Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гидролитические ферменты и их белковые ингибиторы как компоненты взаимодействия картофеля с колорадским жуком

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гидролитические ферменты и их белковые ингибиторы как компоненты взаимодействия картофеля с колорадским жуком"

005005602

На правах рукописи

и/

Цветков Вячеслав Олегович

ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И ИХ БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ КАК КОМПОНЕНТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КАРТОФЕЛЯ С КОЛОРАДСКИМ ЖУКОМ

03.01.05 - физиология и биохимия растений 03.02.08 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 ДЕК 2011

Уфа-2011

005005602

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ибрагимов Ринат Исмагилович, доктор биологических наук, доцент Яруллина Любовь Георгиевна

доктор биологических наук, профессор Каримова Фатима Габдуллазяновна, доктор биологических наук, профессор Хазиев Фангат Хаматович

Ведущая организация:

Государственный научный центр РФ «Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н. И. Вавилова Российской академии сельскохозяйственных наук», г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «22» декабря 2011 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.013.11 при Башкирском государственном университете по адресу: 450076, г. Уфа, ул. З.Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332. Факс: (347) 273-67-78, e-mail: disbiobsu@mail.ru .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета. С авторефератом можно ознакомиться на сайте http://www .bashedu.ru/avtoreferaty

Автореферат разослан «_» ноября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям является одной из важнейших проблем экологически безопасного растениеводства. Решению этой проблемы в значительной степени способствует познание механизмов взаимоотношений растений с организмами-фитофагами. Гидролитические ферменты насекомых-вредителей и патогенных микроорганизмов являются важным звеном при взаимодействии их с растениями, поскольку обеспечивают эффективное расщепление растительных полимеров, составляющих основу кормового субстрата. В тканях организмов-фитофагов выявлена активность различных типов гид-ролаз: катеисиноподобных и трипсиноподобных протеаз (Thie, Houseman, 1990; Michaud et al, 1993; Novillo et al, 1997), эндоглюкозидаз (Scrivener, Slaytor, 1994; Watanabe et al, 1997; Tokuda et al, 1997), целлобиогидролаз и бета-глюкозидаз (Chararas et al, 1983; Xue et al, 1999), альфа-амилаз (Khorram et al, 2010).

Соответственно, подавление активности гидролитических ферментов насекомых-вредителей представляет один из эффективных способов реализации механизмов защиты у растений. Известно, что в тканях различных видов растений обнаружены специфические молекулы (ингибиторы), способные нейтрализовать действие пищеварительных ферментов насекомых. Так, описано присутствие в растениях ингибиторов цистеиновых и сериновых протеаз (Конарев Ал., 2000; Валуева, Мосолов, 2002), ингибиторов целлюлаз различной природы (Sami, Shakoori, 2011), ингибиторов пектиназ (Bugbee et al, 1993; Wei et al, 2002; Akimitsu et al, 2004) и амилаз (Конарев Ал., 1991; Sivakumar et al, 2006). Более того, в ответ на контакт и поедание насекомыми происходит интенсивное накопление ингибиторов гидролаз как в пораженных, так и в интактных органах растений (Green, Ryan, 1972; Boulter, 1993; Zhao et al, 1996; Шпирная, 2006).

К настоящему времени накоплено значительное количество экспериментальных данных о структурно-функциональных особенностях ряда гидролаз, в первую очередь, ферментов млекопитающих, патогенных микроорганизмов (Thie, Houseman, 1990; Варфоломеев, Пожитков, 2000; Qin et al, 2007), получены сведения об участии ингибиторов этих ферментов в защитных реакциях растений (Gourinath et al, 2000; Lawrence, Koundal, 2002; Castro, Fontes, 2005; Bonfig et al, 2010).

Однако молекулярный состав, физико-химические и биохимические свойства, физиологические функции гидролаз организмов - представителей класса насекомых пока малоизученны. Соответственно, и экспериментальные сведения о составе, свойствах, функциях ингибиторов этих ферментов из растительных тканей также весьма ограничены. Исследование гидролаз патогенов и специфичных им ингибиторов из растительных тканей представляет интерес как с точки зрения познания молекулярных механизмов взаимодействия важнейших компонентов наземных экосистем «растение-фитофаг», так и с позиции поиска эффективных и экологически безопасных методов защиты культурных растений от насекомых-вредителей и патогенных микроорганизмов.

Цель и задачи исследований

Цель работы заключалась в выявлении закономерностей функционирования комплекса «гидролитический фермент - ингибитор» как одного из важных физиологических звеньев взаимодействия растений с насекомыми-вредителями.

В задачи исследования входило:

- выделение, очистка и характеристика гидролитических ферментов колорадского жука;

- выделение из листьев картофеля специфичных к гидролазам насекомых белковых ингибиторов, характеристика их состава и свойств;

- исследование активности и молекулярной гетерогенности гидролитических ферментов колорадского жука в различных условиях обитания насекомых;

- исследование уровня активности ингибиторов экзогенных гидролаз в тканях картофеля различных сортов и при действии препаратов-биорегуляторов.

Необходимым условием выполнения поставленных задач являлась постановка доступного метода выделения и очистки гидролитических ферментов, для реализации которого был выбран аффинный сорбент на основе полиакри-ламидного геля со специфическими лигандами.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование специфических белковых молекул, обеспечивающих трофические связи фитофага и растительного организма. Впервые определен молекулярный состав и измерены физико-химические параметры молекул пектиназ, целлюлаз из личинок колорадского жука, выделены и охарактеризованы специфичные ферментам белковые ингибиторы из тканей картофеля. Впервые получены данные о полном подавлении действия амилаз, протеиназ, целлюлаз при питании личинок насекомых листьями томатов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые экспериментальные сведения, раскрывающие молекулярные механизмы взаимодействия важнейших компонентов наземных экосистем: насекомыхфитофа-гов и растений. Выделены и подробно охарактеризованы специфические молекулы ферментов, представляющие гидролитический комплекс колорадского жука - наиболее опасного насекомого-вредителя картофеля. Получены оригинальные данные о молекулярном составе и физико-химических свойствах ингибиторов из растительных тканей, подавляющих активность протеиназ, амилаз, пектиназ вредителя. Для очистки гидролитических ферментов и их белковых ингибиторов разработаны и использованы новые аффинные сорбенты на основе полиакриламидного геля. Получены новые оригинальные данные об изменении уровня активности гидролаз, их молекулярной гетерогенности в зависимости от условий обитания насекомых.

Результаты исследований вносят существенный вклад в представления о механизмах взаимодействия растений с организмами-фитофагами и могут быть использованы для разработки новых, экологически безопасных способов защиты сельскохозяйственных культур от насекомых-вредителей и патогенных микроорганизмов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в т.ч. 5 - в изданиях, включенных в список ВАК РФ. Материалы диссертации доложены на Международных и Всероссийских научных конференциях: «Устойчивость организмов к неблагоприятным условиям внешней среды» (Иркутск, 2009); «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); «Растение и стресс» (Москва, 2010); «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2010); «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); «Био-мика - наука XXI века» (Уфа, 2011); «Экобиотех» - 2011 (Уфа, 2011).

Струю-ура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), выводов и списка использованной литературы, включающего 190 наименований, в том числе 160 - в зарубежных изданиях. Работа изложена на 117 страницах и содержит 12 таблиц и 32 рисунка.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 16.740.110061); ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК№ 16.512.11.2014).

Объекты, материалы и методы исследования

В опытах использовались личинки и имаго колорадского жука (Leptinotar-sa decemlineata Say), растения картофеля (Solarium tuberosum L., селекционные гибриды № 4270, 4273-8, 4281-7, 4292-149, 9513-7, сорта Невский, Луговской, Удача, Башкирский), томата (Solarium lycopersicum L., сорт Молдавский ранний) и баклажана (Solarium melongena L., сорт Юбилейный). Насекомых собирали на растениях картофеля Баймакского, Балтачевского, Белорецкого, Бир-ского, Илишевского, Уфимского, Чишминского районов РБ.

В качестве препаратов-биорегуляторов использовали Циркон (действующее вещество - смесь гидроксикоричных кислот), Эпин-экстра (эпибрассино-лид), Фитоспорин (клетки и споры Bacillus Subtilis 26Д). Клубни картофеля трижды обрабатывали растворами биорегуляторов с интервалом 3 дня.

Для экстракции белков навеску насекомых или растительного материала гомогенизировали в трис-HCl или ацетатном буфере, дважды центрифугировали при 11000 g в течение 10 минут при 4 °С. Супернатант использовали для определения активности и выделения гидролитических ферментов и их ингибиторов.

Для определения активности протеиназ использовали метод Эрлангера (Erlanger, Kokowski, Cohen, 1961), метод агарозных пластин (Шпирная и др., 2009). Активность амилаз, целлюлаз, пектиназ определяли с помощью иммобилизованных в г еле агарозы субстратов для ферментов: крахмала, карбоксиметил-целлюлозы и пектина, соответственно (Анкудимова, 2000; Короткова, 2011; Семенова, 2005).

Для аффинной очистки протеиназ, амилаз, пектиназ и целлюлаз насекомых, их белковых ингибиторов из растений использовали сорбент на основе полиакриламидного геля. Способ приготовления аффинного сорбента описан в главах 2.4 и 3.1.1. При очистке гидролаз в качестве лигандов были использованы ферментные субстраты: желатин (для протеиназ), пектин (для пектиназ), крахмал (для амилаз), карбоксиметилцеллюлоза (для целлюлаз). Для выделения ингибиторов гидролаз из тканей растений в качестве аффинных лигандов были использованы очищенные ферменты колорадского жука.

