Диссертации » Биологические науки » Физиология и биохимия растений

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гидролитические ферменты и их ингибиторы как компоненты системы "насекомое-фитофаг-растение"
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гидролитические ферменты и их ингибиторы как компоненты системы "насекомое-фитофаг-растение""

На правах рукописи

ООЗОВТБТ1

Шпирная Ирина Андреевна

ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И ИХ ИНГИБИТОРЫ КАК КОМПОНЕНТЫ СИСТЕМЫ «НАСЕКОМОЕ-ФИТОФАГ - РАСТЕНИЕ»

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА - 2006

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ибрагимов Ринат Исмагилович

Официальные оппопенты: доктор биологических наук, профессор

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И.Вавилова РАСХН (г. Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится "24" января 2007 г. в " 14 " часов на заседании диссертационного совета Д212.013.11 при Башкирском государственном университете по адресу : 450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32, биологический факультет, ауд. 332.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан " декабря 2006 г.

Ишмухаметова Диляра Галимовна доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук, профессор

J

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Способность приспосабливаться к конкретным условиям окружающей среды (адаптивность) - одно из важнейших свойств растительного организма. Адаптивные изменения в структуре и функциях клетки заложены во множественности локусов и в аллельной структуре гена, что обеспечивает адекватные условиям произрастания популяций варианты адаптивных белков (Конарев, 2000). К таким белкам относятся также ингибиторы, подавляющие активность гидролитических ферментов в первую очередь, протеиназ и амилаз. Они обнаружены в семенах и вегетативных органах культурных растений различных семейств (Mosolov, 1986; Ishikawa et al.,1994; Ohsubo, 1992; Hung et al., 1994; Gruden et al., 1997; Heibges, Salamini., 2003). Широкое распространение и содержание ингибиторов в значительных количествах в растительных тканях позволяют говорить о них как об одном из важных звеньев в регуляции физиологических и патологических процессов. В практическом плане интерес представляют белки, способные подавлять активность чужеродных гидролаз: ферментов насекомых-вредителей, патогенных микроорганизмов, млекопитающих (Конарев Ал.В., 1986; Валуева, 2002; 2004).

Для получения конкретных сведений о роли белков - ингибиторов гидролаз в устойчивости растений необходимы детальные исследования, как самих ингибиторов, так и гидролитических ферментов организмов-фитофагов, на которые направлено их действие. Удобной моделью для этого может служить естественная система «гидролазы колорадского жука - белковые ингибиторы картофеля». Исследование системы позволит получить экспериментальный материал о физиологических и биохимических механизмах взаимоотношений насекомого-вредителя и растения.

Цель и задачи исследований. Цель проводимых исследований заключалась в выявлении закономерностей взаимодействия экзогенных гидролаз и растительных ингибиторов в системе «колорадский жук -

картофель». В связи с этим были сформулированы следующие задачи:

- разработка методов определения активности гидролаз и их ингибиторов;

- определение уровня активности гидролитических ферментов в тканях личинок колорадского жука;

- определение уровня содержания ингибиторов гидролаз в тканях картофеля у сортов с различной степенью устойчивости к колорадскому жуку;

- исследование ингибиторов гидролаз колорадского жука в растениях различных семейств;

- исследование колебаний активности ингибиторов в клубнях и листьях картофеля при действии стрессовых факторов и препаратов-биорегуляторов.

Научная новизна. Разработаны новые методы определения активности протеиназ и амилаз, их ингибиторов. Впервые получены сведения об уровне активности ингибиторов протеиназ и амилаз личинок колорадского жука в тканях растений различных семейств.

Практическая значимость. Разработанные методы могут быть использованы при создании экспресс-тестов для измерения прогеолитической, амилазной активности, активности ингибиторов ферментов в области экологии, сельского хозяйства, микробиологии. Показатель уровня активности ингибиторов гидролаз насекомых-фитофагов предлагается использовать в качестве критерия для оценки эффективности препаратов-биорегуляторов, используемых для защиты растений.

Апробация результатов. Результаты исследований были представлены на конференции «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины» (Самара, 2005); конференции «Генетика, молекулярная биология и биохимия сельскохозяйственных животных» (Гагра, 2005); третьем съезде общества биотехнологов России (Москва, 2005); 10-й школе - конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино. 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Перспективы агропромышленного производства регионов

России» (Уфа, 2006); 1 (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт- Петербург, 2006); втором Международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений» (Казань. 2006); X Международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературных данных, описания объектов и методов исследований, изложения и обсуждения результатов исследований, выводов. Список литературы включает 210 наименований, в том числе 138 - на иностранных языках. Работа изложена на 112 страницах и содержит 17 таблиц и 8 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В экспериментах были использованы клубни, листья различных сортов картофеля (Solanum tyberosiim L.), листья и корнеплоды моркови (Daiicus carota), листья и плоды томата (Solanum lycopersicum), листья баклажана {Solamim melongena), люцерны (Medicago saliva), одуванчика (Taraxacum sp.), тополя (Populus nigra Z..), проростки пшеницы (Triticiim aestivum L).

Личинки колорадского жука Leplinotarsa decenilineata (IV стадия развития) собирали на вегетирующих растениях картофеля, в полевых условиях.

Белки-ингибиторы из растений, протеиназы и амилазы из тканей личинок экстрагировали 0,05М трис-НС1-буфером, рН-8,2, дистиллированной водой. Объем экстрагента для каждого обьекта подбирали экспериментально, Активность иротеолитических фермеИтон определяли по гидролизу Ы,й-бензоил-13Ь-аргинин44Ц1троанилида (БАПНА) (Erlanger, Kokowski, Cohen, 1961) и по гидролизу белковых субстратов в агарозном геле, активность амилаз - по гидролизу крахмала в агарозном геле (см. глава 2). Активность ингибиторов гидролаз определяли по торможению скорости гидролиза субстратов.

Для определения концентрации белка в растворах использовали метод М. Бредфорд (Bradford. 1976). Калибровочную кривую составляли по а-химотрипсину. Гель - хроматографическое разделение смеси белков проводили на сефадексе G-75. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Exel (Microsoft Office).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение активности гидролитических ферментов и их ингибиторов

по гидролизу субстратов в агарозном геле (разработка методов)

Для определения активности протеиназ в качестве субстратов использовали желатин, казеин, гемоглобин, яичный белок, иммобилизованные в 2% гель агарозы. Для приготовления гелевой пластины, содержащей желатин или казеин, порошок агарозы растворяли в I % растворе белка. Смесь окрашивали бромфеноловым синим. Затем 20 мл геля остывшего до 45°С заливали в пластиковую кювету размером 12,5*8,5 см с бортиками высотой 0,5 см (крышка от иммунологического планшета) на строго горизонтальной поверхности. Для формирования устойчивого геля, пластины выдерживали при температуре 4° С, в течение 30 мин. Далее, в пластине вырезали лунки диаметром 4 мм. Для осуществления реакции гидролиза иммобилизованного субстрата, ферментный раствор (20 мкл) заливали в лунки, гелевую пластину накрывали крышкой планшета и иикубировали в течение 14 час, при 37 °С. Молекулы фермента из раствора диффундировали в гель и гидролизовали субстрат вокруг лунки. Соответственно, участки геля вокруг лунок осветлялись, за счет разрушения комплекса субстрат-краситель. Скорость диффузии молекул фермента в геле пропорциональна его исходной концентрации в растворе. Следовательно, размер площади гидролизованного участка зависит от концентрации молекул фермента в лунке и отражает его активность. Реакцию гидролиза белковых субстратов прекращали, обрабатывая пластины 30% раствором уксусной кислоты.

На рис. 1 представлены данные измерения активности растворов трипсина различных концентраций на агарозной пластине с желатином. Как видно, размер гидролизованного участка геля вокруг лунки зависит от начальной концентрации фермента в лунке. В интервале концентраций трипсина 50500 мкг/мл, активность фермента повышается пропорционально увеличению его концентрации в инкубационной среде.

Рис. I. Гидролиз желатина в составе агарозной пластины трипсином при различных концентрациях фермента. Ось абцисс - концентрация трисина: ось орлинат-площадь гидролиза.

О 100 200 300 400 500

Белок, мкг/мл

Активность фермента рассчитывали, измеряя площадь гидролизованного участка вокруг лунки. За I миллиединицу активности (мЕ) принимали такое количество фермента, которое гидролизовало участок геля размером I мм2.

Данная процедура позволяет определять активность протеолитических ферментов различного происхождения с использованием различных белковых субстратов (таб/1.1),

Таблица I

Интенсивность гидролиза различных белковых субстратов протеиназами (размер гидролизованного участка геля, мм")

Протеипаза Субстрат

желатин казеин гемоглобин яичный белок

Контроль (вода) 0 0 0 0

Пропаза Е (1 мг/мл) 4!5.3±2.8 314,0±2.3 3 14,0±1,2 226,9±2.2

Трипсин (1 мг/мл) 201,0± 1,9 283.4±2.9 176,6±1.3 0

Экстракт личинок КЖ 132,7*0,8 50.3±0.3 I 13,1±1,2 132,7±0.5

Химотрипсин (1 мг/мл) 113.1 ±3 * 226,9±1,7 0

*- данные отсутствуют

Как видно из таблицы, протеиназы микроорганизмов, насекомых, млекопитающих интенсивно расщепляли желатин, казеин, гемоглобин. При использовании в качестве субстрата яичного белка, активность трипсина и химотрипсина не проявлялась. По-видимому, она полностью подавлялась мукопротеидами яичного белка, которые являются эффективными ингибиторами этих ферментов (Мосолов, 1971;Велобова, 1993). Параллельно с измерением протеолитической активности, метод позволяет определять и активность ингибиторов этих ферментов (рис.2). Для этого необходимо провести реакции гидролиза субстрата ферментом в контакте с ингибитором и ферментом без ингибитора (контроль).

За 1 миллиединицу активности ингибитора (мИЕ) принимали такое его количество, которое подавляло 1 мЕ активности фермента.

Как видно, соевый ингибитор трипсина эффективно подавляет активность трипсина при гидролизе казеина, и желатины и не оказывает влияния на активность проназы Е.

А-трипсин, субстрат желатин Б - трипсин, субстрат казеин

В - проказа, субстрат желатин Г- проката, субстрат казеин

Рис. 2. I ^давление am иипосги фишлпга и itpoiia tu I. соевым жиноиюром грипсийа (S 11).

Примечание: ¡ фермем^ 1 мгли: 2 - ф. 1 мг/мл + Sil (I \nAu): .1 - ф. 0.1 MKI- мл: 4- ф. 0,1 vkt'm.i + SÏI (0. ! vit" чд| 3 ■ ф. 0,01 чг/мл: 6- ф. 0.01 МКГ'/Л)Л+ STI (0.01 mi м.О.

