Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическая характеристика ингибиторов протеиназ подсолнечника в связи с необходимостью повышения биологической ценности подсолнечного белка

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическая характеристика ингибиторов протеиназ подсолнечника в связи с необходимостью повышения биологической ценности подсолнечного белка"

На правах рукописи

МОСКВИЧ Ирина Анатольевна

БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИНГИБИТОРОВ

ПРОТЕИНАЗ ПОДСОЛНЕЧНИКА В СВЯЗИ С НЕОБХОДИМОСТЬЮ ПОВЫШЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ПОДСОЛНЕЧНОГО БЕЛКА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Краснодар - 2003

Работа выполнена в Кубанском государственном технологическом университете.

Ведущая организация: Кубанский государственный аграрный университет

Защита состоится 30 октября 2003 г в 1230 на заседании диссертационного совета Д 212.100.05 Кубанского государственного технологического университета по адресу 350072 г. Краснодар, ул. Московская, 2, корпус А, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан 26 сентября 2003 г

Ученый секретарь

Научный руководитель: доктор технических наук,

Заслуженный деятель науки , и техники РФ, профессор Щербаков В.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Заслуженный деятель науки РФ,

профессор Проскуряков М.Т. кандидат технических наук, Баталий Т.М.

диссертационного совета канд. техн. наук, доцент

Минакова А. Д.

\

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. В условиях дефицита пищевого и кормового белка в мире важное значение приобретает проблема повышения эффективности использования растительного белка, в первую очередь белка подсолнечных семян - основной масличной культуры России. Одним из существенных ограничений применения подсолнечного белка в рецептуре пшцевых и кормовых продуктов является присутствие в его составе ингибиторов протеиназ, снижающих усвоение белка организмом человека и сельскохозяйственных животных.

К сожалению ингибиторы протеиназ семян подсолнечника исследованы недостаточно, также как и их влияние на протеиназы и белковый комплекс подсолнечных семян и продукте!, их переработки при получении растительного масла и белка. В связи с этим изучение биохимических характеристик протеиназ и их ингибиторов в семенах подсолнечника и белковых продуктах, получаемых из семян, и обоснование способов регулирования их активности являются актуальными и имеют теоретическое и прикладное значение для биохимии растений и технологии комплексной переработки масличных семян.

Актуальность темы подтверждается включением ее в НТО Минобразования РФ «Научные исследования высшей школы по технологии живых систем» (№ госрегистрации 1200004210) и тематику НИР кафедры биохимии и технической микробиологии КубГТУ.

1.2 Цель работы. Изучение биохимических характеристик протеиназ и их ингибиторов в семенах подсолнечника современных сортов и обоснование способов повышения биологической ценности подсолнечных белков в рецептуре пищевых и кормовых продуктов.

В соответствии с этим были определены задачи и основные направления исследований:

- определить распределение количества и активности протеиназ я их ингибиторов в белковых фракциях запасных белков современных сортов;

- изучить их биохимические характеристики и групповую принадлежность, специфичность взаимодействия с субстратами и ингибиторами известных типов;

- определить изменение активности протеиназ и их ингибиторов при переходе покоящихся семян подсолнечника к прорастанию и при прорастании;

- установить возможность изменения локализации ингибиторов протеиназ в тканях прорастающих семян и миграции ингибиторов во внешнюю среду;

- оценить возможность ингибирования протеиназ плесневых грибов ингибиторами протеиназ прорастающих семян подсолнечника;

- определить влияние тепловой и влаготепловой обработки семян подсолнечника при технологической переработке на активность протеиназ и их ингибиторов;

оценить влияние денатурации запасных белков семян на изменение атакуемости их протеиназами и активность трипсинового ингибитора при различных режимах тепловой и влаготепловой обработки;

- обосновать направления модификации условий технологической переработки семян подсолнечника с повышенной трипсинингибирующей активностью для снижения активности трипсинового ингибитора на действующем технологическом оборудовании;

- изучить биологичебскую ценность подсолнечных белков, полученных по предложенному способу и оценить возможность их использования в составе пищевых и кормовых продуктов;

1.3 Научная новизна Впервые изучены протеиназы и их ингибиторы в семенах подсолнечника новых сортов селекции ВНИИМК. Показано, что протеиназы подсолнечных семян относятся к группе сериновых кислых и щелочных протеиназ. Установлено, что активность и количество протеиназ и их ингибиторов в семенах подсолнечника коррелирует с массовой долей запасных белков в семенах. Наибольшую протеолитическую и трипсин ингибирующую активность имеет водорастворимая фракция запасных белков семян.

Впервые количественно оценено изменение активности протеиназ и их ингибиторов при прорастании семян подсолнечника - по мере роста проростка активность протеиназ увеличивается, а активность ингибиторов протеиназ снижается. Предложена гипотеза о создании «защитного барьера» из ингибиторов протеиназ вокруг прорастающего семени в результате миграции ингибиторов из семян в почву, что подтверждено высокой трипсинингибирующей активностью водных вытяжек из зоны прорастания и замедление ими роста почвенных мицелиальных грибов.

Показано и количественно оцененено изменение активности протеиназ и их белковых ингибиторов при традиционной технологической переработке семян подсолнечника.

Установлено, что денатурация запасных белков семян сопровождается потерей ими протеолитической активности, но не

приводит, в условиях существующей технологии, к полной инактивации трипсинового ингибитора. Показана возможность практически полной инактивации ингибитора при обработке подсолнечного шрота в тостере путем дополнительного увлажнения шрота и увеличения продолжительности тепловой обработки.

1.4 Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработаны и рекомендованы: условия влаготепловой обработки подсолнечного шрота в тостере маслоэкстракционного завода, обеспечивающие снижение трипсинингибирующей активности белков; предложения по дополнению ГОСТа на тестированный подсолнечный шрот показателем допустимой трипсинингибирующей активности; предложения по селекции на повышенную протеолитическую и трипсинингибирующую активность высокобелковых сортов подсолнечника с целью получения препаратов протеиназ и трипсиновых ингибиторов для аналитических и медицинских целей;

рецептуры пищевых продуктов с включением белков из семян подсолнечника, обработанных по разработанному способу.

1.5 Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на научно-методических семинарах кафедры биохимии и технической микробиологии КубГТУ (1999 - 2003 гт.), на Всероссийскойнаучно-практической конференции «Продовольственная безопасность как важнейший фактор национальной безопасности страны и роль информационно-консультативных служб АПК в ее обеспечении» (Пенза, 2002), на Международной конференции «Функциональные продукты питания: гигиенические аспекты и безопасность» (Краснодар, 2003).

1.6 Публикации. По результатам диссертационной работы опубликованы 2 статьи в научных журналах и 5 тезисов в сборниках трудов научных конференций различного уровня.

1.7 Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, методической части, восьми глав экспериментальной части, выводов и списка литературы. Основная часть работы изложена на 110 страницах компьютерного текста и содержит 22 таблицы и 10 рисунков. Список литературы включает научных публикаций российских и зарубежных авторов.

Экспериментальная часть 2.1 Объекты исследований. Объектами исследований служили семена высокомасличного подсолнечника сортов Круиз (высокоолеиновый тип), Фаворит и Юбилейный 60 (высоколинолевый тип), выращенные в одинаковых почвенно-климатических условиях на опытных полях НПО «Масличные культуры» ВНИИМК (г. Краснодар) в вегетационные сезоны 2000-2003 гг.

Таблица 1

Характеристика исследуемых сотов подсолнечника (средние данные за 2000 -2003 годы)

Сорт Вегегацион Масса 1000 Мае личность Суммарный

ный семянок, г семянок, %, белок, (N х

период, а.с.в. 6,25), %

дни

Круиз 84 62 47,2 22,3

Фаворит 92 53 52,5 15,2

Юбилейный 60 90 56 53,0 13,8

2.2 Методы исследований. Определяли соотношение отдельных групп азотсодержащих веществ в белковом комплексе семян подсолнечника фракционированием по растворимости; азот белковых фракций - методом Къельдаля после осаждения небелкового азота ТХУ. Аминокислотный состав - модифицированным методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе Милихром А02 (АО «Эконова», г. Новосибирск). Атакуемость белков иротеолитическими фермернтами in vitro - по методу A.A. Покровского -И.Д.Ертанова в установке на 4 сосуда, о скорости расщепления белков судили по нарастанию продуктов гидролиза - суммарному содержанию аминокислот по иингидриновой реакции. Электрофореические фракции белков определяли методом вертикального диск-электрофореза в ПААГе. Относительную биологическую ценность белковых продуктов определяли с помощью тест-организма Тетрахимена пириформис. Активность кислых протеиназ определяли по методу Ансона, щелочных - по методу Кунитца, трипсинингибирующую активность определяли по методу Тирру.