Выделение ферментов производили на жидкостном хроматографе низкого давления BioLogic LP (Biorad, США) при 4 °С.

Для определения изоэлектрической точки и молекулярной массы белков использовали метод двумерного денатурирующего электрофореза в полиакри-ламидном геле (Vincent, Wheatley, Cramer, 2006). Для разделения белков по молекулярной массе проводили SDS-электрофорез в 10%-ном ПААГ.

Эксперименты проводили в трехкратной биологической и четырехкратной аналитической повторностях.

Результаты и обсуждение

Выделение, молекулярный состав и свойства гидролитических ферментов личинок колорадского жука и их ингибиторов из листьев картофеля

Для выделения гидролитических ферментов и их ингибиторов нами был использован аффинный сорбент на основе полиакриламидного геля со специфическими лигандами (Хавкин, Булыгина, 1978; Гарипова и др., 1993).

Объем колонки составлял 20 мл, скорость тока жидкости - 2 мл/мин.

Полиакриламидный сорбент с иммобилизованным желатином был протестирован с использованием коммерческого трипсина. На колонку наносили 1 мл раствора (0,1 мг/мл в трис-НС1-буфере, рН 8,0). Элюцию аффинносвязанных молекул осуществляли с помощью ацетатного буфера, рН 5,6. В результате нанесенный на колонку фермент (0,1 мг) полностью связался с субстратом и вышел в процессе элюции ацетатным буфером.

Для модельных экспериментов по выделению ингибиторов был использован сорбент с иммобилизованным бычьим трипсином. В результате очистки белков из гомогената листьев картофеля удалось получить 72 мкг белка с удельной активностью ингибиторов трипсина 400 мИЕ/мкг, удельная активность повысилась в 8 раз.

В ходе наших экспериментов один и тот же сорбент с иммобилизованным лигандом использовался до 5 раз, что не влияло на профиль хроматографии и степень очистки. Последующие эксперименты показали, что в зависимости от типа лиганда и параметров выделяемых молекул эффективность очистки белков с использованием данного сорбента составляет от 8 до 40 раз.

Выделение протеаз и их ингибиторов. Ферменты, способные гидролизо-вать молекулы белков и пептидов, являются важной частью гидролитического комплекса насекомых. Известно, что в тканях колорадского жука функциони-

рует множество ферментов, относящихся к различным типам протеиназ (Кона-рев Ал., 2000; Валуева, Мосолов, 2002; Вилкова и др., 2005).

Для получения протеаз объединяли фракции, обладающие БАПНА-азной активностью (69-74 мин) (рис.1). Объем ферментного раствора составил 10 мл с общим количеством белка более 0,5 мг (табл. 1). Удельная активность ферментов в процессе выделения повысилась в 50 раз, что соответствует показателям эффективности коммерческих сорбентов.

Рис. 1. Аффинная сорбция протеаз личинок колорадского жука на иммобилизованном желатине.

1 - неспецифические белки,

2 - аффинносвязанные белки.

На рис. 2 представлена хроматограмма выделения ингибиторов протеаз колорадского жука из листьев картофеля.

Для получения ингибиторов протеаз объединяли фракции с 42 по 47 мин., общий объем фракций составил 10 мл. Как видно из таблицы 1, в ходе очистки ингибиторов было достигнуто повышение удельной активности ингибиторов в 8 раз, что значительно ниже, чем степень очистки протеаз колорадского жука.

Рис. 2. Аффинная сорбция ингибиторов протеаз из листьев картофеля на иммобилизованных протеазах.

1 - неспецифические белки,

2 - аффинносвязанные белки.

Выделение целлюлаз, пектиназ, амилаз и их ингибиторов. Очистку целлюлолитических ферментов производили на иммобилизованной карбокси-метилцеллюлозе, пектолитических ферментов - на яблочном пектине, амилоли-тических ферментов - на иммобилизованном картофельном крахмале по методике, описанной выше для протеаз. Иммобилизованные гидролазы колорадского жука были использованы для очистки ингибиторов из листьев картофеля. Как видно из табл. 1, при выделении данных ферментов и ингибиторов было достигнуто повышение удельной активности в 10-26 раз.

Во фракциях элюции ингибиторов целлюлаз вещества полипептидной природы отсутствовали. Можно констатировать, что соединения из листьев карто-

феля, подавляющие активность целлюлаз колорадского жука, не являются полипептидами. По-видимому, эти ингибиторы могут представлять собой низкомолекулярные субстраты ферментов, например, флавоноиды (Sami, Shakoori, 2010) или целлобиозы (Zhou et al, 2007). Необходимо отметить, что в настоящее время в литературе отсутствуют сведения об ингибиторах целлюлаз белковой природы.

Таблица 1

Результаты аффинной очистки гидролаз и их ингибиторов на полиакриламид-ном сорбенте с иммобилизованным лигандом (объем колонки - 20 мл).

Фермент, ингибитор Фракция Объем, мл Концентрация белка, мкг/мл Ферментативная активность, Е/мл Суммарная ферментативная активность, Е Удельная ферментативная активность, Е/мкг

Протеазы Исходный экстракт 3 2100 20 60 0,01

Очищенный препарат 10 56 30 300 0,53

Ингибиторы протеаз Исходный экстракт 3 400 20 60 0,05

Очищенный препарат 10 12 5 50 0,42

Целлюлазы Исходный экстракт 3 2100 250 750 0,12

Очищенный препарат 10 30 50 500 1,67

Пектиназы Исходный экстракт 3 600 64 190 0,11

Очищенный препарат 16 22 52 830 2,36

Ингибиторы пектиназ Исходный экстракт 3 400 22 66 0,06

Очищенный препарат 14 4 3 42 0,75

Амилазы Исходный экстракт 3 600 50 150 0,08

Очищенный препарат 12 20 42 500 2,10

Ингибиторы амилаз Исходный экстракт 3 400 16 48 0,04

Очищенный препарат 16 10 4 64 0,4

Физико-химические свойства гидролитических ферментов. В табл. 2 приведены физико-химические параметры исследованных белков. Полученные нами протеиназы по рН-оптимуму активности наиболее близки к катепсинопо-добным (максимум активности при рН 7,4 - 7,5) и трипсиноподобным (7,8) цистеиновым протеазам млекопитающих (Turk et al, 1993; Zeng et al, 2002). Выделенные протеиназы представлены термолабильными белками и существенно не отличаются от известных ферментов млекопитающих: трипсина (оптимум активности 37 °С), химотрипсина (45-55 °С) (Castillo-Yanez et al, 2009) и различных форм катепсиноподобных ферментов (45 °С) (Aranishi et al, 1992).

Таблица 2

Параметры очистки и физико-химичсские характеристики гидролаз колорад-

ского жука и их ингибиторов из листьев картофеля.

Степень очистки Число изо-форм М.М., кДа Pi рН-оптимум Термостабильность, °С

Протеазы 50 6-7 70; 20-30 4,5 8-9 40

Ингибиторы протеаз 8 3-5 20-30 5-7 - -

Целлюлазы 14 6-7 30-40 5-6 6 50

Пектиназы 20 4-5 20-50 4-5 5,4 40

Ингибиторы пектиназ 12 4 20 6-7 - -

Амилазы 26 4 30-50 5-6 7 40

Ингибиторы амилаз 10 5-6 15-25 5-6 - -

Выделенные нами целлюлазы проявляют максимальную активность при рН 6. Большинство описанных в литературе целлюлаз из различных организмов имеют оптимум при рН 4-5. В то же время они способны эффективно функционировать в диапазоне рН от 3 до 7 (Buchholz et al, 1983; Beldman et al, 1985). Относительно высокую термостабильность целлюлаз можно объяснить наличием в кишечнике личинок насекомых целлюлозоразрушающих бактерий, обладающих термостабильными формами этих ферментов (Bayon, Mathelin, 1980).

Наиболее близки по рН-оптимуму к исследованным нами пектиназам ферменты бактерии Cl pecîinovorum, имеющие оптимум при рН 5,4-5,6. Активность пектиназ сохраняется в диапазоне от 30 до 40 °С.

Максимальная активность амилаз отмечена при рН 7. В данной области значений рН проявляют активность амилолитические ферменты различных животных, в т.ч. насекомых и млекопитающих. Амилолитическая активность сохраняется при температуре до 40 °С.

Молекулярный состав гидролаз и их ингибиторов. На рис. 3-4 представлены результаты разделения полученных белков методом двумерного электрофореза. Можно предположить, что характеризуемые протеазы представляют собой различные формы катепсин-подобных цистеиновых протеиназ, аналогичных ферментам животных (Thie, Houseman, 1990,Yamaguchi et al., 1990; Mi-chaud et al, 1993; Novillo et al, 1999; Lopez-Ordonez et al, 2001; Валуева, Мосолов, 2002; Zhang et al, 2008). Полученные белки схожи с ингибиторами серино-вых протеаз типа Кунитца, ингибиторами катепсина D, трипсина и химотрип-сина (Rancour and Ryan, 1968; Lawrence, Koundal, 2002; Major, Constabel, 2008).

