Активность гидролитических ферментов и их ингибиторов в тканях картофеля и колорадского жука: методические аспекты

Шевченко, Наталья Дмитриевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Активность гидролитических ферментов и их ингибиторов в тканях картофеля и колорадского жука: методические аспекты
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Активность гидролитических ферментов и их ингибиторов в тканях картофеля и колорадского жука: методические аспекты"

На правах рукописи

Шевченко Наталья Дмитриевна

АКТИВНОСТЬ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ИХ ИНГИБИТОРОВ В ТКАНЯХ КАРТОФЕЛЯ И КОЛОРАДСКОГО ЖУКА: МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

03.01,05- физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА-2010

004604960

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ГОУ ВПО

«Башкирский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ибрагимов Ринат Исмагилович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шакирова Фарида Минихановна; кандидат биологических наук, доцент Исаев Рустэм Фидаевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Саратовский государственный

университет им. Н.Г.Чернышевского»

Защита диссертации состоится "июня 2010 г. в 14_часов на

заседании Диссертационного совета Д 212.013.11 при Башкирском государственном университете по адресу: 450074, г. Уфа, ул. З.Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332. Официальный сайт: http://www.bashedu.ru Факс (347)273-67-78; e-mail: disbiobsu@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета и с авторефератом на официальном сайте http://www.bashedu.ru/autoreferat/autoreferat.htm

Автореферат разослан "_ /о? " мая 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Шарипова М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Синтез белков с антимикробными свойствами является одной из универсальных защитных реакций растений при воздействии на них биотических и абиотических факторов (Сотченков, Голденкова, 2003). К таким молекулам относятся и ингибиторы, способные нейтрализовать гидролитические (пищеварительные) ферменты патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Наиболее подробные сведения получены о защитной роли растительных ингибиторов, действующих на протеолитические ферменты. Показано, что выделенные из семян бобовых, злаковых растений, клубней картофеля препараты ингибировали действие ферментов микроорганизмов, и вследствие этого, были способны подавлять рост и развитие колоний патогенных грибов (Мосолов, 1983; Валуева, Мосолов, 2002; 2006; Конарев, 2002). С. Рианом и его сотрудниками было обнаружено, что поранение тканей личинками колорадского жука приводит к системному повышению активности ингибиторов протеиназ во всех органах растений томатов и картофеля (Green, Ryan, 1972; Ryan, 1981). Ингибиторы протеолитических ферментов выявлены практически у всех исследованных представителей дикорастущих и культурных растений (Валуева, Мосолов, 2006). Широкое распространение ингибиторов протеиназ и их содержание в значительных количествах в тканях растений позволяют говорить о них как об одном из важных звеньев в регуляции физиологических и патологических процессов. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что в растительных тканях, должны функционировать и ингибиторы других гидролаз: амилаз, пектиназ, целлюлаз, эстераз. Однако, экспериментальные сведения об этих гидролитических ферментах и их ингибиторах при взаимодействии растений с фитопатогенами в научной литературе пока весьма ограничены (Фомичева, 1992; Яруллина, Ибрагимов, 2006). По-видимому, функционирование в растительном организме генетически детерминированной системы ингибиторов гидролитических ферментов представляет важную часть механизма противостояния растений организмам-фитофагам, т.е. механизма, обеспечивающего устойчивость растений. В связи с вышесказанным, исследования гидролитических ферментов, их ингибиторов при взаимодействии растительного организма с фитофагами приобретают особую актуальность и имеют важное значение как в научном, так и практическом отношении. В значительной степени, накопление новых фактов в этом плане ограничивается недостатком методов, позволяющих параллельно измерять ферментативную и ингибиторную активности в биологических объектах.

Кроме того, существующие в настоящее время методы измерения активности гидролаз довольно трудоемки, и поэтому не позволяют одновременно анализировать большое количество образцов (Ермаков, 1987; Камышников, 2003; Хазиев, 2005).

Цель и задачи исследований. Цель нашей работы заключалось в разработке и модификации новых методов измерения активности гидролаз, их ингибиторов, позволяющих анализировать эти молекулы как компоненты единого функционального комплекса при взаимодействии растений с патогенными микроорганизмами и насекомыми-вредителями.

Весьма удобной моделью для проведения исследований такого рода является природная система «картофель - колорадский жук». Исследование гидролитических ферментов, их ингибиторов при взаимодействии картофеля и колорадского жука позволит получить и ценный экспериментальный материал о физиологических, биохимических механизмах взаимоотношений сельскохозяйственных растений и насекомых- вредителей.

Соответственно, в процессе выполнения работы решались следующие задачи:

- разработка новых методов определения активности амилаз, липаз и их ингибиторов в тканях растений и насекомых;

- модификация методов измерения активности целлюлаз, пектиназ и их ингибиторов в тканях растений и насекомых;

- измерение уровня активности гидролитических ферментов в тканях личинок и имаго колорадского жука, обитающих на различных территориях;

- измерение уровня активности гидролитических ферментов и ингибиторов гидролаз в тканях картофеля районированных сортов и перспективных селекционных сортообразцов картофеля.

Научная новизна. Разработаны новые методы измерения активности гидролитических ферментов и их ингибиторов. Впервые получены сведения об ингибиторах из различных сортов картофеля, подавляющих активность пектиназ, целлюлаз, липаз колорадского жука. Впервые показана зависимость показателя уровня активности гидролитических ферментов колорадского жука от местообитания насекомых.

Практическая значимость. Предложенные методы могут быть использованы в селекции сельскохозяйственных культур для оценки степени устойчивости их к патогенным микроорганизмам и насекомым-фитофагам, в системе мониторинга агрессивности и пищевой активности различных популяций (групп) насекомых-вредителей культурных растений.

Апробация результатов. Результаты исследований были представлены на Втором международном симпозиуме «Сигнальные

системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006 г.); десятой конференции «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2006 г.); школе-семинаре молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии, посвященной памяти В.Г Конарева (Уфа, 2007 г.); Международном симпозиуме «Липиды и оксилипины растений» (Казань, 2008.); Всероссийской научно- практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Вятка, 2007 г.); Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007 г.); Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире» (Улан-Удэ, 2007 г.); пятом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008 г.); Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к

неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ для кандидатских диссертаций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературных данных, описания объектов и методов исследований, изложения и обсуждения результатов исследований, выводов. Список литературы включает 243 наименований, в том числе 98 - на иностранных языках. Работа изложена на 116 страницах и содержит 13 таблиц и 16 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом для исследования служили клубни, проростки, листья картофеля (Solanum tuberosum L.) нескольких сортов и селекционных образцов Башкирского НИИ сельского хозяйства РАСХН; личинки и имаго колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata). Насекомых собирали на посевах картофеля в различных районах Республики Башкортостан.

Активность протеолитических ферментов, их ингибиторов определяли по скорости гидролиза субстрата 1\',а-бензоил-ОЬ-аргиник-4-нитроанилида (Erlanger, Kokowski, Cohen, 1961) и по скорости гидролиза белковых субстратов в агар оптом геле (Ибрагимов и др., 2001). Активность амилаз, целлюлаз, пектиназ, эстераз и их ингибиторов - по скорости гидролиза иммобилизованных в агарозный гель субстратов для этих ферментов: крахмала, карбоксиметилцеллюлозы, яблочного пектина и твин-20 (описания методов даны в главе ((Результаты и обсуждение»).

Для определения концентрации белка в растворах использовали метод М. Бредфорд (Bradford, 1976). Калибровочную кривую составляли по а-химотрипсину. Статистическую обработку полученных данных

проводили с помощью программы Excel (Microsoft Office), однофакторный дисперсионный анализ в программе Statistica 5.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и их ингибиторов по гидролизу субстратов в агарозном геле (модификация методов)

Как уже отмечалось, большая часть используемых на практике методов измерения активности гидролаз и их ингибиторов довольно трудоемка и требует многоступенчатой предварительной очистки биологических экстрактов. Соответственно, эти методы малопригодны для одновременного измерения активности большого количества образцов, которое неизбежно при сравнительном анализе нескольких сортов растений, популяций насекомых и др. Ранее в нашей лаборатории был разработан метод измерения протеолитической и антипротеолитической активности в экстрактах . с использованием иммобилизованной ( на фотопластинах) желатины (патент РФ № 2175134, 2001). Мы предположили, что такой подход, т.е. иммобилизацию ферментного субстрата в соответствующий носитель можно использовать и для измерения активности других гидролаз. Предварительные эксперименты показали, что наиболее подходящим для иммобилизации ферментных субстратов оказался гель агарозы.

Суть предложенного нами подхода заключается в иммобилизации ферментного субстрата в ага^озный гель, инкубации геля с фермеьгным раствором и последующем определении активности ферментов по размеру гидролизованного участка окрашенного субстрата. Во время инкубации, молекулы фермента из раствора диффундируют в гель и гидролизуют субстрат вокруг лунки. Скорость диффузии молекул фермента в геле пропорциональна его исходной концентрации в растворе. Следовательно, размер площади гидролизованного участка зависит от начальной концентрации молекул фермента в лунке и отражает его активность.

Для измерения активности пектинметилэстераз в качестве субстрата нами был использован 1 % - ный яблочный пектин. Конечная концентрация реактивов в смеси составляла: агара - 1 %, пектина-1%, ацетата кальция -0,5 %.

Субстратную смесь нагревали на водяной бане до растворения агара (80 °С) и заливали в пластиковые кюветы. На каждую кювету приходилось 20 мл агарозного раствора. После формирования стабильного геля, в пластине вырезали лунки d = 4 мм. В лунки помещали по 20 мкл ферментного раствора, инкубировали в течение 24 ч при температуре 30°. Реакцию гидролиза остановливали добавлением 10 % раствора ацетата

меди. Участки геля с гидролизованным пектином проявлялись в виде светлых зон округлой формы вокруг лунок, на голубом фоне (рис I, А).

А) Б) 1 1 2

Рис.1. Определение активности псктинач колорадского жука (А), целлюлоз колорадского жука и микромицета Тг1с1юс1егта гее.чеЦБ). ! - колорадский жук (имаго); 2 - Г. гее$е1 (коммерческий препарат. 1мг/мл) Примечание: субстрат для пектиназ яблочный пектин; субстрат для целлюлаз -КМЦ. Здесь и в последующих рисунках, стрелками показан диаметр окружности гидролизованого участка.