Производственные испытания производили на масложиркомбинате ОАО «Краснодарский». Отбор проб семян и продуктов их переработки вели в соответствии с ГОСТ 15895 последовательно по ходу технологического процесса со смещением во времени, соответствующему продолжительности прохождения материалом технологических операций.

Отобранные пробы анализировали в лабораторных условиях кафедры биохимии и технической микробиологии КубГТУ согласно вышеописанным методам. Повторность анализов 4-х кратная. Обработку экспериментальных данных вели методом математической статистики, среднее квадратическое отклонение - не более 5%.

При статистической обработке экспериментальных данных использовали методы дисперсионного и регрессионного анализа.

2. Результаты исследований

Общая схема исследования представлена на рисунке 1.

Как следует из полученных данных, соотношение активности

протеиназ в группах белков было различным и составило в семенах сорта Круиз 12: 3: 1, в семенах сорта Фаворит 10: 3: 1, в семенах сорта Юбилейный 60 9: 2: 1. У всех сортов наибольшей протеолитической активностью отличалась водорастворимая фракция белков. Аналогичная закономерность выяснилась и в распределении ингибиторной активности (табл. 2).

Таблица 2

Распределение протеолитической и ингибиторной активности в белковых фракциях подсолнечных семян, % от суммарной

Сорт Активность протеиназ, % Активность ингибиторов, %

подсолнс Водорас Солераств Щелочер Водораст Солераств Щелочер

чника творима оримая астворим воримая оримая астворим

я фракция ая фракция фракция ая

фракция фракция фракция

Круиз 76 18 6 78 18 8

Фаворит 72 21 7 74 20 6

Юбилейн 72 18 10 76 17 7

ый 60

В связи с этим, при проведении исследований изучали протеолитическую и ингибиторную активность у водорастворимой фракции.

▼

Лабораторный шрот

Рис.1

Общая

схема

исследований

Протеолитические ферменты экстрагировали из измельченных обезжиренных семян водой и для анализа использовали водные экстракты. Экстракты хранили в замороженном виде при температуре -18°С. Активность протеин аз определяли одновременно в пяти повторностях разведенного в два раза экстракта. Результаты представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3

Активность протеолитических ферментов водорастворимой фракции белков семян подсолнечника, мг/г

Протеиназы Сорта подсолнечника

Круиз Фаворит Юбилейный 60

Щелочные 0,465 0,405 0,360

Кислые 0,350 0,310 0,244

Трипсиноподо 0,462 0,288 0,156

бные

Химотрипсино 0.175 0,065 0,063

подобные

Таблица 4

Активность ингибиторов протеолитических ферментов в исследуемых семенах подсолнечника, мг/г

Ингибиторы протеаз Сорта

Круиз Фаворит Юбилейный 60

Ингибиторы 22,4 21,0 15,1

трипсина

Ингибиторы 15,18 16,8 12,6

химотрипсина

Наиболее высокой является активность протеиназного комплекса у семян сорта Круиз, наименьшая - у сорта Юбилейный 60 по всем группам протеиназ. Из протеиназ наиболее активны трипсиноподобные и щелочные протеиназы, наименее активны - химотрипсиноподобные.

Как следует из полученных, данных исследуемые сорта подсолнечника заметно различаются также по активности ингибиторов протеиназ. Наибольшей у сравниваемых сортов является трипсинингибирующая активность (ТИА). Самая высокая ТИА обнаружена у сорта Круиз, она сравнима со средней величиной ТИА кормовых сортов сои. Наименьшая ТИА отмечена у семян сорта Юбилейный 60. По своему значению она близка к ТИА семян пищевых сортов сои, таких как Фора и Веста. Семена сорта Фаворит занимают среднее положение.

Анализ количества протеиназ и их ингибиторов в исследуемых семенах подсолнечника позволил обнаружить положительную корреляцию между массовой долей белка в семенах и количеством протеиназ и их ингибиторов (г=0,80), а также величиной активности этих групп белков (табл. 1, 5).

Таблица 5

Количество протеиназ и их ингибиторов в семенах подсолнечника (верхняя строка - количество протеиназ и их ингибиторов в 100 г семян, нижняя - количество протеиназ и их ингибиторов в одной семянке)

Сорт Протеиназы Ингибиторы протеиназ

Трипсин Химотрипсин Трипсина Химотрипсина

Круиз 59,96 35,0 29,07 19,70

0,037 0,021 0,018 0,012

Фаворит 23,32 9,75 17.01 13,60

0,012 0,005 0,009 0,007

Юбилейный 10,54 4,25 10,24 8,52

60 0,006 0,002 0,005 0,004

Для выяснения биологической роли ингибиторов протеиназ в семенах подсолнечника дальнейшие исследования выполняли на прорастающих семенах. Была установлена обратная зависимость между активностью протеиназ и активностью их ингибиторов по мере формирования проростков (табл.6,7).

Таблица б

Изменение активности щелочных протеиназ при прорастании семян подсолнечника

Дни от начала прорастания Активность протеиназ, мг/г

Круиз Фаворит Юбилейный 60

0 0,46 0,40 0,36

1,5 0,66 0,43 0,51

3 0,78 0,50 0,77

7 0,94 0,98 1,07

Таблица 7

Изменение аюявности ингибиторов щелочных протеиназ при прорастании семян подсолнечника

Дни от начала прорастания Активность ингибиторов протеаз, мг/г

Круиз Фаворит Юбилейный 60

0 22,4 21,0 15,0

1,5 12,3 14,9 7,2

3 10,8 10,1 5,0

7 0,7 0,3 0,0

Как следует из полученных данных, активность протеолитических ферментов, а также активность их ингибиторов в семенах подсолнечника уже после набухания семян подвергается изменениям, однако резкое снижение активности белковых ингибиторов достоверно наблюдалось только к концу прорастания и формированию проростка.

Экспериментальные данные позволяют предполагать, что в процессе прорастания семян подсолнечника происходит протеолиз не только запасных белков семян, но и протеолиз белковых ингибиторов протеиназ, который сопровождается снижением, а затем и потерей их ингибиторной активности. В связи с этим, не исключая функции защиты семян от патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей и торможения протеиназ в покоящихся семенах, можно полагать, что белки-ингибиторы могут служить запасной формой азота в семенах.

Исследования показали, что сравниваемые сорта подсолнечника различаются по динамике изменения активности протеиназ и их ингибиторов при прорастании семян. Наиболее резкое падение трипсинингибирующей активности (ТИА) в прорастающих семенах отмечено для сорта Юбилейный 60 - уже на вторые сутки прорастания она снизилась более чем в два раза; для этого же сорта отмечена и наиболее высокая интенсивность возрастания активности протеиназ. Высокобелковый сорт Круиз характеризовался наиболее высокими показателями ТИА и более медленным ее снижением в процессе прорастания семян. Активность ингибиторов протеиназ у семян этого сорта наибольшая. Сорт Фаворит занимает промежуточное положение по сравниваемым параметрам.

Дальнейшие исследования позволили предположить возможность миграции ингибиторов протеиназ В почву в процессе прорастания семян в результате изменения локализации ингибиторов в клетках семян.

Эксперментальные данные свидетельствуют о том, что ингибиторы протеиназ экстрагируются водой из семян более быстро по сравнению с протеиназами. Водная вытяжка белка из предварительно стерилизованного песка растильни в зоне прорастающих семян проявляла заметную трипсинингибирующую активность, подавляя рост микроорганизмов (таблица 8).

Таблица 8

Триисинингибирукмцая активность водной вытяжки из песка растильни

Дни от начала прорастания ТИА водной вытяжки, мг/г

Круиз Фаворит Юбилейный 60

0 0 0 0

1,5 0,14 0,16 0,27

3 0,20 0,23 0,31

7 0,29 0,34 0,48

Ингибиторы трипсинового типа, выделенные из семян подсолнечника изученных сортов, активно ингибировали рост мицелиальных грибов, которые были получены из смывов с поверхности семян. Водные вытяжки достоверно подавляли рост мицелия фитопатогенных грибов при введении в среду культвирования (таблица 9).

Таблица 9

Угнетение роста Asp. flavus нри введении в питательную среду водного экстракта из семян подсолнечника сорта Круиз

Добавлено к субстрату, мл Количество колоний, ед

2 часа 6 часов 16 часов 24 часа

0,0 100 200 1000 5000

0,1 0 150 500 3000

0,5 0 0 300 1500

1,0 0 0 0 500

При технологической переработке семян подсолнечника

неизбежны интенсивные тепловые и влаготепловые воздействия, которые оказывают денатурирующее воздействие на белки и активность протеолитических ферментов семян и их белковых ингибиторов.