Для измерения активное! il амилаз и их ингибиторов использовали а га розны с i елевые п. iác i нны с 2 "о содержанием крахмала. Для форм irpouai тя (аких пластин смесь ai ар о ш и крахмала кипя гили до

растворения крахмала, разливали на пластины и выдерживали в холодильной камере при 4 "С. 11о истечении времени инкубации с ферментом, помещали й раствор Люголя. Пластина приобретала синюю окраску, участки геля с гйдролиЗОВаниьМ крал малом, красителем не окрашивались (рис.3). Как видно, ферменты слюнной жидкости и личинок КЖ способны гидролидавать крахмал, ичшймтл!(сланный в агйрозный гель, 11ри концентрации белка в слюнной жидкости и 150: 270. 500 мкг/мл, размер г идрол изова н нш участков геля составляет, соответственно 105; 210; 320 мм~

Рие.З, Вид агарозной и ластики с крахмалом при определении активности амилаз из слюнной Жидкости человека. и тканей личинок колорадского жука, а- экстракт ЛЮК: о- вода; в, г. д - слюна человека с коипентран. белка 150: 270: 500 мкг/мл

Опыты с амилазой слюнной жидкости, показывают, что прямо пропорциональная зависимость между концентрацией белка в растворе и размером участка геля с гидролизованным крахмалом наблюдается в интервале от Г© до 500 мг/мл белка.

Таким образом, разработанные методы позволяют обнаружить и измерить активность протеолитпческих. амнлолптпчеекпх ферментов и их ингибиторов im различных биологических источников. Процедура проведения эксперименту проста и досг) пна, не ipeoyci сложною оборудования и специальных приборов. Методы характеризуются

высокой чувствительностью (нижний предел определения активности для коммерческих препаратов трипсина и проназы составил 0,5 мкг/мл). Для определения активности используются микрообъемы ферментных растворов (10-20 мкл), не требуется дополнительной очистки экстрактов. Предложенные методы позволяют варьировать составом инкубационной среды и измерять активность амилаз, всех протеиназ, способных гидролизовать используемые субстраты, а также определять активность их ингибиторов. Результаты определения активности ферментов и их ингибиторов наглядны, пластинки с гелем легко сканировать или фотографировать. Перечисленные преимущества позволяют считать предложенные процедуры определения гидролаз и их ингибиторов перспективными, для проведения экспресс анализов в научных исследованиях и решения практических задач в области медицины, микробиологии, сельского хозяйства, экологии и др.

Выделение, очистка, активность, субстратная специфичность протеолитических ферментов личинок колорадского жука

Наибольшая активность протеиназ личинок колорадского жука, гидролизующих субстрат БАПНА, выявлялась при использовании в качестве экстрагента дистиллированной воды. Для получения концентрированных растворов, обладающих высокой протеолитической активностью, использовали методы осаждения белков органическими растворителями и неорганическими солями. Высокая активность протеиназ сохраняется при осаждении белков ацетоном в объемном соотношении экстракт: ацетон 3:1. В результате гель - хроматографического разделения белков на колонках с сефадексом С-75 выявляются несколько фракций, обладающих протеолитической активностью (рис. 4). Как видно, после разделения белков, осажденных ацетоном, определяется 4 пика с активностями 14,6; 16,0; 17,1 и 21,9 Е/мг белка.

25

-4— 1 .Белок осажденный

сульфатом аммония - - -экстракт

■й— Белок осажденный ацетоном(3:1)

♦ ♦ Л 1 к^ь*4» А

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 номер фракции

Рис. 4. Гель - хроматографическое разделение водорастворимых белков личинок колорадского жука на колонке с сефадексом 0-75. Объем колонки 60 мл. Сбор фракций по 5 мл, скорость элюции 1.0 мл/мин. Элюат - дистиллированная вода. 1.Белки водного экстракта. 2. Белки, осажденные 90 % сульфатом аммония. 3. Белки, осажденные ацетоном.

Наши эксперименты показали, что протеолитические ферменты личинок КЖ обладают широкой субстратной специфичностью, проявляют высокую активность по отношению к синтетическому субстрату БАПНА, способны гидролизовать различные белковые субстраты: казеин, гемоглобин, желатин, яичный белок (рис.5). Как видно, активность протеиназ ЛКЖ по отношению к этим субстратам определяется на уровне, сопоставимом с активностью высокоочищенных коммерческих препаратов протеиназ.

25

20

Г5

я а

¡а

0 проиаза Е □ трипсин

П экстракт тканей пичинок К Ж

Рис.5. Актиимосгь ироссоли!ических ферментов по отношению к различным бел ко и ым субстратам \ [ринечание: ось абцисс - белковые субстраты, ось ординат - активность фермента, Е/мл раствора.

казеин гемоглобин яичный белок Субстрат

Подавление протеолитической и амилазной активности личинок колорадского мука белками-ингибиторами из растений.

Нашей задачей являлась оценка уровня активности белков в различных органах картофеля, подавляющих активность ферментов Личинок КЖ, Для исследования были взяты сорта картофеля, различающиеся по устойчивости к колорадскому жуку. В клубнях, листьях, стеблях растений картофеля выявляются ингибиторы, подавляющие п роте о лит и чес кую активность личинок КЖ. Наибольшая активность этих белков определяется в стеблях картофеля (табл. 2). Показатель удельной активности ингибиторов иротеиназы личинок КЖ в стеблях картофеля изученных сортов изменяется от 2,4 до 4,3 мИЕ/мг белка, В целом, уровень активности ингибиторов проназы Е в клубнях, листьях картофеля значительно выше, чем уровень ингибиторов прогеиназ личинок КЖ. Стебли картофеля, напротив, характеризуются большей активностью ингибиторов протеиназ личинок КЖ.

14

Таблица 2

Активность ингибиторов протеиназ в стебля* сортов картофеля, различающихся по устойчивости к колорадскому жуку

Сор г Ингибиторы

1 [роназы Е БАПНА-азы ЛКЖ

ИК/i массы мИЕ/мг белка ИI V t массы мИЕ/мг бедка

Невским (ну) 0 0 0.56+0.04 4,1+0.2

Луговской (су) 0,08+0,002 0,6+0.04 0.3+0.01 2,4+0.1

Романо (су) 0.08+0.002 0.8+0,07 0.11J 0,02 4.3+0.3

Удача (у) 0,4 ±0.02 2.3+0.15 0,42+0.02 2.6+0.1

Снегирь (у) 0.3±0,01 2.2+0,01 0,56+0.04 4,1+0.3

Примечание: ну - неустойчивый, су - сред неустойчивый, устойчивый сорта картофеля

Вегетативные органы изученных сортов картофеля незначительно отличаются по активности ингибиторов протеиназ. Между уровнем активности ингибиторов протеина! личинок КЖ в органах картофеля и устойчивостью исследованных сортов к колорадскому жуку корреляции не выявлено. Как уже отмечалось, белки из разных органов картофеля неодинаково подавляют активность проназы Е и протеиназ личннок КЖ. Более наглядно эта закономерность проявляется при анализе средних значений показателей активности ингибиторов протеиназ у 5 сортов картофеля (рис.6).

Рис.6. Активность

ингибиторов проназы Ё и протеиназ ы ЛКЖ и:! вегетативных органов картофеля (средние арифметические данные по пяти исследованным сортам).

Ось ординат - активность ингибиторов МИЕ/мг белка: ось аСщисе-вегетативные орган to картофел я.

О мшмбш оры проназы Виигмбиторы прогемназы ЛКЖ

Высокая активность ингибиторов проназы характерна для этиолированных проростков клубней и клубней картофеля. В стеблях и листьях их активность значительно ниже, а активность ингибиторов протеиназ личинок КЖ относительно высокая. Эти факты позволяют предположить, что в процессе роста и развития растений, имеет место последовательный синтез различных ингибиторов, отличающихся по специфичности действия, мишенью которых являются ферменты представителей разных групп организмов-фитофагов. Необходимо отметить, что белки листьев картофеля изученных сортов не подавляли желатингидролизующую активность протеиназ личинок КЖ (табл.3).

Таблица 3

Активность ингибиторов, ИЕ/г массы, желатиназы (Иж) и амилазы (Иа) личинок колорадского жука в различных сортах картофеля

Сорт клубни стебли листья

Иж Иа Иж Иа Иж Иа

Невский (ну) 4,5 12,5 4,2 3.8 0 0

Луговской (су) 8,6 10.0 3,0 3,7 0 0

Романо (су) 8,6 8,6 4,5 4.6 0 0

Удача (у) 4,5 10.0 4.5 7.1 0 0

Снегирь (у) 6,6 8,6 5,1 5,6 0 0

Примечание: активность гидролаз личинок колорадского жука (Е/г массы):

жслатиназа - 28,3; амилаза -19.6.

Антиамилолитическая активность в листьях картофеля нами также не обнаружена. Между тем, белки клубней и стеблей всех исследованных сортов подавляли определенную часть протеиназной и амилазной активности личинок КЖ. В связи с этим, представляло интерес определение уровня активности ингибиторов ферментов личинок КЖ у растений, не поражающихся колорадским жуком. Соответственно, нами проведен сравнительный анализ уровня активности ингибиторов проназы и ингибиторов протеиназ личинок КЖ в тканях 4 видов представителей семейства пасленовых и 4 видов растений других семейств (сложноцветные, ивовые, бобовые, зонтичные) (табл.4).

Таблица 4

Активность ингибиторов протеиназ (проназы Е, протеиназ личинок КЖ) в органах растений - представителей разных семейств

Вид растения Орган растения Ингибиторы

проназы Е протеиназы ЛКЖ

ИЕ/г массы ИЕ/мг белка ИЕ/г массы ИЕ/мг белка

Семейство Пасленовые

Томат (Solanum Iycopersicum) лист 1,2±0,09 4,6±0.36 0.54±0,03 2,1±0.17

плод 0 0 0.73* 8,1*

Баклажан (Solanum melongena) лист 1,4±0,12 6,1 ±0.45 0,22±0.011 0,96±0,05

Физалис (Physalis sp.) лист 0.36±0,01 1,6±0,09 0 0

Картофель (Solanum tuberosum) лист 0.74±0,05 2,8±0,18 0.3±0,019 1,12±0.07

проросток клубня 0,8±0,03 7,3±0,51 0,3±0,015 2,9±0,22

стебель 0,74±0,03 2,8±0,12 0,45±0,03 3,5±0,24

клубень 1,08±0,09 4,7±0,41 0,27±0,02 1,2±0,09

цветок 0,8±0,03 4,7±0,39 0,28±0,02 1,65±0,06

Другие семейства

Одуванчик (Taraxacum sp.) лист 1,5±0,21 8,8±0,35 0,36±0.02 2,1 ±0,14

Тополь (Populus nigra L.) лист 0 0 0,31±0,018 6,2±0,34

Люцерна (Medicago sativa) лист 0 0 0,24±0,01 0,92±0.03

Морковь (Daucus carota) лист 0,85±0,06 4,0±0,28 0,73* 4,6*

корнеплод 0 0 0,73* 4,5*

STI (ком. препарат) - 3,3* 3,3* 0,73* 0.73*

Примечание - Активность протеиназы ЛКЖ - 0,12 Е/мл; активность проназы Е - 0,56 Е/мл ; *-полное подавление активности протеиназы.