Для определения активности целлюлолитических ферментов готовили субстратную смесь, состоящую из 1% агара и 1 % раствора карбоксиметилцеллюлозы. Действие целлюлаз обнаруживали, обрабатывая пластины 6 % раствором ацетата свинца. Зоны гидролиза проявлялись в виде колец молочно-белого цвета на прозрачном фоне (рис. 1, Б).

Активность ферментов (пектиназ. целлюлаз) рассчитывали, измеряя размер участка геля с гидролизованным субстратом вокруг лунки. За 1 единицу активности (Е) принимали такое количество фермера, которое гидролизовало субстрат на участке геля размером 1 мм2. Так, активность пектиназ колорадского жука, представленных на рис.1 составила 78,5 ± 0,5Е/г массы, целлюлаз - 1!7,9±0,3 Е/г массы. Ферментный препарат из гриба Тг1сИос1егта гееэе! в концентрации !мг/мл обладал целлюлазной активностью 125.2 ± 0,3 Е/мг.

Предложенные методы позволяет измерять активность, как коммерческих ферментных препаратов (ферментов с высокой степенью очистки), так и активность пектиназ и целлюлаз в биологических экстрактах, подвергнутых лишь грубой очистке. В таблице 1 приведены данные об уровне активности этих ферментов в тканях картофеля и колорадского жука. Как видно, с помощью предложенных методов можно определить уровень пектолитической и целлюлазной активности и в растительных тканях, и в тканях насекомых. Более того, описанные методы параллельно с измерением активности ферментов, позволяют определять и активность их ингибиторов. Для этого необходимо одновременное проведение реакции гидролиза субстрата свободным ферментом, и ферментом при присутствии ингибитора в инкубационной

среде. По разнице размеров площадей гидролизованных участков геля со свободным ферментом и фермента с ингибитором, рассчитывается ингибиторная активность.

Таблица 1

Активность пектиназ и цедлюлаз в органах картофеля (сорт Невский), в тканях личинок и имаго колорадского жука (Е/г массы)

Объект Пектиназы Целлюлазы

Покоящиеся клубни 0,7±0,1 10,8±0,2

Этиолированные проростки (5 сут.) 0 0

Зеленые проростки картофеля 26,5±0,1 8,0±0,2

Листья картофеля 49,5±3,0 0

Имаго ( замороженные, 6 мес.) 12,0±0,2 19,0±0,2

Имаго (живые) 78,5+0,2 117,9±0,3

Личинки (замороженные, 6 мес.) 11,0±0,1 25,0±0,2

Личинки (живые) 98,5±0,3 125,0±0,2

Невысокая трудоемкость, использование микрообъемов ферментных препаратов, простая технология проведения реакций гидролиза дают возможность исследователю одновременно анализировать большое количес.во образцов. В наших опытах одик исследователь одновременно мог анализировать до 30 биологических образцов в трехкратной повторности.

Определение активности липаз, амилаз и их ингибиторов методом агаротых гелевых пластин (разработка метода)

В качестве субстрата для липолитических ферментов нами был выбран твин -20 (полиоксиэтиленсорбитмонолаурат). Принцип проведения реакции гидролиза и измерения активности фермента был аналогичен измерению пектиназной и целлюлазной активности: иммобилизация субстрата в агарозный гель, затем инкубация геля с ферментом и измерение активности фермента по размеру гидролизованного участка окрашенного субстрата.

Для приготовления гелевой пластины с иммобилизованным субстратом для липаз, к горячему (70° С) 1% водному раствору агарозы приливали 1 мл твина-20, предварительно окрашенного красителем (судан IV) до интенсивно красного цвет. Реакцию гидролиза субстрата

останавливали, помещая пластины в 30 %-ный раствор уксусной кислоты. Участки геля с гидролизованным субстратом проявлялись в виде светлых зон вокру: лунок на общем коричнево- красном фоне (рис.2). Активность твингидролизующих ферментов из имаго в этом случае оказалась равной 32,0 ± 0,2 Е/г массы.

Рис. 2. Г идролиз субстрата твина-20 липазами (эстеразами) из имаго колорадского жука

На рис. 3 представлены данные измерения активности коммерческого препарата липазы из Candida rugosa при различных концентрациях фермента.

30 45 40 35

•чЗО

¡25 ví2 О

15 10 5 0

100 150 .'.DO 250 300 500 900 10001500200С Белок, мкг/м/1

Рис.3. Гидролиз твин-20 в составе агарозиой пластины липазой Candida rugosa при различных концентрациях фермента.

Ось абцисс - концентрация липазы; ось ординат размер зоны гидролиза (активность фермента).

Как видно, размер гидролизованного участка геля вокруг лунки зависит о начальной концентрации фермента в лунке. Нижний предел концентрации фермента (чувствительность реакции) составляет около 100 мкт/мл. При такой концентрации происходит гидролиз субстрата на участке геля размером около 0,8-1,0 мм". В интервале концентраций фермента 100-1000 мкг/'мл, активность фермента повышается пропорционально увеличению его концентрации в инкубационной среде. Как видно, предложенный метод позволяет измерять активность липолигических ферментов в интервале 0,8- 40 Е активности.

Наши эксперименты показали, что предложенный метод позволяет выявить наличие липазной активности и измерить ее уровень в биологических экстрактах различного происхождения. Оказалось, что

I и

наш метод по разрешающей способности и по воспроизводимости результатов не уступает известным методам. Экспериментально показано, что описанный метод применим и для оценки активности ингибиторов ферментов, гидролизуюших полиоксизтиленсорбитмонолаурат. С этом целью на одной пластине в одинаковых условиях проводятся две реакции гидролиза субстрата (твин -20): в первой лунке - свободной фермент, в другой - фермент при присутствии в смеси ингибитором. Активность ингибиторов определяется по разнице размеров площадей гидролнзованных участков геля со свободным ферментом и фермента с ингибитором.

Аналогично определению активности липолитических ферментов, можно определять активность амилаз. Для этой цели нами были использованы агарозные геле вые пластины с 1 % содержанием крахмала. Для проявления активности а-амилаз, пластины по истечении времени инкубации помещали в раствор Люголя. Наши опыты с амилазами слюны человека, с амилазами колорадского жука показывали, что прямо пропорциональная зависимость между исходной концентрацией белка в растворе и размером участка геля с гидролизованным крахмалом соблюдается в интервале от 10 до 500 мг/мл белка.

Таким образом, разработанные нами методы позволяет выявлять и измерять активность липолитических, амилолитических ферментов и их ингибиторов из различных биологических источников. Процедура проведения экспериментов проста и доступна, поскольку не требует сложного оборудования и приборов. По сравнению с титровал..ным методом, наш метод определения липаз обладает более высокой чувствительностью. Немаловажным преимуществом метода является возможность использования в реакциях микрообьемов (5-10 мкл) ферментных растворов и других реактивов, что снижает в несколько десятков раз расход препаратов по сравнению с классическими методами.

Активность гидролитических ферментов в экстрактах имаго и личинок колорадского жука

Нами были исследованы гидролитические ферменты и их ингибиторы при взаимодействии колорадского жука и растений картофеля, представляющего яркий пример специализации насекомых и растений.

Наши исследования показали, что имаго и личинки колорадского жука обладают амилолитической, липолитической, неполитической и целлюлолитической активностью. Как видно из рис.4, высокая активность в тканях имаго и личинок характерна для ферментов, гидролизуюших целлюлозу, пектин.

гЬ

Рис.4. Активность пектиназ, липаз, целлюлаз и амилаз п экстрактах имаго и личинок колорадского жука (Чишмински район. 2007 г.)

ПеМИМ^ЗЫ Л :

Цс'ЛЛ'О/ШЫ ЛМИЛй^

Целлюлолитическая активность в тканях колорадского жука составляет 20-25 Е/г массы, пектиназ (пектинметилэстераз) - более 10 Е/г массы. Уровень активности амилаз (крахмалгидролизующих) ферментов в тканях исследуемых насекомых оказался значительно ниже (в 2-3 раза), чем показатель активности пектиназ и целлюлаз. Уровень активности липаз (твингидролизующих ферментов) у насекомых был очень низким и не превысил 4 Е/г массы. Для сравнения были взяты насекомые, обитающие на территории пяти административных районов республики Башкортостан. Оказалось, что уровень удельной активности гидролаз в имаго изменяется в зависимости от местообитания насекомых. Наибольшая активность целлюлаз и пектиназ (20-25 Е/мг) была характерна для насекомых Баймакского района. Невысокая активность этих ферментов выявлялась у имаго из Белорецкого района. По активности амилаз лидировали насекомые из Илишевского района (16,1 ±0,3 Е/мг белка). Активность протеиназ и липаз, по сравнению с активностью других исследованных гидролаз, в тканях имаго во всех вариантах опыта выявлялась на относительно невысоком уровне. Проведенный дисперсионный анализ показал, что по уровню активности исследованных гидролаз, имаго и личинки выборок из различных районов, достоверно различаются между собой. Во всех вариантах эксперимента, уровень значимости был ниже 0,05.

Анализ уровня активности гидролаз у насекомых всех исследованных выборок из нескольких территорий выявил следующую закономерность: наиболее высокие уровни активности у имаго среди исследованных гидролаз выявлены для целлюлаз и пектиназ. уровень активности амилаз занимает среднее положение. Далее по убыванию уровня активности располагаются протеолитические и липолитические ферменты. Показатель удельной активности гидролитических ферментов в

тканях личинок подвержен значительным колебаниям ь зависимости от возраста насекомых. Так же как и имаго, личинки всех исследуемых локальных популяций характеризуются высокой активностью пектолитических и целлюлозолитических ферментов. Уровень активности этих ферментов у личинок, на всех стадиях их развития, существенно (до 10 раз) превышает аналогичный показатель амилаз, протеиназ, липаз.

Активность гидролитических ферментов с> тканях картофеля различных сортов

В прорастающих клубнях и проростках картофеля нами выявлена амилолитическая активность (рис. 5). Оказалось, что экстракты клубней и проростков картофеля исследованных сортов обладают различным уровнем активности этих ферментов.

Наибольшим значением амилазной активности в клубнях характеризуется сорт Удача (9,0±0,1 Е/г массы), а наименьшим значением - гибрид 4273-16. Высокая активность амилаз характерна также для проростков сорта Невский (6,8Е/г массы), наименьшая -для проростков гибридов 4273-16, 428! -7 (не более 4 Е/г).