Активность протеиназ и их белковых ингибиторов под влиянием технологических факторов изменяется в широком диапазоне. Технологическими параметрами, вызывающими денатурацию белков и,

следовательно, наиболее глубокие изменения ферментативной и ингибирующей активности в продуктах переработки масличных семян и, в частности, семян подсолнечника являются влаготегоювая обработка в жаровне, отжим масла в шнековом прессе и особенно влаготепловая обработка обезжиренных семян в тостере, главной целью которой является удаление из шрота растворителя (рис.2, табл. 10). Таблица 10

Изменение активности протеиназ и их ингибиторов при технологической переработке подсолнечных семян

Технологические Активность протеаз, % Активность ингибиторов, % от

продукты при от исходного исходного

переработке семян кислые щелочные кислые щелочные

Измельченное ядро 100 100 100 100

семян (мятка)

Материал на

прессование (мезга) 80,3 86,4 90,1 92,1

Форпрессовый

жмых 68,6 65,3 89,6 87,4

Лепесток

форпрессового 66,6 60,1 72,3 68,4

жмыха

Шрот 24 20,9 0,0 52,3

Как следует из таблицы 10, ингибиторы протеиназ отличаются значительно большей термостойкостью по сравнению с протеиназами.

Изменение растворимости белковых веществ происходит с увеличением температуры скачкообразно (табл.11).

Измельченное пропарочный шнек

ядро семян (мятка) ^ (инактиватор)

влажность 5-6%, температура 20-25°С

мезга чанная жаровня

агрегата РЗ-МОА

влажность 8-9%, температура 80-85°С

влажность 5-6%, температура 100-105°С

экстрактор лепесюк получение форпрессового НД1250 лепестка

влажность 5-7%, температура 55-60°С

тостер

мезга г

жмых

температура (внутри

пресса) 120-140°С температура жмьгха на выходе из пресса 110-115 С влажность жмыха 6-8%

шрот

влажность 8-10%, температура на выходе из тостера 105-110°С

рисунок 2

Схема технологических операций и их параметры при тепловой и влаготепловой обработке подсолнечных семян в процессе обезжиривания

Наиболее чувствительны к тепловому воздействию низкомолекулярные водорастворимые белки, в состав которых входят протеиназы и их ингибиторы.

Массовая доля этой группы белков резко снижается уже при температуре 60°С, соответствующей первой стадии влаготепловой обработки мятки семян. При температурах в прессующем тракте форпресса 120°С доля растворимых белков снижается до величин, близких к нулю. Затем, при температурах, превышающих 120°С,. начинается рост содержания растворимых белков, коррелирующий с уменьшением доли щелоче- и нерастворимых белков.

Таблица 11

Изменение растворимости белковых веществ при нагревании подсолнечных семян и продуктов их переработки

Температур Отношение азота фракций к общему азоту. %

а, °С Водораствори Солераствори Щелочераствор Нерастворима

мая мая имая я

20 15,4 56,1 5,1 23,4

60 4,8 64,8 6,0 25,8

105 2,0 52,6 18,2 27,4

120 0,0 4,9 29,9 64,2

140 7,6 3,6 14,7 78,1

160 12,6 2,3 7,7 68,4

Существенное влияние на глубину этих процессов оказывает начальная влажность белков. При влажности обезжиренных семян, соответствующей влажности мятки после увлажнительного шнека и на начальных стадиях приготовления мезги обнаруживается значительное

возрастание водорастворимого азота и снижение азота нерастворимого остатка.

В первый период влаготепловой обработки происходят наиболее заметные изменения водорастворимых фракций, одним из компонентов которой являются протеиназы и их ингибиторы. Влаго тепловая обработка оказывает значительное влияние на физические свойства и физиологическую активность белков.После тепловой обработки при 45°С атакуемость белка ферментами пепсином и трипсином увеличилась на 6,17%, возросла до максимального значения вязкость белковых растворов. Такие изменения свидетельствуют о начальных этапах денатурации белков. Дальнейшее повышение температуры до 60°С сопровождается более глубокими конформационными изменениями белковых молекул: снижается доля альбуминов, что приводит к значительному снижению атакуемости белков ферментами. Нагревание материала до 90°С ведет к двукратному по сравнению с исходным снижению активности ингибиторов протеиназ. Продолжается дальнейшее снижение вязкости белковых растворов и атакуемости белков протеолитическими ферментами.

Экспериментально установлено, что нагревание высоковлажных семян подсолнечника в условиях, исключающих потерю ими влаги, приводит к быстрому снижению трипсинингибирующей активности. Даже при относительно невысокой температуре 45°С нагревание высоковлажных белков снижает активность ингибиторов протеиназ на одну треть, а нагревание при температуре 90°С в указанных условиях снижает трипсинингибирующую активность вдвое.

Таблица 12

Влияние тепловой обработки семян подсолнечника на атакуемость белков ферментами и изменение вязкости белковых растворов

Температура Активность Атакуемость Массовая Вязкость,

обработки ингибиторов белков доля N мПа/С

семян, °С протеиназ, ферментами,% водораствори

мг/г мых белков,

%

До обработки 15,0 58,94 0,38 1,02

45

60 10,4 65,11 0,31 1,60

90 9,3 50,36 0,29 1,36

8,7 48,48 0,20 1,18

Происходящая при нагревании белков при 45°С их термоденатурация является, как можно судить на основании полученных данных, ограниченной. Она почти не сказывается на фракционном составе белков - соотношение фракций по растворимости изменяется в пределах ошибки измерения (табл.13).

Таблица 13

Влияние тепловой обработки обезжиренных семян на групповой состав белков

Температур Азот групп белков, % на сухое вещество

а обработки Альбумины Глобулины Глютелины Нерастворим

семян,0 С ый остаток

До 0,38 6,7 1,02 0,20

обработки

45 0,31 6,59 1,35 0,22

60 0,29 5,96 2,06 0Д9

90 0,20 5,24 2,45 0,79

Обращает внимание высокая степень атакуемости белков протеолитическими ферментами - максимальная при тепловой обработке белков при 45°С. Не исключая объяснения этого как результата начальной денатурации белковых молекул и роста доступности их для действия протеиназ, не менее вероятной причиной высокой атакуемости белков можно считать снижение активности ингибиторов протеиназ, способных тормозить протеолиз. Однако полученные нами данные не дают оснований для однозначногозаюпочения - повышение интенсивности тепловой обработки сопровождается как снижением атакуемости белков по мере возрастания глубины их тепловой обработки, так и снижением активности протеиназ.

Одновременно со снижением активности протеиназ, снижается активность ингибиторов трипсина, хотя последние изменяются медленнее, проявляя высокую термостойкость, отмечавшуюся ранее в ряде работ.

В процессе жарения и последующего прессования мезги в аминокислотном составе суммарного белка снижается содержание отдельных аминокислот. Наиболее существенным изменениям подвержены такие реакционноспособные аминокислоты, как фенилаланин, количество которого в форпрессовом жмыхе снижается до 4,92% против 6,87% в исходных семенах. Наблюдается также снижение первой лимитирующей аминокислоты подсолнечных семян - лизина, но на содержание большинства других аминокислот прессование не оказывает существенного влияния.

В ходе подготовки материала к экстракции и особенно при отгонке растворителя из шрота наблюдается дальнейшее снижение ряда незаменимых аминокислот.

При разработке способа обезвреживания подсолнечных белков подсолнечный шрот, полученный по традиционной технологии подвергали

тепловой обработке при 120°С в течение 25минут. Влажность образцов шрота была двух уровней и составляла 8,5% и 15,3%. Образцы для анализов отбирали каждые пять минут (табл.14). Таблица 14

Влияние продолжительности тепловой обработки и влажности подсолнечного шрота

на активность ингибитора трипсина

Продолжительность тепловой обработки, мин. Активность ингибитора трипсина, мг/г

Влажность шрота 8,5% Влажность шрота 15,3%

0 22,3 21,0

5 22,0 20,1

10 21,5 11,5

15 12,8 8,3

20 11,8 3,4

25 11,0 0,0

Таблица 15

Влияние продолжительности тепловой обработки на биолот ическую ценность подсолнечного шрота (начальная влажность шрота 15,3%)

Наименование белковга о продукта, продолжительность тепловой обработки, мин Биологическая ценность по отношению к казеину, %

Подсолнечный шрот до тепловой 52,6

обработки

Подсолнечный шрот после тепловой

обработки:

5 57,3

10 60,0

15 63,5

20 69,3

25 70,1

Оценку относительной биологической ценности подсолнечного шрота вели с использованием тест-организма инфузории Тетрахимена пириформис. Как следует из экспериментальных данных (табл.15), по мере увеличения продолжительности тепловой обработки шрота растет его биологическая ценность, по-видимому под влиянием двух процессов -уменьшения активности ингибиторов трипсина и тепловой денатурации запасных белков, увеличивающей доступность белковых молекул для пищеварительных ферментов тест-организма.

Общие выводы

1. Установлено, что в семенах современных сортов подсолнечника присутствуют активные протеиназы и их ингибиторы, локализованные преимущественно в водорастворимой фракции белков семян. Протеиназы подсолнечника относятся к группе сериновых протеиназ.