Целлюлазы личинок представлены 8 компонентами с параметрами, сходными с молекулами эндоглкжоназ из Reticuîitermes speratus (Watanabe et al, 1997) и Nasutitermes takasagoensis (Tokuda et al, 1997).

а е

. Рис.3.

ee_ f зь | : Двумерный электрофорез

■к- протеаз (а),

3.. 34 „ - м целлюлаз (б),

- 4 - > » пектиназ (в),

1 амилаз (г)

8 в 10%-ном SDS-ПААГ.

«I J* Окраска Кумасси G-250.

3 : 4 S \ 8 Щ 10 - 3 4 f0: 7 ; 9 Я

В составе пектиназ личинок колорадского жука выявлено около 8 белков с м.м. от 20 до 50 кДа. В данном диапазоне находятся м.м. как большинства известных пектатлиаз, так и пектинметилэстераз микробного и растительного происхождения (Whitaker, 1990; Dixit et al, 2004; Jayani, Saxena, Gupta, 2005). Однако по значениям изоэлектрических точек (pi 4-5) исследованные нами ферменты более схожи с пектинметилэстеразами, чем с петсгатлиазами, у большинства из которых изоэлектрическая точка лежит в диапазоне pH 7-11. Полученные ингибиторы пектиназ, предположительно, представляют собой ингибиторы пектинметилэстераз, активность которых выявлена в листьях картофеля (Rausch, Greiner, 2004; Hothorn et al., 2004a; Di Matteo et al., 2005).

45- 35_

14-

143456789 19 3456789 1«

Рис. 4. Двумерный электрофорез ингибиторов протеаз (а), пектиназ (б), амилаз (в) в 10%-ном SDS-ПААГ. Окраска Кумасси G-250.

Исследованные амилазы, по-видимому, являются альфа-амилазами, среди которых известны представители с молекулярной массой 40-60 кДа (Matsuura et al, 1984). Возможно, среди исследованных белков присутствуют также низкомолекулярные формы бета-амилаз или фрагменты их молекул, содержащие центр связывания с субстратом. Молекулярная масса ингибиторов амилаз составляет 15-25 кДа, что соответствует характеристике множества известных ингибиторов растительного и микробного происхождения (Feng et al, 1995).

Таким образом, гидролитические ферменты колорадского жука представлены гетерогенным комплексом полипептидов с м.м. от 30 до 70 кДа.

Влияние кормового субстрата на активность и молекулярный состав гидролитических ферментов личинок колорадского жука

Уровень гидролитической активности в тканях имаго и личинок колорадского жука зависит от возраста, физиологического состояния насекомых, от типа и состава кормового субстрата. Наиболее хорошо изучены в этом отношении протеолитические ферменты насекомых (С)уегпеу е1 а1, 1998; 211и-8а1гтап, Zeng, 2008; Умаров, 2009). В наших экспериментах определяли изменение активности протеиназ, амилаз, пектиназ и целлюлаз при голодании насекомых и при кормлении их листьями нескольких видов растений семейства пасленовых. Личинки были собраны с растений картофеля и в течение 48 часов содержались в контейнерах при искусственном кормлении.

Как видно из рис. 5, смена пищевого субстрата существенно изменяет уровень гидролитической активности у насекомых. Наибольшая активность исследуемых ферментов выявляется у личинок, продолжающих питаться листьями картофеля сорта Невский. Кормление насекомых листьями баклажана приводит к снижению активности в их тканях протеиназ, целлюлаз и амилаз. У личинок, питавшихся листьями томатов, активность протеаз, целлюлаз и амилаз полностью подавляется, в гомогенатах определяется лишь пектиназная активность, уровень которой в два раза снижен по сравнению с контролем. Необходимо отметить, что голодание личинок в течение 48 ч также приводит к существенному (на 20-40 %) снижению уровня протеиназ, целлюлаз, пектиназ, активность амилаз выявляется на уровне контрольного варианта.

I прогеазы 3 лекгинэзы 3 целлюлазы

Картофель Картофель Баклажан Томат (Невским) (Башкирский)

Рис. 5. Активность гидролитических ферментов в гомо-генате личинок колорадского жука в зависимости от пищевого субстрата. «Невский», «Башкирский» - сорта картофеля. «Без корма» -личинки, лишенные пищи в течение 48 ч.

Режим питания

Электрофоретические спектры ферментов у насекомых, питавшихся листьями картофеля и баклажана, качественно не различаются. В них выявляется 4 мажорных компонента протеаз, 3 - целлюлаз, 4 - пектиназ и 3 компонента амилаз. Как и ожидалось, из тканей насекомых, питавшихся томатами, удалось выделить и разделить электрофоретически только пектолитические ферменты. При голодании насекомых спектральный состав исследуемых гидролитических ферментов не изменялся.

Таким образом, функциональное состояние гидролитического комплекса личинок колорадского жука в значительной степени определяется биохимическим составом кормового субстрата и в меньшей степени - количеством корма. Полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения о том, что часть гидролитической активности личинок может быть обусловлена также

ферментами кишечной микрофлоры, в том числе микроорганизмов, попадающих в организм при питании насекомых.

Активность гидролитических ферментов колорадского жука, обитающего на различных территориях

Ранее было показано, что выборки насекомых из различных районов имеют существенные различия по экологическим, токсикологическим и биохимическим параметрам (Умаров, 2009). Нами была исследована активность гидро-лаз личинок колорадского жука в различных локальных популяциях (выборках) на территории Республики Башкортостан (рис. 6).

Протеаэы Целлюлазы

I I С ^ ^ ^ цс.ики.ш^В! ^^ .............

20 ЛО I 20 20

15............................15 I 15 ^ 1 15

ю ..............................ю ..........х ю " 1 ш

ж

Щ ■ ж 5

О * * О

Ш щ Ш Щ : Щ !Ш ш в Щ

12345 ° 12346 ° 12345

Рис. 6. Уровень активности гидролаз личинок колорадского жука, обитающего в различных районах РБ. I - Балтачевский, 2 - Илишевский, 3 - Белорец-кий, 4 - Чишминский, 5 - Баймакский районы.

Личинки всех исследованных локальных популяций характеризуются высокой активностью пекголитических и целлюлолитических ферментов, уровень активности которых существенно (до 10 раз) превышает аналогичный показатель амилаз и протеиназ. Наибольший показатель пектиназной активности среди исследуемых образцов выявлен у личинок Баймакской выборки насекомых (более 16,6 ± 0,2 Е/мг), максимальный уровень целлюлазной активности (20,3 ± 0,2 Е/мг) обнаружен также у личинок из Баймакского района. Высокий уровень амилазной активности определяется в личинках из Белорецкой и Чишминской выборок насекомых.

Активность ингибиторов гидролитических ферментов в тканях картофеля различных сортов

Уровень активности ингибиторов чужеродных гидролаз в органах растений может свидетельствовать о степени устойчивости растения к насекомым-вредителям и патогенным микроорганизмам (Яруллина, Ибрагимов, 2006). В данной части работы исследовали зависимость уровня активности ингибиторов от сорта картофеля.

Наибольшей активностью ингибиторов амилаз насекомых отличался сорт Невский. В молодых листьях картофеля антиамилазная активность отсутствовала или выявлялась на очень низком уровне (рис. 7). В листьях, проростках и клубнях исследованных сортов картофеля выявлена активность ингибиторов, подавляющих действие целлюлолитических и пектинолитических ферментов.

Уровень ингибиторной активности в листьях картофеля значительно различается в зависимости от сорта. Так, экстракты листьев гибрида № 4281-7 обладают наибольшей антицеллюлазной активностью, причем практически в равной степени подавляется активность целлюлаз и колорадского жука, и Т. гееш. У сортов Невский, Удача активность свободных ингибиторов целлюлаз в листьях совсем не выявлялась.

I

Башчирсхнй Л уп

й ЛугоккоА Невский Удача № 4270 N14281.7

Сорт картофеля

Рис. 7. Активность ингибиторов целлюлаз триходермы Т. гееье1 (а), целлюлаз колорадского жука (б) из клубней и листьев картофеля.

Таким образом, листья и клубни изученных сортов и гибридов картофеля имеют существенные различия по уровню активности ингибиторов целлюлоли-тических и пектинолитических ферментов ЬерИпоШгяа с1есетИпеа1а и ТпсИойегта гееяег.

Влияние препаратов-биорегуляторов на активность ингибиторов экзогенных гидролаз в клубнях картофеля

Использование препаратов-биорегуляторов является одним из перспективных направлений биологической защиты растений. Одним из способов стимулирования устойчивости растений может служить регулирование активности ингибиторов протеаз в растительных тканях.

Обработка клубней картофеля препаратами-биорегуляторами изменяет активность ингибиторов протеиназ. Фитоспорин-М и Эпин-экстра на 4-е сутки после обработки вызывают снижение ингибиторной активности. На 7-е сутки в клубнях, обработанных Эпин-экстра, происходит повышение активности ингибиторов протеиназ.