В наших опытах, целлюлазная активность была обнаружена в прорастающих клубнях и проростках картофеля (рис.6). Как видно из рисунка, изученные сорта существенно различаются по значению целлюлазной активности в клубнях и проростках. Так, активность целлюлаз в клубнях в зависимости от сорта изменяется от 2 до 20 Е/г массы, в проростках - от 3 до 12 Е/г массы. Наибольшей целлюлазной активностью обладают клубни образцов 4281-149 и 4292-172, а наименьшей - клубни гибрида 4281-7. Следует отметить, что в

Рис. 5. Активность амилаз в клубнях и проростках картофеля через 3 суток прорастания ( 2008 г).

Невский Удача 427316 4281-7 4281-49 4292-172

Сорт, гибрид

этиолированных проростках картофеля целлюлазная активность нами не обнаружена.

Рис.6. Активность

з целлюлаз в клубнях и

й проростках картофеля

«Ь к клубни через 2 недели прорас-

тания клубней (2008г.)

^ У Сорт, гибрид

Как видно, листья и проростки картофеля, по сравнению с клубнями, характеризуются более высокой активностью пектиназ (рис.7). Уровень пектиназной активности в листьях в 30-50 раз превышает анологичный показатель клубней. Высокий уровень пектиназной активности в листьях обуславливается, по-видимому, интенсивным обменом пектинсодержащих соединений в вегетируюшем растительном организме.

Рис.7. Активность пектиназ в клубнях, 4-х недельных про-ростках и листьях картофеля (2007г.)

Л и политическая активность обнаружена в клубнях картофеля (рис.8). Наибольшая активность этих ферментов выявлена в клубнях сортов Удача. Невский и сортообразцов 4273-8, 428 1-7.

Относительно низкими значениями твинолитической активности обладали клубни сортообразцов 4292-149 и 9513-7. Активность липаз в

свежесобранных (дозревающих) клубня;; можно объяснить их участием в трансформации и запасании жироподобных соединений.

/ / / ч^ .Я ^ ^

Сорт, гибрид

Рис. 8. Активность липо.титических ферментов в покоящихся (через 20 суток после сбора) клубнях картофеля различных сортов (2007 г.).

Необходимо отметить, что в проростках и листьях картофеля изученных сортов липазная активность отсутствовала.

Активность ингибиторов гидролитических ферментов в тканях

картофеля

Эта глава посвящена выявлению и определению содержания ингибиторов (активности) в органах картофеля, подавляющих действие целлюлаз, пектиназ, липаз и амилаз колорадского жука и некоторых микроорганизмов

Из таблицы 2 видно, что экстракты клубней, стеблей исследованных сортов картофеля подавляли активность амилаз тканей личинок колорадского жука. Наибольшей активностью ингибиторов амилаз насекомых отличались клубни сорта Невский. В молодых листьях картофеля антиамилазная активность отсутствовала или выявлялась на очень низком уровне.

В листьях, проростках и клубнях исследованных сортов картофеля выявлена активность ингибиторов, подавляющих действие целлюлолитических (табл.3) и пектинолитических ферментов. Уровень ингибиторной активности в листьях картофеля значительно различается в зависимости от сорта.

Так, экстракты листьев гибрида 4281-7 обладали наибольшей антицеллюлазной активностью, причем практически в равной степени подавлялась активность целлюлаз и колорадского жука, и Т. гееяег. У сортов Невский, Удача активность свободных ингибиторов целлюлаз в

листьях не выявлялась совсем. Антицеллюлазная активность в листьях этих сортов обнаруживалась лишь после прогревания экстрактов.

Таблица 2

Активность ингибиторов амилаз личинок колорадского жука из различных тканей картофеля, ИЕ/г массы

Сорт, гибрид Клубни Стебли Листья

Невский 15,0±1,1 5,1 ±0,1 1,0±0,2

Луговской 9,0±0,4 3,4±0,1 0

Удача 5,0±0,2 4,1 ±0,2 0

№4281-80 7,1 ±0,2 5,0±0,2 М±0,3

№4273-16 4,1 ±0,3 5,0±0,3 0

Примечание: активность ингибиторов измерена в экстрактах после их прогревания. Собственная амилазная активность у личинок колорадского жука -118 Е/г массы.

Прогревание экстрактов приводило либо к появлению, либо к повышению активности целлюлолитических ферментов. Этот факт указывает на то, что определенная часть молекул ингибиторов целлюлаз в растительных тканях может находиться в составе комплексов с термолабильными компонентами клетки.

Наши эксперименты показали, что в клубнях и листьях картофеля содержатся и ингибиторы, подавляющие действие пектинолитичесшх и липолитических ферментов. Причем, оказалось, что картофельные ингибиторы проявляют активность по отношению к ферментам различных организмов: бактерий, грибов, насекомых, млекопитающих. Интересно отметить, что после прогревания экстрактов в ряде случаев, мы наблюдали повышение ингибиторной активности по отношению к пектиназам и липазам. Исходя из этого факта, предполагается, что часть ингибиторов в тканях картофеля может находиться в составе неактивных комплексов с термолабильными компонентами клеток.

В целом, в тканях картофеля нами выявлены водорастворимые соединения, способные подавлять активность целлюлолитических, пектинолитических, амилолитических и липолитических ферментов. Картофельные ингибиторы способны подавлять активность ферментов бактерий (Т. reesei.), грибов (Candida rugosa) насекомых (L. decern linéala), млекопитающих (Porcine liver). Изученные сорта и гибриды картофеля имеют существенные различия по уровню антигидролитической активности в клубнях и листьях.

Таблица 3

Активность ингибиторов целлюлолитических ферментов триходермы Т. геезе1 и имаго колорадского жука в листьях картофеля,

ИЕ/г массы (2009 г.)

Активность ингибиторов, ИЕ/г массы

Сорт, гибрид Т. reesei L. decemlineata

1 2 1 2

Башкирский 4,Ш),1 12,0±0,2 10,1±0,1 19,7±0,2

Луговской 2,3±0,1 14,8 ±0,7 2,8±0,6 19,7±0,8

Невский 0 11,8 ±0,1 4,6 ±0,9 20,1 ±0,2

Удача 0 5,6±0,6 0 5,5±0,8

№ 4270 2,4±0,1 7,8±0,2 3,9±0,2 10,1±0,1

№4281-7 2,3±0,1 28,3 ±1,2 5,6±0,5 27,1 ±0,6

Примечание: - данные отсутствуют, 1 - экстракт без прогревания; 2-экстракт после прогревания Активность целлюлаз Т. reesei -125,2 Е/мг; активность целлюлаз L. decemlineata - 117,9 Е/г.

Таким образом, разработанные нами методы позволяют выявлять и измерять уровень активности ряда гидролаз в растительных тканях, в тканях млекопитающих, насекомых, у микроорганизмов. Использованием этиг. методов также можно определить активность ингибиторов, подавляющих действие гидролитических ферментов различного происхождения.

выводы

1. Разработаны новые методы измерения активности липолитических, амилолитических ферментов и их ингибиторов, основанные на гидролизе иммобилизованных в агарозный гель ферментных субстратов. Предложены модификации методов измерения активности целлюлаз, пектшшз и их ингибиторов. Показана возможность использования предложенных методов для измерения активности гидролаз и их ингибиторов в гомогенатах тканей растений и насекомых.

2. Проведен сравнительный анализ уровня активности амилаз, целлюлаз, пектиназ, протеиназ, амилаз, липаз в имаго и личинках колорадского жука, обитающего на различных территориях. Насекомые различного возраста, независимо от места обитания, характеризуются высокими показателями активности целлюлаз и пектиназ, среднее значение активности характерно для амилаз, для протеиназ и липаз характерны наименьшие значения активности.

3. Представители насекомых одной локальной популяции (выборки), находящиеся на разных стадиях развития, по показателю ферментативной активности не имеют достоверных различий (р > 0,05). Насекомые одного возраста из различных локальных популяций, существенно различаются по уровню гидролитической активности (для всех исследованных ферментов р< 0,05).

4. В органах картофеля различных сортов измерен уровень активности гидролитических ферментов. В покоящихся клубнях картофеля гидролитическая активность отсутствует, или выявляется на очень низком уровне. В активно вегетирующих органах (прорастающих клубнях, проростках, листьях) картофеля выявлен относительно высокий уровень активности гидролаз. Изученные сорта и селекционные сортообразцы характеризуются индивидуальными показателями гидролитической активности.

5. В клубнях и листьях картофеля выявлена активность ингибиторов, подавляющих активность амилаз, пектиназ, целлюлаз, липаз млекопитающих, насекомых, микроорганизмов (грибов, бактерий). Предложенные нами методы позволяют выявить межсортовые различия по уровню активности ингибиторов гидролаз в органах картофеля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях рекомендованных ВАК МОИ РФ

1. Шпирная И.А., Умаров И.А., Шевченко Н.Д., Яхин О. И., Ибрагимов Р. И. Стимулирование естественных механизмов устойчивости в тканях картофеля под влиянием биорегуляторов // Вестник Оренбургского государственного университета, 2007,- № 7. -С. 427-428.

2. Шпирная И.А., Умаров И.А., Шевченко Н.Д., Ибрагимов Р.И. Определение активности гидролаз и их ингибиторов по гидролизу субстрата в геле агарозы // Прикладная биохимия и микробиология, 2009,-№ 3. -С. 497-501.

3. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А., Ибрагимов Р. И. Метод измерения активности пектиназ по гидролизу иммобилизованного субстрата // Аграрная Россия, спец. вып. -2009. - С. 133-134.

4. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А., Саляхова А.Ф., Цветков В.О., Марданшин И.С., Ибрагимов Р. И. Активность ингибиторов целлюлаз, пектиназ в клубнях и листьях картофеля // Вестник Оренбургского государственного университета, 2009, № 6 .- С.431-433 .

5. Spirnaya LA., Umarov I. A., Shevchenko N. D., Ibragimov R. I. Evaluation of the Activity of Hydrolases and Their Inhibitors Using Substrates Immobilized on Agarose Gel// Applied Biochemistry and Microbiology, 2009, Vol. 45, N. 4.- P. 449-453.

Публикации в других изданиях

6. Шпирная И.А., Умаров И.А. Шевченко Н.Д., Ибрагимов Р. И. Подавление активности гидролитических ферментов колорадского жука ингибиторами из растительных тканей //Вятский медицинский вестник, 2007, №4,- С. 200-202.

7. Шевченко Н.Д., Ибрагимов Р.И., Шпирная И.А., Умаров И.А., Хамадалиев Р.Ф. Активность компонентов системы «эстеразы-ингибиторы эстераз колорадского жука» в тканях картофеля // Вестник Башкирского государственного университета, 2008, Т. 13. №4. - С. 922-925.

