1.- P. 51-52.

132. Walker Simmons M., Ryan C.A. Proteinase inhibitor synthesis in tomato leaves. Induction by chitosan oligomers and chemically modified chitosan and chitin // Plant Physiol. - 1984.- V. 76, N 3. - P. 787-790.

133. Wilson K.A. The release of proteinase inhibitors from legume seeds during germination // Phytochemistry.- 1980.-V. 19, N 12.- P. 2517-2519.

134. Wilson K.A., Chen I.C. Amino acid sequence of a mung bean trypsin inhibitor and its modified forms appearing during germination .// Plant Physiol. 1983. - V. 71, N 2. - P. 341-349.

135. Yoshikawa M., Kiyochura T., Iwasaki T. et al. Isolation and some properties of two fragments with inhibitory activity obtained from adzukibean proteinase inhibitor by peptic digestion // J. Biochem.- 1980.- V. 87, N 2.-P. 619-627.

136. Zhong-Kui Z., Jin-Ku В., Hong Z., Weng-Shen X. Молекулярная модификация ингибитора цистеиновой протеиназы из семян риса и ингиби-рование им пирикуляриоза риса // Chin. Biochem. J. 1996. - V. 12, N 6.-Р. 709-714.