Как видно, уровень активности ингибиторов протеиназ в растительных тканях представителей изученных видов подвержен значительным колебаниям. Причем, активность ингибиторов в тканях разных органов одних и тех же растений, также существенно различается. При анализе данных (табл.4) прослеживается определенная закономерность: между активностью ингибиторов проназы Е и активностью ингибиторов протеиназ личинок КЖ в растительных объектах обратно пропорциональная связь. В тканях, характеризующихся отсутствием или

обладающих низкой активностью ингибиторов проназы Е, выявляется высокий уровень ингибиторов лротеиназ насекомых (личинок КЖ). Можно предположить, что низкая активность или отсутствие ингибиторов ферментов микроорганизмов, (в частности, ингибиторов проназы Е) в тканях, является одним из факторов низкой устойчивости растительных объектов к грибным и бактериальным поражениям.

Влияние факторов различной природы на активность ингибиторов протеинази ингибиторов амилаз в тканях растений

Возможность искусственного регулирования уровня ингибиторов гидролитических ферментов, открывает принципиально новые подходы к поиску защитных препаратов, стимулирующих естественные механизмы устойчивости растений. Активация генов ингибиторов чужеродных гидролаз, при обработке растений такими препаратами будет способствовать повышению их устойчивости к патогенным микроорганизмам и насекомым-вредителям. В этом разделе представлены данные об активности ингибиторов в клубнях и листьях картофеля при действии на них физических, химических, биотических факторов.

Как видно из таблицы 5, активность ингибиторов протеиназ в листьях картофеля повышается при действии низких температур, при механическом повреждении, при поедании растений личинками КЖ.

В практическом отношении важным является факт повышения активности ингибиторов ферментов при обработке растений раствором инсектицида Децис. Это свидетельствует о том, что обработка растений защитными препаратами не только подавляет жизнедеятельность организмов-фитофагов, но и стимулирует собственные механизмы защиты растительного организма. Важно, что антипротеолитическая активность повышалась и в частях растений, не контактировавших с физическим и химическим фактором.

Таблица 5

Изменение активности ингибиторов БАПНА - гидролизующих ферментов в листьях картофеля при воздействии различных факторов (сорт Элит)

Фактор воздействия на растение Вариант опыта Белок, м кг/мл Ингибиторы. ИЕ/г массы

Проназы Трипсина Протеиназы ЛКЖ

Без обработки Контроль 0,26 0.55±0,05 1,24±0,07 0,18±0,02

Личинки колорадского жука Поврежденные 0,26 0,82±0.03 1.73±0,09 0.27±0,01

Неповрежденные 0,26 0,95±0,03 1,6±0,09 0,3±0,03

Низкая температура 0,27 0,96±0,07 1,22±0,10 0,6±0,03

Механическое повреждение Поврежденные 0,3 1,15±0.1 !,45±0,03 0,4±0,03

Неповрежденные 0,26 0,38±0,04 1,33±0.04 0,55±0.05

Обработка препаратом «Децис» Обработанные 0,24 0.97±0,04 1,23±0,06 0,44±0,01

Необработанные 0,26 1.34±0.03 1,66±0,03 0,37±0.03

Выявленные закономерности, в целом, подтверждаются и при исследовании активности ингибиторов амилаз (табл.6). Как видно, при охлаждении, при механических и биотических повреждениях, в листьях картофеля проявляется активность ингибиторов, подавляющих амилазы личинок КЖ. При этом, в тканях неповрежденных растений, активность амилаз ЛЮК не определялась.

Таблица 6

Изменение активности ингибиторов амилаз в листьях картофеля (сорт Элит) при воздействии различных факторов

Фактор воздействия на растение Вариант опыта Ингибиторы, ИЕ/массы

амилазы ЛКЖ амилазы слюны

Без обработки Контроль 0 0

Личинки колорадского жука поврежденные 4,5 0

Неповрежденные 0 0

Низкая температура 4,5 0

Механическое повреждение поврежденные 4.5 0

неповрежденные 0 0

Обработка препаратом Децис обработанные 4,5 0

Необработанные 4.5 0

Примечание: Активность гидролаз, Е/массы амилазы личинок КЖ - 23,8; амилазы слюнной жидкости чел.- 25.9.

Нужно отметить, что белки из картофеля не подавляли активность амилаз слюны человека.

Таким образом, при действии на растения различных факторов значительно изменяется уровень активности ингибиторов, подавляющих активность прогеиназ, амилаз насекомых и микроорганизмов. Результаты этих экспериментов и данные других исследователей (Ильинская, Васюкова, Озерецковская, 1991; Озерецковская. 1994) позволяют говорить о возможности искусственного регулирования активности компонентов в системе «гидролаза-ингибитор», в частности путем обработки защитными препаратами - биостимуляторами.

В таблице 7 представлены данные об изменениях в уровне активности ингибиторов проназы Е и протеиназ ЛКЖ в клубнях картофеля при действии препаратов-биорегуляторов. Различные варианты препаратов растительного происхождения (серия ИБГ) любезно предоставлены сотрудниками Института биохимии и генетики УНЦ РАН (Яхин И.А. и сотр.).

Таблица 7

Изменение активности ингибиторов БАПНА - гидролизующих ферментов (ИЕ/г массы) в клубнях картофеля при действии препаратов - биорегуляторов

Препарат Концентрация, % Диски Клубни

Ингибиторы, ИЕ/г массы

Проназы Е Протеиназы ЛКЖ Проназы Е Протеиназы ЛКЖ

Контроль (вода) - 0. 93±0,02 0,22±0,01 1,05±0,04 0.27±0,01

Циркон 0.03 0.93±0.04 0.62±0,02 0,94±0.03 0

Эпин 0.03 0.95±0.04 0.17±0,05 1,10±0.03 0,80±0,02

Рифтал 0.5 0,95±0,03 0.18±0,01 1.11 ±0.05 0

Денис 0.0002 0,91+0,03 0.33±0.02 1.10±0.04 0.13±0,01

ИБГ- 32 0.03 0.95±0.03 0,36±0,03 1.15±0,02 0.07±0,002

ИБГ-42 0.03 0.88±0.03 0.07±0,004 1.06±0.03 0.22±0.01

ИБГ- 5Н 0.03 0.84±0.03 0 1,04±0.04 0

ИБГ-31 0.03 0.99±0.05 0.032±0.001 1.07±0,03 0.44±0.03

ИБГ-41 0,03 0,94±0.07 0.08±0.004 1,10±0,05 0,54±0,03

ИБГ- 60 0,03 0.94+0,04 0.26±0.02 1.15±0.03 0

Примечание: Кл\бни - иптактпые клубим выдержанные I ч в растворе с биорегулятором. Диски- вырезаны ич интактиых клубней и выдержаны 1 ч в растворе биорегулятора.

Как видно, обработка клубней и дисков не оказывает существенного влияния на активность ингибиторов проназы Е (табл.7). Иная картина обнаруживается при измерении в тканях картофеля уровня ингибиторов ферментов личинок КЖ. Так при обработке дисков препаратами Циркон, ИБГ-32, Децис наблюдается значительное повышение антипротеолитической активности против ферментов личинок КЖ. В тоже время, обработка препаратом ИБГ-5Н клубней и дисков, полностью подавляет в них активность данных ингибиторов. Полное подавление активности ингибиторов личинок КЖ обнаруживалось и при действии Циркона, Рифтала, ИБГ-60 на клубни картофеля. Большинство изученных препаратов оказывало противоположный эффект при действии на интактные клубни и вырезанные диски. Модификация активности ингибиторов при обработке картофеля биорегуляторами обнаруживалась и при исследовании ингибиторов, подавляющих активность желатиназы и амилазы личинок КЖ. Как видно из таблицы 8, активность ингибиторов протеиназ, гидролизующих желатин, полностью подавляется при обработке клубней и дисков Рифталом, Децисом и препаратом ИБГ-41

Таблица 8

Активность ингибиторов гидролитических ферментов (ИЕ/г массы) личинок колорадского жука в клубнях картофеля под действием препаратов-

биорегуляторов

Препарат, 0,03% Клубни Диски

Иж Иа Иж Иа

Контроль (вода) 3.6 5.3 3.6 5,2

Циркон 3.3 10,2 7,1 5,3

Эпин 0 0 7,1 5,3

Рифтал 0 5.3 0 10,2

Децис 0 14.7 0 10.2

ИБГ-32 0 5.3 7.1 10.2

ИБГ-42 0 5,3 7.1 0

ИБГ-5Н 3.3 5.3 0 10.2

ИБГ-3] 0 10.2 10.0 10.2

ИБГ-41 0 5.3 0 10.2

ИБГ-60 3.3 5,3 0 14.7

Примечание: Иа- ингибиторы амилаз: Иж - ингибиторы желатинах

Повышение активности этих ингибиторов наблюдалось в вариантах опыта с ИБГ-31, ИБГ- 41, Эпином, Цирконом. Иная закономерность обнаруживается при измерении активности ингибиторов амилаз в обработанных клубнях и дисках. В клубнях, во всех вариантах опыта (за исключением варианта с Эпином), активность ингибиторов выше или определяется на уровне контрольного варианта. В обработанных дисках, полное подавление активности ингибиторов амилаз выявляется в варианте с ИБГ-42.

Таким образом, обработка клубней и дисков картофеля растворами биорегуляторов в условиях модельных экспериментов изменяет активность ингибиторов гидролитических ферментов личинок КЖ (протеиназ, амилаз). При этом разные препараты одной концентрации (0,03 % раствор) оказывают различное действие на активность ингибиторов. Одни препараты повышают ингибиторную активность, другие, напротив, полностью подавляют её. По-видимому, такие различия определяются не только химической природой (составом), но и различными концентрациями действующего вещества в составе определенного препарата. Нужно отметить, что эффект действия одних и тех же препаратов на клубни и диски в большинстве случаев также носит противоположный характер. Различный характер действия препаратов в этом случае можно объяснить воздействием двух факторов при использовании дисков. По-видимому, конечный результат (уровень антигидролитической активности) определяется суммарным эффектом механического и химического воздействий.

Таким образом, уровень активности ингибиторов гидролитических ферментов в растительных тканях можно регулировать путем обработки растений препаратами - биорегуляторами с целью активации механизмов их устойчивости к воздействию фитофагов.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые методы определения активности протеиназ, амилаз с использованием гелей на основе агарозы. Методы позволяют количественно оценивать активность гидролитических ферментов и их ингибиторов по отношению к разным субстратам.

2. Из гомогенатов личинок колорадского жука методом гель-фильтрации выделены 4 фракции белков, обладающие протеолитической активностью. Протеиназы личинок способны гидролизовать желатин, казеин, яичный белок, гемоглобин, синтетический субстрат БАПНА.

3. Активность протеиназ личинок колорадского жука подавляется белками растений семейств пасленовых, сложноцветных, бобовых, ивовых. Растения семейства пасленовых обладают пониженной, по сравнению с растениями других семейств, активностью белков-ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука.

4. При действии на растения картофеля низких температур, механического повреждения, повреждения насекомыми-фитофагами, обработке растений защитными препаратами, значительно повышается уровень активности ингибиторов, подавляющих активность протеиназ и амилаз насекомых, микроорганизмов.