2. Активность и количество протеиназ и их ингибиторов в белковом комплексе коррелирует с величиной массовой доли запасных белков в подсолнечных семенах. Наибольшая протеолитическая и ингибиторная активность установлена у белков сорта Круиз, наименьшая активность - у сорта Юбилейный 60.

3. Показана способность эндогенных ингибиторов протеиназ подавлять рост микроорганизмов, локализованных на поверхности семян.

4. Впервые установлено изменение активности протеиназ и их ингибиторов при прорастании семян - по мере роста и развития проростка активность протеиназ увеличивается, а активность их ингибиторов снижается. Высказано предположение и экспериментально подтверждена возможность выхода ингибиторов протеиназ из прорастающих семян в

окружающую среду и ингибирование ими протеиназ почвенных микроорганизмов.

5. Показано и количественно оценено изменение активности протеиназ и их ингибиторов при переработке семян подсолнечника в технологии получения растительного масла и шрота. Показано, что технологические воздействия не подавляют полностью активность ингибиторов протеиназ.

6. Для практически полной инактивации ингибитора трипсина в подсолнечном шроте необходимо дополнительное увлажнение шрота в тостере и увеличение продолжительности тепловой обработки шрота.

7. Рекомендованы технологические условия для повышения биологической ценности белков подсолнечного шрота при тестировании на действующем в масложировой промышленности оборудовании.

8. На основании изучения комплекса функционально-технологических свойств белковые продук-ш из семян подсолнечника могут быть рекомендованы как компоненты продуктов функционального назначения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Защитная роль ингибиторов протеиназ из семян подсолнечника современных сортов / И.А. Москвич // Известия вузов. Пищевая технология. №2-3, с. 105-106.

2. Влияние термоденатурации белков семян подсолнечника на их атакуемость ферментами / А.Д. Минакова, И.А. Москвич, В.Г. Щербаков II Известия вузов. Пищевая технология. №4, с.42-45

3. Ингибитор трипсина в белковом комплексе семян подсолнечника / Москвич И.А. //Мат-лы per. Научно-практической конф. молодых ученых «Научное обеспечение сельскохозяйственного производства», Краснодар, 1999 г. -С. 220-221

4. Ферментативный комплекс семян подсолнечника перспективных сортов /Москвич И.А., Щербаков В.Г. // Мат-лы 2-й per. Научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», Краснодар, 2001. -С. 190-191.

5. Изменение активности протеаз и их белковых ингибиторов при прорастании семян подсолнечника / В.Г. Щербаков, И.А. Москвич // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции «Продовольственная безопасность как важнейший фактор национальной безопасности страны и роль информационно-консультативных служб АПК в ее обеспечении», Пенза, 2002. -С. 199200.

6. Биологическая ценность белков подсолнечных семян современных сортов подсолнечника / И.А. Москвич, А.Д. Минакова // Материалы конференции «Современные проблемы торговли, расширения ассортимента и контроля качества потребительских товаров и продуктов общественного питания.» Санкт-Петербург, 2002, с. 123-124.

7. Изменение активности протеиназ и их ингибиторов в процессе прорастания семян подсолнечника / И.А. Москвич, В.Г. Щербаков // Материалы Межд. Конференции «Функциональные продукты питания: гигиенические аспекты и безопасность» Краснодар, КГАУ, 2003, с. 170171.

Лицензия ИД 02334

14.07.2000

Подписано в печать22.09.03 Бумага офсетная Печ. л. 1,0 Тираж 100

Формат 60 х 84 Офсетная печать

Заказ № 5 52

Отпечатано в типографии КубГАУ, 350044, Краснодар, Калинина, 13

»

#

>

*

* ■

í

I

»

I i

f

i

i

t

f

i

! !

; 1 ■ ! i - ¡

i к

1 9

^ооН

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Москвич, Ирина Анатольевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Растительные белки.

1.2 Протеолитические ферменты растений.

1.3 Роль протеолитических ферментов в растениях.

1.4 Ингибиторы протеолитических ферментов растений.

1.5 Классификация ингибиторов протеаз отдельных ботанических семейств и их характеристика.

1.6 Роль ингибиторов протеолитических ферментов в растений.

1.7 Характеристика исследуемого объекта.

1.8 Технология переработки семян подсолнечника.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимическая характеристика ингибиторов протеиназ подсолнечника в связи с необходимостью повышения биологической ценности подсолнечного белка"

Все основные свойства и функции организма обусловлены свойствами и функциями белков. Свойства белка определяют молекулярную организацию протоплазмы, обмен веществ, реакцию организма на внешние воздействия. Через белки реализуется генетическая функция нуклеиновых кислот и морфогенетических процессов. Уже почти два столетия белки находятся в центре внимания биологов. В последнее время особенно возрос интерес к проблеме растительного белка. Это вызвано тем, что растения осуществляют его первичный синтез из неорганических элементов и являются основным источником белкового питания человека и животных.

Одна из вечных проблем человечества - обеспечение пищей, самой дефицитной частью которой является белковая. До сих пор более половины населения мира испытывают недостаток в белке и проблема увеличения его производства остается самой актуальной. Увеличение ресурсов белка за счет животноводства и рыбного промысла имеет свои пределы, которые уже практически достигнуты. Поэтому главным источником пищевого и кормового белка являются растения.

С проблемой пищевой ценности растительных белков связаны также вопросы безвредности растительного белка для организма человека. В растительном сырье присутствуют различные антипитательные или антиалиментарные вещества. К ним относятся, в частности, ингибиторы протеолитических ферментов, присутствующие в семенах зерновых, бобовых и других растений. Присутствуя в белковых продуктах, белки-ингибиторы протеиназ пищеварительного тракта могут существенно снизить усвояемость растительного белка.

Протеолитические ферменты и их ингибиторы играют важную роль в жизнедеятельности организмов.

Протеиназы и их технические препараты широко применяются в пищевой промышленности, в медицине, используются в виде кормовых добавок в животноводстве. Соевый ингибитор типа Баумана-Бирк является средством, которое эффективно применяется при лечении злокачественных новообразований. В настоящее время широко ведется поиск ингибиторов растительного происхождения, пригодных для использования в медицине.

В то же время высокое содержание ингибиторов в некоторых растениях приводит к значительному снижению пищевой ценности белковых продуктов. Так, в сое содержится пять ингибиторов трипсина в количестве 5 - 10 % от общей суммы белков. Присутствие ингибиторов протеиназ в рационе питания животных и человека приводит в ряде случаев к отрицательным физиологическим явлениям.

Многие ингибиторы обладают высокой устойчивостью к повышению температуры и не разрушаются даже после кипячения. Ряд растительных продуктов употребляется в пищу в сыром виде. В результате ингибиторы протеиназ могут в существенной степени затруднять усвоение белков, несмотря на содержащиеся в растениях активные протеиназы, способные стимулировать процесс гидролиза и усвоения белков пищи.

В связи с этим изучение растительных протеиназ и их ингибиторов в исходном сырье и белковых пищевых продуктах приобретает особое значение, определяя их биологическую ценность и безвредность для живого организма.

Данные о содержании протеиназ и их ингибиторов в растениях касаются в основном представителей ботанических семейств - бобовых, злаковых, пасленовых и тыквенных, реже - сельдерейных и капустных. Исследования последних десятилетий свидетельствуют об участии белков-ингибиторов во многих метаболических процессах растений - в процессах органического протеолиза белков и синтеза ферментов в прорастающих семенах, в создании механизмов защиты растения от повреждения микроорганизмами и насекомыми-вредителями. Эти работы дают основание полагать, что белки-ингибиторы ферментов являются обязательным компонентом белкового комплекса многих растений, во всяком случае тех из них, в которых белки в созревающих семенах откладываются в запас.

К сожалению, сведения о протеиназах и их белковых растительных ингибиторах семян подсолнечника, основной и традиционной масличной культуры юга России, крайне ограничены, получены на семенах подсолнечника старых сортов и выполнены методами, уже не применяемыми в современных биохимических исследованиях.

Отсутствуют также исследования протеаз и их ингибиторов в продуктах технологической переработки семян подсолнечника. Жмыхи и шроты, получаемые после удаления из семян растительного масла, представляют собой высокобелковые продукты и могут служить перспективным источником получения белковых концентратов и изолятов, применяемых в пищевой промышленности в качестве белковых обогатителей и функциональных добавок.

В связи с этим изучение биохимических характеристик протеиназ и их ингибиторов в хранящихся, покоящихся и прорастающих семенах подсолнечника и их изменений при технологической переработке семян представляют теоретический интерес для биохимии растений и химии белка и имеют прикладное значение для масложировой промышленности, перерабатывающей семена подсолнечника, при получении растительного масла и белка.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с НТП Минобразования РФ «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» (№ госрегистрации 01200004219) и в соответствии с тематикой НИР кафедры биохимии и технической микробиологии КубГТУ (№ госрегистраци 2.14.09 и 2.14.005.6).