8. Шпирная И.А., Ибрагимов Р. И., Шевченко Н.Д. Протеолитическая активность экстракта личинок колорадского жука // Материалы конференции «Биология- наука XXI века». Пущино, 2006.-c.103.

9. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А. Выделение и свойства протеолитических ферментов личинок Leptinotarsa decemlineata // Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете. Тез докл. Второго международного симпозиума, Казань, 2006 - С. 228-229.

10. Шпирная И. А., Шевченко Н.Д. Определение активности протеолитических ферментов и их ингибиторов методом гелевых пластин //

Сигнальные системы клеток растений: роль з адаптации и иммунитете.Тез докл. Второго международного симпозиума, Казань, 2006.- С, 230-231. ■->•

11. Шпирная И.А., Умаров И.А., Шевченко Н.Д., Иорапгмов Р. И. Определение активности эстераз методом агарозных пластин // Мат-лы Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире», Улан-Удэ, 2007. - С. 398-399.

12. Шпирная И.А., Умаров И.А., Шевченко Н.Д. Изменение активности ингибиторов гидролаз в растениях картофеля при внешнем, воздействии // Материалы школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН «Биомика-наука XXI века», Уфа, 2007.-С. 148-149.

13. Шпирная И.А., Шевченко Н.Д., Ибрагимов Р. И. Определение активности липолитических ферментов (эстераз) методом агарозных пластин // Сборник материалов Международного симпозиума «Липиды и оксилипины растений», Казань, 2008.-е. 69.

14. Шевченко Н.Д., Хамадалиев Р.Ф., Шпирная И.А., Ибрагимов Р. И. Определение активности эстераз в тканях картофеля {Solanum tuberosum) и колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) // Сборник материалов Международного симпозиума «Липиды и оксилипины растений», Казань. -2008.- С. 68

15. Ибрагимов Р. К, Шевченко Н.Д., Шпирная И.А., Саляхова А.Ф., Цветков В.О. Гидролитическая активность тканей картофеля и колорадского жука // Материалы Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск,2009.-С. 182-185.

16. Цветков В.О., Шевченко Н.Д., Ибрагимов Р.И., Гарипова М.И. Выделение протеиназ колорадского жука с использованием аффинного сорбента на основе акриламида // Материалы 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века », Пущино. - 2010 (в печати).

Шевченко Наталья Дмитриевна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 021319 от 05.01.99 г.

Подписано в печать 23.04.2010 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,15. Уч.-изд. л. 1,27. Тираж 100 экз. Заказ 307.

Редакционно-юдате.чъский центр Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Отпечатано на множительном участке Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шевченко, Наталья Дмитриевна

1. Природа и физиолого-биохимическая роль гидролитических ферментов (аналитический обзор литературы)

1.1. Пектолитические ферменты микроорганизмов и растений (структура, свойства и физиологическая роль). ^

1.2. Целлюлолитические ферменты.^

1.3.Эстеразы.

1.4. Амилолитические ферменты.

2. Растительные ингибиторы гидролитических ферментов.

2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Материалы и реактивы.

2.3. Методы исследований.

2.3.1. Определение концентрации белка.

2.3.2. Определение липазной активности в экстрактах. ^

2.3.3. Определение активности протеолитических ферментов.

2.3.4. Определение активности ингибиторов трипсина по БАПА.

2.4. Математическая обработка результатов.

Результаты и обсуждение.

3.1. Модификация и разработка методов определения активности

3.1.1. Определение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и их ингибиторов по гидролизу субстратов в агарозном геле (модификация методов).

3.1.2. Определение активности липаз, амилаз и их ингибиторов методом агарозных гелевых пластин (разработка метода).

3.2. Активность гидролитических ферментов в экстрактах имаго и личинок колорадского жука. ^

3.3. Активность гидролитических ферментов в тканях картофеля различных сортов.

3.4. Активность ингибиторов гидрблитических ферментов колорадского жука в тканях картофеля. gJ

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активность гидролитических ферментов и их ингибиторов в тканях картофеля и колорадского жука: методические аспекты"

Синтез белков с антимикробными свойствами является одной из универсальных защитных реакций растений при воздействии на них биотических и абиотических факторов (Clarini, 2002; Сотченков, Голденкова, 2003). К таким молекулам относятся и ингибиторы, способные нейтрализовать гидролитические (пищеварительные) ферменты патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Наиболее подробные сведения получены о защитной роли растительных ингибиторов, действующих на протеолитические ферменты. Показано, что выделенные из семян бобовых, злаковых растений, клубней картофеля препараты ингибировали действие ферментов микроорганизмов, и вследствие этого, были способны подавлять рост и развитие колоний патогенных грибов (Мосолов, 1983; Валуева, Мосолов, 2002; 2004; 2006; Конарев, 2002). С. Рианом и его сотрудниками было обнаружено, что поранение тканей личинками колорадского жука приводит к системному повышению активности ингибиторов протеиназ во всех органах растений томатов и картофеля (Green, Ryan, 1972; Ryan, 1981). Ингибиторы протеолитических ферментов выявлены практически у всех исследованных представителей дикорастущих и культурных растений (Валуева, Мосолов, 2006). Широкое распространение ингибиторов протеиназ и их содержание в значительных количествах в тканях растений позволяют говорить о них как об одном из важных звеньев в регуляции физиологических и патологических процессов. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что в растительных тканях должны функционировать и ингибиторы других гидролаз: амилаз, пектиназ, целлюлаз, эстераз. Однако, экспериментальные сведения об этих гидролитических ферментах и их ингибиторах при взаимодействии растений с фитопатогенами в научной литературе пока весьма ограничены (Фомичева, 1992; Яруллина, Ибрагимов, 2006). По-видимому, функционирование в растительном организме генетически детерминированной системы ингибиторов гидролитических ферментов представляет важную часть механизма противостояния растений организмам-фитофагам, т.е. механизма, обеспечивающего устойчивость растений. В связи с вышесказанным, исследования гидролитических ферментов, их ингибиторов при взаимодействии растительного организма с фитофагами приобретают особую актуальность и имеют важное значение как в научном, так и практическом отношении. В значительной степени, накопление новых фактов в этом плане ограничивается недостатком методов, позволяющих параллельно измерять ферментативную и ингибиторную активности в биологических объектах.

Цель нашей работы заключалась в разработке и модификации новых методов измерения активности гидролаз, их ингибиторов, позволяющих анализировать эти молекулы как компоненты единого функционального комплекса при взаимодействии растений с патогенными микроорганизмами и насекомыми-вредителями.

Соответственно, в процессе выполнения работы решались следующие задачи:

- модификация методов измерения активности целлюлаз, пектиназ и их ингибиторов в тканях растений и насекомых; измерение уровня активности гидролитических ферментов в тканях личинок и имаго колорадского жука, обитающих на различных территориях;

ПРИРОДА И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ РОЛЬ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шевченко, Наталья Дмитриевна

выводы

1. Разработаны новые методы измерения активности липолитических, амилолитических ферментов и их ингибиторов, основанные на гидролизе иммобилизованных в агарозный гель ферментных субстратов. Предложены модификации методов измерения активности целлюлаз, пектиназ и их ингибиторов. Показана возможность использования предложенных методов для измерения активности гидролаз и их ингибиторов в гомогенатах тканей растений и насекомых.

2. Проведен сравнительный анализ уровня активности амилаз, целлюлаз, пектиназ, протеиназ, амилаз, липаз в имаго и личинках колорадского жука, обитающего на различных территориях. Насекомые различного возраста, независимо от места обитания, характеризуются высокими показателями активности целлюлаз и пектиназ, среднее значение активности харак-терно для амилаз, для протеиназ и липаз характерны наименьшие значения активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шевченко, Наталья Дмитриевна, Уфа

1. Абдеев P.M., Голденкова К.А., Мусийчук К.А., Пирузян Э.С. Свойства термостабильной целлюлазы Clostridium thermocellum H Биохимия. - 2001. - Т.66 .-№7.- С. 991 - 992.

2. Акаева М.М., Фурсов О.В. Синтез, активация и секреция а-амилазы алейронового слоя и щитка зерновки пшеницы. // Физиология растений. -1990.-Т.37.-№ 6. -С. 1180-1185.

3. Арташов Д.К., Гевантмахер C.B., Вагина О.Н., Розмухамедова Б., Давранов К.Д. Очистка и свойства липазы из Pénicillium species в водной среде и в обращенных мицеллах в бензоле // Биохимия.-1994.- т. 59, вып. 3.- С. 425-433.

4. Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Кожонина О.М., Битюцкая Л. А., Дронов Р.В., Трофимова О. Д. Компьютерный анализ пространственной структуры некоторых гидролитических ферментов // Биохимия.- 2005.- т. 70, вып. 10.- С. 1318-1327.

5. Асатиани B.C. Ферментные методы анализа. М.: Наука, 1969.-740с.

6. Астапович Н.И., Рябая Н.Е. Полигалактуроназа Sacharomyces pastorianus: выделение и некоторые свойства// Прикл. биохим. микробиол . 1997.- Т . 33. -№ 3. -С . 287-291 .

7. Безбородова A.M., Астапович Н.И. Секреция ферментов у микроорганизмов. М. Изд-во "Наука", 1984.-70 с.

8. Беккер З.Э. Физиология и Биохимия грибов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1988. - 230 с.

9. Бенкен И.И., Мосолов В.В., Федуркина Н.В. Влияние ингибиторов протеиназ фасоли на фитопатогенные грибы // Микология и фитопатология. 1976.- Т. 10.- № 3. - С.198-201.

10. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф.Биологическая химия /Под ред. акад. АМН СССР С. С. Дебова.- М.: Медицина, 1990. -528 с.

11. Бернхард С. Структура и функция ферментов. М: Мир, 1971.-333 с.

12. Брокерхоф X., Дженсен Р., Липолитические ферменты, пер. с английского, М., 1978.-396 с.

13. Буданцев А.Ю. Основы гистохимии: Учебное пособие. Пущино: Пущинский гос. ун-т.- 2008.- 58 с.

14. Валуева Т. А., Мосолов В. В. Белки-ингибиторы протеолитических ферментов // Прикладная биохимия и микробиология,-1995. Т. 31, № 6. - С. 579-589.

15. Валуева Т.А., Григорьева Л. И. Взаимодействие соевого ингибитора трипсина (Ингибитор Кунитца) с цистеиновыми протеиназами // Биоорганическая химия.- 1994.- Т 20.- №2- С. 162-168.

16. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитичсеких ферментов в защите растений // Успехи биологической химии.-2002.-Т.42.-С. 193-216.