5. Уровень активности ингибиторов гидролитических ферментов в растительных тканях можно регулировать путем обработки растений препаратами-биорегуляторами. Показатель антигидролитической активности в растительных тканях может служить одним из критериев оценки >ффекпШноети действия новых Препаратов - биорегуляторов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ибрагимов Р.И.. Шпирная И.А., Яхин О.И. Индуцирование антипротеолитической активности в проростках Triticum aestivum.L. при действии препаратов-биорегуляторов /У Мат. Межрегиональной научно-практ. конф. «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины»,- Самара, 2005. - С.141-144.

2. Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И. Бахгиярова С.М. Активность протеиназ и ингибиторов трипсина в гомогенате трутневого расплода // Материалы Всероссийской научно-практ. конф. «Генетика, молекулярная биология и биохимия сельскохозяйственных животных».- Орел, 2005. -С.149-152.

3. Шпирная И.А, Ибрагимов Р.И. Сравнительная характеристика продуктов пчеловодства по протеолитической и антитрипсиновой активности // III съезд общества биотехнологов России: Сб. тезисов,-Москва, 2005,- С. 131-132.

4. Шпирная И.А, Ибрагимов Р.И, Шевченко Н.Д. Протеолитическая активность экстракта личинок колорадского жука// Тезисы докл. конференции «Биология - наука XXI века». -Пушино, 2006.- С. 103.

5. Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И. Влияние биорегуляторов на активность протеолитических ферментов и их ингибиторов в растительных тканях //Материалы I (IX) Межд. конф. молодых ботаников,- СПб, 2006,- С.221

6. Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И., Умаров И.А. Подавление активности гидролитических ферментов личинок колорадского жука растительными белками // Вестник Башкирского государственного университета. - 2006,-№ 3,- С.49-52.

7. Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И. Использование агарозной пластины для определения активности амилазы слюны. Тезисы X Международной молодежной школы-конференции.- Владивосток, 2006.-С.52.

8. Шпирная И.А., Леонова С.А. Исследование активности протеолитических ферментов и ингибиторов трипсина в сортах мягкой яровой пшеницы // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Перспективы агропромышленного производства регионов России». -Уфа, 2006. - С. 193-195.

9. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А. Выделение и свойства протеолитических ферментов личинок Leptinotarsa decemplineata // Тез. докладов второго

международного симпозиума «Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете».- Казань, 2006.-С.228-229

10. Шпирная И.А., Шевченко Н.Д. Определение активности протеолитических ферментов и их ингибиторов методом гелевых пластин // там же - С.230-231.

11. Ибрагимов Р.И., Шпирная И.А. Индуцирование активности ингибиторов протеиназ в растительных тканях // там же-С. 44-45.

Шпирная Ирина Андреевна

ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И ИХ ИНГИБИТОРЫ КАК КОМПОНЕНТЫ СИСТЕМЫ «НАСЕКОМОЕ-ФИТОФАГ - РАСТЕНИЕ»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 021319 от 05.01.99 г.

Подписано в печать 19.12.2006 г. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. 1,38. Уч.-изд. л. 1,24. Тираж 100 экз. Заказ 935.

Редакционно-издательский центр Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32.

Отпечатано на множительном участке Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шпирная, Ирина Андреевна

Введение.

1. Подавление активности чужеродных гидролитических ферментов -один из механизмов устойчивости растений (аналитический обзор литературы).

1.1. Протеолитические ферменты и амилазы патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей культурных растений.g

1.2. Растительные белки - ингибиторы протеиназ и амилаз: биохимическая характеристика, активность и физиологические функции.^

1.2.1. Свойства ингибиторов различных семейств.j

1.2.2. Физиологические функции ингибиторов протеиназ и а- амилазы из растений.

1.3. Перспективы использования ингибиторов чужеродных гидролаз в селекции и растениеводстве.

2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Материалы и реактивы.

2.3. Методы исследований.

2.3.1. Определение активности протеолитических ферментов.

2.3.2. Определение активности ингибиторов гидролаз.

2.3.3. Определение концентрации белка.

2.3.4. Математическая обработка результатов.

3. Результаты и обсуждение.

3.1 Определение активности гидролитических ферментов и их ингибиторов по гидролизу субстратов в агарозном геле (разработка методов).

3.1.1. Определение активности протеолитических ферментов и их ингибиторов.

3.1.2. Определение активности амилаз и их ингибиторов.

3.2. Функционирование системы «гидролазы насекомых - белковые ингибиторы растений» при различных физиологических состояниях растительного организма. gj

3.2.1. Выделение, очистка, активность, субстратная специфичность протеолитических ферментов личинок колорадского жука. ^

3.2.2. Подавление протеолитической и амилазной активности личинок колорадского жука белками-ингибиторами из растений.

3.3. Влияние факторов различной природы на активность ингибиторов протеиназ, ингибиторов амилаз в тканях растений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидролитические ферменты и их ингибиторы как компоненты системы "насекомое-фитофаг-растение""

Способность приспосабливаться к конкретным условиям (адаптивность)

- одно из важнейших свойств растительного организма. На уровне генотипа первостепенную роль в адаптации играют гены - регуляторы, управляющие кластерами структурных генов, на уровне фенотипа - кодируемые ими белки.

Адаптивные изменения в структуре и функциях клетки заложены во множественности локусов и в аллельной структуре гена, что обеспечивает в поколениях адекватные условиям произрастания популяций варианты адаптивных белков, таких как, ферменты, шоковые белки и т.д. К этой функциональной группе белковых молекул относятся и белки-ингибиторы, способные подавлять активность гидролитических ферментов, в первую очередь, протеиназ и амилаз. Такие белки обнаружены в семенах и вегетативных органах культурных растений различных семейств: пасленовых (Ishikawa et al.,1994; Gruden et al., 1997; Heibges, Salamini., 2003), бобовых (Norioka et al.,1988; Hung et al.,1994), злаковых (Mundy, Svendsen 1983; Ohsubo, 1989) и др.

Широкое распространение ингибиторов гидролаз и их содержание в значительных количествах в тканях растений позволяют говорить о них как об одном из важных звеньев в регуляции различных физиологических процессов. Кроме выполнения защитных функций, они служат регуляторами активности эндогенных ферментов в онтогенезе. В последние годы их используют как генетические маркеры в решении проблем эволюции, систематики, сортовой идентификации и иммунитета, а также как перспективные препараты для медицины (Мосолов, 1983; Валуев, Сытов, 2001; Конарев, 2002). Белковые ингибиторы и их природные мишени

- протеиназы, амилазы, эндополигалактуроназы и другие гидролазы насекомых, микроорганизмов и млекопитающих являют собой яркий пример сопряженной эволюции растений и фитофагов на молекулярном уровне (Konarev, 1996).

Как известно, ключевую роль в усвоении и мобилизации питательных веществ растений животными, микроорганизмами играют гидролитические ферменты, в т. ч. амилазы и протеиназы (Конарев, Фомичева, 1992; Мосолов, Валуева, 2002).

Предполагается, что одним из универсальных механизмов противостояния растений вредным насекомым и микроорганизмам-патогенам, является функционирование в растительном организме генетически детерминированной системы ингибиторов гидролитических ферментов. В практическом плане, в связи с проблемой устойчивости растений к патогенным микроорганизмам и насекомым - вредителям, большой интерес представляют белки-ингибиторы, способные подавлять активность экзогенных гидролитических ферментов (Бенкен, Мосолов, Федуркина, 1976; Конарев Ал.В., 1986; Валуева, 2002; 2004).

Показано, что искусственное введение генов ингибиторов протеиназ в неустойчивые растения приводит к появлению у них устойчивости к патогену (Johnson, Narvaez, Ryan, 1989; Duan et al.,1996; Irie et al.,1996). Обнаружена корреляция между наличием отдельных групп ингибиторов и устойчивостью растений к ряду грибных заболеваний, в том числе к головне и корневым гнилям (Кладницкая и др., 1994; Ибрагимов, Яруллина, 1996; Ибрагимов 1997).

Интересно отметить, что активность ингибиторов в растениях значительно изменяется при действии на них различных биотических и абиотических факторов. С. Рианом и его сотрудниками (Green, Ryan, 1971;1972; Ryan, 1976; 1976; 1987; Walker-Simmons, Ryan, 1984) было обнаружено, что поранение тканей личинками колорадского жука приводит к повышению активности ингибиторов протеиназ в листьях томатов и картофеля. Повреждение одного листа вызывало активацию ингибиторов по всем органам растений. Обработка клубней картофеля защитными препаратами биологического происхождения также вызывало длительное повышение активности в них ингибиторов протеиназ, что способствовало увеличению устойчивости клубней к действию возбудителей болезней (Яхин и др., 1998). Однако возможности искусственного стимулирования антигидролитической активности в растениях пока малоизучены и работы по этой тематике единичны. Новые сведения в этом плане позволят предложить принципиально новые подходы к поиску препаратов для защиты растений, стимулирующих естественные механизмы устойчивости растений.

Для получения конкретных сведений о физиологической роли белков -ингибиторов гидролаз растений необходимы детальные исследования, как самих ингибиторов, так и гидролитических ферментов организмов-фитофагов, на которые направлено их действие. Удобной моделью для этого может служить естественная система «гидролазы колорадского жука -белковые ингибиторы картофеля».

Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata является опасным вредителем картофеля. Пищеварительные ферменты колорадского жука представлены различными типами протеиназ, амилаз (Brunelle et al., 1999; Jongsma, Bolter, 1997; Конарев, 2000). В тканях картофеля содержится большое количество ингибиторов гидролаз. Так, в клубнях на их долю приходится до 15-20% всех водорастворимых белков (Ryan et al.,1976). Среди белков-ингибиторов картофеля, обнаружены ингибиторы протеолитических ферментов различных классов - сериновых, цистеиновых и аспартильных протеиназ, а также металлсодержащих карбоксипептидаз (Bryant et al.,1976; Keilova, Tomasek, 1976; Pompe -Novak et al., 2002; Ревина, Сперанская, Кладницкая, 2004). Дальнейшее исследование функционирования системы «гидролазы колорадского жука - ингибиторы картофеля» позволило бы получить ценный экспериментальный материал о физиологических и биохимических механизмах взаимоотношений насекомого-вредителя и растения.

Цель нашей работы - выявление закономерностей взаимодействия экзогенных гидролаз и растительных ингибиторов в системе «колорадский жук - картофель».

В ходе исследования нами были сформулированы следующие задачи:

- разработка методов определения активности гидролаз и их ингибиторов;

- определение уровня активности гидролитических ферментов в тканях личинок колорадского жука;

- определение уровня содержания ингибиторов гидролаз в тканях картофеля у сортов с различной степенью устойчивости к колорадскому жуку;

- исследование ингибиторов гидролаз колорадского жука у растений различных таксонов;

- исследование колебаний активности ингибиторов в клубнях и листьях картофеля при действии стрессовых факторов и препаратов - биорегуляторов.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шпирная, Ирина Андреевна

Выводы:

1. Разработаны методы определения активности протеиназ, амилаз с использованием гелей на основе агарозы. Методы позволяют количественно оценивать активность гидролитических ферментов и их ингибиторов по отношению к разным субстратам.

2. Из гомогенатов личинок колорадского жука методом гель-фильтрации выделены 4 фракции белков, обладающие протеолитической активностью. Протеиназы личинок способны гидролизовать желатин, казеин, яичный белок, гемоглобин, синтетический субстрат БАПНА.