Обработка препаратами на 4-е сутки вызывает снижение активности ингибиторов карбогидраз по сравнению с контрольным вариантом. По истечении 7 суток выявляются различия в действии препаратов. Так, препараты Циркон и Эпин-экстра стимулируют повышение активности ингибиторов амилаз, Фитоспорин-М, напротив, понижает данную активность (в клубнях, обработанных Цирконом, на 7-е сутки повышается активность ингибиторов всех карбогидраз). На 10-е сутки стимулирующее влияние препаратов проявляется в отношении ингибиторов амилаз и целлюлаз, активность ингибиторов пектиназ в это время понижается. Вероятно, данные различия обусловлены химической природой препаратов: действующими веществами препаратов Циркон и Эпин-экстра яв-

ляются растительные метаболиты (гидроксикоричные кислоты и 24-эпибрассинолид, соответственно), Фитоспорин-М содержит эндофитный штамм бактерий Bacillus subtilis 26 Д.

Таким образом, обработка клубней картофеля препаратами-биорегуляторами оказывает влияние как на активность ингибиторов протеиназ, так и на активность ингибиторов карбогидраз колорадского жука.

ВЫВОДЫ

1. Получены аффинноочищенные на специфических субстратах ферментов препараты протеиназ, амилаз, пектиназ, целлюлаз из тканей личинок колорадского жука.

2. Из листьев картофеля на иммобилизованных ферментах выделены белки-ингибиторы, подавляющие действие протеиназ, амилаз, пектиназ колорадского жука.

3. Протеазы колорадского жука представлены 6-ю высокомолекулярными (м.м. 65-75 кДа) и 3-мя низкомолекулярными (м.м. 25 кДа) компонентами. Ингибиторы протеаз картофеля представлены 5-ю полипептидами с м.м. в интервале 20-30 кДа.

4. Целлюлолитический комплекс ферментов колорадского жука представлен 6-ю белковыми компонентами с м.м. 30-40 кДа. Ингибиторы целлюлаз белковой природы в листьях картофеля не обнаружены.

5. Пектиназы колорадского жука представлены 8-ю компонентами с м.м. 20-50 кДа. Ингибиторы пектиназ в листьях картофеля представлены 4-мя белками с м.м. 20 кДа.

6. Амилолитическая активность фитофага обусловлена 4-мя белками с м.м. от 30 до 50 кДа. В тканях картофеля ингибиторы амилаз представлены 6-ю белками с м.м. 15-25 кДа.

7. Личинки колорадского жука, обитающего на различных территориях, характеризуются различным уровнем активности протеиназ, целлюлаз, пектиназ, амилаз. Видовая принадлежность кормового растения является фактором, оказывающим значительное влияние на функциональное состояние гидролаз-ного комплекса личинок колорадского жука.

8. Выявлены различия в уровне активности ингибиторов экзогенных гид-ролаз в листьях и клубнях районированных сортов, селекционных сортообраз-цов картофеля. Обработка клубней картофеля препаратами-биорегуля-торами оказывает значительное влияние на активность соединений, ингибирующих гидролитические ферменты личинок колорадского жука. Уровень активности ингибиторов гидролаз в клубнях зависит от состава препарата и количества обработок.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ:

1. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А., Саляхова А.Ф., Цветков В.О., Мардан-шин И.С., Ибрагимов Р.И. Активность ингибиторов целлюлаз, пектиназ в клубнях и листьях картофеля // Вестник Оренбургского государственного университета, №6, 2009, с. 431-433.

2. Ибрагимов Р.И., Яруллина Л.Г., Шпирная И.А., Умаров И.А., Цветков В.О., Максимов И.В. Биохимические факторы развития устойчивости растений к патогенам // Современные наукоемкие технологии, № 4,2010, с. 46-48.

3. Цветков В.О., Рябцева Н.Д., Шпирная И.А., Басырова А.М., Валиахме-това К.И., Ибрагимов Р.И. Выделение и характеристика протеолитических ферментов личинок колорадского жука // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13, №5 (3), с. 120-124.

4. Шпирная И.А., Ахатова А.Р., Цветков В.О., Яруллина JI.M., Артемьева М.А., Ибрагимов Р.И. Иммуностимулирующий эффект препаратов-биорегуляторов при обработке клубней картофеля // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13, №5 (3), с. 221-224.

5. Шпирная И.А., Цветков В.О., Басырова A.M., Фостий З.А., Ибрагимов Р.И. Диффузия ингибиторов пектиназы A. niger из прорастающих семян злаков // Вестник Уральской медицинской академической науки, № 4/1 (38), 2011, с. 121-122.

Публикации в других научных изданиях и материалах конференций:

6. Шпирная И.А., Саляхова А.Ф., Цветков В.О. Белки картофеля, подавляющие активность амилаз колорадского жука // Аграрная Россия, спец. вып. 2009. С.134-135.

7. Цветков В.О., Шпирная И.А., Умаров И.А., Ибрагимов Р.И. Выделение и характеристика ингибиторов пектолитических ферментов колорадского жука из листьев картофеля // Биомика, спец. вып. 2011. Т. 1. № 2. С. 143-144.

8. Цветков В.О., Ибрагимов Р.И., Шпирная И.А., Умаров И.А. Выделение и свойства целлюлаз колорадского жука Leptinotarsa Decemlineata L. // Тезисы докладов всероссийского симпозиума «Растение и стресс». Москва, 2010, с. 279-280.

9. Цветков В.О., Шевченко Н.Д., Ибрагимов Р.И., Гарипова М.И. Выделение протеиназ колорадского жука с использованием аффинного сорбента на основе полиакриламида // Материалы 14-й международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущино, 19 -23 апреля 2010 г., с. 66-67.

10. Цветков В.О., Ибрагимов Р.И., Шпирная И.А., Умаров И.А., Мещерякова Е.С. Выделение и характеристика ингибиторов протеолитических ферментов из тканей клубня картофеля // Клеточная сигнализация у растений. Материалы Ш международного симпозиума. Казань, 2011, с. 204.

11. Цветков В.О., Ибрагимов Р.И., Шпирная И.А., Ахатова А.Р., Валиах-метова К.И. Выделение и характеристика ингибиторов гидролитических фер-

ментов колорадского жука из клубней картофеля // Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий. Материалы докладов VII съезда Общества физиологов растений России. Нижний Новгород, 2011, с. 735-736.

12. Ибрагимов Р.И., Шевченко Н.Д., Шпирная И.А., Саляхова А.Ф., Цветков В.О. Гидролитическая активность экстрактов тканей картофеля и колорадского жука // Материалы Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды», г. Иркутск, 24-28 августа 2009 г., с. 182-185.

13. Умаров И.А, Цветков В.О., Ибрагимов Р.И. Адптационный полиморфизм и экологическая пластичность колорадского жука как наиболее значимые показатели в формировании резистентности // Материалы международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов», Уфа, 2009. Т. 2, с. 197-200.

14. Хасанова Д.Р., Цветков В.О., Ибрагимов Р.И. Активность ингибиторов целлголаз в тканях картофеля // Студент и наука: материалы студенческих научных конференций, Уфа, 2010, с. 84-85.

15. Ибрагимов Р.И., Шпирная И.А., Цветков В.О., Умаров И.А. Диффузия ингибиторов гидролаз патогенных грибов из прорастающих семян // Материалы VII международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2010. С. 442-444.

16. Марданшин И.С., Шевченко Н.Д., Ибрагимов Р.И., Шпирная И.А., Цветков В.О. Активность ингибиторов гидролаз и устойчивость картофеля к колорадскому жуку // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, молодых ученых и специалистов «Молодые ученые - агропромышленному комплексу Поволжья», Саратов, 2010. С. 99-101.

17. Умаров И.А., Ибрагимов Р.И., Беньковская Г.В., Марданшин И.С., Цветков В.О. Устойчивость к инсектицидам и пищевая активность колорадского жука // Материалы конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем», Краснодар, 2010, с. 293-297.

Цветков Вячеслав Олегович

ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И ИХ БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ КАК КОМПОНЕНТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КАРТОФЕЛЯ С КОЛОРАДСКИМ ЖУКОМ

03.01.05 - физиология и биохимия растений 03.02.08 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 21.11.11 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 566. Гарнитура «"ПтезКетеКотап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цветков, Вячеслав Олегович

Введение.

1. Распространение и свойства гидролитических ферментов организмов-фитофагов и их ингибиторов из растений (обзор литературы).

1.1. Протеолитические ферменты и их ингибиторы.

1.2. Целлюлолитические ферменты и их ингибиторы.

1.3. Пектолитические ферменты и их ингибиторы.

1.4. Амилолитические ферменты и их ингибиторы.

1.5. Физиологическая роль гидролаз и их ингибиторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Материалы и реактивы.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Синтез аффинного сорбента.

2.3.2. Аффинное выделение ферментов.

2.3.3. Определение концентрации белка.

2.3.4. Определение активности протеаз.

2.3.5. Определение активности ферментов методом агарозных гелевых пластин.

2.3.6. Определение параметров условий функционирования ферментов (значений рН и температуры среды).

2.3.7. Определение активности ингибиторов трипсина по БАПНА.

2.3.8. Разделение гидролаз и их ингибиторов методом двумерного электрофореза.

2.3.9. Математическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение и характеристика гидролитических ферментов личинок колорадского жука.

3.1.1. Получение аффинного сорбента на основе полиакриламида и разработка методов выделения гидролитических ферментов и их белковых ингибиторов.

3.1.2.-Выделение и характеристика протеолитических ферментов.

3.1.3. Выделение и характеристика целлюлолитических ферментов.

3.1.4. Выделение и характеристика пектолитических ферментов.

3.1.5. Выделение и характеристика амилолитических ферментов.

3.2. Выделение и характеристика ингибиторов гидролаз колорадского жука из листьев картофеля.

3.2.1. Выделение и характеристика ингибиторов протеаз.

3.2.2. Выделение и характеристика ингибиторов целлюлаз.

3.2.3. Выделение и характеристика ингибиторов пектиназ.

3.2.4. Выделение и характеристика ингибиторов амилаз.

3.3. Активность и молекулярная гетерогенность гидролитических ферментов колорадского жука в различных условиях обитания.

3.3.1. Влияние кормового субстрата на активность и молекулярный состав гидролитических ферментов личинок колорадского жука.

3.3.2. Активность гидролитических ферментов колорадского жука, обитающего на различных территориях.

3.4. Активность ингибиторов гидролитических ферментов в тканях картофеля различных сортов.

3.5. Влияние препаратов-биорегуляторов на активность ингибиторов экзогенных гидролаз в клубнях картофеля.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидролитические ферменты и их белковые ингибиторы как компоненты взаимодействия картофеля с колорадским жуком"

Повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям является одной из важнейших проблем экологически безопасного растениеводства. Решению этой проблемы в значительной степени способствует познание механизмов взаимоотношений растений с организмами-фитофагами. Гидролитические ферменты насекомых-вредителей и патогенных микроорганизмов являются важным звеном при взаимодействии их с растениями, поскольку обеспечивают эффективное расщепление растительных полимеров, составляющих основу кормового субстрата. В тканях организмов-фитофагов выявлена активность различных типов гидролаз: катепси-ноподобных и трипсиноподобных протеаз (Hartl et al., 2010; Schlüter et al., 2010; Pereira et al., 2010; Jongsma et al., 2011), эндоглюкозидаз (Morrison et al., 2009; Pope et al., 2010), целлобиогидролаз и бета-глюкозидаз (Anand et al., 2010; Allardyce et al., 2010), альфа-амилаз (Khorram et al., 2010).

Соответственно, подавление активности гидролитических ферментов насекомых-вредителей представляет один из эффективных способов реализации механизмов защиты у растений. Известно, что в тканях различных видов растений обнаружены специфические молекулы (ингибиторы), способные нейтрализовать действие пищеварительных ферментов насекомых. Так, описано присутствие в растениях ингибиторов цистеиновых и серино-вых протеаз (Конарев Ал., 2000; Валуева, Мосолов, 2002; Ма et al., 2011), ингибиторов целлюлаз различной природы (Sami, Shakoori, 2011), ингибиторов пектиназ (Lee et al., 2011) и амилаз (Конарев Ал., Фомичева, 1991; Sivakumar et al., 2006). Более того, в ответ на контакт и поедание насекомыми происходит интенсивное накопление ингибиторов гидролаз как в пораженных, так и в интактных органах растений (Ryan et al., 1990; Heil, 2009; Bruinsma et al., 2010).

К настоящему времени накоплено значительное количество экспериментальных данных о структурно-функциональных особенностях ряда гидролаз, в первую очередь, ферментов млекопитающих, патогенных микроорганизмов (Варфоломеев, Пожитков, 2000; Yang et al., 2009), получены сведения об участии ингибиторов этих ферментов в защитных реакциях растений (Castro, Fontes, 2005; Bonfig et al., 2010).

Однако молекулярный состав, физико-химические и биохимические свойства, физиологические функции гидролаз организмов - представителей класса насекомых пока малоизученны. Соответственно, и экспериментальные сведения о составе, свойствах, функциях ингибиторов этих ферментов из растительных тканей также весьма ограничены. Исследование гидролаз патогенов и специфичных им ингибиторов из растительных тканей представляет интерес как с точки зрения познания молекулярных механизмов взаимодействия важнейших компонентов наземных экосистем - растений и организмов-фитофагов, так и с позиции поиска эффективных и экологически безопасных методов защиты культурных растений от насекомых-вредителей и патогенных микроорганизмов.

В связи с вышесказанным, цель нашей работы заключалась в выявлении закономерностей функционирования комплекса «гидролитический фермент - ингибитор» как одного из важных физиологических звеньев взаимодействия растений с насекомыми-вредителями.

Исследования были посвящены решению следующих задач:

- выделение, очистка и характеристика гидролитических ферментов колорадского жука;

- выделение из листьев картофеля специфичных к гидролазам насекомых белковых ингибиторов, характеристика их состава и свойств;

- исследование активности и молекулярной гетерогенности гидролитических ферментов колорадского жука в различных условиях обитания насекомых;

- исследование уровня активности ингибиторов экзогенных гидролаз в тканях картофеля различных сортов и при действии препаратов-биорегуляторов.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Цветков, Вячеслав Олегович

выводы

1. Получены аффинноочищенные на специфических субстратах ферментов препараты протеиназ, амилаз, пектиназ, целлюлаз из тканей личинок колорадского жука.

2. Из листьев картофеля на иммобилизованных ферментах выделены белки-ингибиторы, подавляющие действие протеиназ, амилаз, пектиназ колорадского жука.

3. Протеазы колорадского жука представлены 6-ю высокомолекулярными (м.м. 65-75 кДа) и 3-мя низкомолекулярными (м.м. 25 кДа) компонентами. Ингибиторы протеаз картофеля представлены 5-ю полипептидами с м.м. в интервале 20-30 к Да .

4. Целлюлолитический комплекс ферментов колорадского жука представлен 6-ю белковыми компонентами с м.м. 30-40 кДа. Ингибиторы целлюлаз белковой природы в листьях картофеля не обнаружены.

5. Пектиназы колорадского жука представлены 8-ю компонентами с м.м. 20-50 кДа. Ингибиторы пектиназ в листьях картофеля представлены 4-мя белками с м.м. 20 кДа.

6. Амилолитическая активность фитофага обусловлена 4-мя белками с м.м. от 30 до 50 к Да. В тканях картофеля ингибиторы амилаз представлены 6-ю белками с м.м. 15-25 кДа.

7. Личинки колорадского жука, обитающего на различных территориях, характеризуются различным уровнем активности протеиназ, целлюлаз, пектиназ, амилаз. Видовая принадлежность кормового растения является фактором, оказывающим значительное влияние на функциональное состояние гидролазного комплекса личинок колорадского жука.

8. Выявлены различия в уровне активности ингибиторов экзогенных гидро-лаз в листьях и клубнях районированных сортов, селекционных сортообраз-цов картофеля. Обработка клубней картофеля препаратами-биорегуляторами оказывает значительное влияние на активность соединений, ингибирующих гидролитические ферменты личинок колорадского жука. Уровень активности ингибиторов гидролаз в клубнях зависит от состава препарата и количества обработок.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цветков, Вячеслав Олегович, Уфа

1. Астапович Н.И., Рябая Н.Е. Полигалактуроназа Sacharomyces pastori- -anus: выделение и некоторые свойства // Прикл. биохим. микробиол. -1997.-Т. 33. №3. С. 287-291

2. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений // Успехи биологической химии. 2002. - Т. 42. С. 193-216.

3. Варфоломеев С.Д., Пожитков А.Е. Активные центры гидролаз: основные типы структур и механизм катализа // Вестн. Моск. ун-та. 2000. -Т. 41. № 3. С. 147.

4. Велобова Е. Н. Переваривание белков. Киев: Гродынец. 1993. - 29 с.

5. Гарипова М.И., Фролова И.С., Клеева О.Б., Монаков Ю.Б., Кузнецов В.П. Иммуносорбент для очистки интерферона // Вопросы вирусологии. 1993. - Т.38. №3. С. 129-132.

6. Гофман Ю.Я., Вайсблай И.М. Определение ингибиторов трипсина в семенах гороха // Прикладная биохимия и микробиология. 1975. - Т. 2. № 5. С. 777-783.

7. Дьяков Ю.Т., Озерецковская O.JL, Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология. М., 2001.- С.302.

8. Ибрагимов Р.И., Умаров И.А., Шпирная И.А., Марданшин И.С. Пищевая активность колорадского жука на различных сортах картофеля // Сборник «Вавиловские чтения-2008», СГАУ. Ч. 1. С. 136-137.

9. Ю.Иголкина Л.А., Руденская Ю.А., Руденская Г.Н. Аффинные сорбенты на основе хитозана для выделения протеолитических ферментов // Вестн. Моск. Ун-та. 2000. - Т. 41. № 6. С. 398-401.

10. Клесов A.A. Биохимия и энзимология гидролиза целлюлозы // Биохимия. 1980. - Т. 55. -№ 10. - С. 1731-1765.

11. Н.Конарев Ал.В., Фомичева Ю.В. Перекрестный анализ взаимодействия компонентов альфа-амилаз и протеиназ насекомых с белковыми ингибиторами из эндосперма пшеницы // Биохимия. 1991. - Т. 56. №. 4. С. 628-638.

12. Кузнецова A.B., Руденская Г.Н., Богачева A.M., Воюшина Т.Л., Степанов В.М. Аффинные сорбенты для выделения протеиназ, содержащиев качестве лигандов морфолиды трипептидов // Биоорганическая химия. 1997. - Т. 23. № 11. С. 868-876.

13. Наумов Д.Г. Иерархическая классификация гликозил-гидролаз // Биохимия. 2011. - Т. 76. Вып. 6. С. 764-780.

14. Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов. Скурат Е.В.: дисс. канд. биол. наук: М. 2006. 122 с.