17. Валуева Т. А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений от патогенных микроорганизмов // Биохимия.-2004.-Т.69 вып. 11.-С. 1600-1606.

18. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Трипсинсвязывающие центр ингибитора сериновых протеиназ из картофеля // Биоорганическая химия. 1976. — Т.2.-№10. — С. 1389-1394.

19. Варфоломеев С.Д., Зайцев С.В. Кинетические методы в биохимических исследованиях. М.: Изд-во МГУ, 1982. 343с.

20. Васильева К.В.и др., Пектолитические ферменты из Aspergillus niger// Биохимия иммунитета и покоя растений. М.: Из-во «Наука», 1969.

21. Велобова Е. Н. Переваривание белков. Киев: Гродынец.-1993.-29 с.

22. Вилкова Н.А. Физиологические основы теории устойчивости растений к насекомым. Автореф. докт. дисс. Л., ВИЗР.-1980.- 49 с.

23. Гасанова Т.В., Скурат Е.В., Фролова О.Ю. Пектинметилэстераза как фактор стабильности растительного транскриптона//Молекулярная биология.- 2008.- т. 42.- № 3.- С. 478-486.

24. Глинка Е.М, Буранцева Е.А., Проценко М.А.,Салькова Е.Г. Влияние белкового ингибитора полигалактуроназы на интенсивность образования олигоуронидов //Физиология растений.- 2003.- т.50.- № 2.-С.260-264.

25. Глинка Е.М., Гладких Т.А., Проценко М.А. Выделение из клубня картофеля белкового ингибитора активности полигалактуроназы // Прикладная биохимия и микробиология.- 1997.- т.ЗЗ.- С.514-518.

26. Головченко Н.П., Идвильская Н.А., Акименко В.К. Состав целлюлазного комплекса Clostridium thermocellum // Биохимия.- 1985. -Т. 50.- С. 109—113.

27. Горовой Л.Ф., Кошевский И.И. Грибные полисахариды в, защите растений // Тез. докл. I съезд микологов России, Москва.- 2002.-С. 230-231.

28. Горовой Л.Ф., Кошевский И.И. Преараты нового поколения для защиты растений//\/1 конференция «Защита растений»(Москва-Щелково, октябрь, 2001):тез.докл.-М.: «ВНИРО».- 2001 .-С.85-87.

29. Гофман Ю.Я., Вайсблай И.М., Определение ингибиторов трипсина в семенах гороха // Прикладная биохимия и микробиология.-1975.-Т. 2. № 5-С.777-783.

30. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. Изд. 3, перераб. и дополн. М.: " Элевар", - 2000. - С.10 -106.

31. Гусаков A.B., Синицын А.П., Клесов A.A. // Прикладная биохимия и микробиология.- 1992. -Т.21.- № 1.- С. 59-69.

32. Дарканбаев Т.Б., Фурсов О.В. Амилазы зерновых и регуляция их активности // Успехи биол. химии.- 1982.- Т. 22. -с. 137.

33. Диеров Ж.Х., Циоменко А.Б., Давранов К.Д., Кулаев И.С. Гидрофобная хроматография и характеристика секртируемых липаз гриба Rhizopus microsporus //Биохимия.-1993.-т.58.- вып.7.-С.979-986.

34. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, т 1-3. М.: Наука, 1982.-375с.

35. Дихтярев С.И., Сичкарь JI.A. Исследование условий выделения, свойств и стандартизация растительных ингибиторов протеолитических и липолитических ферментов // Связь «Структура -свойства» БАВ тезисы докладов Национальной академии Украины, 2002.-С.7-9.

36. Домаш В.И., Шарпко Т.П., Забрейко С.А., Сосновская Т.Ф. Протеолитические ферменты и ингибиторы трипсина высших растений в условиях стресса//Биоорганическая химия.- 2008, Т.34.-С. 278-283.

37. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта.- М.: Агропромиздат, 1985.-351с.

38. Дунаевский Я.Е, Павлюкова Е.Б., Белякова Г.А., Белозерский М.А. О физиологической роли ингибиторов протеиназ растений: две группы функционально активных ингибиторов в семенах гречихи // Мол. биол.- 1995. Т. 29, вып.6.- С. 1258-1264.

39. Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Эндогенные ингибиторы протеаз как фактор устойчивости растений // Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.- С. 119-123

40. Дунаевский Я.Е., Матвеева А.Р., Белякова Г. А., Домаш

41. B.И., Белозерский М.А. Внеклеточная щелочная протеиназа Colletotrichum gloeosporioides II Биохимия.- 2007, т. 72, № З.-С. 424-431.

42. Дьяков Ю.Т., Долгова A.B., Рыбакова И.Н. Багирова С.Ф. Дивергенция популяций фитопатогенного гриба Phytophthora infestans в связи с специализацией к растению-хозяину.// Журн. общ. биологии. -1994. Т.55.-С.179-188.

43. Дьяков Ю.Т., Озерецковская O.JL, Джавахия В.Г., Багирова

44. C.Ф. Общая и молекулярная фитопатология.- М., 2001.- С.302.

45. Едрева A.M. Стрессовые белки растений. PR-белки.// Физиол.растен.38.- 1991.- С.788-799.

46. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. Методы биохимического исследования растений. Под ред. Ермакова А.И.-Л.:Агропромиздат, 1987.-430 с.

47. Зоров И.Н., Семенова М.В., Цурикова Н.В., Синицын А.П. Гидролиз пшеничной муки под действием препаратов амилазы и индивидуальных ферментов // Прикладная биохимия и микробиология.-2006.- т. 42.- № 6.- С.700-704.

48. Зоров И.Н., Синицын А.П., Кондратьева Е.Г. Оценка эффективности кормовых ферментных препаратов при разрушении некрахмальных полисахаридов зерновых субстратов // Прикладная биохимия и микробиология.- 2006.- т. 42,- № 6.-С.705-709.

49. Ибрагимов Р.И. Внеклеточные протеолитические ферменты гриба Fusarium sp. и их ингибиторы из растений // Вестник Башкирского университета. 1997. - № 3 (I, II).- С. 51-54.

50. Ибрагимов Р.И. Содержание ингибиторов протеиназ в семенах сельскохозяйственных культур // Качество продукции растениеводства и приемы его повышения.- Уфа: Баш. гос. агр. ун-т. -1998.- С. 146-149.

51. Ибрагимов Р.И., Умаров И.А., Шпирная И.А., Марданшин И.С. Пищевая активность колорадского жука на различных сортах картофеля // Сборник ч.1 «Вавиловские чтения- 2008», СГАУ.-С. 136-137.

52. Исламов P.A., Фурсов О.В. Бифункциональный ингибитор а-амилазы трипсина из зерна пшеницы. // Прикладная биохимия и микробиология. -2007. -Т. 43. -№ 4.- С. 419-423.

53. Калинин Ф.Л., Лобов В. П., Жидков В. А. Справочник по биохимии. К.: Наукова думка.- 1971.-306 с.

54. Камышников B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика: Справочник в 2-х т. Т.2.-2-е изд. Мн.:Беларусь, 2003.-463 с.95

55. Капранчиков B.C. Некоторые физико-химические свойства липазы зародышей семян пшеницы // Биотехнология. 2003.- №5 С.44-52.

56. Кладницкая Г.В., Валуева Т.А., Домаш В.И., Новикова JI.M., Мосолов В.В.Экзопротеиназа гриба Fusarium, sambucianum Fuck и их взаимодействие с ингибиторами // Прикладная биохимия и микробиология.-1994.-Т.30.- №1.-С 21-29.

57. Клесов A.A. Биохимия и энзимология гидролиза целлюлозы// Биохимия.-1980.- Т.55.- №10.- С.1731-1765.

58. Клесов A.A. Ферментативное превращение целлюлозы // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнол. М., 1983. Т. 1. С. 63-150.

59. Клесов A.A. Ферменты целлюлазного комплекса // Проблемы биоконверсии растительного сырья. М., 1993. С. 95-136.

60. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия М.: Высшая школа, 2000.- 480 С.

61. Коваленко A.B. Технология препарата пектинметилэстеразы томатов Дис. канд. техн. наук Одесская Гос. Академия пищевых технологий. Одесса, 1997. - 149 с.

62. Козлов К.А., Кислицина В.П. О некоторых проблемах проявления энзиматической активности почв//Сб. докл. симпозиума по ферм, почвы. Минск: Наука и техника, 1968.- С. 66-89.

63. Козлов К.А., Михайлова Э.Н. // Почвоведение, №2, 58.1968.

64. Кольчевский А.Г., Пахомов А.Н. Множественные формы неспецифических эстераз в онтогенезе капустной совки Barathra brassicaceae II Онтогенез-1990 №6 с.580-584.

65. Конарев A.B. Ингибиторы ферментов как генетические маркеры // Аграрная Россия.- 2002.- № 3.- С. 44-52.

66. Конарев A.B. Системы ингибиторов гидролаз у злаков — организация, функции и эволюционная изменчивость // Автореферат дисс.докт.биол.наук, М., 1992.-38 С.

67. Конарев Ал.В. Взаимосвязи и изменчивость ингибиторов протеиназ и а-амилаз у пшеницы и родственных ей злаков // Сельхоз. биол.- 1986.- №3. С. 46-51.

68. Конарев Ал.В. Ингибиторы гидролаз и сопряженная эволюция злаков и вредных насекомых// 9 Всес.совещ. По иммунитету раст. К болезням и вредителям, Минск, сент., 1991: Тез докл. т.2-Минск,1991-с.270-271.

69. Корнеева О.С., Попова Т.Н., Капранчиков B.C., Мотина Е.А. Идентификация каталитически активных групп липазы зародышей семян пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология.- 2008.- т.44.-№4, с.З87-393.

70. Кретович B.JI. Биохимия растений. М.: Высшая школа.-1986. -С.503.

71. Кретович B.JL, Яровенко B.JI. Ферментные препараты в пищевой промышленности М.: Пищевая промышленность, 1975. - 536 с.

72. Лобанок А.Г., Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Тамкович И.О., Мамович О.М. Свойства и стабилизация пектиндеполимераз из препарата пектиназа Г20 на основе ультраконцентрата биомассы гриба Pénicillium digitatum И Биотехнология.- 2008.- №6.- С. 73-79.

73. Маали Амири Р., Голденкова Павлова И.В., Юрьева М.О. Жирнокислотный состав липидов растений картофеля трансформированных геном 12 —десатуразы цианобактерий //Физиология растений.- 2007- т.54.- №5.- С.678-685.

74. Маслова Н.Ф, Носольская Т.Н. Фармакологические аспекты применения в медицине отечественного растительного ингибитора липаз // Связь «Структура свойства» БАВ тезисы докладов Национальной академии Украины, 2002.- С.26-31.

75. Мельник М.С., Капков Д.В., Могутов М.А., Рабинович М.Л., Клесов A.A. // Биохимия.- 1989. -Т. 54.- С.387 — 395.

76. Метлицкий Л.В., Васильева К.В. Пектолитические ферменты // Биохимия иммунитета и покоя растений М.: Наука, 1969.-358с.

77. Метлицкий Л.В., Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л. Индукторно-супрессор-ная гипотеза фитоиммунитета // Журнал общ. биол.-1986.-Т.47.№3 .-С.748-75 8.

78. Методика исследований по культуре картофеля НИИКХ, М., 1967. 263с.

79. Методы биохимического исследования растений Под ред. Ермакова А.И. Л.: Агропромиздат, 1987. 430 с.

80. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Захаренко И.Н. Специфические эстеразы грибов рода Aspergillus и Flisanum // Прикл. биохимия и микробиол.- 1997.- Том 33.- № 5.- С. 492-496.

81. Мосолов В.В. Новое о природных ингибиторах протеолитических ферментов // Биоорганическая химия. 1998. Т. 26. С. 273-278.

82. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза. -М.: Наука.- 1983.- С.40.

83. Мосолов В .В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений. Прикладная биохимия и микробиология. 2005, 41, № 3, 261-282.

84. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов. М.: ВИНИТИ.-1993.- 207 с.

85. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Участие протеолитических ферментов во взаимодействии растений с фитопатогенными микроорганизмами // Биохимия.- 2006.- Т 71.- вып. 8.- С. 1034 1042.

86. Озерецковская O.JL, Васюкова Н.И., Караваева К.А., Канева И.М. Характер супрессии фитоалексинообразования при совместном взаимодействии расы возбудителя фитофтороза и сорта картофеля // прикл. Биохимия и микробиол.-1993.-№2 .-С.328-332.

87. Озерецковская O.JL, Васюкова Н.И., Панина Я.С., Чаленко Г.И. Действие иммуномодуляторов на устойчивость и восприимчивость картофеля к Phytophtora infestansll Физиология растений.-2006.-Т.53.-№4. -С. 546-553.

88. Озерецковская O.JL, Ильинская Л.И., Васюкова Н.И.Биохимические механизмы олигогенной фитофтороустойчивости картофеля // Успехи биол.химии-1993-С.51-85.

89. Останина Е.С., Варламов В.П., Яковлев Г.И. Ингибирование активности липаз низкомолекулярным хитозаном // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. - Т.44. - №1. - С.38-43.

90. Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов. Скурат Е.В.: дисс. канд. биол. наук: М., 2006.-122с.

91. Покорна В. К методике определения липолитичеекой способности верховых и низинных торфов и грязей // Почвоведение.-1946.-№ 1.- с. 106-109.

92. Покорна В. Почвоведение.- 1964.- №1.- 106.

93. Полевой В.В. Физиология растений.- М:Высш.шк., 1989.464 с.

94. Попова Л.С., Имшеницкий A.A., Кириллова Н.Ф., Сорокина Т.А. Эстеразная активность пигментной группы бактерий рода Pseudomonas //Микробиология.- 1989.- Т.54.-С. 54-59.

95. Попова Н.И., Кривова А.Ю., Растимешина И.О., Бурцева С.А. Взаимосвязь биосинтеза липидов, липоксигеназы и липазы у культур актиномицетов //Микробиология. — 2005. -Т.74. №5. С.717-719.

96. Применение методов биохимии в исследованиях по защите растений. Под редакцией Тютерева С.Л., Новожилова К.В. Л.: ВИЗР, 1976.- 134 с.

97. Проценко М.А., Буза Н.Л., Криницина A.A., Буланцева Е.А.,Кораблева Н.П. Белковый ингибитор полигалактуроназы — структурный белок клеточной стенки растений // Биохимия.- 2008.- т. 48.-№ 6.-С. 863-868.

98. Пятыгин С. С. Стресс у растений: физиологический подход //Общая биология . 2008.-Том 69.- № 4.-С. 294-298.

99. Рабинович М. Л. // Биотехнология.- 1998.- Т. 11.- С. 4-149.

100. Раушенбах И.Ю., Лукашина Н.С., Хлебодарова Т.М. Роль эстеразы ювенильного гормона в метаморфозе Díptera // Генетика. 1991. -Т. 22. - № 3. - С. 274-281.

101. Ревина Т.А., Кладницкая Г.В., Чаленко Г.И., Валуева Т.А. Влияние белков-ингибиторов протеиназ из клубней картофеля на рост м-развитие фитопатогенных микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология.- 2008.- т.44.- №1.-С. 101-105.

102. Ревина Т.А., Сперанская A.C. Белок-ингибитор субтилизина из клубней картофеля // Биохимия. 2004.- Т. 69, вып. 10.-С. 1345-1352.

103. Родионова H.A. Ферментативное расщепление целлюлозы// Доклады АН СССР.- М.: Наука. 1981.-С.4-13.

104. Родионова H.A., Безбородов A.M. // Прикл. биохим. микробиол.- 1997. -Т . 33. -№ 5. С . 467-487.

105. Рославцева С. А., Еремина О.Ю., Костырко И.Н Исследование эстеразных систем насекомых/.// Агрохимия. -1990.- №10.-СЛ17-123.

106. Рубин Б.А. Растение в борьбе с заболеваниями. М: Знание, 1977.-64 с.

107. Рубин Б.А., Арциховская Е.В., Аксенова В.А. Биохимия и физиология иммунитета. М.: Высш. школа.- 1975.- 320 с.

108. Самохвалов А.Н., Игнатов А.Н. Активирование иммунитета капусты Brassica oleraceae L. Против сосудистого бактериоза // Биол.науки-1991-№12.-С. 131-142.

109. Сапожникова E.B. Превращение пектиновых веществ в растениях //Обменные процессы и их регуляция у растений и животных. -Саранск: Мордовский гос. ун-т, 1980. С. 4-16.

110. Сарсенбаев К.Н., Полимбетова Ф.А. Роль ферментов в устойчивости растений.Алма-Ата: Наука, 1986.- 184 с.

111. Семенова М.В. Свойства внеклеточных пектиназ грибов рода Aspergillius Дисс. канд. хим. наук, М., 2005, 167 с.

112. Серебров В.В., Алексеев A.A., Глупов В.В. Изменение активности и спектра эстераз гемолимфы гусениц вощинной моли Gallería mellonella L. (.Lepidoptera; Pyralidae) при микозах // Известия РАН.- 2001, №5.- С. 588-592.

113. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М.: Изд-во МГУ, 1995.224 с.

114. Синицына O.A., Федорова Е.А., Семенова М.В., Гусанов A.B., Соколова Л.М., Бубнова Т.М., Окунев О.Н. Выделение и свойства внеклеточной пектиназы Penicillmm canescens // Биохимия, 2007, т. 72, вып. 5.-С. 699-706.

115. Скомаровский A.A. и др., Новые целлюлазы для высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы// Прикладная биохимия и микробиология.- 2006.- Т42.- № 6.-С. 674-680.

116. Скоупс Р. Методы очистки белков. М: Мир, 1985. С.358

117. Сотченков Д.К., Голденкова И.В. Антимикробные белки и пептиды, участвующие в защите растений от грибных и бактериалных патогенов// Успехи современной биологии.- 2003, Т 123, №4.- С.323-335.

118. Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы и ее роль в поддержании стабильноститранскриптона растений. Гасанова Т.В. Автореф. дис.канд. наук М., 2008.102

119. Табак М.Я., Щелокова С.С. Влияние твинов на липазную активность Oospora lactis //Биотехнология.- 1979.- вып. 4.- С. 658-662.

120. Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе. Казань: Фэн, 2001.- 448 с.

121. Тарчевский И. А. Процессы деградации у растений // Соросовский образовательный журнал.- 1996.- №6.- С. 13-19 .

122. Тарчевский И. А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липидов// Физиология растений.- 1992.- Т.39.-№ 6.-С. 1215-1223.

123. Третьяков H.H., Кошкин Е.И., Макрушин И.М. и др. Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений под ред. Третьякова Н.Н.-М.: Колос, 1998.-640 с.

124. Усов А. И. Химия и технология крахмала, пер. с англ., М., 1975.-С. 236.

125. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М.: Высш. шк., 1993.1. С.483

126. Филлипович Ю.Б., Коничев A.C. Множественные формы ферментов насекомых и проблемы сельскохозяйственной энтомологии.-М.: Наука, 1987.- 168 с.

127. Фомичева Ю.А. Пищеварительные а-амилазы и протеиназы насекомых как элемент специфичного взаимодействия в системе растение насекомое -фитофаг: Автореф. канд. дис. Санкт-Петербург, 1992.- 15 с.

128. Фурсов О.В., Кузовлев В.А., Акаева М.М. Свойства и особенности амилаз зерна злаковых // Ферменты и качество зерна.-Алма-Ата: Наука, 1987.-С. 41.

129. Фурсов О.В., Кузовлев В.А., Аникеева JI.A. и др. Особенности ферментативного гидролиза крахмальных гранул зерен злаковых //Прикл. биохимия и микробиол.-1990. -Т.26.- № З.-С. 371.

130. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии.- М: Наука. 2005.-С.252.

131. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв.-М.: Наука, 1976. -С.180.

132. Хлуднев Д.В., Мосолов И.И. Поведение белка-ингибитора а-амилазы 2 из зерна пшеницы при прорастании // Физиология растений. -1992.- Т. 39. -№ 1.- С.120-125

133. Цыбина Т.А., Дунаевский Я.Е., и др., О пищеварительных протеиназах личинок Большого Мучнистого хрущика Tenebrio molitor: очистка и характеристика трипсиноподобной протеиназы// Биохимия.-2005.- Т.70. №3.-С.370-377.

134. Шапиро И.Д., Вилкова H.A., Слепян Э.И. Устойчивость растений к вредителям и болезням. Л.: Агропромиздат, 1986.- С. 190.

135. Шапиро И.Д., Турулева Л.М., Фасулати С.Р., Иващенко Л.С. Иммунологические барьеры и источники устойчивости картофеля к колорадскому жуку // Бюлл. ВИР, Л., 1991, в. 214, с. 50-56.

136. Шпирная И.А. Гидролитические ферменты и их ингибиторы как компоненты системы «Насекомое-фитофаг-растение». Автореф. дис. канд. биол. наук Башкире, гос. ун-та Уфа, 2006, 24 с.

137. Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И., Умаров И.А. Подавление активности гидролитических ферментов личинок колорадского жука растительными белками // Вестник Башкирского универститета.- 2006, № З.-С. 49-52.

138. Шубанов А. А., Ельина Е.А. Продуцирование полигалактуроназ мицелиальными грибами Aspergillus niger и Penicillium diercxii // Химия и компьютерное моделирование, Бутлеровсие сообщения.- 2002.- №7.- С. 64-68.

139. Яруллина JI. Г., Ибрагимов Р.И. Клеточные механизмы формирования устойчивости растений к грибным патогенам.- Уфа: Гилем, 2006-С. 232.

140. Яшина И.М. Генетические и методические аспекты традиционной селекции картофеля на устойчивость к колорадскому жуку // Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.- С.102-107.

141. Amadioha А.С. Production of cellulotic enzymes by Rhizopus-infected tissues of potato tubers//Mycologia.-1993.- №4,- P.574-578.

142. Arrese Estela L., Rajesh T. Patel and Jose L. Soulages The main triglyceride-lipase from the insect fat body is an active phospholipase Al: identification and characterization // Journal of Lipid Research.- 2006.-Vol. 47.- P.2656-2667.

143. Arrese E. L., Rojas-Rivas В. I., Wells M. A. Synthesis of sn-1,2-diacylglycerols by monoacylglycerol acyltransferase from Manduca sexta fat body// Arch. Insect Biochemestry Physiol.- 1996.-Vol 31.- P. 325-335.

144. Athenstaedt K.3 Daum G. Tgl4p and Tgl5p, Two Triacylglycerol Lipases of the Yeast Saccharomyces cerevisiae Are Localized to Lipid Particlesv // J. Biol. Chem.- 2005.-Vol. 280.- №. 45.-P. 37301-37309.

145. Athenstaedt K., Daum G. YMR313c/TGL3 Encodes a Novel Triacylglycerol Lipase Located in Lipid Particles of Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem .- 2003.-Vol. 278 №. 26.- P. 23317-23323.

146. Aubert J. P., Beguin P., Millet J., Activation of the Lipid Droplet Controls the Rate of Lipolysis of Triglycerides in the Insect Fat Body //J. Biol.Chem -2005.-Vol. 280.- №. 24.-P. 22624-22631.

147. Berger B., Raadt A., Grieng H. Useful hydrolytic enzymes: Proteases, lipases and nitrilases // Pure &Appl. Chem.- 1992.-Vol. 64.- №. 8.-P. 1085-1088.

148. Bleez E., Summerer S., Flenet M., Rogniaux H., Dorselaer A., Schuber F. Soubean Epoxide Hydrolase // J. Biol. Chem.- 2005.- Vol. 280.- № 8.- P. 6479-6487.

149. Bradford M.M. A rapide and sensetive method for the quantitasion of microgramm quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding II Anal. Biochem. 1976.- V.172.- № 1. - P. 248 - 254.

150. Brockerhoff H., Hoyle R. J., Hwang P.C. Anal.Biohem. 1970.p. 37.

151. Bronner R., Westphal E., Dreger F Pathogenesis-related proteins in Solarium, dulcamara L. resistant to the gall mite Aceria cladophthirus (Nalepa) (syn. Eriophyes cladophthirus Nal.) II Physiol.and' Mol.Plat Pathol.-1991 .-№2.-P.93-104.

152. Bryant J., Green T., Gurusaddaiah T., Ryan C.A. Proteinase inhibitor II from potatoe: Isolation and characterisation of the isoinhibitor subunits // Biochemistry. -1976.- V. 15.-№ 3.- P. 3418 3423.

153. Calza R.E., Irwin D.C., Wilson D.B. Purification and characterization of two P-l,4-endoglucanases from Thermomonospora fusca II Biochemistry.- I990.-Vol. 24. P. 7797-7804.

154. Chlumska J., Kratka J. Changes of pectin conents in alfalfa plants after inoculation with differently virulent isolates of Corynebacterium michiganese pv. Insidiosum investiated at an early stage of disease // Zbl.Mikrobiol.-1989.-№5.-P.337-340.

155. Chosso J. Inhibition of cellulotic activity by lactate in a Cellulomonas uda species. //Biotechnol. And Bioeng.- 1987.- №6.- P. 767769.

156. Clarini C.R., Grossi-de-S6 M.F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides//Toxicon.- 2002.- vol.40.- Is. 11.-P. 1515-1539.

157. Confalonieri V.A., Vilardi I.C., Saidman B.O Esterase variation among Argentine populations of Trimerotropis pallidipenis// Genet., Selec., Evol.-1990.-№3.- P.279-288.

158. Cooper A.B., Morgan H.W. Improvement fluorometric method to assay for soil lipase activity// Soil. Biol. And Biochem.- 1981.- Vol. 13.-N4.-P.307-311.

159. Cordero M.J., Raventos D., Segundo B.San. Induction of PR' proteins in germinating maize seeds infected with the fungus Fusarium moniliforme //Physiol and Mol.Plant Pathol.-1992.-№3.-P. 189-200.

160. Cornell H.V. Endophage-ectophage ratios and plant defence// Evol.Ecol.-1989.-№l.-P. 64-76.

161. Dingle J., Reid W., Solomons G. The enzyme degradation of pectin and other polysaccharides.il. Application of the «cup-plate» assay to the estimation of enzymes // J. Sci. Food.- 1994, Agric.3-4: P. 149-155.

162. Drapron R., Xuan Anh N.G., Launay B., Guilbolt A., General Chem.1969.-P. 647.

163. Dreywood R.D. Qualitative test for carbohydrate material // Ind and Eng Chem.Anal.- 1946.- Vol.18.- №2.- p.499.

164. Eastmond P. J. Sugar-dependent Encodes a Patatin Domain Triacylglycerol Lipase That Initiates Storage Oil Breakdown in Germinating Arabidopsis Seeds //Plant Cell. March; 18(3): 2006. -P.665-675.

165. Eastmond P.J. Cloning and Characterization of the Acid Lipase from Castor Beans // J. Biol. Chem.- 2004.- Vol. 279,.-№ 44.- P. 45540-45545.

166. Enyedi Alexander J., Yalpani Nasser, Silverman Paul, Raskin Ilya.Signal molecules in systemic plant resistance to pathogenes and pests // Cell.-1992.- №6.- P. 879-886.

167. Erlanger B.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes of trypsin // Arch. Biochem. Biophys.- 1961,- V. 95.- № 2.- P. 271-278.

168. Feiton G.W., Broadway R.M., Duffey S.S. Inactivation of protease inhibitor activity by plant-derived quinones: complications for hostplant resistance against noctuid herbivores // J.Insect physiol.-1989.- №12.-P.981-990.

169. Fryer T. F., Reiter B., Lawrence R.C. Lipases// J. Dairy Sei. -1977.-P. 477.

170. Gatehouse A.M., Gatehouse I., Dobie P. Biochemical basis of insect resistance in Vigna Unguqulata // J. Sei. Food Agric. 1979.- V. 30, № 2. - P.369-381.

171. Garcia-Casado G., Sanchez-Monge R., Salcedo G. Characterization of Affinity-purified Juvenile Hormone Esterase from the Plasma of the Tobacco Hornworm, Manducta sexta II J. Biol. Chem .- 1996.-Vol. 265.- № 35.- P . 21727-21732.

172. Ghose T.K., Bisaria V.S. Studies on the mechanism of enzymatic hydrolysis of cellulosic substances // Biotechnol. Bioeng.- 1992. -Vol. 21.-P. 131-146.

173. Graskova I.A., Antipina I.V., Potapenko O.Y., Voinikov V.K. Pathogen impact on the activity dynamics of potato suspension cells extra cellular peroxidase// Journal of Stress Physiology & Biochemistry.- 2005.-Vol. l.-№ l.-P. 15-20.

174. Green T.R., Ryan C.A. Wound- induced proteinase inhibitor of plant leaves. A possible defence mechanism against insects //Science. 1972.-V. 175.-№5.-P. 776 -777.

175. Griesbach E., Krämer I. Induktion einer Resistenz gegen

176. Clavibacter Michiganensis subsp. Michiganensis in Tomatenplanzen durch109

177. Pramunisierung mt einem apathogenen Stamm des Erregers: Vortr.48.Dtsch. Pflanzenschutz-Tag., Gottinen, 5-8 Okt, 1992 // Mitt. Biol.Bundesanst.Land-und Forstwirt.Berlin-Dahlem.-1992.- №283.- p.243.

178. Halim R.H., Mitchell H.L, Wassom C.E. Trypsin inhibitors of corn (Zea mays) II Trans. Kans. Acad. Sci. 1973.- V.76.- N 2. - P. 289-293.

179. Halim R.H., Wassom C.E., Mitchell H.L., Edmans L.K. Supression of fungal growth by isolated trypsin inhibitors of corn grain //J. Agric. Food. Chem. 1973.- V. 21.-№ 6. - P. 1118-1119.

180. Hammock, B. D., Kerkut, G. A., and Gilbert, L. I. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology // Pergamon Press, Oxford Vol. 7, 1985.-P. 431-472.

181. Hao J., Pazlarova J., Strnadova M, Chaloupka J. Regulation of extracellular proteins and a-amylase secretion by temperature in Bacillus subtilis II Folia micrbiol.-1989.- №3-P.179-184.

182. Hayashi Y., Hayashi M., Hayashi H., Hara-Nishimura I, Nishimura M. Direct interaction between glyoxysomes and lipid bodies in cotyledons of the Arabidopsis thaliana pedl mutant.// Protoplasma .-2001.- P. 83-94.

183. Hilder V.A., Boulter D. Genetic engineering of crop plants for insect resistance a critical review// Crop Prot.- 1999.- Vol.l8.-P.177-191.

184. Huang A. H. C., Brockman, H. L., and Borgstrom, D. Plant lipases. In Lipases //Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam.- 1983,- P. 419—442.

185. Hung Т.Н., Giridhaz R., Chiou S.H., Wen-Teng W. Identification of the Ricin Lipase Site and Implication in Cytotoxicity // J. Biol. Chem.- 2003.-Vol. 278.- № 19.-P. 17006-17011.

186. Hwang D.L.R., Yang N.K., Foard D.E. Rapid release of protease inhibitors from soybeans. Immunochemical quantitation and parallels with lectins II Plant Physiol. 1978.- V.61.- № 1.- P. 30 -34.

187. J. Genest. Lipoprotein disorders and cardiovascular risk// J.Inh rit.Metab.Dis.26 .-2003.- P.267 -287.

188. Jensen J.R. Lipids, 8, 1973 Methods in enzymology ed. by G.E. Perfmann, L. Lorand, v. 19, N.Y-L, 1970.

189. Jensen R.G., Dejong F.A., Lar R.M. Determination of lipas specifity //Lipids.- 1983, №3 .- P.239-252.

190. Kaiser P., Monzon de Asconegui M. S. Bull. Internat. Inform. //Biologie du sol.- 1971.- №14.- P. 12.

191. Kaiser P., Monzon M.S. Mesure de l'activité des enzymes pectinolytiques dans le sol//Biol. Sol.- 1971.- №14.- P. 16-19.

192. Kohn Rudolf, Markovic Oskar, Macho va Eva. Deesterification mode of pectin by pectin esterases of Aspergillus foetidus, tomatoes and alfaalfa. //Collect Czch.Chem. Commun.-1983.- №3.- C. 790-797.

193. Konstantinidis A.K., Marsden I., Sinnott M.L. Hydrolyses of alpha- and beta-cellobiosyl fluorides by cellobiohydrolases of Trichoderma reesei II Biochem. J.- 1993.- Vol.291.- P. 883—888.

194. Kubicek C.P. // Adv. Biochem. Eng.Biotechnol. Ed. A.Fiechter. Springer-Verlag. Berlin. Heidelberg.-1992.-Vol. 45. P. 1—27.

195. Kurabi A, Berlin A, Gilkes N, Kilburn D, Bura R, Robinson J,

196. Markov A,Skomarovsky A, Gusakov A, Okunev O, Sinitsyn A, Gregg D, Xie

197. D, Saddler J. Enzymatic hydrolysis of steam-exploded and ethanol organosolvliipretreated Douglas-fir by novel and commercial fungal cellulases. Appl Biochem Biotechnol.- 2005.- P.219-230.

198. Margesin R., Feller G., Haminerle M., Stenger U., Schinner P. A colorimetric method for the determination of lipas activity in soil// Biotechnol. Letters.-2002.-Vol.24.- №l.-P.27-33.

199. Martin H. F., Peers F. G. Oat lipase//Biochem J. 1953 October;. 55(3): 523-529.

200. Miyata S., Akazava T. Purification and Characterization of an Esterase Hydrolyzing Monoalkyl Phthalates from Micrococcus sp. YGJ1 // The Japanese Biochemical Society .-2005.-Vol. 137.- № 1.- P.27-32.

201. Morimoto Richard I.,Tissieres Alfred, Georgopoulos costa The stress response, funktion of the proteins , and perspectives/ //Stress proteins Biol. And Med.-Cold spring Harbor (N.Y.), 1990-P.1-36.

202. Morlon-Guyot J., Helmy M., Lombard-Frasca S., Pignol Ge'rard Pie'roni D., Beaumelle B. Identification of the Ricin Lipase Site and Implication in Cytotoxicity // J. Biol. Chem Vol. 278, No. 19, Issue of May 9.2003 .-P. 17006-17011.

203. Mosolov V.V., Loginova M.D., Fedurkina, Benken I.I. The biological significance of proteinase inhibitors in plants // Plant Sci. Lett.-1976.-V.7, N2.- P. 77-80.

204. Mundy J., Hejgaard J, Svendsen I. Characterisation of a Afunctional wheat inhibitor of endogenous a-amilase and subtilisin // FEBS Letters. 1984.- V. 167, N 2. - P. 210-215.

205. Mundy J., Svendsen I, Hejgaard J. Barley a-amilase/subtilisin inhibitor. I. Isolation and characterisation // Carlsberg. Res. Communs. 1983. -V. 48,N2. -P. 81-90.

206. Okyta T., De Coleya R., Rapoport L. Synthesis of Possible Precursor of a-amylase in Whete Aleurone Cells // Plant Physiol.- 1979.-V.63.-№ i. P.195.

207. Pancholi S.K., Lynd J.Q. Soil. Biol. And Biochem., 4 № 1.- P,257.

208. Pancholy S.K., Lynd J.O. Qualitative fluorescence anaysis of lipase activity// Soil.Biol. And Biochem.-1972.- Vol.4.- №2 .-P. 257-259.

209. Pant Radha, Ramana D. Cellulotic activity in a Phytophagous lepidopterian insect Philosamia ricini\ the origin of the enzymes // Insect Biochem.-1989.-№3 .-P.269-276.

210. Patel R. T., Soulages J. L., Hariharasundaram B.5 Arrese E. L. Activation of the Lipid Droplet Controls the Rate of Lipolysis of Triglycerides in the Insect Fat Body // J. Biol. Chem .- 2005.-Vol. 280, No. 24, Issue of June 17.-P. 22624-22631.

211. Pfliiger W., Seffes R., Wachendorff U., Zoebelin G.Naturalthinsecticides from higher plants-results of 5 years screening// Poc.18 Int.Congr. Enttomol., Vancouver, July 3rd -9th , 1988: Abstr.and Anthor Index.-Vancouver., 1988- P.475.

212. Rahul B. Biraria and Kamlesh K. Bhutani. Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential// Drug Discovery Today .-2007.-Vol. 12, Issues 19-20, October.-P. 879-889.

213. Richardson M. The proteinase inhibitors of plant and microorganisms // Phytochemistry.- 1977.- Vol.l6.-№2.-P.159-169.

214. Richardson M., Compos F., Xavier-Tilho C. et all. Chymotrypsin inhibitor from potatoes: interactions with target ensymes // Biochem et Biophys. Acta, 1986.- № 1.- P. 184-192.

215. Roe R.M., Hammond A.M., Sparks T.C.Characterization of theplasma juvenile hormone esterase in synchronous last stadium female larvae of113the sugar cane bored, Diatraea saccharalis (F.) //Insect Biochem.-1983.- №2.-P. 163-170.

216. Ryan C. A. Defense responses of plants // Plant Gene Research: Genes Involved in Microbe Plant Interactions. -1984.- P. 375-386.

217. Ryan C.A. Oligosacharide signalling in plants // Ann. Rev. Cell Biol. 1987. - V. 3, № 2. - P. 243 -245.

218. Ryan C.A. Proteinase inhibitors // Biochemistry of plants / Ed. By A.Marcus. Orlando: Acad.Press. 1981. - P. 531-357.

219. Ryan C.A. Proteolytic enzymes and their inhibitors of plants // Ann.Rev. Plant Physiol. -1973. V. 24, № 1. P.173 -196

220. Ryan C.A. The searh for the proteinase inhibitor-inducing factor, PIIF // Plant Mol. Biol. 1992.- V. 19, № 1. - P. 123-133.

221. Saloheimo M., Nakari-Setala T.,Tenkanen M., Penttila M. cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast.//European journal of biochemistry/FEBS 1997; 249(2):584-91.

222. Sathiya M., Balasubramanian R. Chitinases and glucanases in Arachis Hypogaea L. In defached leaves infected with Puccinia arachidis Spegll Z. Pflanzenkrankh. Und Pfalanzenschuts.-191- №3.- P.305-316.

223. Svendsen I., Hejgaard J., Mundy J. Complete amino acid sequence of the a-amylase/subtilisin inhibitor from barley // Carlsberg Res. Commun.-1986.- V. 51. P. 141-157.

224. Schlaak H.E., Uschtrin D., Arndt R.Comparison of the lipolytic activity of unspecific carboxylesterase and lipase //Hoppe-Seyler's z Physiol.Chem.- 1982.-№9.-C.961.

225. Selivanov N. Yu., Sorokina I. V., Selivanova O. G., Sokolov O. I. and Ignatov V. V. Investigation of enzymatic degradation of pectinpolysaccharides under limiting conditions//Biochemistry(Moscow).-2008.-Vol. 73.-№ 1.-P. 80-86.

226. Shimoto Masao, Kitamura Keisuke. Effect of absence of seed a-amylase inhibitor in the growth inhibitory activity to azuki bean weevil (Callosobruchus vulgaris L.)// Jap J. Breed-1991, №2.- C.231-240.

227. Soulages J.L., Wells M.A. 1994. Lipophorin: the structure of an insect lipoprotein and its role in lipid transport in insects // Adv Protein Chem .-1994.-: 371-415.

228. Tashiro M., Azao T., Hirata C. et al. Purification and characterisation of major trypsin inhibitor FMTJ -II, from foxtail millet grain // J. Biochem.- 1990.- V. 108, N 4.- P. 669- 672.

229. Tomme P., Warren R.A.J., GilkesN.R. // Adv. Microbial Physiol.-1995. Vol. 37. -P. 1—81.

230. Ussuf K. K. Proteinase inhibitors: Plant-derived genesof insecticidal protein for developing insect-resistant transgenic plants // Current Science.- 2001.-vol. 80.- №7.-P.47-853

231. Walker Simmons M., Ryan C.A. Proteinase inhibitor synthesis in tomato leaves. Induction by chitosan oligomers and chemically modified chitosan and chitin // Plant Physiol. - 1984.- V. 76.- N 3. - P. 787790.

232. Willott E., Bew L.K., Nagle R. B., Wells M. A. Sequential Structural Changes in the Fat Body of the Tobacco Hornworm, Manduca sexta, during the Fifth Larval Stadium // Tissue and Cell .-1988.-№20.-P. 635643.

233. Wilson K.A. The release of proteinase inhibitors from legume seeds during germination // Phytochemistry.- 1980.- V. 19.-№ 12.- P. 25172519.

234. Wilson K.A., Chen I.C. Amino acid sequence of a mung bean trypsin inhibitor and its modified forms appearing during germination// Plant Physiol. 1983. - V. 71.-N 2. - P. 341-349.

235. Woloshuk Charles P.,Meulenhoff Josien S., Sela- Buurlage Marianne, Elzen Peter J.M.van den, Cornelissen Ben J.C.Patohogen-induced proteins with inhibitory activity toward Phytophtora infesas // Plant Cell.-1991.- №6.-P.619-628.

236. Wong J.H., Ng T.B. The enzymes // Peptides.- 2005.- V. 26.- № 4.-P. 2086-2092.

Информация о работе

Шевченко, Наталья Дмитриевна
кандидата биологических наук
Уфа, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Активность гидролитических ферментов и их ингибиторов в тканях картофеля и колорадского жука: методические аспекты - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы