Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пищеварительные альфа-амилазы и протеиназы насекомых как элемент специфичного взаимодействия в системе растение-насекомое-фитофаг

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Пищеварительные альфа-амилазы и протеиназы насекомых как элемент специфичного взаимодействия в системе растение-насекомое-фитофаг"

российская академия сельскохозяйственных наук

всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений

На правах рукописи

ФОМИЧЕВА

Юлия Владимировна

ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЕ а-АМИЛАЗЫ И ПРОТЕИНАЗЫ НАСЕКОМЫХ КАК ЭЛЕМЕНТ СПЕЦИФИЧНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СИСТЕМЕ РАСТЕНИЕ -НАСЕКОМОЕ-ФИТОФАГ

Специальность: 03.00.09 — Энтомология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург 1992

Диссертационная работа выполнена в научно-исследовательском институте защиты растений в период аспирантской подготовки в 1988— 1990 г.

Научный руководитель — доктор сельскохозяйственных наук, профессор Вилкова Н. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Буров В. Н.; доктор биологических наук, профессор Гаврилюк И. П.

Ведущая организация — Санкт-Петербургский государственный университет.

Защита состоится « ^5~>> 199 «¿г. в часов

на заседании Специализированного совета Д.020.01.01 при научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 189620, Санкт-Петербург, Пушкин-6, шоссе Подбельского, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке научно-исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Наседкина Г. А.

МТУШЫ10П1МЛ15.Ш. Возросшая опасность' загрязнения окружающей среди пестицидами требует экологизации зашиты растений, а следовательно, развития исследований, связанных о разработкой нехимичес-юк методов зодиты растений. В этом направлении важны разработки теоретических и практических аспектов проблемы иммунитета растений к вредителям, где ключевую роль играет понятие биологической системы растение - насекомое-фитофаг, в основе изучения которой лежит рассмотрение многосторонних разноуровневых связей между растением и насекомым. Наиболее важным в этом плане представляется анализ трофических связей, главным элементом которых выступают пищеварительные .гвдролазы насекомых. Другой-стороной этих взаимодействий являются особенности кормового растения, выражающиеся в различных факторах, препятствующих действию гидролаз на растительные ткаи;. Среди этих факторов особое значение имеет наличие • специфических белков-ингибиторов, которые присутствуют в семенах и вегетативных органах растений многих семейств, в том числе у злаков.

Несмотря на то, что исследования взаимодействия ферментов нв-секомых и природных ингибиторов ведутся уже долгое время, роль ингибиторов как фактора иммунитета остается невыясненной. Очевидно; что для получения целостных представлений об их значении в. устойчивости растений необходимы детальные исследования, как самих ингибиторов, их биохимических свойств, гетерогенности, распространений' в различных таксономических группах растений, так и ферментов насекомых. на которые направлено их действие.

Пищеварительные ферменты насекомых изучены недостаточно, сведения о.них разрозненны. Отсутствует подробная классификация и данные по распространению отдельных классов гидролаз в предела* основных групп вредителей сельскохозяйственных растений. '

Цели и задачи. Цельп- наших.'испледовяний било изучить пищеварительные «-амилазы и протеиназы вредных насекомых, отличающихся .по широте пищевой специализации, типу пищеварения и характеру¡воздействия на кормовое растение, рассмотреть роль этих гидролаз. .во взаимодействии фитофагов с кормовыми растениями на пример» высокоспецифичных взаимодействий «-амилаз и протеиназ насекомых с. белковыми ингибиторами этих гидролаз из злаков.

■ В связи с этим перед-нами стояли следующие задачи? 1. Изучить пищеварительные а-амилазы и протеиназы различных, видов насекомых - фитофагов. ' " ■ •

г..Выявить степень биохимической гетерогенности а-амилаз и протеи. наз этих насекомых.

3. С помощью специфических реакций взаимодействия с природными ингибиторами изучить свойства отдельных компонентов а-амилаз и нро-теиназ и провести их предварительную классификацию.

4. Рассмотреть системы ингибиторов а-амилаз и протеиназ - насекомых ' у различных видов и сортов пшеница, кукурузы, ячменя 'и других злаков.

лизации и обладающих как внутриполостным, так и внекишечнам Ш: •щеварением. Изучен компонентный состав этих ферментов с помощью изоэлектрофокусирования и рассмотрены свойства отдельных компонентов. Показаны различия в степени гетерогенности-и свойствах отдельных компонентов «-амилаз и протеиназ у вредителей, питающихся на вегетативных и репродуктивных органах растений,, а также у насекомых с грызущим и сосущим ротовым аппаратом, отличающихся по характеру воздействия на растение. Впервые с,помощью специально разработанных методик подробно изучены высокоспецифичные взаимодействия гидролаз насекомых и их природных ингибиторов, содержащихся в растениях и получена биохимическая характеристика основных- протеиназ ряда вредных насекомых. Рассмотрен компонентный состав ингибиторов а-амилаз и протеиназ насекомых у различных видов и сор- • тов пшеницы и ячменя, а также линий кукурузы. Выявлена неидентичность характера взаимодействия пищеварительных а-амилаз различных насекомых с кишгонентами ингибиторов «-амилаз из эндосперма шени-, цы. В эндосперме Hordeum bulboeum- обнаружен представитель ' нового класса бифункциональных ингибиторов экзогенных гидролаз, взаимо-. действующий1 с трипбином и а-амилазами насекомых. ■

Практическая ценность работц. разработан метод идентификации ингибиторов гидролаз. Данный метод имеет ряд модификаций применительно к .объектам исследований и может быть использован в биохимии растений и животных для идентификации ин^биторов отдельных компонентов сложных смесей гидролаз.-Метод позволяет. оценивать качественный состав «-амилаз и протеиназ неизученных организмов, в том числе насекомых, что необходимо для поиска адекватных антиалимея- • тарных факторов. По результатам работы'сделано заключение об огра-. ни.ченности. возможногр использования ингибиторов' гидролаз в ■ селек- . ции растений на иммунитет в связи с высокой специфичностью .втогс

иммуногенетического барьера.' .

^ШройахшЯ-ииийливашь Материалы диссертации были долокенн на IX Всесоюзном совещании по иммунитету растений к болезням и вредителям ( Минск 1991 ). По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы, в том числе получено свидетельство об изобретении ( Авторское свидетельство N 1648979).

Объем и структура писсертяния. Диссертация изложена на ^^ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания,объектов и методов исследований, результатов исследования, выводов. Работа содержит -^рисунков, список литературы включает ^'^наименований, из та-ЗЦ? на русском языке.

Во введении раскрыта актуальность тематики, обозначены основные направления работы.

_]_ышш_представляет собой обзор литературы, в котором" рас-• крыты основные направления, по которым ведется изучение биологической системы растение-насекомое на молекулярном уровне, рассмотрены. молекулярные основы иммуногенетических барьеров растений и роль атрептической форды конституционального иммунитета, а также ингибиторного барьера в защитных механизмах растений. Представлены имеющиеся в литературе данные по а-амилазам и протеиназам насекомых и ингибиторам этих гидролаз, содержащихся в растениях разных семейств. Отмечается недостаточность этих данных для получения целостных представлений о характере взаимодействия этих элементов биологической системы.

2 глявя посвядена объектам и методам исследований. . Объекты исследований. Объектами исследований служили пищеварительные «-амилазы и протеиназы насекомых-фитофагов и белковые ' ингибиторы из эндосперма различных видов и сортов пшеницы, ■ ячшвд и линий кукурузы. Источником ферментов" служили имаго и личинка .следующих видов насекомых-фитофагов: вредной черепашки, остроголовой алии, красногрудой пъявицы, овсяной шведской мухи, зернового-точильщика, амбарного долгоносика, рисового долгоносика, большого-мучного хрущака, малого мучного хрущака, булавоусого хрущака, звр^ новой mo.ui, ккной (амбарной)" огневки. р '■ Гидролазы выделяли из гомогенатов пищеварительных органов' •к целых насекогшх. Кишечники и слюнные железы выделяли с помощьи гта-тодики, принятой в лаборатории энтомологии и "иммунитета- растений к.

вредителям, лиофилиэировали или оамораитши при -7о"С. .< -Амилазы йкстрагировали 0.1» раствором OuOi (из гомигенитои ь-кратким огамом, из кишечников 1-5 органов на мо мкл. иа одкшпм жбдео - 5 -:о органов на 100 мкл). Протеюшзи экйтрагаровали 0.05 M раствором дитиоэритритола (из гомогенатов - 5 кратным объемом, из кишечников - ю - 20 органов на юо мкл).

Фракции белков, содержащих"ингибиторы извлекали'из размолотых зерен, лишенних зародишей 4-кратним объемом веди в течение одного часа при 2ûéC. 0-амилазц инактировали прогреванием при «о0с в течение Ь минут. Ингибиторы тиоловых протеиназ извлекали ¡¿-кратным объемом 2 M мочевины. Для аналитического фракционирования белков зерна и ферментов насекомых использовалось инс^кусирование в уль-третонких пластинах 6st полиакришлнднаго геля (ИА.АГ) на приСоре Multiphop II (ШВ, Швеция). 1.5-2 часа и ï'ùet systeai (LKB, Швеция). Гель-фильтрацию белков зернь проводим в тонком слое ге-ля(сефадекс g-ioo) нанесенного на подложку.

Амилазы и протеиназы, а также ингибиторы этих гидролаз выявляли в спектрах помощью методов, разработанных А.В.'Коиаревым ранее (1982;,1985). Ингибиторы протеиназ выявляли методом желатиновых реплик, ингибиторы «-амилаз - с использованием i>% ПААР- реплики, содержащей крахмал и изучаемую а-амилазу: После контакта с гелем, на котором проводилось фракционирование, реплику проявляли в растворе J/KJ.

Протеиназы выявляли по гидролизу желатины фотопленки, а также синтетических субстратов. Для работы с и-бензоил-вь-аргинин-р-нит-роанилидом (БЯША,) применяли модифицированный нами метод Оллсона (Ohleson et al., 1986) Для анализа протеиназ с эцетил-Ын$енилала-нин-2-нафтиловым' эфиром (АФНЭ) применяли модифицированный наш метод Хейгарда (Hedgaard, 1982).

Методы перекрестного анализа взаимодействия компонентов гад-ролва ингибиторов входили в задачу работы и подробно описаны, в главе, посвященной результатам исследований)..

а-Амилазы и протеиназы очищали с по^сцыа препаративного- изо' фокусирования в геле-"Ultrodex" (lkb) , а также .аффинной. хроматографией на'агарозе,.связанной с соевым ингибитором трипсина. . Активность ингибиторов протеиназ определяли по • гидролизу ■ БАША в, 0.05 M трис-HOi буфере pH ?..8 в 96-луночных'планшетах. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторностях, результата обрабатывались статистически. '

т глава. Гетерогенность а- амилаз вредных насекомых.'

На современном этапе изучения пищеварительных функций насекомых не достаточно лишь сведений о наборе гидролитических фермен- ■ тов. Необходимым является рассмотрение характера спектров пищеварительных гидролаз, выступающего в качестве центрального механизма становления пищевой специализации насекомых, в том числе, фитофагов. Степень гетерогенности пищеварительных эндогидролаз, расщепляющих нативный субстрат, определяет уровень приспособленности фитофагов к разнообразному пищевому субстрату. В связи с этим в изучении пищеварительных ферментов одним из первых этапов является рассмотрение их компонентного состава. Широкая представленность в . растении углеводов определяет большой удельный вес карбогидраз, среди которых-наиболее важной является а-амилаза. Для фракционирования гидролаз нами применялось изофокусирование, так как этот метод имеет наибольшую разрешающую способность и ряд других характеристик,- делающих его удобным в работе (veвtвгbвгg, 1970).

Результаты исследований показали,что а-амилазы у всех изучен-' ных насекомых гетерогенны.. Спектры а-амилаз свидетельствуют о ви-\' доспецифгшости их компонентного состава. Амилазы насекомых", повреждающих вегетативные органы растений отличаются низкой активностью и бедным компонентным составом. Насекомые, питающиеся зрелым зерном, в частности, вредители запасов (зерновой точильщик, амбарный долгоносик, суринамский мукоед, малый мучной и Оулавоусый хру-■ щаки) обладают «-амилазами, представленными большим числом компонентов, что связано с питанием этих видов трудногидролизуемым субстратом - зрелым зерном. Каиболее богатый компонентный состав у ■ а-амилаз клопов - остроголовой элии и вредной черепашки, способных питаться как на вегетативных,так и на репродуктивных органах рас-, тений. Амилазы слюнных желез и кишечника у этих клопов отличаются по компонентному составу,, а также свойствам компонентов. В частно-^ сти, а-амилазы слюнных желез и кишечника вредной черепашки различаются по термостабильности. Более термостабильным является главный компонент кишечной а-амилазы, сохраняющий свою активность щи 70*0, тогда как главный компонент слюнной «-ймилазы инактивируется при 50 °С. ..

При работе с малоизученными ферментами насекомых уже на ран-сних этапах исследований необходимы подходы, позволяющие оценивать 'степень биохимической гетерогенности кошонентов. .

О характере неоднородности компонентов ферментов можно' су-

• ■ ' 5

дать на основании их взаимодействия со спецв^ческимя факторами субстрата, среди которых целесообразно исполъиоьач'ъ белковые . ингибиторы гидролаз, т.к. отношение к ингибиторам является одной из наиболее важных биохимических характеристик фермента. Для выясне- . ния степени неоднородности компонентов спектра <*-амилаэ по отношению к ингибиторам, мы разработали специальные методы. Их суть заключается в том, что раздельно проводится Фракционирование а-шялвз И белковых ингибиторов, затем создаются условия для перекрестного взаимодействия компонентов этих спектров. При совмещении гелей в результате диффузии компоненты мигрируют из геля в гель. В точке пересечения компонентов «-ашхьз с ингибиторами происходит их инактивация.

Как показали наши исследования, «-ямилваы разных видов насекомых отличаются по чувствительности к пшеничным ингибиторам. а-Амилазы клопов очень слабо ингиОируются альбуминами пшеницы: Компоненты «-вмилаз слюшых желез и кишечника остроголовой алии и вредной черепашки неоднородны по чувствительности к ингибиторам. У. остроговой 8лии часть компонентов слюнных а-амилаз1 (с р1~7) не взаимодействуют с ингибиторами; компоненты с р1~ з.5 чувствительны к ингибиторам фракции с м.м. 12 кДа, специфичных для а-амилаз насекомых (рис.1А)'. Слинная «-амилаза вредной.черепашки ,в условиях наших вкспериментов не взаимодействовала со всеми тремя фракциями ингибиторов в эндосперме мягкой пшеницы (с м.м. 12; 24; и 60 кДа). По-видимому, ето связано с различиями в онтогенетической специфичности этих ьидов! остроголовая елия питается зерном в стада моло-• чно-восковой спелости, а вредная черепашка способна питаться зерном в стадии полной спелости, когда содержание ингибиторов в .эндосперме максимально. В связи с этим у вредной , черепашки выработалось адаптация пищеварительных ферментов, нечувствительных к ингибиторам. Не отмечено и действие ингибиторов из эндосперма пшеницы на компоненты а-амилаз красногрудой пьявицы, питающейся на вегетативных частях растения. С другой стороны, а-адаилазы зернового точильщика (рис. 1Б), амбарного долгоносик?.;и большого мучного хру-. щака сходным образом-реагируют с большим числом.компонентов ингибиторов из эндосперма мягкой пшеницы, принадлежащим к фракциям с М.м.'12 и 24 кЦа (компоненты с м.м. 60 кДа в данных условиях идентифицировать трудно). Амилазы вредителей запасов обладают повышенным уровнем активности пищеварительных «-амилаз для преодоления ингибируюцэго действия белков зерна, .

т.з

5.1

рВ

«гишагта^авдм 'шимигощ щ^иие

ьу

* р!

ВIII I! 11 1818

12ч1а

24 кД«

7.3

Рис. 1. Анализ взаимодействия компонентов <*-згдшз слюнных -желез остроголовой влгя (А) и а-аьилаз кишечника зетового точильщика (В) с ингибиторами из эндосперма мягкой шенищ с. Безостая I. -а - изофокусяижаяие «-амилаз;

б - картина перекрестного взаимодействия компонентов «-амилаз и ингибиторов;

в - изофскусирсвачгге ингибиторов. ,

4. глава. Гетерогенность протеиназ вредных насекомых. 1 У кгсекск-ас з пгзевзрителыгой системе . функционируют протео-литнческне фертяте, йранжаитае 'участке как в начальных этапах пицевареккя (яротеинззы),. так и з ггрсмежуточнш: (амино и карбокск-"леяткдззы) к конечных {дипептядзэы). СчеЕкио.что язучение основных элементов биохимического взаимодействия' насекомых к растений

Т

должно включать выяснение характера комплексов л^о-геин^а, сиосо<3-ных гидролизовать нативные белки растения. Для выяснения степени ■ гетерогенности и- биохимической природы компонентов протеиназ были применены как стандартные методики, модифицированные нами для решения поставленных задач, так и специально разработанный наш тод перекрестного анализа. Из синтетических субстратов, наиболее часто применяемых для характеристики протеиназ нами были использо-вены бензоил-аргинин-п-нитроашшд (ЕАЛНА) и ацетилфетшвланинэти-ловый эфир (АФЯЭ). У насекомых, повреждающих вегетативные органы злаков (красногрудая пьявица и ¡¡¡ведекая муха) не удалось выявить' активность к БАША и АФНЭ, тогда как вредители запасов (большой мучной хрущак, зерновой томильщик, малый-и Сульвлусый хрущаки, су-ринамский мукоед), обладают протеиназами, гидролиьувдими ЕА1ША, су-, бстрат тр1Шсиновых ферментов. У малого хрущака и мукоеда удалось выявить протеиназные компоненты, гидрализующие АФНЭ. Однако, этот подход не позволяет охарактеризовать- все разнообразие протеиназ в связи с низкой чувствительностью ферментов насекомых к синтетическим субстратен. Поэтому для установления природы отдельных компонентов этих ферментов нами был использован метод анализа перекрестного взаимодействия компонентов ферментов и.ингибиторов из растений.

С помощью описанного метода были проанализированы протеина-зы насекомых-фитофагов, питающихся зрелым зерном (вредители запасов) и вегетативными органами (красногрудая ггьявица и шведская муха). Среди, куков-вредителей запасов богатым спектром протеиназ • обладает большэй мучной хрущак. Изучение взаимодействия щелочных протеиназ большого мучного хрущака с ингибиторами из эндосперма мягкой пшеницы продемонстрировало различную природу этих компонен-. тов. На рис 2 показана картина перекрестного взаимодействия 'этих элементов, из нее видно, что компонент с р1 г 10.5 - это химотрип-синоподобная протеиназа, а компонент с р1 ~.7.Э - трипсиноподобная протеиназа.

Протеинааы зернового точильщика также лредставлены большим 'числом компонентов с.различными изоточкамн. Все пять главных, компонентов, обладающих БАПНА-зной и желатиназной активностью реагируют с ингибиторами трипсина,следовательно, являются трипешоподо-■ бными протеиназами. Из данных литературы известно, что протеиназы жуков р. амьоИит активны в кислых областях значений рн. Изучение вэвимодействия этих ферментов с ингибиторами с помощью перекрестного метода показало, что они являются тиоловыми протеиназами.

7.3

-I-Г

10,6

7.3

Ш

7.3 Ю.6

• Рис. 2. Анализ взаимодействия компонентов протеиназ большого мучного хрущака с ингибиторами из эндосперма пшеницы с. Безостая 1. а -изофокусирование протеиназ; б - изофокусирование ингибиторов химотрипсина; в - картина перекрестного взаимодействия компонентов протеиназ и ингибиторов;

г - изофокусирование ингибиторов трипсина.

Ранее было установлено, (Конарев, 1986), что у амбарного и рисового долгоносиков щелочные протеинаы являются химотрипсин'о-- подобными ферментами. Использование перекрестного мётода позво-, лило получить четкие картины, подтверждающие эти данные .

. В. спектре протеиназ суринамского Мукоеда ОгугаерШив вш*1-тгаепв1в- были охарактеризованы три компонента, два из которых вели себя как трипсиноподобные, а один - как химотрипсиноподобный. Три-.'псиноподобные протеиназы были также идентифицированы с помощью перекрестного метода у личинок южной огневки. •

Изучение субстратной специфичности протеиназ вредной черепашки показало, что эти протеиназы очень слабо' гидролизовали БАГОЦ И желатин, но проявляли активность по АФНЭ. Перекрестный анализ (с . использованием обогащенных афишной хроматографией препаратов ин-

гибиторов) показал, что эти компоненты чувствительны к ингибиторам трипсина из пшеницы и к соевому ингибитору трипсина и не взаимодействуют с ингибитором химотрипсина.

У шведской мухи основные компоненты протеиназ также являются трипсшюподобными. Проведенные исследования свидетельствуют,, что трипсиноподобные ферменты характерны как для насекомых, питающихся зрелым зерном, так и повреждающих вегетативные органы злаков. Расширение спектра протеиназ, участвующих в пищеварении явилось важным эволюционным преимуществом, позволивши« насекомым аффективно' переваривать различные растительные белки.

6 главар Взаимодействие e-амилаз насекомых с белковыми ингибиторами из эндосперма разных злаковых культур.. В наших исследованиях рассмотрены взаимодействия а-амилаз насекомых с белковыми ингибиторами из разных злаков. Представляет интерес изучение ингибиторов иЗ ячменя, кукурузы и овса, так как зерно втих злаков, по данным ряда авторов (Granum, 1975s Silano at ■el., 1977? Sanohez-Monge at al., 1^86; Baker. 1988) He содержит-специфических ингибиторов «-амилазы человека. Г • Ферменты большого мучного хрущака, амбарного долгоносика, зе-рновога .точильщика, больиогд и «алого хрущаков сходно реагировали с компонентами белковых фракций с молекулярной массой 12, 24 и 60-кДа, выделенных из мягкой и твердой пшеницы, а также с различными компонентами ингибиторов однозернянок. Амилазы зернового точильщика наименее чувствительны к ингибиторам а-амилаз. Фермент суринам-ского мукоеда, обладая общей высокой чувствительностью к ингибиторам, не взаимодействовал с компонентами'ингибиторов, специфичных к «-амилазам насекомых из мягкой пшеницы и Tritioum boeotioum, но реагировал с низкомолекулярашми ингибиторами «-амилаз из кукуруза.

Изучение компонентного состава ингибиторов у двух видов дикого и .10-ти сортов культурного ячменя показало различия в -характере взаимодействия этих ингибиторов с ферментами трех видов насе-комух. Наиболее полный состав ингибиторов у всех изученных образцов наблюдается при проявлении спектроч сс-амилазой большого' мучного хрущака. Спектр ингибиторов, проявленных ферментом -амбарного долгоносика несколько обеднен, однако в нем присутствует ряд специфических компонентов (рис.э). Как выяснилось при более детальном исследовании, большинство компонентов принадлежит к фракции с молекулярной массой 24 кДа, тогда как а-амилазу мучного, хрущака ин-гибируют альбумины'с молекулярной массой 12, 24 и бо кДа (рис.4).

. ' 10

■pH

а .-.6 в г ■ д .-е-ж а • и .к л м н.'.' - б в

к л м н

л к

5,0

| - » » -с

Рис. а Изофокусирование ингибиторов агйшиаз насекомых, выделенных из эндосперма различных гидов и сортов ячменя:

& - Tnticum aestivum с. Chinese 'spring; б - Hordeum spontsneum к-212; б - Н. bulbosum W-47; г-н - Н. vulgare: r - с. Иытева 1104; д - с. Нутанс 56; е - с. Черниговский 5; ж - с. Бутане 106; з-с. Domen; и - с. Одесский 31; м - Одесский 46; н - с. Пиркка

Спектры проявлены:;«-амилазами; амбарного долгоносика (А); большого мучного хрущака (Б); зернового точильщика (В).

7,3

5.0

. . —-.-1— ■ —-«--.. ■—i---- t ■ ( —►

12 гц 60 12 2<» ■ 12 24 12 24

I

Рио4,Схема двумерного Фракционирования изофокусированием' и тонкослойной гель-фильтрацией ингибиторов а-амилаз из эндосперма 'ячменя Hordeum bulbosum И-47 (А,Б) и Н. vulgare с. Черниговский 5 (В,Г), активных к «-амилазам большого мучного хрущака (А,В) и ам-Оврного долгоносика (Б,Г)..

6 глава. Взаимодействие протеиназ с белковыми ингибиторами из 'эндосперма злаков. : "

; Как известно, в растениях многих семейств обнаружены ингибиторы трипсина, изучение которых имеет большое значение< в связи с тем, что трипсиноподобные ферменты широко распространены в природе и встречаются как .у высших животных, так и у насекомых-фитофагов и возбудителей заболеваний, tibi проанализировали изоэлектрические спектры ингибиторов, выделенных из мягкой и твердой пшеницы, однозернянок, ячменя, ржи и кукурузы, проявляя их очищенными фракциями трипсиноподобных ферментов различных насекомых. Эти спектры были сходны между собой. Не обнаружено принципиальных; различий между йтими спектрами и спектрами ингибиторов бычьего трипсина, то есть протеиназы насекомых и млекопитающих, в отличие от а-амилаз инги-бируются одной и той же системой инги'иторов. Измерения активности ингибиторов трипсина по отношению к различным протеиназам показало/ что наиболее интенсивно с ингибиторами взаимодействует фермент вераового гочилыцика. Его чувствительность примерно в ю раз превышает, чувствительность других- протеиназ. Ингибируицая активность к бычьему, трипсину была низкой у всех проанализированных образцов

• 12

пшеници, отличающихся по набору ингибиторов трипсина. По-видимому, подобные отношения имеют место и в природе.

¿(ед/ил).

0.5

0.*

О.Э

0,2

0.1

4:

Рис. 5. Активность ингибиторов трипсина из. эндосперма раалич-■"",ов и совтов пшеницы по отношению к протеиназам: - зернового точильщика; . . . .

суринамского•мукоеда;

^NN>1 большого мучного хрущака?

1Н1И11111 - бычьему трипсину,.

ГгШош аевИтош с.Безостая 1; 2 зрг1п£; 3 - Т. топоооооит К-14237; 4 - Т. аавШит с. Аврора 51.

Т.' аевиуш с. СЫ.певе . аевИуит с. Аврора 49; 5

Интересной стороной, вопроса о функции ингибиторов в зерне 'злаков является наличие бифункциональных ингибиторов. Исследования зарубежных авторов показали, что'в эндосперме кукурузы содержится белок, проявляющий. ингибирующую активность к а-амилазе малого мучного хрущака и бычьему трипсину Ш^азМеоп еЬ а:., 1937). В наших исследованиях этот белок, имеющий изоточку в области рН^б.о инги-■ ' ■ .'•■;.■ • '13

т

бировал «-амилазы всех изученных видов насекомых, а так же их три-' псиноподобные нротеиназы. Подобный бифункци ональный ингибитор был обнаружен наш у ячменя Ногйеиш Ьи1Ьовит. Эти исследования показали, что различное отношение'а-амилаз насекомых-к низкомолекуляряым ингибиторам пшеницы, ржи, ячменя и ¡кукурузы может объясняться как варьированием общей чувствительности к ингибиторам так и различием природы этих белков.

10,5

3,0 .

б

2

3

4

Рис. 6. Выявление бифункциональных ингибиторов трипсина

а-амилаз насекомых среди белков эндосперма злаков: 1 - ТгШошп Ьоеоисит К - 40118: 2 - Т. Ьоед«ош(ДжебраильскиЙ р-н); Ногйеит Ьи1Ъозш V-47; 4 - геа таув Мо 1Т. а - необработанный препарат; б - препарат обработан трипсин-с'ефарозой.

Таким образом, проведенные исследования позволяют предположить, что белковые ингибиторы гидролаз являются наиболее специфичным фактором иммунитета'растений к вредным организмам. Высокая активность, стабильность в различных.условиях, наличие большого числа компонентов, специфичней реагирующих с определенными ферментами вредных организмов, обусловливает важную роль этих белков в "жизнедеятельности как самого растения, так и питающихся им насе-.. комых. Исследования биохимических сторон взаимодействия ферментов насекомых и белков кормовых растений необходимы для генетических и селекционных разработок, направленных на получение.устойчивых.сортов растений. Применение ингибиторов в селёкции для получения устойчивых сортов растений ограничено в связи с высокой специфичное-, тью данного иммуногенетического барьера. • Однако, использование свойств белкрв для получения сортов, имеющих полезные признаки

• • и

б

•(устойчивость к вредным организмам, питательная ценность) в гене-'тической инженерии, считают весьма перспективным (Sohukle, liurdook, 1983), так как белки являются прямыми продуктами гена. Кроме того, ■устойчивость к насекомым этих, форм растений не связана с ухудшением питательных свойств для человека и млекопитающих.. С помощью переноса гена повышенного синтеза ингибитора трипсина получены устойчивые к повреждению насекомыми фоДш растений (Boulter at 'al., :1984; Gatehouse, Hilder, 1986; Hilder at al., 1937).'

выводы .

. 1, Показано, что насекомые-фитофаги облада'юг гетерогенными пищеварительными «-амилазами и протеиназами. Изучение изоэлектри-ческих спектров этих эндогидролаз показало видоспецифичность их компонентного состава.

•2. Насекомые, повреждающие вегетативные и репродуктивные органы злаков отличаются по степени гетерогенности пищеварительных гидролаз. Амилазы клопов, связанные с внекишечным и внутриполост-нш пищеварением отличаются по степени гетерогенности и свойствам основных.компонентов, в частности, по термостабильности.'

' з. Белковые ингибиторы гидролаз, содержащиеся в растениях являются элементами высокоспецифичного взаимодействия растения и насекомого, Ингибиторы.«-амилаз выступают одним из факторов, воздействующих на адаптации пищеварительных 'ферментов, выражающиеся в различной чувствительности а-амилаз фитофагов к пшеничным ингибиторам.

4. У насекомых-фитофагов выявлены протеиназы разных типов -трипсиноподобные, химотрипсиноподобные и тиоловые. Показано, что трипсиноподобные протеиназы характерны для всех . изученных видов насекомых, как повреждающих зерно, ,так 'И вегетативные органы растений'.. , ' ' ' ' ''•'• '

5./Разработан метод анализа специфичных взаимодействий компонентов гидролаз на стадии' аналитического фракционирования. Получено авторское свидетельство я 1648979 заявка N 4692980 от 22 мая 1989 Г. •

.6. Показано,что а-аМилазы разных насекомых отличаются по составу своих ингибиторов.в эвдосперме разных видов и сортов ячменя, что свидетельствует о высокой специфичности ингибиторного иммуно-генетического барьера. .

7. Установлено,.что трипсиноподобные ферменты насекомых инги

бируются теми же компонентами ингибиторов у пшеницы, ячменя и кукурузы, что и .трипсин поджелудочной железы быка.

8. В эндосперме ячменя Ногйеш Ьи1Ьозиш обнаружен неописанный ранее ингибитор, принадлежащий к особому классу бифункциональных ингибиторов экзогенных гидролаз, способных ингибировать трипсин и ст-амилазы насекомых.

1. А,с. 1648979 (СССР) Способ идентификации ингибиторов- гидролаз./ Всес. НИИ защиты растений? Авт. ' изобрет. Ал.В. Конарев,. Ю.В.Фомичева, Н.А.Вилкова.- Заявл.' 22.05.89., № 4692930/13! Опубл. В Б.И.,1991., № 18.

2. Конарев Ал.В., Фомичева Ю.В., Перекрестный анализ' взаимодействия компонентов а-амилэз и протеиназ насекомых с белковыми ингибиторами из эндосперма пшеницы // Биохимия.- 1991. - Т. 56, Вып 4. - С. 628-638. , '

■ з. Конарев Ал.В., Фомичева Ю.В. Ингибиторы гидролаз и сопряженная эволюция злаков и вредных насекомых // Тез.докл. IX Всес. совещ. по иммунитету растений к болезням и вредителям. Сент. 1991Г.Т Минск, 1991..-Т. 2, С.>276'-"271." , ;

^ • » ' • 4 ...