15. Применение методов биохимии в исследованиях по защите растений. Под редакцией Тютерева C.JL, Новожилова К.В. Л.: ВИЗР, 1976. 134 с.

16. Рабинович М.М., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолити-ческих ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы // Успехи биологической химии. 2000. - Т. 40. С. 205-266.

17. Рахматуллина С.Р. Влияние препарата «Рифтал» на морфофизиологи-ческие параметры проростков пшеницы при нормальном и дефицитном минеральном питании // Агрохимия. 2007. - № 5. С. 42-48.

18. Unsaturated Hexuronate Sugars by a Periplasmic Binding Protein Involved in Pectin Catabolism // Journal of Molecular Biology. 2007. - V. 369. № 3. P. 759-770.

19. Allardyce B, Linton S, Sa R. The last piece in the cellulase puzzle: the characterisation of beta-glucosidase from the herbivorous gecarcinid land crab Gecarcoidea natalisll J Exp Biol. 2010. - V. 213. № 23. P. 2950-2957.

20. Anzai H, Nisizawa K, Matsuda K. Purification and characterization of a cellulase from Dolabella auricularia II J. Biochem. 1984. - V. 96. P. 1381— 1390.

21. Anzai H, Uchida N, Nishide E, Nisizawa K, Matsuda K. Isolation of a complex of endo-cellulases from the gastric teeth of Dolabella auricularia by affinity chromatography // Agric. Biol. Chem. 1988. - V. 52. P. 633-640.

22. Aranishi F, Hara K, Ishihara T. Purification and characterization of cathep-sin H fromhepatopancreas of carp Cyprinus carpio II Comparative Biochemistry and Physiology. 1992. - V. 102. № 3. P. 499-505.

23. Arunachalam C, Asha S. Pectinolytic Enzyme A Review of New Studies // Advanced Biotech Journal - Online. May 2010.

24. Barkan D, Hostetter D, Mahrus S, Pieper U, Wells J, Craik C, Sali A. Prediction of protease substrates using sequence and structure features // Bioin-formatics. 2010. - V. 26. № 14. P. 1714-1722.

25. Barnby F, Morpeth F, Pyle D. Endopolygalacturonase production from Kluyveromyces marxianus. Resolution, purification and partial characterization of the enzyme // Enzyme Microbial Technol. 1990. -V. 12. P. 891897.

26. Beguin P, Aubert J. The biological degradation of cellulose // FEMS Microbiol. 1994. - Rev. 13. P. 25 - 58.

27. Benchabane M, Rivard D, Girard C, Michaud D. Companion Protease Inhibitors to Protect Recombinant Proteins in Transgenic Plant Extracts. Recombinant proteins from plants // Methods in Molecular Biology. 2009. -V. 483. P. 265-273.

28. Bergelson J, Kreitman M, Stahl E, Tian D. Evolutionary Dynamics of Plant R-Genes // Science. -2001. V. 292. № 5525. P. 2281-2285.

29. Birk Y. The Bowman-Birk inhibitor, trypsin- and chymotiypsin-inhibitor from soybeans // International Journal of Peptide and Protein Research. -1985.-V. 25. P. 113-131.

30. Bolter C. Methyl Jasmonate Induces Papain Inhibitor(s) in Tomato Leaves // Plant Physiology. 1993. - V. 103. № 4. P. 1347-1353.

31. Boulter C. Methyl jasmonate induces papain inhibitor(s) in tomato leaves // Plant Physiol. 1993. - V. 103. № 4. P. 1347-1353.

32. Broadway R. Dietary regulation of serine proteinases that are resistant to serine proteinase inhibitors // Journal of Insect Physiology. 1997. - V. 43. № 9. P. 855-874.

33. Bruinsma M, Loon J, Dicke M. Increasing insight into induced plant defense mechanisms using elicitors and inhibitors // Plant Signal Behav. 2010. - V. 5. № 3. P. 271-274.

34. Brunelle F, Girard C, Cloutier C, Michaud D. A hybrid, broad-spectrum inhibitor of Colorado potato beetle aspartate and cysteine digestive proteinases // Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 2005. - V. 60. P. 2031.

35. Brunelle F, Nguyen-Quoc B, Cloutier C, Michaud D. Protein hydrolysis by Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata, digestive proteases: The catalytic role of cathepsin D // Insect Biochemistry and Physiology. 1999. -V. 42. № i.p. 88-98.

36. Bugbee W. Storage rot of sugar beet // The Sugar Beet Crop: Science into practice. Chapman and Hall, London. 1993. P. 551-570.

37. Cantarel B, Coutinho P, Rancurel C, Bernard T, Lombard V, Henrissat B. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics // Nucleic Acids Res. 2009. - Y. 37. P. 233-238.

38. Castro M, Fontes W. Plant Defense and Antimicrobial Peptides // Protein and Peptide Letters. 2005. - V. 12. P. 11-16.

39. Chararas C, Eberhard R, Courtois J, Petek F. Purification of three cellulases from the xylophagous larvae of Ergates faber (Coleoptera: Cerambycidae) // Insect Biochem. 1983. - V. 13. P. 213-218.99

40. Chi Y, Jing X, Lei J, Ahn J, Koo Y, Yun D, Lee S, Behmer S, Koiwa H, Zhu-Salzman K. Stability of AtVSP in the insect digestive canal determines its defensive capability // Journal of Insect Physiology. -2011.-V.57.№ 3.P. 391-399.

41. Cordero M, Raventos D, Segundo B. Induction of PR proteins in germinating maize seeds infected with the fungus Fusarium moniliforme II Physiol and Mol. Plant Pathol. 1992. - №3. - P. 189-200.

42. Dixit V, Kumar A, Pant A, Khan M. Low molecular mass pectatlyase from Fusarium moniliforme: similar modes of chemical and thermal denaturation // Biochem Biophys Res Commun. 2004. - V. 315. P. 477-484.

43. Douglas A. The microbial dimension in insect nutritional ecology // Functional Ecology. 2009. - V. 23. № 1. P. 38-47.

44. Ducros V, Czjzek M, Belaich A, Gaudin C, Fierobe H, Belaich J. Crystal structure of the catalytic domain of a bacterial cellulase belonging to family // Structure. 1995. - V. 3. P. 939-949.100

45. Edwards M, Gatehouse J, Gatehouse A. Molecular and biochemical characterisation of a dual proteolytic system in vine weevil larvae (Otiorhynchus sulcatus, Coleóptera: Curculionidae) // Insect Biochem Molec. 2010. - V. 40. № 11. P. 785-791.

46. Erlanger B.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes of trypsin // Arch. Biochem. Biophys. -1961.-V. 95.-№2.-P. 271-278.

47. Ferry N, Edwards M, Gatehouse T, Capell P, Christou P, Gatehouse. Transgenic plants for insect pest control: a forward looking scientific perspective // Transgenic Res. 2006. - V. 15. P. 13-19.

48. Fluhr R, Lampl N, Roberts T. Serpin protease inhibitors in plant biology // Physiologia Plantarum Accepted Article (Accepted, unedited articles published online for future issues). 2011

49. Franco O, Rigden D, Meló F, Grossi-de-Sa M. Plant alpha-amylase inhibitors and their interaction with insect alpha-amylases // European Journal of Biochemistry. 2002. - V. 269. № 2. P. 397-412.

50. Girard C, Jouanin L. Molecular cloning of cDNAs encoding a range of digestive enzymes from a phytophagous beetle, Phaedon cochleariae II Insect Biochem. Mol. Biol. 1999. - V. 29. P. 1129-1142. ; ,

51. Gori M, Malana M. Production of Carboxymethyl Cellulase from Local Isolate of Aspergillus Species // Pak. j. life soc. Sci. 2010. - V. 8. № 1. P. 16.

52. Gubb D, Sanz-Parra A, Barcena L, Troxler L, Fullaondo A. Protease inhibitors and proteolytic signalling cascades in insects // Biochimie. 2010. - V. 92. № 12. P. 1749-1759.

53. Halla M, Rubina J, Behrensa S, Bommarius A. The cellulose-binding domain of cellobiohydrolase Cel7A from Trichoderma reesei is also a thermo-stabilizing domain // Journal of Biotechnology. 2011. - V. 155. № 4. P. 370-376.

54. Hartl M, Giri A, Kaur H, Baldwin I. Serine Protease Inhibitors Specifically Defend Solarium nigrum against Generalist Herbivores but-Do-Not Influence Plant Growth and Development 11 The Plant Cell. 2010. - V. 22. № 12. P. 4158-4175.

55. Heil M. Damaged-self recognition in plant herbivore defence // Trends in Plant Science. 2009. - V. 14. № 7. P. 356-363.

56. Henrissat B, Bairoch A. Updating the sequencebased classification of glyco-syl hydrolases // Biochem. J. 1996. - V. 316. P. 695-696.

57. Henrissat B, Davies G. Structural and sequencebased classification of glycoside hydrolases // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. - V. 7. P. 637-644.

58. Hivrale V, Chougule N, Giri A, Chhabda P, Kachole M. Biochemical characterisation of alpha-amylase inhibitors from Achyranthes aspera and their interactions with digestive amylases of coleopteran and lepidopteran insects

59. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2011. - V. 91. № 10. P. 1773-1780.

60. Jayani R, Saxena S, Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes: A review // Process Biochemistry. 2005. - V. 40. P. 2931-2944.'

61. Jiang C, Li C, Chang H. Influence of Pectinesterase Inhibitor from Jelly Fig (Ficus awkeotsang Makino) Achenes on Pectinesterases and Cloud Loss of Fruit Juices // Journal of Food Science. 2002. - V. 67. № 8. P. 30633068.

62. Jones R, Ospina-Giraldo M. Novel Cellulose-Binding-Domain Protein in Phytophthora Is Cell Wall Localized // PLoS ONE. 2011. - V. 6. № 8. P. 235-255.

63. Jongsma M, Beekwilder J. Co-evolution of insect proteases and plant protease inhibitors // Curr Protein Pept Sci. 2011. - V. 12. № 5. P. 437-447.

64. Jongsma M, Bolter C. The adaptation of insects to plant protease inhibitors // Journal of Insect Physiology. 1997. - V. 43. № 10. P. 885-895.

65. Kim J, Park S, Hwang I, Cheong H, Nah J, Nahm K, Park Y. Protease Inhibitors from Plants with Antimicrobial Activity // Int. J. Mol. Sci. 2009. -V. 10. №6. P. 2860-2872.

66. Koiwa H, Bressan R, Hasegawa P. Regulation of protease inhibitors and plant defense // Trends in Plant Science. 1997. - V. 2. № 10. P. 379384.

67. Kolarz B, Wojaczynskaa M, Herman B. Polyacrylamide sorbents. Synthesis and sorption properties // Reactive Polymers. 1989. - V. 11. P. 29-35.

68. Kotkar H, Sarate P, Tamhane V, Gupta V, Giri A. Responses of midgut amylases of Helicoverpa armigera to feeding on various host plants // Journal of Insect Physiology. 2009. - V. 55. № 8. P. 663-670.

69. Laluk K, Mengiste T. The Arabidopsis extracellular unusual serine protease inhibitor functions in resistance to necrotrophic fungi and insect herbivory // The Plant Journal. 2011. - V. 68. № 3. P. 480-494.

70. Laskowski M. Protein inhibitors of serine proteinases mechanism and classification // Adv Exp Med Biol. - 1986. -V. 199. P. 1-17.

71. Lawrence P, Koundal K. Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects // EJB Electronic Journal of Biotechnology. 2002. - V. 5. № 1.

72. Lee O, Sathiyaraj G, Kim Y, In J, Kwon W, Kim J, Yang D. Defense Genes Induced by Pathogens and Abiotic Stresses in Panax ginseng C. A. Meyer //J. Ginseng Res.-201 l.-V. 35. № 1. P. 1-11.

73. Link M, Rausch T, Greiner T. In Arabidopsis thaliana, the invertase inhibitors AtC/VIF 1 and 2 exhibits distinct target enzyme specificities and expression profiles // FEBS Letters. 2004. - V. 573. № 1-3. P. 105-109.

74. Lopez-Ordonez T, Rodriguez M, Hernandez-Hernandez D. Characterization of a cDNA encoding a cathepsin L-like protein of Rhodnius Pro-lixus II Insect Mol. Biol. 2001. - V. 10. № 5. P. 505-511.

75. Lu S, Deng P, Liu D, Luo J, Han R, Gu X, Liang S, Wang X, Li F, Lozanov V, Patthy A, Pongor S. Solution Structure of the Major alpha-Amylase Inhibitor of the Crop Plant Amaranth // The Journal of Biological Chemistry. 1999. -V. 274. P. 20473-20478.

76. Luczkovich J, Stellwag E. Isolation of cellulolitic microbes from intestinal tract of the punfish // Marine Biology. 1993. - V. 116. P. 381-388.

77. Ma J, Zhao Q, Lu M, Wang J. Kunitz-type trypsin inhibitor gene family in Arabidopsis and Populus trichocarpa and its expression response to wounding and herbivore in Populus nigra II tree genetics & genomes. -2011.-V. 7. №2. P. 431-441.

78. Maeda I, Shimohigashi Y, Kihara H, Ohno M. Purification and characterization of a cellulase from the giantsnail Achatina fulica II Biosci. Biotech. Biochem. 1996. -V. 60. P. 122-124.

79. Major J, Constabel C. Functional Analysis of the Kunitz Trypsin Inhibitor Family in Poplar Reveals Biochemical Diversity and Multiplicity in Defense against Herbivores // Plant Physiology. 2008. - V. 146. P. 888903.

80. Markovic O, Janecek S. Pectin degrading glycoside hydrolases of family 28: sequence-structural features, specificities and evolution // Protein Eng.-2001.-V. 14. №9. P. 615-631.

81. Marshall J, Grand R. Characterization of a b-1,4-glucan hydrolase from the snail, Helixpomatia II Comp. Biochem. Physiol. 1976. - V. 53. P. 231-237.

82. Matsuura Y, Kusunoki M, Harada W, Kakudo M. Structure and Possible Catalytic Residues of Taka-Amylase A // J Biochem. 1984. - V. 95. № 3. P. 697-702.

83. Michaud D, Nguyen-Quoc B, Yelle S. Selective inhibition of Colorado potato beetle cathepsin H by oryzacystatins I and II. // FEBS Letters. 1993. - V. 331. № 1-2. P. 173-176.

84. Mikicinski A, Sobiczewski P, Sulikowska M, Pulawska K, Treder J. Pectolytic Bacteria Associated with Soft Rot of Calla Lily (Zantedeschia spp.) Tubers // Journal of Phytopathology. 2010. - V. 158. № 4. P. 201209.

85. Molina S, Pelissari F; Vitorello C. Screening And Genetic Improvement Of Pectinolytic Fungi For Degumming Of Textile Fibers // Braz. J. Microbiol. 2001. - V. 32. № 4. P. 320-326.

86. Morrison M, Pope P, Denman S, McSweeney C. Plant biomass degradation by gut microbiomes: more of the same or something new? // Current Opinion in Biotechnology. 2009. - V. 20. № 3. P. 358-363.

87. Moura D, Ryan C. Wound-Inducible Proteinase Inhibitors in Pepper. Differential Regulation upon Wounding, Systemin, and Methyl Jasmonate // Plant Physiology. 2001. - V. 126. №. 1. P. 289-298.

88. Mukhopadhyay D. The Molecular Evolutionary History of a Winged Bean O-Chymotrypsin Inhibitor and Modeling of Its Mutations Through Structural Analyses // Journal of Molecular Evolution. 2000. - V. 50. №3. P. 214-223.

89. Muricken D, Gowda L. Molecular engineering of a small trypsin inhibitor based on the binding loop of horsegram seed Bowman-Birk inhibitor // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2011. - V. 26. № 4. P. 553-560.

90. Nagata K, Kudo N, Abe K, Arai S, Tanokura M. Three-Dimensional Solution Structure of Oryzacystatin-I, a Cysteine Proteinase Inhibitor of the Rice, Oryza sativa L. japónica II Biochemistry. 2000. - V. 39. № 48. P. 14753-14760.

91. Niranjane AP, Madhou P, Stevenson T. The effect of carbohydrate carbon sources on the production of cellulase by Phlebia gigantean II Enzyme Microbial. 2007. - V. 40. P. 1464-1468.

92. Novillo C, Castañera P, Ortego F. Characterization and distribution of chymotrypsin-like and other digestive proteases in Colorado potato beetle larvae // Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 1997. - V. 36. P. 181-201.

93. Overney S, Fawe A, Yelle S, Michaud D. Diet-related plasticity of the digestive proteolytic system in larvae of the Colorado potato beetle {Leptino-tarsa decemlineata Say) // Insect Biochemistry and Physiology. 1997. - V. 36. № 4. P. 241-250.

94. Parini C, Fortina M, Manachini P. Properties of two pectin lyases produced by Aureobasidium pullulans LV 10 // J Appl Bacteriol. 1988. -V. 65. P. 477-481.

95. Pietro A, Roncero M. Purification and characterization of an exo-polygalacturonase from the tomato vascular wilt pathogen Fusarium ox-ysporum f.sp. lycopersici IIFEMS Microbiol Lett. 1996. - V. 145. P. 295298.

96. Prasad E, Dutta-Gupta A, Padmasree K. Purification and characterization of a Bowman-Birk proteinase inhibitor from the seeds of black gram (Vigna mungo) II Phytochemistry. 2010. - V. 71. № 4. P. 363-372.

97. Raiola A, Camardella L, Giovane A, Mattei B, De Lorenzo G, Cer-vone F, Bellincampi D. Two Arabidopsis thaliana genes encode functional pectinmethylesterase inhibitors // FEBS Letters. 2004. - V. 557. № 16. P. 199-203.

98. Ramanujam N, Saritha, P. Production of pectiniyase by solid-state fermentation of sugarcane bagasse using Aspergillus niger II Advanced Biotech. 2008. - P. 30-33.

99. Ramos M, Grangeiro T, Freire E, Sales M, Souza D, Araujo E, Freitas C. The defensive role of latex in plants: detrimental effects on insects // Arthropod-plant interactions. 2010. - V. 4. № 1. P. 57-67.

100. Reca I. Identification and characterisation of new members of pectin methylesterase/invertase inhibitor family in tomato {Solarium lycopersi-cum) II Dottorato Di Ricerca In Biotecologie Vegetali. XX Ciclo. 2008.

101. Reeck G, Kramer K, Baker J, Kanost M. Proteinase inhibitors and resistance of transgenic plants to insects. In "Advances in Insect Control: The Role of Transgenic Plants", 1997. Taylor and Francis, Brostol, PA, P. 157183.

102. Rosso M, Favery B, Piotte C, Arthaud L, De Boer J, Hussey R. Isolation of a cDNA encodinga b-l,4-endoglucanase in the root-knot nematode

103. Meloidogyne incognita and expression analysis during "plant parasitism // Mol. Plant Microbe Interact. 1999. - V. 12. P. 585-591.

104. Ryan C. Protease Inhibitors in Plants: Genes for Improving Defenses Against Insects and Pathogens // Annual Review of Phytopathology. 1990. - V. 28. P. 425-449.

105. Sakai T, Sakamoto T, Hallaert J, Vandamme EJ. Pectin, pectinase and protopectinase: production, properties and applications // Adv Appl Microbiol. 1993. - V. 39. P. 231-294.

106. Sakon J, Irwin D, Wilson D, Karplus P. Structure and mechanism of endo/exocellulase E4 from Thermomonospora fusca II Nat. Struct. Biol. -1997.-V. 4. P. 810-881.

107. Sami A, Shakoori A. Cellulase activity inhibition and growth retardation of associated bacterial strains of Aulacophora foviecollis by two glycosylated flavonoids // Journal of Medicinal Plants Research. 2011. - V. 5. № 2. P. 184-190.

108. Sathiya M, Balasubramanian R. Chitinases and glucanases in Arachis Hypogaea L. in defached leaves infected with Puccinia arachidis Speg IIZ. Pflanzenkrankh Und Pfalanzenschuts. 1991. - №3. - P. 305-316.

109. Schluter U, Benchabane M, Munger M, Kiggundu A, Vorster J, Goulet M, Cloutier C, Michaud D. Recombinant protease inhibitors for herbivore pest control: a multitrophic perspective // Journal of Experimental Botany. 2010. - V. 61. № 15. P. 4169-4183.

110. Senthilkumar R, Cheng C, Yeh K. Genetically pyramiding protease-inhibitor genes for dual broad-spectrum resistance against insect and phyto-pathogens in transgenic tobacco // Plant Biotechnology Journal. 2010. - V. 8. № l.P. 65-75.

111. Shembekar V, Dhotre A. Studies of pectin degrading microorganisms from soil // Journal of microbial world. 2009. - V. 11. № 2. P. 216-222.

112. Singh S, Ramakrishna M, Rao A. Optimization of downstream processing parameters for the recovery of pectinase from the fermented broth of Aspergillus carbonarious II Process Biochem. 1999. - V. 35. P. 411^17.

113. Singh S, Rao A. A simple fractionation protocol for and a comprehensive study of the molecular properties of two major endopolygalacturonases from Aspergillus niger II Biotechnol Appl Biochem. 2002. - V. 35. P. 115-123.

114. Sivakumar S, Mohan M, Franco O, Thayumanavan B. Inhibition of insect pest alpha-amylases by little and finger millet inhibitors // Pesticide Biochemistry and Physiology. 2006. - V. 85. № 3. P. 155-160.

115. Smant G, Stokkermans J, Yan Y, De Boer J, Baum T, Wang X. Endogenous cellulases in animals: isolation of b-l,4-endoglucanase genes from two species of plant-parasitic cyst nematodes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. P. 4096-4911.

116. Sojka D, Francischetti I, Calvo E, Kotsyfakis M. Cysteine Proteases from Bloodfeeding Arthropod Ectoparasites // Advances in Experimental Medicine and Biology.-201 l.-V. 712. P. 177-191.

117. Stratmann J, Scheer J, Ryan C. Suramin inhibits initiation of defense signaling by systemin, chitosan, and a glucan elicitor in suspension-cultured1.copersiconperuvianum cells // PNAS. 2000. - V. 97. № 16. P. 88628867.

118. Sui Y, Wang J, Zhao X. The impacts of classical insect hormones on the expression profiles of a new digestive trypsin-like protease (TLP) from the cotton bollworm, Helicoverpa armigera II Insect Molecular Biology. -2009. V. 18. № 4. P. 443-452.

119. Thie N, Houseman J. Identification of cathepsin B, D and H in the larval midgut of Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata Say (Coleoptera: Chrysomelidae) // Insect Biochemistry. 1990. - V. 20. № 3. P. 313-318.

120. Tiffin P, Brandon S. Molecular Evolution of the Wound-Induced Serine Protease Inhibitor wipl in Zea and Related Genera // Mol Biol Evol. -2001.-V. 18. № 11. P. 2092-2101.

121. Titarenko E, Rojo F, Leon J, Sanchez-Serrano J. Jasmonic Acid-Dependent and -Independent Signaling Pathways Control Wound-Induced Gene Activation in Arabidopsis thaliana II Plant Physiology. 1997. - V. 115. №2. P. 817-826.

122. Tokuda G, Watanabe H, Matsumoto T, Noda H. Cellulose digestion in the wood-eating higher termite, Nasutitermes takasagoensis (Shiraki): distribution of cellulases and properties of endo-b-l,4-glucanase // Zool. Sci. -1997.-V. 14. P. 83-93.

123. Turk B, Dolenc I, Turk V, Bieth J. Kinetics of the pH-induced inacti-vation of human cathepsin L // Biochemistry. 1993. - V. 32. № l.P. 375380.

124. Vincent D, Wheatley M, Cramer G. Optimization of protein extraction and solubilization for mature grape berry clusters // Electrophoresis. 2006.- V. 27. P. 1853-1865.

125. Viswanathan A, Kuriakose B, Bharadwaj S, Thomas G. Expression of Aprotinin in Anther Causes Male Sterility in Tobacco var Petit Havana II Plant molecular biology reporter. 2011. - V. 29. № 4. P. 825-834.

126. Walsh T, Strickland J. Proteolysis of the 85-Kilodalton Crystalline Cysteine Proteinase Inhibitor from Potato Releases Functional Cystatin Domains // Plant Physiology. 1993. - V. 103. № 4. P. 1227-1234.

127. Wasternack C, Parthier B. Jasmonate-signalled plant gene expression // Trends in Plant Science. 1997. - V. 2. № 8. P. 302-307.

128. Watanabe H, Noda H, Tokuda G, Lo N. A cellulase gene of termite origin // Nature. 1998. -V. 394. P. 330-331.

129. Watanabe H, Tokuda G. Animal cellulases // Cell. Mol. Life Sci. -2001.-V. 58. P. 1167- 1178.

130. Weeda S, Kumar G, Knowles N. Developmentally linked changes in proteases and protease inhibitors suggest a role for potato multicystatin in regulating protein content of potato tubers // PLANTA. 2009. - V. 230. № 1. P. 73-84.

131. Wilson D. Cellulases and biofuels // Current Opinion in Biotechnology. 2009. - V. 20. № 3. P. 295-299.

132. Wilson D. Three Microbial Strategies for Plant Cell Wall Degradation // Annals of the New York Academy of Sciences. 2008. - V. 1125. P. 289-297.

133. Wolfenden R, Lu X, Young G. Spontaneous Hydrolysis of Glycosides // J. Am. Chem. Soc. 1998. - V. 120. P. 6814-6815.

134. Xu B, Hellman U, Ersson B, Janson J. Purification, characterization and amino-acid sequence analysis of a thermostable, low molecular mass endo-b-l,4-glucanase from blue mussel, Mytilus edulis II Eur. J. Biochem. -2000. V. 267. № 4970-4977.

135. Xue X, Anderson A, Richardson N, Anderson A, Xue G, Mather P. Characterisation of cellulase activity in the digestive system of the redclaw crayfish (Cherax quadricarinatus) II Aquaculture. 1999. - V. 180. P. 373386.

136. Yadav P, Singh V, Yadav S, Yadav K, Yadav D. In silico Analysis of Pectin Lyase and Pectinase Sequences // Biochemistry (Moscow). 2009. -V. 74. №9. P. 1049-1055.

137. Yamaguchi N, Chung S, Shiroeda O. Characterization of a Cathepsin L-like Enzyme Secreted from Human Pancreatic Cancer Cell Line HPC-YP // Cancer Res. 1990. - V. 50. P. 658-663.

138. Yan Y, Smant G, Stokkermans J, Qin L, Helder J, Baum T. Genomic organization of four b-l,4-endoglucanase genes in plant-parasitic cyst nematodes and its evolutionary implications // Gene. 1998. - V. 220. P. 61-70.

139. Zang F, Zhu Y, Cohen A. Molecular cloning and partial characterization of a trupsin-like in salivary gland of Lygus disponsi (Hemiptera: Mirri-dae) // Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2002. - V. 32. P. 455464.

140. Zeng F, Zhu Y, Cohen A. Partial characterization of trypsin-like protease and molecular cloning of a trypsin-like precursor cDNA in salivary glands of Lygus lineolaris II Comparative Biochemistry and Physiology. -2002. -V. 131. P. 453-463.

141. Zhou X, Wheeler M, Oi F, Scharf M. Inhibition of termite cellulases by carbohydrate-based cellulase inhibitors: Evidence from in vitro biochemistry and in vivo feeding studies // Pesticide Biochemistry and Physiology. -2008.-V. 90. № l.P. 31-41.

142. Zhu-Salzman K, Zeng R. Molecular mechanisms of insect adaptation to plant defense: Lessons learned from a Bruchid beetle // Insect Science. -2008. V. 15. № 6. P. 477-481./