Целью работы являлось изучение биохимических характеристик протеиназ и их ингибиторов в семенах подсолнечника современных типов и выяснение возможности повышения эффективности использования подсолнечных белков в пищевых и кормовых продуктах путем направленной термической инактивации присутствующих в семенах ингибиторов протеиназ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Москвич, Ирина Анатольевна

Выводы

Выполнено экспериментальное исследование белкового комплекса семян подсолнечника новых сортов, позволяющее выявить особенности физико-химических свойств их биологически активных веществ (протеиназ и их белковых ингибиторов) при технологической переработке семян в производстве и обосновать способ повышения биологической ценности получаемых продуктов.

1. Впервые количественно оценена разнокачественность сортов подсолнечника по активности протеиназ и их эндогенных ингибиторов, выявлена положительная корреляция с величиной массой доли в семенах запасных белков.

2. Показано распределение протеолитической и ингибиторной активности в белковом комплексе семян, установлена преимущественная локализация биологически активных белков в водорастворимой фракции запасных белков семян.

3. Впервые показана обратная зависимость активности протеиназ и их ингибиторов в прорастающих подсолнечных семенах. Возрастание активности протеиназ и снижение активности их эндогенных ингибиторов может являться следствием выхода ингибиторов протеиназ из прорастающих семян в окружающую среду.

4. Впервые предложена гипотеза о формировании вокруг проростков семян «защитной зоны» из ингибиторов, препятствующей повреждению его микроорганизмами почвы, подтвержденная экспериментально установленным подавлением роста микроорганизмов ингибиторами протеиназ, выделенными из подсолнечных семян. Эти результаты позволяют предполагать, что в прорастающих семенах биологическая роль ингибиторов протеиназ заключается в подавлении протеолитической активности почвенных микроорганизмов, не исключая возможности расходования ингибиторов в качестве запасных белков при прорастании семян.

5. Денатурационным изменениям под действием технологических факторов переработки подсолнечных семян подвергаются в первую очередь и в большей степени водорастворимые белки. Наибольшее денатурирующее воздействие оказывают операции влаготепловой обработки измельченных семян, отжим масла на шнековых прессах и операция отгонки растворителя из шрота в тостерах. Под действием этих операций электрофоретические спектры всех групп белков упрощаются, растворимость и физико-химические характеристики белков изменяются от снижения растворимости до появления пластических свойств по мере углубления тепловой денатурации. Белки теряют биологическую ценность, снижается массовая доля незаменимых аминокислот, активность ингибиторов приближается к нулевой.

6. Определены основные технологические параметры, обеспечивающие снижение трипсинингибирующей акивности шротов, получаемых из семян подсолнечника высокобелковых (кондитерских) сортов, позволяющие вырабатывать высокобелковые продукты для моногастрических сельскохозяйственных животных.

7. Предложены рекомендации для селекции сортов подсолнечника на высокую трипсинингибирующую активность для производства на их основе лечебных препаратов.

8. Ожидаемый экономический эффект от реализации результатов диссертационной работы в технологии переработки семян и селекции подсолнечника основывается на повышении биологической ценности подсолнечных шротов и создании источников получения ингибиторов протеиназ из растительного сырья.

Заключение

Как следует из анализа литературных данных, несмотря на обилие информации об ингибиторах протеолитических ферментов растений, сведения о них противоречивы и во многих отношениях не отличаются полнотой.

Это в полной мере относится к ингибиторам протеаз подсолнечника, характеристика которых неполна. Изучение изменения их активности под влиянием технологических воздействий на семена в процессе их переработки отсутствует. Немаловажно и то, что ограниченные сведения об ингибиторах ферментов семян подсолнечника получены на семенах сортов уже длительное время снятых с производства. Сведения об ингибиторах семян подсолнечника новых и перспективных сортов и гибридов отсутствуют.

В связи с изложенным целью нашего исследования являлось:

1. определение активности протеаз перспективных сортов и гибридов подсолнечника селекции ВНИИМК;

2. изучение влияния различных параметров технологической обработки, применяемой при получении из семян масла и белка, на активность ингибиторов протеаз;

3. выяснение влияния активности ингибиторов протеаз на биологическую ценность пищевых белковых продуктов, полученных при переработке семян с помощью тест-организма (Tethrachymena pyriphormis);

4. поиск возможных путей модификации (совершенствования) технологического процесса переработки семян подсолнечника и получения на их основе белковых продуктов - концентратов, изолятов - с целью возможно более полной инактивации ингибиторов протеаз и повышения биологической ценности белковых продуктов из семян;

5. рекомендация направлений и возможных методов повышения биологической ценности белков шрота при технологической переработке семян подсолнечника на действующем в масложировой промышленности оборудовании;

6. выяснить изменение активности ингибиторов протеаз при прорастании подсолнечных семян и оценить их биологическую роль в растении.

2. Экспериментальная часть

2.1. Исходный материал, условия и методы эксперимента

Объектом исследования служили семена высокомасличного подсолнечника сортов Круиз, Юбилейный 60, Фаворит, выращенных в одинаковых почвенно-климатических условиях на опытных полях НПО «Масличные культуры» ВНИИМК (г. Краснодар) в сезоны 1999, 2000, 2001, 2002 гг.

2.1.1. Характеристика объектов исследования

Современные сорта и гибриды подсолнечника обладают высокой потенциальной продуктивностью и при оптимальном сочетании всех факторов жизни (вода, питательные элементы, тепло, свет и др.) обеспечивают урожайность семян 3,5-4,0 т/га и более. Подсолнечник - основная масличная культура Кубани. В Краснодарском крае рекомендованы к использованию 14 гибридов и 16 сортов отечественной селекции и 23 гибрида иностранной. В семянках таких сортов содержится в среднем 50-54% масла.

Сорт Круиз включен в Государственный реестр селекционных достижений и допущен к использованию с 1998 года. Скороспелый сорт подсолнечника, от всходов до физиологической спелости 81 - 83 дня, устойчивый к заразихе, подсолнечной моли, средневосприимчивый к фомопсису (24%). Масличность абсолютно сухих семянок 47 - 49%, высокоурожайный, среднерослый. Его урожайность на госсортоучастках составляет 1,76 т/га. Отличительной особенностью сорта Круиз является высокое содержание в масле (более 71%) триацилглицеролов олеиновой кислоты, которых в обычных сортах содержится не более 30%. Масло, полученное из семян высокоолеинового сорта подсолнечника Круиз, аналогично оливковому и может быть использовано для диетического питания.

В отличие от старого высокоолеинового сорта Первенец, новый сорт при переопылении с другими сортами и гибридами не теряет высокоолеиновости семян. Рекомендуется для всех зон возделывания подсолнечника.

Сорт Фаворит является новым среднеспелым сортом. Он обладает уникальными качественными характеристиками. Внесен в список сортов, рекомендованных к возделыванию с 1997 года. Отличительной особенностью сорта подсолнечника Фаворит является устойчивость к гидролитическому распаду масла. Благодаря применению новых методов оценки и отбора, удалось снизить активность фермента липазы в семенах этого сорта, что позволяет получать сырье с низким кислотным числом при перестое растений на корню и даже при кратковременном увлажнении бурта. Производственное испытание, проведенное в Ставропольском крае в 1994 году показало, что при уборке 27 ноября кислотное число в семенах контрольного сорта Юбилейный 60 составило 5,3 мг КОН, а в семенах сорта Фаворит - всего 1,3 мг КОН. Помимо этого, Фаворит обладает устойчивостью к ложной мучнистой росе, заразихе и подсолнечной моли, высокотолерантный к фомопсису (36%). По урожаю маслосемян с единицы площади он не уступает сорту Юбилейный 60, превышая по этому показателю такие сорта, как ВНИИМК 8883, Березанский и Родник. Масличность абсолютно сухих семянок колеблется от 50 до 51,5%, сбор масла от 12 до 13 ц/га. Рекомендуется к возделыванию в южных районах российской Федерации, а в Центральной полосе - с применением десикации.

В качестве сорта-контроля использовали сорт Юбилейный 60. Это первый в мировой практике сорт подсолнечника, полученный на основе межвидовых гибридов, обладающий устойчивостью к ложной мучнистой росе и комплексу рас заразихи. Районирован с 1981 года. Сорт среднеспелый, высокорослый - высота растений 190-210 см. Высокомасличный, масличность абсолютно сухих семянок 51 - 53%. Хорошо приспособлен к механизированной уборке, дружно цветет и одновременно созревает. Благодаря хорошим физико-механическим свойствам семян при переработке дает высокий выход масла. Урожайность колеблется от 28 до 33 ц/га. Хорошие результаты показывает при возделывании в Ростовской и Волгоградской областях, Ставропольском крае. Положительно отзывается на внесение минеральных удобрений. Хороший медонос. Фомопсисом и белой гнилью поражается в средней степени (48, 89).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Москвич, Ирина Анатольевна, Краснодар

1. Абрамова Е.П. Протеолитические ингибиторы фасоли, их получение и свойства. —Автореф. дис. канд. биол. наук. -М., 1967.-18с.

2. Александров С.Л., Антонов В.К. Эффективность протеолитических ферментов. -В кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов». -М., 1993,- с.12-13.

3. Алексеева М.В. Белки алейроновых семян некоторых бобовых и тыквенных. В кн. «Растительные белки их биосинтез» АН СССР, М.: Наука, 1975. -с.136-141.

4. Андреева Н.С. Внутримолекулярная подвижность аспартатных протеиназ и ее роль в их функциях. -В кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов». -М.-1993, -с. 14.

5. Антонов В.К. Химия протеолиза.-М.: Наука, 1983. -с.367.

6. Балабушевич Н.Г., Донецкий И.А., Гладышева И.П. Природные ингибиторы как основа для создания лекарственных средств. -В кн. Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов». -М., 1993. -с. 115-117.

7. Белозерский М.А., Емцева И.Б., Курсанова Т.А. Выделение и свойства протеиназы из семян гречихи. -В кн.: Тезисы симпозиума «Химия протеолитических ферментов». —Вильнюс, 1973. -с.99.

8. Белозерский М.А. выделение и свойства 11S глобулина семян гречихи. -В кн.: Растительные белки и их биосинтез. -М.: Наука, 1975.-е. 152-156.

9. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е. Начальные превращения главного запасного белка в прорастающих семенах гречихи //Биохимия. -1984. -Т.49, №3. -с.479-485.

10. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., Руденская Г.Н. Регуляция активности протеаз, осуществляющих гидролиз запасных белков у растений. В.кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1993. -с.37.

11. Белозерский М.А. Свойства и физиологическая роль протеиназ и их ингибиторов в семенах некоторых высших растений. -Автореф. дисс.канд.биол. наук. -М., 1983. -44с.

12. Бенкен И.И., Томилина Т.Б. Антипитательные вещества белковой природы в семенах сои. Научно-технический бюллетень ВИР. 1985. Вып.149. -с. 3-10.

13. Бейли Дж. Методы химии белков. -М.: Мир, 1965. -с.284.

14. Береш И.Д., Вакар А.Б., Соседов Н.И. Некоторые кинетичесие свойства потеолитических ферментов прорастающего зерна пшеницы // Докл. АН СССР. -1972. т.203, №2. -с.473-476.

15. Бжесюк С, Межвинская Т. Ферментативная активность как возможный показатель жизнеспособности семян // Wiss Beitz — Martin — Zather — Vailer — Wittenberg. -1976 -№6. -c.168-201.

16. Биохимия растительного сырья /В.Г. Щербаков, В.Г. Лобанов, Т.Н. Прудникова и др.; Под. ред. В.Г. Щербакова. М.: Колос, 1999. -376 с.

17. Вайнтрауб И.А., Шутов А.Ф. Протеиназы семян. -В кн.: Тезисы симпозиума "Химия протеолитических ферментов". Углич, 1979.-с. 196-23.

18. Вайсблай И.М. Состав ингибиторов трипсина семян гороха// Вопр. питания. -1979. -№ 2. -с. 76-77.

19. Валуева Т.А., Валуев Л.И. Особенности взаимодействия многоцентровых белков-ингибиторов сериновых протеиназ с ферментами. В. кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1993. -с.30.

20. Веремеенко К.Н. Протеолитические ферменты и их применение в медицине // Здоровье. -Киев. -1971. -159 с.

21. Вовчук С.В., Левицкий А.П., Чарский И.С. Выделение и очистка. Биохимические свойства трипсиноподобных ферментов ячменя. В кн.: Тезисы симпозиума "Химия протеолитических ферментов". Углич, 1969. с. 65-66.

22. Вовчук С.В., Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Динамика изменения активности протеиназ и ингибитора трипсина в зерне ячменя при созревании // Физиология и биохимия культурных растений. -1987. -т.15. №3 с.262-266.

23. Вовчук С.В., Волчевская Е.А., Левицкий А.П., Адамовская В.Г. Выделение и свойства ингибитора пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. -1993. -т.29, вып. 1. —с. 91.

24. Воскобойникова Т.В. Физиолого-биохимические характеристики сортов сои в целях создания новых и совершенствования существующих методов селекции. -Автореф. дисс.канд.биол. наук. -Краснодар, 1994. -19с.

25. Высоцкий В.Г., Зилова И.С. Роль соевых белков в питании человека // Вопр. питания. 1995. -№ 5. с. 20-27.

26. Гладышева И.П., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А., Гладышев А.П. Паписова А.И., Ларионова Н.И. Ингибирование экзогенных сериновых протеиназ ингибитором трипсина из гречихи ИТ-1

27. Биохимия. -1996. -т. 60, вып.9. -с.1530-1535.

28. Гребинский С.О. Биохимия растений. -Изд. Львовского университета. — 1967.-c.8-ll.

29. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: пер. с англ. :В 2 т.-М.: Мир, 1986.-Т. 1. -С.393.

30. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: пер. с англ. М.: Мир, 1964. 816 с.

31. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика: пер. с англ. -М.: Мир, 1991.-е 263-282.

32. Домаш. В.И., Буснюк О.В., Забрейко С.А., Ермолицкая JI.B. Белковые ингибиторы эндогенных протеиназ растений. В.кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1997. -с. 89.

33. Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Сульфгидрильная протеаза в эндосперме прорастающих семян ржи. В кн.: Тезисы симпозиума "Химия протеолитических ферментов". Углич, 1979. с.70-71.33.

34. Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Протеолиз и запасание белка семян пшеницы на ранней стадии прорастания // Физиология растений.- 1989. -т.75. №3. -с. 425-428.

35. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Ингибиторы трипсина и внеклеточных сериновых протеиназ микромицетов из семян гречихи. В.кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1993. -с.96.

36. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений. Л.: Колос, 1972.-456 с.

37. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи. Л. : Колос, 1964. -С. 366-380.

38. Зимачева А.В., Иевлева В.В., Мосолов В.В. Выделение и характеристика ингибиторов цистеиновых протеиназ из клубней картофеля //Биохимия. -1984. -т.49, №7. -с.1153-1158.

39. Зимачева А.В., Мосолов В.В. Ингибиторы цистеиновых протеиназиз семян сои// Биохимия. -1995. -т.60, №1. -с.118-123.

40. Золотая книга народной медицины. Энциклопедия. Сост. В.А. Миронов. -М.: «Звонница-МГ», «РИПОЛ КЛАССИК», 1999. -с. 225-226.

41. Иевлева В.В., Зимачева А.В., Мосолов В.В. Новая протеиназа из прорастающего зерна ячменя. В.кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия . протеолитических ферментов. М., 1993. -с.44-45.

42. Иевлева В.В., Руденская Ю.А., Дунаевский Я.Е., Мосолов В.В. 7,5 кДа ингибитор цистеновых протеиназ из семян тыквы. В.кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1997. -с. 91.

43. Казаков Е.Д. Методы оценки качества зерна. М.: Агропромиздат, 1987. -215 с.

44. Касымова Т.Д., Петросян Л.Г., Кученкова М.А., Юлдашев П.Х. Протеазы хлопчатника. В кн.: Тезисы симпозиума "Химия протеолитических ферментов". Углич, 1979. с.51.

45. Каталог сортов и гибридов масличных культур ВНИИМК. Краснодар, 2000. -с.6-7.

46. Кашпаров И.В., Попов М.Е., Попов Е.М., Структурно-функциональная организация ферментов. В.кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М.,1997. -c.l 1.

47. Кладницкая г.В., Валуева Т.А., Ревина Т.А., Мосолов В.В. Накопление ингибиторов химотрипсина в клубнях картофеля при инфицировании возбудителем фитофтороза. В.кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1997. -с.87.

48. Классификация и номенклотура ферментов. -Под ред. Браунштейна. -М.: ИЛ, 1962. -198 с.

49. Клименко В.Г. Белки семян бобвых растений. В кн. «Растительные белки их биосинтез» АН СССР, М.: Наука, 1975. -с.97-116.

50. Ковалева О.В. Протеолитические ферменты и ингибиторы протеиназ из растений и их влияние на пищеварительные протеиназы позвоночных животных. Автореф. дисс.канд. техн. наук. -Краснодар, 1998.

51. Конарев З.Г. Проблема пищевой и кормовой ценности растительных белков. В кн. «Растительные белки их биосинтез» АН СССР, М.: Наука, 1975. -с. 5-20.

52. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия: пер. с нем. JI.B. Козлова, Е.Д. Левицкой, П.Д. Решетова. М.: Мир, 2000. -470 с.

53. Кочетов М.С. Практическое руководство по энзимологии. -М.: Высшая школа, 1980.-с.5-63.

54. Красильников В.Н., Гаврилюк И.П. Перспективы производства белковых нутрицевтиков. В кн.: Растительный белок: новые перспективы / Под ред. Е.Е. Браудо. М.: Пищепромиздат, 2000. -с. 24-39.

55. Кретович В.Л. Биохимия растений. М.: Высшая школа, 1986. -с.137-155.

56. Лобанов В.Г., Шаззо А.Ю., Щербаков В.Г. Теоретические основы хранения и переработки семян подсолнечника. М.: Колос, 2002. - 592 с.

57. Ливенская О.А. Ингибиторы сериновых протеиназ из семян кукурузы. -Автореф. дисс.канд. биол.наук. -М.,1985. -20с.

58. Марх А.Ф., Фельдман А.Л., Юрченко С.И., Загибалов А.Ф. Белковые вещества овощных культур. В кн. «Растительные белки их биосинтез» АН СССР, М.: Наука. 1975. -с.162-166.

59. Мецлер Д. Биохимия: пер с англ.: В 2 т. М.: Мир,1980. -Т.1. -с.87-105.

60. Метлицкий А.В., Ахвледиани К.С. Некоторые вопросы эволюции паразитизма и иммунитета растений. В кн. «Биохимические основы защиты растений. М.: Наука, 1966.

61. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. -М.: Наука, 1971.-144 с. 65. Мосолов В.В., Шульмина А.И., Малова Е.Л. Выделение из клубнейкартофеля ингибитора трипсина и химотрипсина //Биохимия. -1974. -т.29,№5.-с.656-963.

62. Мосолов В.В. Растительные белки-ингибиторы ферментов. В кн. «Растительные белки их биосинтез» АН СССР, М.: Наука, 1975. -с. 172-184.

63. Мосолов В.В. Природные ингибиторы протеолитических ферментов. -В кн. Успехи биологической химии. -М.: Наука, 1982. -т.22. -с. 100-104.

64. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы как регуляторы процесса протеолиза. -М.: Наука, 1983.-40 с.

65. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов. -М.: Наука, 1983. -207 с.

66. Мосолов В.В. Ингибиторы протеолитических ферментов белковой природы . В. кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1993. -с. 28-29.

67. Мосолов В.В. Ингибиторы протеолитических ферментов. В.кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1997. -с. 12.

68. Нестеренко М.В., Мосин В.А., Шемякин М.Ф. Изучение белков, индуцируемых поранением в растениях картофеля и ингибирующих активность экзогенных сериновых протеиназ // Биохимия. -1992. -т. 52, вып.4 -с. 566.

69. Нортроп Д., Кунитц М., Херриот Р. Кристаллические ферменты. М: ИЛ. -1950.-346.

70. Оглоблина О.Г., Арефьева Т.И. Роль протеолитических ферментов и их ингибиторов в инвазии злокачественных опухолей // Биохимия. -1994. -т.59, вып.З. -с. 340-352.

71. Онивоги О.П. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в традиционных пищевых продуктах Гвинеи. Автореф. дисс.канд. биол. наук. -Краснодар, 1983. - 21 с.

72. Петибская B.C., Кочегура А.В., Зеленцов С.В., Шабалта О.М., Каленов П.А. О перспективах повышения питательной ценности сои при селекции на низкую трипсинингибирующую активность. Сельскохозяйственная биология, 1998. № 1. —с. 63-66.

73. Петибская B.C., Шабалта О.М., Кочегура А.В., Зеленцов С.В. Повышение биологической ценности семян сои пищевого назначения. Известия ВУЗов. «Пищевая технология». 1997., №2-3., -с. 19-22.

74. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М. Субстратная специфичность панкреатических сериновых протеиназ различного происхождения. В. кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1997. -с. 78.

75. Проскуряков М.Т. Биохимия. Краткий курс. Краснодар, КубГТУ, 2002. -199 с.

76. Погорлецкая В.Б. Ингибиторы протеиназ серой гнили из семян подсолнечника. Бюллетень НТИ ВНИИМК. 1985. Вып. 1 (88). -с.17-21.

77. Подсолнечник, под ред. B.C. Пустовойта. М. : Колос, 1975. -592 с.

78. Попов М.П., Витол И.С. Металлозависимые протеазы из семян фасоли // Прикладная биохимия и микробиология. 1990. № 4. -с.474-478.

79. Попов Е.М. Принципы структурно-функциональной организации ферментов. В. кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1993.-с. 15.

80. Попов Е.М., Кашпаров И.В., Попов М.Е. Механизм действия аспартатных протеиназ. В.кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1997.-с. 69.

81. Производство и применение ферментных препаратов в пищевой промышленности. Под. ред. Фениксовой Р.В. -М.: Пищепромиздат, 1963.-с.92 -117.

82. Пятницкий Н.П., Проскуряков М.Т. Определение активности химотрипсина по скорости створаживания мол очно-ацетатной смеси. — В кн. : Материалы 17 научной конференции физиологов юга РСФСР. -Ставрополь, 1969. -т.2. -с.80-82.

83. Ревина Т.А., Валуева Т.А., Ермолова Н.В., Кладницкая Г.В., Мосолов В.В. Выделение и характеристика нового ингибитора трипсина и химотрипсина из клубней картофеля //Биохимия. -1995. -№ 11.-е. 1844 -1852.

84. Ревина Т.А., Валуева Т.А., Кладницкая Г.В., Мосолов В.В., Менделе Р. Ингибитор сериновых протеиназ из клубней картофеля. В.кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1997. -с.86.

85. Рекомендации по технологии возделывания подсолнечника в Краснодарском крае. Краснодар, 2000. -26 с.

86. Ротарь В.И., Сенюк В.И., Хорстман К., Вайнтрауб И.А. Цистеиновые протеиназы прорастающих семян фасоли. В.кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1997. -с.50.

87. Руденская Г.Н., Степанов В.М., Богданова Е.А., Ревина Л.П., Головкин Б.Н. Сериновая протеиназа плодов Maclura pomifera. В. кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1993. -с.54.

88. Румш Л.Д. Химия протеолиза. В. кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1993. -с. 5-6.

89. Сарбаканова Ш.Т., Белозерский Я.Е., Заиров С.З. О наличии аспартильной протеиназы в семенах пшеницы. Выделение и характеристика фермента // Биохимия. -1988. -т. 53, № 5. 768-775.

90. Суринов Б.П. О методах определения активности протеолитических ферментов // Прикладная биохимия и микробиология. 1970. Т. 6, вып. 2. -с. 226-233.

91. Соболев A.M., Суворов В.И. О некоторых особенностях белков алейроновых зерен. В кн. «Растительные белки их биосинтез» АН СССР, М.: Наука, 1975. -с.126-136.

92. Соболев A.M. Запасание белка в семенах растений. М.: Наука, -1983. - с. 112.

93. Современная фитотерапия. Под ред. Веселина Петкова. София, Медицина и физкультура, 1988.-504с.

94. Степанов В.М. Протеиназы как катализаторы пептидного синтеза. В. кн.: Тезисы 3 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1993. -с. 16.

95. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции. -М.: Высшая школа, 1996. -с. 203-233.

96. Степанов В.М. Эволюция протеиназ. Аналогии и параллели. В.кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1997. -с.5.

97. Туманьян Н.Г., Бухтоярова З.Г., Вишнякова И.А. Активаторы и ингибиторы протеолитических ферментов семян риса // Прикладная биохимия и микробиология. -1986. -т. 22, №4. -с. 486-491.

98. Туманьян Н.Г., Проскуряков М.Т. Активность и свойства протеолитических ферментов в прорастающих семенах риса // физиология растений. 1989. -т.36, № 37. -с.520-525.

99. Флауменбаум Б.Л., Левицкий А.П., Беленькая И.Р. Кинетика инактивации соевого ингибитора трипсина при тепловой обработке // Укр. биохим. журнал. -1992. -вып.64, № 6. -с. 94-98.

100. Фурсов О.В., Перуанский Ю.В. Длительность хранения семян кукурузы и активность гидролитических ферментов // Вестник с/х наук Казахстана. -1974. № 12.-с. 103.

101. Хлуднев ДВ., Пивненко Н.В., Мосолов В.В. Ингибитор химотрипсина/субтилизина из эндосперма зерновок пшеницы // Биохимия. — 1992. т. 52, вып. 12.-е. 1874.

102. Хавкин Э.Е. Обмен веществ прорастающих семян. М.: Наука, -1982. -с.318.

103. Цыбина Т.А., Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е. Катионные ингибиторы протеианз из семян гречихи. В.кн.: Тезисы 4 симпозиума «Химия протеолитических ферментов. М., 1997. -с.88.

104. Чабан А.Н. Множественность форм ингибиторов сериновых протеиназ в семенах фасоли. Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М., 1983. 23 с.

105. Шутов А.Д. Протеолиз запасных белков в прорастающих семенах бобовых. Автореф. дисс. д. биол. наук. -М.: Ин-т биохимии им. А.Н. Баха АН СССР, 1983.-40 с.

106. Шутов А.Д., Белтей Н.К., Вайнтрауб И.А. Цистеиновая протеиназа из прорастающих семян пшеницы: частичная очистка и гидролиз клейковины // Биохимия. 1984. -т.49, № 7, -с. 1171 -1177.

107. Щербаков В.Г. Биохимия и товароведение масличного сырья. М. : Пищевая промышленность, 1969.- 456 с.

108. Щербаков В.Г. Технология получения растительных масел. 3-е изд., перераб. и доп. М. :Колос, 1992. - 207с.

109. Щербаков В.Г., Иваницкий С.Б., Лобанов В. Лабораторный практикум по биохимии итовароведению масличного сырья. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Колос, 1999.- 128 с.

110. Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биологгия. Пер. с англ. под ред. А.И. Аргапова и др. М., изд-во НИИ биомед. хим. РАМН, 1999/2000. -372с.

111. Ambe K.S., Sohonie К. Studies in trypsin inhibitors in indian food-stuffs: Part III.-Trypsin inhibitor in germination double-bean and field-bean their growing plants //Sci. Industr. Res. -1956. Vol.15, -p. 136-140.

112. Anderson R.L., Rackis J.J., Tallent W.H. Biologically active substuns in soy product. In.: Proc. Keystone Conf. Soy Protein and Human Nutr. - New York.: Academic Press. -1980. -p. 209-233

113. Anson M.L. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with gemoglobin // J. Gen. Physiol. -1938. -Vol. 22. №1/ -p. 79 -89.

114. Ashton F.M. Mobilization of storage protein of seeds // Annu. Rev. Plant Physiol. -1976. -Vol.27 -p. 95-117.

115. Baumgartner В., Chrispeels M. Partial characterisation of a protease inhibitor of mund beans // Plant Physiol. -1976. -Vol.58 -p. 1-6.

116. Birk Y. Purification and same properties of a highly active inhibitor of trypsin and @-chimotrypsin from soybeans // Biochem. Biopys. Acta. —1961. -Vol. 54. -p. 378.

117. Birk Y., Gertler A., Khalef S. A pure trypsin inhibitor from soy beans // Biochem. 1963. -Vol. 87. -p. 281.

118. Birk Y. Proteinase inhibitor frome plant sourse // Metods of enzymology. -N.Y. -L. Academic Press. -1976. -Vol. 45. -p. 695-736.

119. Birk Y. Trypsin inhibitor from Garden Bean (Phaseolus vulgaris). N.Y. - S.F.— L. - Academic Press. -1976. -Vol. 45. -p. 710-715.

120. Birk Y. Trypsin and chimotrypsin inhibitors from Graundnuts (Arachis hypogaea). N.Y. S.F -L. - Academic Press. -1976. -Vol. 45. -p. 716-722.

121. Birk Y. Proteinase inhibitors from potatoes. N.Y. S.F.-L. — Academic Press. — 1976.-Vol. 45.-p. 728-736.

122. Birk Y. Trypsin and chimotrypsin inhibitors from soybean. N.Y. — S.F.-L. — Academic Press. -1976. -Vol. 45. -p.700-707.

123. Chabala J., Reseday A., Walsh M. Inhibitor of trypsin and chimotrypsin in winged bean // Agr. and food chem. -1981. -Vol. 242. p. 4274.

124. Chen I., Mitchell H.L. Trypsin inhibitor in plants // Phytochemistry. -1973. — Vol. 12.-p. 327-330.

125. Doell H.B., Ebden C.J., Smith C.A. Trypsin inhibitor activity of conventional food wich are part of the British diet and some soy products // Plant foods for human nutrition. -1981. -Vol. 31. № 2 p. 139-150.

126. Dryjanski Marek, Otlewski Jacek, Wilusz Tadeusz Serin proteinase from Cucurbita ficifolia seeds // Acta biochim. Pol. -1990. -Vol. 37. № 1-p. 169-172.

127. Evers A.D., Redman D.G. The location of proteolytic enzymes in developing grains of whit // Chem. Ind. -1973. -Vol. 1, № 2. -p. 90-91.

128. Feeney R.E., Means G.E., Bigler J.C. Inhibitor of human trypsin, plasmin and trombin by naturally occurity inhibitors of proteolytic enzymes // Biol. Chem. -1969. -Vol. 244, № 8. -p. 1957 1960.

129. Graham J., Ryan C. Accumulation of a metall-carboxipeptidase inhibitors in leaves of wounded plant potato // Biochem. and Biophys. 1981. - Vol. 4. — p. 11641169.

130. Нага I., Matsubara H. Pumpkin (Cucurbita sp.) seed globulin // Plant and cell Physiol. -1980. -Vol. 21. -p. 219-232.

131. Harris N., Chrispeels M. Hystochemical and biochemical observations on storage protein metabolism and protein body autolysis in cotyledons of germinating Mund bean // Plant Physiol. -1975. -Vol.75, -p. 292-299.

132. Harvey B.M.R., Daks A. The hydrolysis of endosperm protein in Zea mays // Plant Physiol. -1974. Vol. 53, № 3. -p. 453-457.

133. Haynes R., Osuga D.T., Freeney R.E. Modification of aminogroups in inhibitors of proteolytic enzymes // Biochemistry. 1968. Vol.7-p. 541.

134. Ikenaka Т., Odani S., Koide T Chemical structure and inhibitory activity of soybean proteinase inhibitors. In. : Proc. 2nd Int. Res. Conf. «Proteinase inhibitjrs.»Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. -1974. -p. 326-330.

135. Knypl J., Radziwonowska-Jozwiak A. Electrophoregramm patterns of embryo axis and protein body of soybean seeds // Biochem. und Physiol. Pflauz. -1979. Bd. 174.-s. 641-645.

136. Kunitz M. Crystalline soybean trypsin inhibitor // Gen. Physiol. -1947. Vol. 30. p. 291-310.

137. Micola J., Suolinna E. Purification and properties of a trypsin inhibitor from barley // Europ. J. of Biochem. -1969. Vol. 9, № 4. -p. 555-560.

138. Mossor G., Skupin J., Romanowska B. Plant inhibitors of proteolytic enzymes // Nabrung. -1984. Vol. 28, № 1. -p. 93-112.

139. Mutambo F., Raman A., Theobalt A.E. Isolation and purification of trypsin inhibitors from pumpkin seeds (Cucurbita maxima) // J. Pharm. and Pharmacol. -1995. Vol. 43, Suppl. -p. 17.

140. Otlewski J., Polanowski A., Leluk J., Wilusz T. Trypsin inhibitors in summer squash (Cucurbita pepo) seeds. Isolation, purification and partial characterization of three inhibitors // Acta biochim. Pol. -1984. -Vol. 31. № 3- p. 267-278.

141. Otlewski J., Zhykyt Т., Krokoszynska I.,Wilusz T. Inhibition of serin proteinases by squash inhibitors // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1990. Vol. 371. № 7-p. 589-594.

142. Pearse G., Jihnson S., Ryan C.A. Purification and characterization from tabacco (Nicotiana Tabaccum) leaves of six smoll, wound-inducible proteinase isoinhibitors of the potato inhibitor family I // Plant Physiol. -1993. Vol. 102, № 2. -p. 639-644.

143. Pham T.C., Leluk J., Polanowski A., Wilusz T. Purification and characterization of trypsin inhibitors from Cucurbita pepo var patissona fruts // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1985. Vol. 366. № 10-p. 939-944.

144. Polanowski A. Inhibitors of trypsin from seeds of rye // Acta biochim. Pol. -1964. -Vol. 14. № 4-p. 390-395.

145. Richardson M. The proteinase inhibitors from plants and microorganisms // Am. Biol. Chem. Soc. -1974. -Vol. 51. -p. 159-169.t 151. Ryan C.A. Proteolytic enzymes and their inhibitors in plants // Ann.Rev. Plant

146. Physiol. -1973. Vol. 24.-p.l73-196.

147. Sakato S.K., Tanaka T.N/. Misawa M.M. Isolation and characterization of a proteinase inhibitor from Scopolia // EuropeanJ. Biochemistry. -1975. Vol. 55. -p. 211-215.

148. Shain Y., Maiyer A.M. Proteolytic enzymes and Endogenous Trypsin Inhibitor in Germination Lettuce Seeds // Physiol. Plant-1965. Vol. 18.-p.853- 589.

149. Shinbu S., Emi s., Tsuneo W., Tadashi F. Isolation and characterization of a proteinase inhibitor from spinash leaves // Phytochemistry. -1995. -Vol. 24. n. 3 -p. 419-423.147.