3. Активность протеиназ личинок колорадского жука подавляется белками растений семейств: пасленовых, сложноцветных, бобовых, ивовых. Растения из семейства пасленовых обладают пониженной, по сравнению с растениями из других семейств, активностью белков-ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука.

4. При действии на растения картофеля низкой температуры, механического повреждения, поедания насекомыми, обработке защитным препаратом значительно повышается уровень активности ингибиторов, подавляющих активность протеиназ, амилаз насекомых и микроорганизмов.

5. Уровень активности ингибиторов гидролитических ферментов в растительных тканях можно регулировать путем обработки растений препаратами-биорегуляторами. Стимулирующий эффект препаратов проявляется и в проростках, выращенных из обработанных семян и клубней. Показатель антигидролитической активности в растительных тканях может служить одним из критериев оценки эффективности действия препаратов-биорегуляторов.

Заключение

Способность приспосабливаться к конкретным условиям окружающей среды (адаптивность) - одно из важнейших свойств растительного организма. Адаптивные изменения в структуре и функциях клетки заложены в множественности локусов и в аллельной структуре гена, что обеспечивает адекватные условиям произрастания популяций варианты адаптивных белков (Конарев, 2000). К таким белкам относятся ингибиторы, подавляющие активность гидролитических ферментов, в первую очередь, протеиназ и амилаз (Конарев Ал.В., 1986; Ибрагимов, 1998; Валуева, 2002; 2004). Как известно, агрессивность и патогенность фитофагов (насекомых, микроорганизмов), определяется и активностью их пищеварительных (гидролитических ферментов). Соответственно, исход взаимодействия растений и фитофагов, в значительной степени, будет зависеть и от относительной активности компонентов комплекса «фермент фитофага -ингибитор растительного организма».

Разработанные нами методы позволили оценить изменение активности протеиназ и амилаз личинок колорадского жука и их ингибиторов в экстрактах растительных тканей при различных физиологических состояниях. Эксперименты показали, что протеолитические ферменты личинок КЖ обладают широкой субстратной специфичностью: проявляют высокую активность по отношению к синтетическому субстрату БАПНА, различным белковым субстратам (казеин, гемоглобин, желатин, яичный белок). Активность протеиназ насекомых по отношению к этим субстратам определялась на уровне, сопоставимом с активностью высокоочищенных коммерческих препаратов ферментов.

В клубнях, листьях, стеблях растений картофеля выявляется ингибиторы, подавляющие протеолитическую и амилазную активность личинок КЖ. Наибольшая активность этих белков определяется в стеблях, тогда как листья картофеля отсутствием или низкой активностью этих ингибиторов. Между уровнем активности ингибиторов протеиназ личинок КЖ в органах картофеля и устойчивостью исследованных сортов к колорадскому жуку корреляции не выявлено. Необходимо отметить, что активность протеиназ личинок колорадского жука подавляется белками растений семейств пасленовых, сложноцветных, бобовых, ивовых. Растения семейства пасленовых обладали пониженной, по сравнению с растениями других семейств, активностью белков-ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука.

Возможность искусственного регулирования уровня ингибиторов гидролитических ферментов, открывает принципиально новые подходы к поиску защитных препаратов, стимулирующих естественные механизмы устойчивости растений. Активация генов ингибиторов чужеродных гидролаз, при обработке растений такими препаратами способствует повышению их устойчивости к патогенным микроорганизмам и насекомым-вредителям.

Наши результаты свидетельствует о том, при действии на растения картофеля низких температур, механического повреждения, повреждения насекомыми-фитофагами, обработке растений защитными препаратами, значительно повышается уровень активности ингибиторов, подавляющих активность протеиназ и амилаз насекомых, микроорганизмов. Причем, антигидролитическая активность повышалась и в частях растений, не контактировавших с физическим и химическим фактором. Важно, что обработка растений защитными препаратами не только подавляет жизнедеятельность организмов-фитофагов, но и стимулирует собственные механизмы защиты растительного организма.

Модификация активности ингибиторов протеиназ, амилаз в тканях является, по-видимому, частью неспецифических реакций растений в ответ на действие стрессовых факторов биотического и абиотического характера. Об этом свидетельствует и то обстоятельство, что накопление ингибиторов протеиназ в тканях происходит одновременно с увеличением содержания других защитных соединений (фитоалексинов, лектинов, лигнинов). Причем, накопление этих соединений в растительном организме индуцируется одними и теми же элиситорами, в роли которых могут выступать углеводсодержащие фрагменты клеточных стенок растений и грибов, а также некоторые фитогормоны (Walker-Simmons, Jin, West et all., 1984; Albercheim, Darvill, Augur et all., 1992; Тарчевский, 2001). Как предполагается, способность растительных белков подавлять активность чужеродных ферментов является результатом сопряженной эволюции растений и гетеротрофных организмов (насекомых, бактерий, грибов) (Harborne, Ingham, 1978; Конарев, 1992).

Из этого следует, что искусственное изменение баланса активности гидролаз и их ингибиторов в растительных тканях является одним из механизмов повышения их устойчивости. Наиболее перспективным в этом плане является возможность использования препаратов, приводящих к длительной индукции синтеза ингибиторов гидролаз в растениях. Наши эксперименты показали, что при обработке растений картофеля экспериментальными препаратами - биорегуляторами, наблюдается повышение в растении активности белков - ингибиторов гидролитических ферментов личинок колорадского жука, что может быть одним из путей повышения устойчивости растения к поражению колорадским жуком.

Таким образом, ингибирование гидролитической активности белковыми молекулами является важным механизмом поддержания жизнеспособности и целостности растительного организма. Белки-ингибиторы гидролаз принимают активное участие в регуляции активности эндогенных и экзогенных гидролаз путем образования комплексов "фермент-ингибитор", что является важнейшим звеном в формировании защитных реакций растений на действие насекомых вредителей, патогенов и других неблагоприятных воздействий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шпирная, Ирина Андреевна, Уфа

1. Бенкен И.И., Мосолов В.В., Федуркина Н.В. Влияние ингибиторов протеиназ фасоли на фитопатогенные грибы // Микология и фитопатология. -1976.- Т.10, № 3. С.198-201.

2. Валуев И.Л., Сытов Г.А., Валуев Л.И., Валуева Т.А., Ульянова М.В., Платэ Н.А. Ингибиторы протеолитических ферментов в терапии сахарного диабета. Вопросы медицинской химии. -2001.- Т.47. № 1. С. 132-139.

3. Валуева Т. А., Ревина Т.А., Мосолов В. В. Белки-ингибиторы протеиназ из клубней картофеля, относящиеся к семейству соевого ингиибтора Кунитца // Биохимия.- 1997.- Т. 62, № 12. С. 1600-1608.

4. Валуева Т.А., Зимачева А.В., Мосолов В.В. Локализация трипсинсвязывающего центра в молекуле ингибитора сериновых протеиназ // Докл. АН СССР. 1977. - Т. 237, № 6. - С. 1513-1516.

5. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Белки- ингибиторы протеолитических ферментов у растений// Прикладная биохимия и микробиология.-1995,- Т. 31. №6 С.579-589.

6. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений от патогенных микроорганизмов // Биохимия.-2004.-Т.69 вып.11.-С.1600-1606.

7. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитичсеких ферментов в защите растений //Успехи биологической химии.-2002.-Т.42.-С. 193-216.

8. Валуева Т.А., Мосолов В.В., Григорьева Л.И. Ингибиторы протеиназ из растений как полифункциональные белки. // Прикладная биохимия и микробиология. -2001.Т. 37. № 6. С. 643-650.

9. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Гвоздева E.JL, Герасимова Н.Г., Ильинская Л.И., Озерецковская О.Л. Влияние элиситоров на накопление ингибиторов протеиназ в пораненных клубнях картофеля. Прикладная биохимия и микробиология. 2001, 37, № 5,1- 6.

10. Ванюшин БФ. Апоптоз у растений //Успехи биолог, химии.- 2001.- №41. С.3-38.

11. Велобова Е. Н. Переваривание белков. Киев: Гродынец, 1993, 29 с.

12. Воскобойникова Н.Е., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Ингибитор металлопротеиназы из покоящихся семян гречихи // Биохимия.- 1990.- Т.55, № 5.- С. 839 847.

13. Гофман Ю. Я., Вайсблай И. М. Определение ингибитора трипсина в семенах гороха. //Прикладная биохимия и микробиология.-1975. Т. 2. №5. - С. 777-783.

14. Грачева И.М. , Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: "Элевар" 2000.512 с.

15. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта.- М.: Агропромиздат, 1985.-351с.

16. Дунаевский Я.Е, Павлюкова Е.Б., Белякова Г.А., Белозерский М.А. О физиологической роли ингибиторов протеиназ растений: две группы функционально активных ингибиторов в семенах гречихи// Мол. биол.- 1995. Т. 29. вып.6. С. 1258-1264

17. Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Эндогенные ингибиторы протеаз как фактор устойчивости растений / Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку,- М. Наука, 2000.-С.119-123

18. Дунаевский Я.Е., Цыбина Т.А., Белякова Г.А., Домаш В.И., Шарпио Т.П., Забрейко С.А., Белозерский М.А. Ингибиторы протеиназ как антистрессовыебелки высших растений // Прикладная биохимия и микробиология.-2005.-т.41. № 4. С.392-396.

19. Ибрагимов Р.И. Влияние фунгицидов на активность протеиназ и их ингибиторов у пшеницы // Итоги научных исследований биологического факультета БашГУ за 1994 г.- Уфа: Баш. ун-т.- 1995. С. 87-88.

20. Ибрагимов Р.И. Внеклеточные протеолитические ферменты гриба Fusarium sp. и их ингибиторы из растений //Вестник Башкирского университета. 1997. -№3 .С. 51-54.

21. Ибрагимов Р.И. Подавление активности внеклеточных протеиназ патогенного гриба Fusarium sp. ингибиторами из семян и вегетативных органов растений // Доклады Россельхозакдемии.- 1997.- № 2.- С. 15-17.

22. Ибрагимов Р.И. Содержание ингибиторов протеиназ в семенах сельскохозяйственных культур // Качество продукции растениеводства и приемы его повышения.- Уфа: Башгосагроун-т. 1998.- С. 146-149.

23. Ибрагимов Р.И., Сабитов A.M., Яшина И.Н. Изучение активности протеиназ и их ингибиторов у гречихи посевной и гречихи татарской// Вопросы биотехнологии, Уфа, 1995 .С. 72-78.

24. Ибрагимов Р.И., Хабибуллин С.И., Ахметов P.P. Способ определения активности протеолитических ферментов. Патент на изобретение № 21751342001

25. Ибрагимов Р.И., Яковлев В.Г., Ахметов P.P. Определение активности ингибиторов в составе комплекса с протеиназой // Физиология и биохимия культурных растений,-1987.- №1.С.51-54.

26. Ибрагимов Р.И., Яруллина Л.Г. Изучение протеиназ и их ингибиторов у пшеницы в связи с устойчивостью к корневой гнили //Итоги научных исследований биологического факультета БашГУ за 1995 г.- Уфа: Баш. ун-т.-1996. -С .6.

27. Ивлева Е.В., Руденская Ю.А., Дунаевский Я.Е., Мосолов В.В. 7,5 кДа-ингибитор цистеиновых протеиназ из семян тыквы // Биохимия.- 1997.- Т. 62, № 5. С. 644 - 650.

28. Ильинская Л.И., Васюкова Н.И., Озерецковская О.А. Биохимические аспекты индуцированной устойчивости // Итоги науки и техники Сер. Защита растений. Т.7. М.: ВИНИТИ - 1991.- 102 с.

29. Кладницкая Г.В., Валуева Т.А., Домаш В.И., Мосолов В.В. Экзопротеиназы гриба Fusarium sambucinum и их взаимодействие с ингибиторами // Прикл. биохим. и микробиол.- 1994.- Т. 30, вып. 1. С. 21-29.

30. Кладницкая Г.В., Валуева Т.А., Ермолова Н.В. Накопление ингибиторов протеиназ в диффузатах клубней картофеля при инфицировании возбудителем фитофтороза // Физиол. растений. 1996.- Т.43, № 5.-701 - 706.

31. Колорадский картофельный жук, Leptinotarsa decemlineata say: филогения, морфология, физиология, экология, адаптация, естественные враги. М: Наука, 1981.375 с.

32. Конарев А.В. Ингибиторы ферментов как генетические маркеры // Аграрная Россия- 2002, №3.- С.44-52

33. Конарев Ал.В. Идентификация ингибиторов тиоловых протеиназ насекомых и зерна у пшеницы и других злаков // Докл. ВАСХНИЛ.- 1984. -№ 10. С. 13-15.

34. Конарев Ал.В. Изменчивость ингибиторов трипсиноподобных протеиназ у пшеницы и родственных ей злаков в связи с устойчивостью к зерновым вредителям // Сельхоз. биол. -1987.- № 5.- С.17-24.

35. Конарев Ал.В. Ингибиторы протеиназ и устойчивость картофеля к колорадскому жуку // Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.-С.35-40

36. Конарев Ал.В. Компонентный состав ингибиторов трипсина из зерновки и листьев пшеницы // Докл. ВАСХНИЛ. -1987. -№ 12.- С. 6-9.

37. Конарев Ал.В. Методы анализа компонентного состава ингибиторов ос-амилаз и протеиназ у злаков //Прикл. биохим. и микробиол.- 1985.- Т.21, № 1.-С.92-100.

38. Конарев Ал.В. Системы ингибиторов гидролаз у злаков организация, функции и эволюционная изменчивость // Автореф. дисс. докт. биол. наук. - М.: 1992.-38 с.

39. Конарев Ал.В., Вилкова Н.А. Ингибиторы ферментов и иммунитет // Защита растений. -1984.- № 10. С. 17-19.

40. Конарев Ал.В., Вилкова Н.А. К вопросу об идентификации, компонентном составе и функционировании систем ингибиторов протеиназ у пшеницы // Сельхоз. биология. -1984. № 9.- С.39-44.

41. Конарев Ал.В., Фомичева Ю.В. Перекрестный анализ взаимодействия компонентов а-амилаз и протеиназ насекомых с белковыми ингибиторами из эндосперма пшеницы //Биохимия. -1991. -Т.56, №.4,- С.628-638.

42. Мелентьев А.И., Ямалеев A.M., Ибрагимов Р.И., Исаев Р.Ф. Сродство к углеводам и лектиноподобная активность ингибиторов трипсина из семян пшеницы в связи с устойчивостью к фитопатогенным грибам // Сельхоз. биология. 1986.- № 12. - С .52-54.

43. Методы экспериментальной микологии. Справочник. Киев «Наукова думка», 1982-211с.

44. Метлицкий Л.В., Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л. Индукторно-супрессор-ная гипотеза фитоиммунитета // Журнал общ. биол.-1986.-Т.47.№3.-С.748-758.

45. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы протеолитических ферментов как регуляторы процессов протеолиза.- М.: Наука.-1983.- 40 с.

46. Мосолов В.В. Белки ингибиторы протеаз и а - амилаз у растений (обзор) // Прикл.биохим. и микробиол.- 1995.-Т. 31, № 1 .- С. 5-10.

47. Мосолов В.В. Ингибиторы протеолитических ферментов в растениях // Вопросы мед. химии. 1987.- Т. 336 № 5. - С. 52-56.

48. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука.-1971.- 414 с.

49. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений. Прикладная биохимия и микробиология. 2005,41, № 3,261-282.

50. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов. М.: ВИНИТИ.-1993.- 207 с.

51. Мосолов В.В., Колосова Г.В., Валуева Т.А., Дронова JI.A. Ингибитор трипсина из семян гледичии (Gleditsia triacanthos L.) // Биохимия 1982. - Т. 47, № 5.- С. 797-802

52. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений // Прикладная биохимия и микробиология.-2005.-т 41 №3.-с.261-282.

53. Практикум по биохимии. Под ред. С.Е.Северина и Г.А.Соловьевой. -М., Изд-во МГУ.- 1989.- 508 с.

54. Применение методов биохимии в исследованиях по защите растений (Методические укзания) п/р К.В.Новожилова, С.Л.Тютерева, издательство ВИЗР, Ленинград, 1976 с.61-62

55. Ревина Т.А., Сперанская А.С., Кладницкая Г.В., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Белок-ингибитор субтилизина из клубней картофеля. Биохимия. 2004, 69, № 10, 1345-1352.

56. Скоупс Р. К. Методы очистки белков. Пер с англ. Антонова В.К. М: Мир.-1985.-358 с.

57. Сперанская А.С., Криницина А.А., Полтрониери П.и др.Ингибиторы протеиназ типа Куница группы В из картофеля: молекулярное клонирование генов//Биохимия.- 2005.- т.70 вып.З.- С.360-369.

58. Тарчевский И.А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липидов // Физиология растений.- 1992. Т. 39. № 6.- С. 1215 1223.

59. Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе. 2001. Казань. Фэн (Наука). 448 с.

60. Фомичева Ю.В. Диссертационная работа. Пищеварительные а -амилазы и протеиназы насекомых как элемент специфического взаимодействия в системе растение насекомое- фитофаг. С-П6.-1992.- 16 с.

61. Хабибуллин С.И. Диссертационная работа. Активность ингибиторов экзогенных протеиназ в клубнях и листьях картофеля в связи с устойчивостью к колорадкскому жуку. Уфа.-2003.-22 с.

62. Элпидина Е.Н., Воскобойникова Н.Е., Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е. Обнаружение в белковых телах семян гречихи металлопротеиназы и ее ингибитора // Биохимия,- 1990.- Т.55. № 4. С. 734 -744.

63. Ямалеев A.M., Муксинов В.Х., Исаев Р.Ф. Активность ингибиторов протеаз в семенах пшеницы в связи с устойчивостью к твердой головне // Сельхоз. биол.- 1980.- Т.15. № 1. С.143-144.

64. Яхин И.А., Ибрагимов Р.И.,Яхин О.И., Исаев Р.Ф., Вахитов В.А. Индуцированное действие биопрепарата "Стифун" на накопление ингибиторов трипсина в клубнях картофеля при хранении //Доклады Россельхозакадемии.-1998,-№4.-С. 12-15.

65. Abe M., Abe K., Kuroda M., Arai S. Corn kernel cysteine proteinase inhibitor as a novel cystatin superfamily member of plant origin. Molecular cloning and statement studies //Europ.J. of Biochemistry.- 1992.- vol. 209. №.3. P. 933-937.

66. Albersheim P., Augur C., Cheong J.J., Eberhard S., Hahn M.G. Oligosaccharins -oligosaccharide regulatory molecules // Accts. Chem. Res.-1992.-V. 25. P. 77-83.

67. Antcheva N., Pintar A., Patthy A., Simoncsits A., Barta A. Proteins of circularly permuted sequence present within the same organism: The major serine proteinase inhibitor from Capsicum annuum seeds // Protein Science. -2001.-N 10 P. 2280-2290.

68. Appelbaum S.W., Konijn A.M. The presence of a tribolium -protease inhibitor in wheat // Incekt. Physiol.-1966,- V.4. № 12. P. 665 -669.

69. Argall M. E., Bradbury J. H., Shau. C. Amino-acid sequence of a trypsin/chymotrypsin inhibitor from giant taro (Alocasia macrorrhiza) // J. Biochim. biophys. acta, Prot. struct, mol. enzymol.-1994.- V. 1204. № 2. P. 189-194.

70. Ary M. В., Shewiy, P. R., Richardson M. The amino acid sequence of a cereal Bowman-Birk type trypsin inhibitor from seeds of Jobs tears (Coix lachryma-jobi L.) // FEBS Lett. -1988.-229. P. 111-118.

71. Atkinson A.H.,Heath R.L.,Simpson R.J., Clarke A.E., Anderson M.A. Proteinase inhibitors in Nicotiana alata stigmas are derived from a precursor protein which is processed into five homologous inhibitors // Plant Cell. -1993.- № 5. P.203-213.

72. Ball A.M, Ashby A.M, Daniels M.J, Ingram D.S, Johnston К Evidence for the requirement of extracellular protease in the patho- genie interaction of Pyrenopeziza brassicae with oilseed rape // Phys- iol Mol Plant Pathol. -1991.- V. 38. P. 147-161.

73. Balls A., Ryan C. Activities of Directly and Indirectly Acetylated Chymotrypsins // PNAS.-1963.- № 50. P. 448-453.

74. Batista F., Batista, L.V. Alimentagao e nutrigao no nordeste semiarido do Brasil // Situa9ao e perspectivas. Sitientibus. -1996.- № 15. P. 287-289.

75. Belozersky M.A, Dunaevsky Y.E, Musolyamov A.X, Egorov T.A. Complete amino acid sequence of the protease inhibitor from buckwheat seeds// FEBS Lett.-1995.- V. 371. P. 264-66.

76. Bergey D.R., Orozco-Cardenas M., de Moura D.S. and Ryan C.A. A wound-and systemin-inducible polygalacturonase^ tomato leaves// Proceedings of National Academy of Sciences.- 1999.- № 96. P. 1756-1760.

77. BirkY. The Bowman-Birk inhibitor. Trypsin- and chymotrypsin-inhibitor from soybeans // Int J Pept Protein Res. -1985.-№ 25. P. 113-131.

78. Bode W., Huber R., Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases // J. Biochem. -1992. -№ 204. P.433-451.

79. Boisen S., Djurtoft R. Trypsin inhibitors from rye endosperm. Purification and properties // Cereal Chem. 1981. - V. 58. № 2. - P. 194-198.

80. Boiler Т., Vogeli U. Vacuolar localisation of ethylene-induced chitinase in bean leaves // Plant Physiol.- 1984.- V. 84.№ 2. P. 442-444.

81. Bolter C.J. Methyl jasmonate induces papain inhibitor(s) in tomato leaves // Plant Physiology.- 1993.-V. 103. P. 1347-1353.

82. Bonade -Bottino M., Lerin J., Zaccomer В., Jouanin L. Physiological adaptation explains the insensitivity of Baris coerulescens to transgenic oilseed rape expressing oryzacystatin//I.Insect Biochem Mol Biol. -1999.-№29. P.131-138.

83. Bradford M.M. A rapide and sensetive method for the quantitasion of microgramm quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 172. № 1. - P. 248 - 254.

84. Bradshaw H.D.F., Hollick J.B., Parsons T.J. et al. Systemically wound -responsive genes in poplar trees encoude proteins similar to sweet potato sporamins and legume Kunitz inhibitors // Plant Mol. Biol. 1989. - V. 14. № 1. - P. 51-59.

85. Brunelle F., Nguyen Quoc В., Cloutier C., Michaud D. Protein hydrolysis by Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata, digestive proteases : the catalytic role of cathepsin D // Arch. Insect Biochem. Physiol.-1999.- V. 42. № 1. P. 88-98.

86. Bryant J., Green Т., Gurusaddaiah Т., Ryan C. A. Proteinase inhibitor II from potato: Isolation and characterisation of the isoinhibitor subunits // Biochemistry. -1976.-V. 15.-P. 3418-3423.

87. Brzin, J.; Popovic, Т.; Drobnic-Kosorok, M.; Kotnik, M. Inhibitors of cysteine proteinases from potato//Biol. Chem. Hoppe Seyler.l998.-,V. 369. P. 233-238.

88. Ceci LR, Spoto N, de Virgilio M, Gallerani R. The gene coding for the mustard trypsin inhibitor-2 is discontinuous and wound-inducible// FEBSLett.- 1995.- V. 364. P. 179-181

89. Dannenhoffer J., Renee C., Thompson G. Phloem-specific expression of the pumpkin fruit trypsin inhibitor//Planta.-2001.- V.212. P. 55-162.

90. Darvill A., Augur C, Bergmann C, Eberhard S., Hahn M., Lo V., Marfa V. Oligosaccharins oligosaccharides that regulate growth, development and defense reponses in plants // Glycobiology 2. -1992-. P. 181-198.

91. Del Pozo 0., Lam E. Caspases and Programmed Cell Death in the Hypersensitive Response of Plants to Pathogens // Current Biol. 1998.-№ 8. P.l 129-1132.

92. Duan X., Li X., Xue Q. Abo-el-saad M, Xu D, Wu R Transgenic rice plants harbouring an introduced potato inhibitor II gene are insect resistant // Nat. Biotechnol.- 1996.- V. 14. № 4. P. 494-498.

93. Eckelkamp C., Ehmann В., Schopfer P. Wound-induced systemic accumulation of a transcript coding for a Bowman-Birk trypsin inhibitor-related protein in maize (Zea mays L.) seedlings // FEBS Lett. 1993. V. 323. № 2. P. 73-76.

94. Erlanger B.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes of trypsin // Arch. Biochem. Biophys.- 1961.- V. 95.№ 2.- P. 271-278.

95. Farland P., Ryan C.A. Proteinase inhibitor inducing factor in plant leaves // Plant Physiol. 1974.- V. 54. № 5. - P. 706-711.

96. Farmer E., Ryan C. Octadecanoid precursors of jasmonic acid activate the synthesis of wound inducible proteinase inhibitors UPlant Cell. 1992. №4. P. 129 -134.

97. Favel, A., Le-Nguyen, D., Coletti-Previero, M.A. & Castro, B. Active site chemical mutagenesis of Ecballium elaterium trypsin inhibitor II: new microproteins inhibiting elastase and chymotrypsin// Biochem Biophys Res Commun, 1989.N 162 (1) P.79-82.

98. Fernandes K.V., Sabelli P.A., Barratt D.H., Richardson M., Xavier-Filno J. The resistance of cowpea seeds to bruchid beetles is not related to level of cysteine proteinase inhibitors // Plant Molecular Biology.- 1993.- V. 23. № 1. P. 215-219.

99. Fritz H., Tshesche H., Greene LJ and Truscheit E. Proteinase inhibitors. 1974. Berlin. 382 p.

100. Garcia-Olmedo F., Salcedo G., Sanchez-Monge R., Gomez L., Royo J., Plant proteinaceous inhibitors of proteinases and a-amylases // Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol. -1987.- V. 4. P. 275-334.

101. Gatehouse A.M., Gatehouse I., Dobie P. Biochemical basis of insect resistance in Vigna Unguqulata // J. Sci. Food Agric. 1979.- V. 30, № 2. - P.369-381.

102. Gatehouse J.A., Lycett G .W., Delauney A. J., Croy R., Boulter D. Sequence specificity of the post-translational proteolytic cleavage of vicilin, a seed storage protein of pea (Pisum sativum L.) // Biochem. J. -1983.- V. 212. P. 427-432.

103. Girard C, Le Metayer M, Bonade-Bottino M, Pham-Delegue MH, Jouanin L, High level of resistance to proteinase inhibitors may be conferred by proteolytic cleavage in beetle larvae // Insect Biochem Mol Biol. 1998.- № 28. P. 229-237

104. Giri A.P., Harsulkar A.M., Deshpande V.V., Sainani M.N., Gupta V.S., Ranje

105. Green Т., Ryan C. Wound- induced proteinase inhibitor of plant leaves. A possible defence mechanism against insects //Science.-1972.-V.175.№ 5.- P.776-777.

106. Gruden K., Popovic Т., Cimerman N., Krizaj I. Inhibition of Colorado potato beetle larvae by a locust proteinase В // Biotechnology Letters. 2003.-V. 27. №. 12 P. 829-834.

107. Gutierrez-Campos, Torres-Acosta, Saucedo-Arias, Gomez-Lin. "The use of Cysteine protease inhibitors to engineer resistance against potyviruses in transgenic tobacco plants //Nature Biotechnology. -1999.- № 17. P. 1223-1226.

108. Harborne J.B. Biochemical aspects of plants and animal cjevolution // New Phytologist. -1979.-V.83. № 2. P. 601-602.

109. Hatano К., Kojima M., Tanokura, M., Takahashi К. Solution structure of bromelain inhibitor VI from pineapple stem: Structural similarity with Bowman Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor from soybean // J.Biochem.- 1996.- №3. P.5379-5384.

110. Hayashi Y, Yamada K, Shimada T, Matsushima R, Nishizawa NK, Nishimura M, Hara-Nishimura I. A proteinase-sorting body that prepares for cell death or stress in the epidermal cells of Arabidopsis // Plant Cell Physiology .-2001,- № 42. P. 894-899.

111. Heibges A., Salamini F., Gebhardt C. Functional comparison of homologous members of three groups of Kunitz-type enzyme inhibitors from potato tubers (Solanum tuberosum L.) //Mol Genet Genomics. -2003.-V.269. P. 535-541.

112. Hejgaard J., Hauge S. Serpins of oat (Avena sativa) grain with distinct reactive centers and inhibitory specificity // Physiologia Plantarum. -2002.- V.l 16. P. 155-163

113. Hengartner A. The biochemistry of apoptosis //Nature. 2000.- № 12.-P.685-687.

114. Hojima Y., Pierce J., Pisano J. Pumpkin Seed Inhibitor of Human Factor XII, Activated Hageman Factor and Bovine Trypsin // Biochemistry.-1982.- № 21. P. 37413746.

115. Hilder V., Gatehouse A., Sheerman S., Barker R. A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco.//Nature. -1987.- V. 300. P. 160-163.

116. Hobday S., Thurmaen D., Barber D. Proteolytic and trypsin inhibitory activities in extracts of germinating Pisum sativum seeds // Phytochemistry.- 1973.-V. 12.1. P. 1041-1046.

117. Hwang D.R., Yang N.K., Foard D.E. Rapid release of protease inhibitors from soybeans. Immunochemical quantitation and parallels with lectins // Plant Physiol. -1978.-V.61.№ 1.Р. 30-34.

118. Ikenaka Т., Norioka S. Bowman-Birk family serine proteinase inhibitors. // Elsevier Science.- 1986.- Amsterdam, The Netherlands. P. 361-374.

119. Irie K., Hosoyama H., Takeuchi Т., Iwabuchi K., Watanabe H., Abe K., Arai Transgenic rice established to express corn cystatin exhibits strong inhibitory activity against insect gut proteinases // Plant Mol. Biol. -1996.- № 30.- P. 149-157.

120. Ishikawa A., Ohta S., Matsuoka K., Hattori Т., Nakamura K. A family of potato genes that encode Kunitz-type proteinase inhibitors: structural comparisons and differential expression // Plant and Cell Physiology.- 1994.- V. 35. P. 303-312.

121. Johnson R., Narvaez J., An G., Ryan C. Expression of proteinase inhibitors I and II in transgenic tobacco plants: Effects on natural defense against Manduca sexta larvae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 89. № 3. P. 9871-9875.

122. Jongsma M.A., Bolter C. The adaptation of insects to plant protease inhibitors. J Insect Physiol.- 1997.-V. 43. P. 885-895.

123. Jongsma M.A., Bakker P.L., Peters J., Bosch D., Stiekema W. Adaptation of Spodoptera exigua larvae to plant proteinaseinhibitors by induction of proteinase activity insensitive of inhibiton // Proc. Natl Acad. Sci.-1995.- № 92. P. 8041-8045.

124. Keilova H., Tomasek V. Isolation and properties of cathespin D inhibitor from potatoes//Col.of Czechoslovak Chem. Communication.-1976.-V.41.P. 489-497.

125. Kirsi M., Micola I. Occurence and heterogenity of chymotrypsin inhibitors in vegetative tissues of barley // Physiol. Plant.- 1977. V.39. № 1. - P. 110-114.

126. Kondo H., Ijiri S., Abe K., MaedH., Arai S. Inhibitory effect of oryzacystatins and a truncation mutant on the replication of poliovirus in infected Vero cells // FEBS Lett.- 1990.- V. 299. № 1. P. 48-50.

127. Kortt A.A. Isolation and properties of a chymotrypsin inhibitor from winged bean seed (Psophocarpus tetragonolobus (L) Dc.) // Biochim Biophys Acta. -1980.-V. 24. P. 237-248.

128. Kreis M., Forde J., Williamson M., Shewry P.R. In "Cereal Quality" Characterization of proteins and genes determining barley feedquality. Aspects of Applied Biology.-1987.- № 15. P. 97-103

129. Kunitz M. Crystalline soybean trypsin inhibitor. 2. General properties // J. Gen. Physiol. -1947. -V.30. № 2. P.291 -310.

130. Kuo Т., Pearce G., Ryan C. Isolation and characterization of proteinase inhibitor I from etiolated tobacco leaves // Arch. Biochem. Biophys.-1984.- V.230. № 2. P. 504-510.

131. Laskowski M., Kato I. Protein inhibitors of proteinases // Ann. Rev. Biochem. -1980.- V.49, N 2.- P. 593-626.

132. Li Z., Traore S., Maximova A., Guiltinan M. Somatic embryogenesis and plant regeneration from floral explants of cacao (Theobroma cacao L.) using thidiazuron. // In vitro Cell Developmental Biology. -1998.- № 34. P. 293-299.

133. Lundgard R., Svensson В. The four major forms of barley b-amylase. Purification,characterization and structural relationship // Carlsberg Res Commun. -1987-V.52. P. 313-326.

134. Lyons A., Richardson M., Tatham A.S., Shewry P.R. Characterisation of homologous inhibitors of trypsin and a-amilase from seeds of rye ( Secale cereale L.) //Biochem. Biophys. Acta. 1987. - V. 915.№ 2. P.305-313.

135. Mares M., Meloun В., Pavlik M., Kostka V. Primary structure of Cathepsin-D inhibitor from potatoes and its structural relationship to trypsin inhibitor family // FEBS Letters.-1989. V.251. P.94-98.

136. Maskos K., Wunderlich M., Glockshuber R. RBI, a one-domain alpha-amylase/trypsin inhibitor with completely independent binding sites (Eleusine coracana Gaertneri) // FEBS Lett. -1996.- V. 397. P. 11-16.

137. Micola J., Suolinna E. Purification and properties of an inhibitor of microbial alkaline proteinases //Arch. Biochem. and Biophys.-1971.- V.144. № 2. P.566-575.

138. Mosolov V., Loginova M., Fedurkina L., Benken I. The biological signiticance of proteinase inhibitors in plants // Plant Sci. Lett.- 1976.- V.7, № 2. P. 77-80.

139. Muntz K., Shutov A.D. Legumains and their functions in plants // Trends in Plant Science. 2002. № 7. P. 340-344.

140. Mundy J., Hejgaard J, Svendsen I. Characterisation of a bifiinctional wheat inhibitor of endogenous a-amilase and subtilisin // FEBS Letters. 1984.- V. 167.160. №2.-P. 210-215.

141. Nagasue A., Fukamachi H., Ikenaka H., Funatsu C. The amino acid sequence of barley rootle trypsin inhibitors //Agric.Biol.Chem.-1988.-V.52.№ 6. P. 1505-1514.

142. Norioka N., Hara S., Ikenaka Т., Abe J. Distribution of the Kunitz and the Bowman-Birk family proteinase inhibitors in leguminous seeds// Agric Biol Chem 1988.-№52. P. 1245-1252.

143. Odani S., Koide Т., Ono T. Purification and characterisation of proteinase inhibitors from Phaseolus angularis // J.Biochem.- 1986.-V.100, N 4.- P. 975-983.

144. Odani, S., Ikenaka, T. The amino acid sequences of two soybean double-headed proteinase inhibitors and evolutionary considerations on the legume proteinase inhibition. Journal of Biochemistry, September 1976. V.80. № 3. P. 641-643.

145. Odani, S., Koide, Т., Ono T. The complete amino acid sequence of barley trypsin inhibitor//Journal ofBiol.Chemistry.-1983.-V.258. № 13. P. 7998-8003

146. Otlewski J., Sywula A., Kolasinski M., Krowarsch D. Unfolding kinetics of bovine trypsinogen // Eur J Biochem.-1996.- V. 242. P. 601-607.

147. Paulot V., Holzer F.M., Walling L.L. Differentional expression of tomato proteinse inhibitor I and II genes during pathogen invasion and wounding // Molecular Plant-Microbe Interaction.-1991.- V. 4. № 3. P. 284-292.

148. Pearse G., Johnson S., Ryan C.A. Purification and characterisation from tobacco (Nicotian tabacum) leaves of six small, wound-inducible isoinhibitors of the potato inhibitor II family // Plant Physiol. 1993.- V. 102, N 3.- P. 639-644.

149. Pernas M., Sanchez-Monge R., Salcedo G. Biotic and abiotic stress can induce cystatin expression in chestnut // FEBS Lett. 2000. V. 467. № 3.-P. 206-210.

150. Plunkett G., Senear D.F., Zuroske G., Ryan C.A. Proteinase inhibitors I and II from leaves of wounded tomato plants: purification and properties //Arch.Biochem. Biophys. -1982. V. 213. № 3. P. 463-472.

151. Pompe -Novak M., Poljak-Prijatelj M., Popovi T.,Ttukelj В., Ravnikar M. The impact of potato cysteine proteinases in plant growth and development // Physiol, mol. plant pathol.-2002.-V.60. № 2. P. 71-78.

152. Protempa J., Korzus E., Travis J. The serpin superfamily of proteinase inhibitors: Structure, function and regulation // Journal of Biological Chemistry.1994.-V.269. P. 15957-15960.

153. Rasmussen, S. K., Klausen, J., Hejgaard, J., Svensson B. Primary structure of the plant serpin BSZ7 having the capacity of chymotrypsin inhibition // Biochim Biophys Acta.-1996.-V.1297. P.127-130.

154. Richardson M. Protein inhibitors of enzymes // Food Chem.- 1979.- V. 6. № 3,-P. 325-353 (обзор)

155. Richardson M. The proteinase inhibitors of plants and microorganisms // Phytochemistry.- 1977.-V. 16. № l.-P. 159-169.

156. Richardson M., Compos F., Xavier-Tilho C. et al. Chymotrypsin inhibitor from potatoes: interactions with target ensymes // Biochem et Biophys. Acta.-1986.- V. 872. № l.P. 184-192.

157. Roberts Т., Marttilla S., Rasmussen S., Hejgaard J. Differential gene expression of suicide-substrate serpin proteinase inhibitors (serpins) in vegetative and grain tissues of barley //Journal of Experimental Botany. -2003,- V. 54. P. 2251-2263.

158. Rodis P, Hoff JE. Naturally occurring protein crystals in the potato. Inhibitor of papain, chymopapain and ficin //. Plant Physiol. -1984.-V. 74. P. 907-911.

159. Ryan C.A. Oligosacharide signalling in plants // Ann. Rev. Cell Biol. 1987. -V. 3, № 2. - P. 243 -245.

160. Ryan C.A. The searh for the proteinase inhibitor-inducing factor, PIIF // Plant Mol. Biol. 1992.- V. 19, № 1. - P. 123-133.

161. Ryan C.A., Kuo Т., Pearce G., Kunkel R. Variability in the consentration of thre heat stable proteinase inhibitor from potato tubers // Am. Potato J.-1976- V. 53. № 12.- P.433-455.

162. Ryan C. A. Defense responses of plants // Plant Gene Research: Genes Involved in Microbe Plant Interactions. -1984.- P. 375-386.

163. Ryan C. A. Protease inhibitors in plants: Genes for improving defenses against insects and pathogens // Ann. Rev. Phytopathol.-1990.- № 28. P. 425-449.

164. Shewry P.R. Tuber storage proteins // Annals of Botany-2003.-V.91.P.755-769

165. Silvermann G.A., Bird P.I., Carrell R.W. The serpins are an expanding superfamily of structurally similar but functionally diverse proteins // Journal of Biological Chemistry. -2001.-V.276. P. 33293-33296.

166. Svendsen I., Hejgaard J., Mundy J. Complete amino acid sequence of the a -amylase/subtilisin inhibitor from barley // Carlsberg Res. Commun.-1986.- V. 51. P. 141-157.

167. Svendsen I., Iohassen I. Amino dcid sequence homology between a serine protease inhibitor from barley and potato inhibitor I // Biochem. Soc. Trans. 1981.-V. 9.№ 2.- P.265-267.

168. Tashiro M., Asao Т., Hirata C., Takahashi K., Kanamori M. The Complete Amino Acid Sequence of a Major Trypsin Inhibitor from Seeds of Foxtail Millet (Setaria italica)//J Biochem (Tokyo). -1990.- V.108. P. 669-672.

169. Thie N., Houseman J. Identification of cathepsin B, D and H in the larval midgut of Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata // Insect Biochem. -1990.- V. 20. P. 313-318.

170. Thompson G.A., Schulz A. Macromolecular trafficking in the phloem // Trends in Plant Science. 1999.- № 4. C. 354-360.

171. Turk V., Bode W. The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases // FEBS Letters.- 1991.-V. 285. P. 213-219.

172. Urwin P.E., Lilley C.J., McPherson M.J., Atkinson H.J. Resistance to both cyst and root-knot nematodes conferred by transgenic Arabidopsis expressing a modified plant cystatin // Plant J. -1997.-V. 12. № 2. P. 455-461.

173. Valueva Т., Revina Т., Mosolov V., Mentele R. Primary structure of potato Kunitz-type serine proteinase inhibitor//Biol. Chemistry.- 2000.- V. 381. № 12. P. 1215-1221.

174. Valueva Т., Shulgin M. Isolation and characterisation of protein inhibitors of microbial proteinases from cereal seeds //Biol. Zent.Bl.-1988.- V.107. № 1. P. 51-52.

175. Walker Simmons M., Ryan C.A. Proteinase inhibitor synthesis in tomato leaves. Induction by chitosan oligomers and chemically modified chitosan and chitin // Plant Physiol. - 1984.- V. 76.№ 3. - P. 787-790.

176. Walsh Т., Twitchell W. Two Kunitz-Type Proteinase Inhibitors from Potato Tubers II Plant Physiol.-1991,- V. 97. P. 15-18.

177. Werner R., Guitton M., Muhlbach H. Nucleotide sequence of a cathepsin D inhibitor protein from tomato // Plant Physiol. -1993. -V. 103 (4) P. 1473.

178. Wilson K.A. The release of proteinase inhibitors from legume seeds during germination//Phytochemistry.- 1980.- V. 19. № 12. P. 2517-2519.

179. Wilusz J, Michael G., Keene D. A Host Protein (La) Binds to a Unique Species of Minus-Sense Leader RNA during Replication of Vesicular Stomatitis Virus // PNAS.- 1983-V. 80. P. 5827-5831.

180. Xu D., Xue Q., McElroy D., Mawal Y., Hilder V. Constitutiveexpression of a cowpea trypsin inhibitor gene, CpTi, in transgenic rice plants confers resistance to two major reice insect pests // Mol. Breed. -1996.-№ 2. P. 167-173.

181. Уен K.W., Lin M.L, Tuan S.J., Chen Y.M., Lin C.Y., Kao S.S. Sweet potato (Ipomea batatas) trypsin inhibitors expressed in transgenic tobacco plants confer resistance against Spodoptera litura. Plant Cell Reporter.-1997.-V. 16. P. 696-699.

182. Yetter M., Saunders R., Boles H. a-Amylase inhibitors from wheat kernels as factors in resistance to postharvest insects //Cereal Chem.-1979.-№ 56. P. 243-244.

183. Yoo В., Aoki K., Xiang Y., Campbell L., Hull R. Characterization of Cucurbita maxima Phloem Serpin-1 (CmPS-1) // J. Biol. Chem.-2000.- V. 275. P. 35122-35128.

184. Zhu-Salzman K., Koiwa H., Salzman R., Shade R. Cowpea Bruchid Callosobruchus maculatus uses a three-component strategy to overcome a plant defensive cysteine protease inhibitor // Insect Molecular Biology.-2003,- № 12. P. 135-145.

Информация о работе
  • Шпирная, Ирина Андреевна
  • кандидата биологических наук
  • Уфа, 2006
  • ВАК 03.00.12
Диссертация
Гидролитические ферменты и их ингибиторы как компоненты системы "насекомое-фитофаг-растение" - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Гидролитические ферменты и их ингибиторы как компоненты системы "насекомое-фитофаг-растение" - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы