Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеолиз и накопление проламинов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеолиз и накопление проламинов"

--т4

у ; 1 :

{

ОРДЕНОВ ЛЕНИНА И ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ии. А. В. ПАЛЛАДИНА

На правах рукописи ВОВЧУК СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

УДК 581.19

ПРОТЕОЛИЗ И НАКОПЛЕНИЕ ПРОЛАМИНОВ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Киев — 1988

Работа выполнена в лаборатории биохимии растений Всесоюзного ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени селекционно-генетического института ВАСХНИЛ.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Е. Г. СУДЬИ НА; доктор биологических наук, профессор В. В. МОСОЛОВ; . ?

едшцая "о'р'г а1 ш з а ц и я"В се <мктт й ' н&ДФ^-йсслёЖйатель-ский институт растениеводсма им. Н. И. Вавилова ВАгСХНИЛ.

Чяьа^хтз г. в / ' ча $го сс

Защита состоится'

на заседании специализированного совета Д 016.07.01 при Институте биохимии им. А. В. Палладина АН УССР по адресу: 252030, Киев, 30, ул. Леонтовича, 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «

/О

198

J

Ученый секретарь специализированного совета

КИРСЕНКО О. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Растения, в частности злаки, являются основными источниками продовольственного и кормового белка, который в рационе человека составляет от одной трети до половины потребляемого количества, э в рационе сельскохозяйственных животных - более двух третей (Кретович, Токарева, .1978; Рядчиков, 1978). Ежегодно дефицит кормового белка в нашей стране составляет свыше 7 ыда. тонн, что при условии недостаточной биологической ценносги злаковых белков из-за низкого содержания лизина приводит к значительному перерасходу зерна, измеряемому десятками миллионов тонн (Левицкий, 1987). В связи с этим проблема увеличения количества и повышения качества растительного белка является одной из основных задач науки и практики (Созинов, 1985).

Запасные белки злаков, проламины, составляй! до всех белков злаковых культур. Эти белки значительно отличаются по своим физико-химическим свойствам от других известных белков и во многом определяют общее количество белка в зерне в целом, его полноценность и переваримость, технологические свойства муки (Кокарев, 1980). Проламины являются естественными субстратами для протеолитических ферментов растительного и животного происхождения, поэтому изучение основных закономерностей их ферментативного гидролиза представляет весомненный теоретический и практический интерес.

Факт наличия протеолитических ферментов в семенах злаков известен сравнительно давно (Мосолов, 1971; Козышна, 1978; Левицкий, 1982), однако их биохимические свойства и физиологическая роль изучены мало. Вместе с тек процесс биосинтеза и накопления белка, в частности проламинов, в созревающей зерновке, формирование питательных и технологических свойств муки протекают на фоне изменяющейся активности протеиназ и их ингибиторов. В связи с этим исследование диалектической взаимосвязи между этими процессами и изучение роли прохеолиза в определении количества и качества белка в зерне являются важными задачами, имеющими как теоретическое, так и практическое значение.

цель и задачи исследований. Целью работы явилось определение взаимосвязи между процессами протеолиза проламинов и количественно-качественными показателями этих белков.

В работе решались следующие основные задача:

1. Выделить и изучить свойства лротеолитичесиих ферментов и ингибиторов протеиназ из зерна злаков.

2. Исследовать связь системы протеолиза с накоплением белка в зерне и на этой основе сформулировать новую концепцию -высокобелковое™ злаков.

3. Исследовать связь системы протеолиза с накоплением высо-колизиновых белков и определить новые теоретические и методические подходы к решению проблемы высоколизиновости злаков.

Ь. Изучить взаимосвязь между лротеолизом и биохимическими свойствами клейковины сортов озимой мягкой пшеницы, различающихся по хлебопекарным свойствам.

5. Сравнить методы получения препаратов проламинов.

Научная новизна работы. Выделены в очищенном состоянии и изучены биохимические свойства ряда растительных протеолитичес-ких ферментов и ингибиторов протеиназ. В созревающей зерновке паеницы обнаружена низкомолекулярная протеаза, растопляющая про-ламины. В хроматине и эндосперме злаков обнаружена пуотеиназа, расщепляющая гистоны и выявлен ее белковый ингибитор. Впервые обоснована научная концепция участия системы протеолиза в регуляции накопления запасных белков злаков. Установлена высокая корреляция между содержанием белка в зерне озимой пшеницы и уровнем ингибиторов. Обосновано участие системы протеолиза в определении такого свойства зерна ячменя как высоколизиновостъ. Показано, что хлебопекарные качества озимой пшеницы в значительной степени обусловлены устойчивостью к протеояизу и -фракции проламинов ( з-бедных глиадинов), зависящей от ее аминокислотного состава. Показана связь уровня ингибиторов в зерне пшеницы с устойчивостью к фитоаэболеваниям.

Практическая значимость работы. Предложен способ отбора высокобелковых генотипов озимой пшеницы по уровню ингибитора трипсина в зерне. Разработана методика выявления лиз-гена из Хайпро-ли в гибридах ячменя по соотношению ингибиторов трипсина и химо-трилсина. Разработан ферментативный метод определения переваримости зерновых белков, пригодный для определения кормовых достоинств зерна. Рекомендованы эффективные методы получения чистых препаратов проламинов. Разработан или усовершенствован ряд методов определения и выделения протеиназ и их ингибиторов из вориа злаков.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных (I глава), экспериментальной части (5 глав), заключения, выводов, списка литературы (311 источников) и приложения. Работа изложена на 302 страницах машинописного текста, содержит 60 рисунков и 78 таблиц.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 1У и У Всесоюзных биохимических съездах (Ленинград, 1979 ; Киев, 1986), на Всесоюзном симпозиуме "Азотный и белковый обмен растений" (Тбилиси, 1978), на П Всесоюзном, симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Углич, 1979), на П Всесоюзном совещании по производству и использованию растительного белка (Краснодар, 1981), на 1У и У Республиканских биохимических съездах (Днепропетровск, 1982; Ивано-Франковск, 1987), на франко-советском симпозиуме по биохимии и генетике растительных белков (Клерцон-Феррэи, Франция, 198£), на Международной научной конференции по теоретическим и прикладным аспектам биохимии и селекции злаков (Прага, 1986), на 4-оц Европейском конгрессе по биотехнологии (Амстердам, 1987).

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ \

Объектом исследований явились белки зерна различной степени зрелости озимой мягкой пшеницы и ярового ячменя, заращенного на опытных полях института или в оранжереях фитотрона.

Пролэмины из зерна выделяли методами экстракции пропиловым ( Shewry et al., 1980} Вуегз et al., 1983 ) И ЭТИЛОВЫМ (Baxter, 1967i shewry et al., 1981 ) спиртом с последующим осаждением белков ацетоном (Кизель, 1934) или солевыми растворами (Kasania, I960). В ряде случаев проводили обезжиривание муки (Прищеп, Губарева, 1974; Baxter, 197б( Shewry et al., 1980; Kaaarda,.1980) и предварительную .экстракцию альбуминов и глобулинов (Кизель, 1934; Гэврилюк и др., 1973; Byers et al., 1983).

Общий азот определяли методом Кьельдаля с последующий определением аммиака титриметрически в аппаратах Сереньевэ, либо фенолгипохлоритпыы методом на аппарате "Контифла" (ВНР). Концентрацию белка определяли биуретовым методом (Левицкий, 1979), методом Лоури, а в хромагогрзфических фракциях - по поглощению при 280 нм.

Аминокислотный анализ белков проводили на автоматических анализаторах "Хромаспек" ( Rank Hilger, Англия) и Хитачи-835

(Япония). Содержание триптофана определяли колориметрическим методом с пара-диметилашнобензальдегидом (Ермаков, 1972), содержание ыетионина - штропруссидным методом после гидролиза белков проназой (Зелинский, 1979), дистеин определяли на анализаторе аминокислот после предварительного окисления белков над-муравьинной кислотой и последующего их гидролиза 6М HCI (моохг, 1963). Лизин определяли энзиматическим методом с использованием

1 -лизиндекарбоксилазы на автоматическом анализаторе фирмы "Техникон" (CÍA). N -концевую аминокислотную последовательность белков определяли с помощью газофазного белкового анализатора "Gas-Phase Protein Sequencer 470А" (Арр. Bioayat., USA ) В Институте общей генетики АН СССР.

Электрофорез белков проводили в 10%, 15% и 17% полиакрила-мидных гелях, содержащих 0,1$ додецилсульфата натрия при рН 8,3 по методу Laemmii а также в 8,5$ полиакриламидном геле в элю-микий-лактагном буфере рН 3,1 (Tkachuk, Metiiah, 1980). Компонентный состав ингибиторов трипсина исследовали с помощью изо-электрофокусирования на приборе Muitiphor II (lkb, Швеция) в пластинах 6%-ного полиакриламидного геля в интервале рН 5-II с доследующей идентификацией ингибиторов методом желатиновых реплик (Ал.Конарев, 1986). Препаративное изозлектрофокусирование белков проводили на колонке 1КВ-8Ю1 (НО мл) в течение 24- ч при 1500 V и 3 w. Градиент рН 3,5-10 создавали с помощью 1% раствора амфолинов.

Гель-фильтрацию проводили на сефздексах Г-25, Г-50, Г-75 и Г-100. Ионообменную хроматографию осуществляли на ионообменни-ках КМ- и ДЭАЭ-целлюлозах. При аффинной хроматографии в качестве лиганда использовали клейковину, очищенные препараты трипсина, химотрипсина и ингибитора трипсина, ковалентно связанные с се-фарозой 4£.

Питательные качества белков определяли биологическим методом с использованием личинок малого мучного хрущака Uriboiium confusum и оценивали по привесу 10 личинок за одии сутки опыта (Левйцкий и др., 1983). Переваримость белков оценивали с помощью пронвзы (Левицкий, Вовчук, 1979) и препарата панкреатина из поджелудочной железы свиньи (Левицкий и др.,.1985).

При исследовании протеолиза проламинов готовили 2% растворы вапасшга белков не 0,2М пиридиновом буфере рН 7,0 (для трипсина,

химогрипсина и эластазы) или 0,Ш глицин-ацетатном буфере рН 4,5 (для папзина и прогеиназы пшеница). Использовали 0,02^5 растворы трипсина ("Спофа", ЧССР), 0,01% растворы -химогрип-сина ("Реанэл", ВНР), 0,1% раствор эластэзы ("Серва", ФРГ), 0,1$ раствор палаинэ ("Мерк", ФРГ) и 0,5^ раствор прогеиназы, выделенной иа созревающего зерна пшеницы. О степени гидролиза белков судили по количеству неосавдаемых 10% ТХУ продуктов про-геолиза, определяемых с помощью реактива Фолина при 750 нм, и выражали в нзномодях тирозина, образуемого за I мин инкубации, а также с помощью методов гель-фильтрации на сефадексе Г-?5 и Г-100 и электрофореза в 15-17% ПААГе, содержащем додецилсульфат натрия или в 8,5$ ПААГе при рН ЗД.

Активность протеолитических ферментов исследовали в ультратермостате по гидролизу при +30°£0,0г°с 235 казеина (рН 6,0), 2$ гемоглобина (рй 3,5), 0,5-2^ клейковины и глиадина (рН 4,5), 1% протамина или гистоиов (рН 5,0) и Н-л -бензоил- 1-аргинин-пара-" -нйтроанилиду (БАПНА "Серва", ФРГ) при рН 9,0-10,0 (Вовчук, 1979). Активность "связанных" протеиназ определяли в лиофильно высушенной остатке, полученной после солевой экстракции муки, к которому прибавляли раствор субстрата и полученную смесь инкубировали при постоянном встряхивании. Как и з случае со "свободными" (т.е. легко экстрагируемыми) протеиназаыи, реакцию останавливали 107» ТХУ.

Активность протеолитических ферментов выражали в ыилли-, ыикро- или нэнокаталзх на I кг' муки или на I зерно. За I катал принимали количество фермента, катализирующее образование I моля тирозина (при определении по гемоглобину, казеицу или запасным белкам), I моля аргинина (для протамина или гистонов) и расщепление I ыоля субстрата (при определении по БАПНА) за I с инкубации. удельную активность ферментов рассчитывали на I кг белка.

Содержание ингибиторов протеиназ определяли по торможению протеолитической активности трипсина, хдаотрипсина и папаша, измеряемой казеиновым'методом (Левицкий, 1979). Количество ингибиторов выражали г граммах ицактивировэнного фермента в пересчете на I кг ауки или I зерно-(ингибиторная активность) и на I кг белка (удельная ингибиторная активность).

Биосинтез белка исследовали по включению, меченного 353_ яетионина или ^С-глицияа в белковые фракции. Радиоактивность белковых и небелковых фракций определяли на сцингилляционнон

6.

счетчике Ыарк-З (Нидерланды) с использованием жидкого сцинтил-. ляторэ на толуоловой основе с добавлением тритона Х-100.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выделение и свойства протеолитических ферментов и ингибиторов лротеиназ из зерна злаков. В покоящейся зерне пшеницы и ячменя содержатся протеиназы, способные гидролизовать многие белковые и синтетические субсграгы и проявляющие активность в кислой (рН 3,5-4,5), слабо кислой (рН 5,0-6,0) и щелочной (рН 9,5-10,0) средах. Протеолитические фермент обнаруживаются во всех анатомических частях зерновки, однако основное их количество (до 80-90%) локализовано л эндосперме. В зерновке ячменя лротеииазы содержатся также в оболочках.

Эти ферменты представлены основании типами протеиназ: тио-ловыми, сериновыыи, карбоксильными, металлосодержащими (табл.1).

Таблица I

Влияние ингибиторов на протеолитические ферменты

созревавшего зерна пшеницы ингибирования)

1ШШ :фенилыетил- : Пепстэтчн А :1,10-фенан-(I ыМ) :сульфонилфто-: (I мкг/мл) :тролин _:рид (I ыЫ; :_:(1 Ш)

активность во

казеи- :г.емо- :казеи-:гемо- :каэеи-:гемо- :казеичгемо-ну, :глоби- :ну :глоби-:ну, :глоби-:вд, :глоби-

:ну, : :ну, : :ну, : :ну, рН 6,0 : рН 3,5: рН 6ДрН 3,5:рН 6,0:рН'3,5:рН6,0:рН 3,5

? 93,4 59,5 81,8 61,3 68,0 28,4 0,0 0,0

14 86,2 45,3 71,4 33,7 - 24,0 25,1 0,0

28 100 60,3 - 42,3 60,3 68,7 - 0,0

полная зрелость 100 70,8 39,7 62,2 56,3 _ 25,6 0,0

5 дней прорастания 99,0 78,3 14,3 61,5 53,1 31,9 0,0 0,0

Оценивая действие различных ингибиторов на протеазы зерна, расщепляющие казеин, можно сделать вывод, что все-протеолитические фермент содержат тиоловые группы (необязательно в активной центра!), взаимодействие которых с ШШБ приводит к инакти-

Дни после цветения

вации.вссх типов протеияаз. Более интересна, с нашей точки зрения, динамика активности сериновых протеиназ (ингибируемых фенил-нетилсульфонилфторидом): наиболее высок их удельный вес в начальных фазах развития зерновки, а затем по мере созревания существенно снижается, что можно объяснить не только уменьшением их абсолютного количества, но и связыванием с белковыми ингибиторами.

При созревании изменяется также количество множественных форм ферментов. С помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе было показано, что на 5-7 день после цветения в пшеничной зерновке содержится 3 формы казеин-, проламин- и гемоглобингидролизующих протеиназ, 2 формы БАПНАзы и I форма лротаминрасщеплявдего фер--мента. К периоду полкой зрелости в эндосперме обнаруживается по одной форме казеин- и продамингидролизувщих ферментов, БАПНАзы и по 2 формы гемоглобин- и прогаминрасщепляющих протеиназ.

Одна из протеиназ, гидролизующих клейковину, была выделена из зерна пшеницы, полученного на 5-7 день после цветения. Очистка фермента проведена с помощью гель-фильтрации на сефадекое Г-50, аффинной хроматографии на клейковинэ-сефзрозе, препаративного изоэлектрофокусироваиия и повторной гель-фильтрации на се-фадексе Г-100 (рис.Г). Суммарные данные по очистке протеиназы представлены в таблице 2.

Оптимум рН фермента равен 4,4-4,6, молекулярная масса по данным гель-фильтрации на сефадекс8 Г-100 находится в области П400-12100 Д, р1 - 4,45. Активность протеиназы возрастает в присутствии 2-меркаптоэтанола, снижается под действием ПХМБ, однако не изменяется в присутствии йодацетамида.

Важно отметить, что выделенная нами протеинаэа способна ин-гибироваться (хотя и не очень сильно) сериновыми ингибиторами белковой природы, что ыожет указывать на возможность регуляции ее активности с помощью эндогенных ингибиторов, накапливающихся при созревании зерновки.

Наряду с клейковиной, фермент хорошо гидролизует гемоглобин, казеин и практически не действует на синтетический субстрат БАПНА. Под действием данной протеиназы происходит снижение количества высокомолекулярной фракции клейковины и увеличизазтся со-дернсание среднемолекулярных продуктов, а также образуется'не- • большое количество свободных аминокислот (рис.2).

Предста?'!телем сериновых протеиназ эндосперма зерна шпени-

А

Б

В

40 .80 120 номера.фракций

40 60 30 номера фракций

40 50 60 номера фракций

.Рис.1. Выделение протеиназы из созревающего зерна пшеницы. А - гель-

филырация на сефэдексе Г-50; Б - аффинная хроматография на клейко-вина-сефарозе; В - изоэлектрофокусирование в амфолинах рН 3,5-5,0. I - белок; 2 - протеиваза; 3 - градиент рН.

Таблица 2

Выделение лротеиназы из созревающего (5-7 день после цветения) зерна пшеницы

Этапы очистки Юбщий •'белок : Актива : ность* Сдельная ¡активюсть КлЕ750/ыг> Выход, % :Козффи- :циент ^чистки

Исходный экстракт 525 30,0 0,057 100 I

Гель-фильтрация на сефадексе г-50 144,5 26,3 0,182 87,7 3,2

Клейковина-сефарозз 6,3 6,5 1,038 21,.7 18,2

Изозлектройокуси-ровка (рН 3,5-5,0) 0,1(0 1,5 3,750 5,0 65,8

Сефадекс Г-100 0,31 1,3 4,095 4,3 71,8

Активность определяли по гидролизу О,^клейковины (рН 4,5) и выражали в величинах прироста экстинкцни (при длине волны 750 на) за 20 часов инкубации. Удельную активность рассчитывали на I ыг белка.

[¡родин, мг 3,0

40 ДО Номера фракций

Рис.2. Гель-Фильтрация на сефадексз Г-50 исходной клейковины (А) а клейковины, подвергнутой гидролззу про-геиназойу выдблеввс.1 из созревающего зерна даени-цы (Б). I - белок; 2 - пролш.

ци и ячменя является протаиинрасщепляющий фермент, описанный и выделенный ваий впервые. Данная прохеиназа, в отличие ох БАПНАгы, гидролизует преимущественно протамиы и менее специфична по отношению к БАПНА (таСл.З). .

Таблица 3

Субстратная специфичность протеолитических ферментов, выделенных из зерна ячменя с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе

Ферменты • : казеин •протамин : гйсгоны БАПНА

; мк-кат ;мкат : мкат мк-кат

: кг белка * • :кг белка | кг белка кг белка

Исходный экстракт зерна ячменя 14,г 5,0 0,031 21,2

БАПНАза 98,3 30,5 - 566,8

Протаминрасщепля-ющая протеиназа 143,4 113,4 27,3 23,8

Данные ферменты отличаются друг от друга также по своей чувствительности к действию ингибиторов протеинаа. Активность • БАПНАгы практически не изменяется э присутствии белковых ингибиторов трипсина, в то время как лрсггаинрэсщеплявдая лротеиназа в большей или меньшей степени чувствительна к этим ингибиторам (а том числе и к ингибитору трипсина, выделенному из верна ячменя) (табл.4).

Таблица 4

Влияние ингибиторов на активность протеолитических ферментов зерна ячменя ингибирования)

Активаторы, ингибиторы 1 Концент- I рация • * ]Тр*шсин * • « . Протамин-. расщепля-: ющая про: теиназа : БАПНАза •

Соевый ингибитор трипсина 0,5 мг/ыя -100 -55 +5

Контрикал - 0,5 мг/мл -96 -33 -12

Овомукоид 0,5 ыг/ыд -100 -31 • '42

Ингибитор трипсина иа ячменя 0,1 мг/мл -97 ' .-55 • +18 '

и*

Аналогичная протеиназа, гидролизующая протаиин, содержится также в ядрах клеток проростков ячменя. Основные количества данного фермента локализованы в дезоксирибонуклеопротеиднои комплексе во фракции негистоновых белков. Ядерная протеинага имеет оптимум рН 5,5, хорошо гидролизует протамин, гистонй и проявляет низкую активность по отношении к казеину- и гемоглобину. Наряду о ингибиторами трипсина сои и ячменя, активно.сть ядерных ферментов тормозится цисгеином и ЭДТА, что указывает на присутствие во фракции негистоновых белков, также металлозави-сиыых протеиназ (табл.5).

Таблица 5

Влияние ингибиторов нэ активность ядерных протеиназ, ингибирования)я

Ингибиторы, активаторы

: Концентрация : Трипсин : Ядерные ; . .протеиназа

СИТ

Ингибитор трипсина из ячменя

дистеии

ЭДТА

0,5 мг/нл

0,1 мг/мл 5 мЫ 5 иШ

-100

-97,1 +19,8 +20,1

-47,4

-67,7 -87,7 -68,8

8 (+) - эктивация;{-) - ингибировдние.

Таким образом, в зерновке пшеницы а ячменя, а такке в ядрах клеток проростков содержатся различные типы эндопептидаз и экзопептвдазы. В настоящее время известны различные способы регуляции активности этих ферментов,, однако одним из наиболее специфичных является инактивация протеиназ белковыми ингибиторами (Мосолов, 1983).

Данные белки содержатся во всех анатомических частях зерновки и способны проявлять ингибирующэе действие как по отношении к эк-зогепша, так и эндогенным сериновим а тиоловьи протеиназам.

С поыощьв изоэлектрофокусировання и ионообменной хроматографии на КМ-цоллюлозе было показано, что в зерновке пшеницы и ячиеня содержится несколько'фори ингибиторов тряпсина (рис.3). Наряду с трипсином данные ингибиторы обладают активностьп по отношению к сериновыи протеиназаи зерна ячменя (табл.6). Эти трия-синоподобиые ферменты^ взаимодействуют тэкяе с ингибиторами трипсина, выделанными из зерна пшеницы и ячменя и ковалеятно связан-

—J—//-1

7ЯП " i+CO

(тЧ

Рис.3. Хроматография на КМ-целлюлозе ингибиторов трипсина зерна ячменя. Элюция аммоний-ацетатным буферов рН 6,3. Обозначения: белок f—); I, П, Ш - ингибиторы трипсина; ингибитор хииотриггсина (*—* ): ингибиторы протаминрасщеплшощей протеиназы •(««»).

ними о сефарозой (рис.4).

Таблица 6

Активность ингибиторов трипсина, выделенных из зерна ячменя на КМ-целлюлозе, по отношению к протеиназам созревающего зерна ячменя ингибирования)

Ингибиторы трипсина Активность по -

5 казеину : прот амину : БАПНА

Ингибитор I Ингибитор П Ингибитор Ш 64.5 55,7 71.6 100,0 95,1 92,4 23.2 23,9 12.3

В260

Рис.4. Аффинная хроматография на ингибитор

трипсин -сефарозе протеиназ созревающего зерна пшевиды»

I - белок; 2 - протеиназз, определяемая по гидролизу казеина.

Ингибиторы протеиназ являются белками альбумин-глобулиновой природы и находятся в зерновке как в свободном, так и в агрегированном с проламинаыи состоянии. Б частности, способность ингибиторов трипсина образовывать комплексы с запасными белками была использована нами для идентификации белков неглиадиновой природы во фракции лроламинов.

Для зерна лкеницы и ячменя отмечаются значительные сортовые различия в содержании ингибиторов протеиназ. Высокий уровень ингибиторов трипсина и хшотрипсина отмечается для устойчивых к 8аболэваниям сортов озимой мягкой пшеницы, в частности, к мучнистой росе. При этом было установлено, что содержание данных ингибиторов в зерне устойчивых сортов в 2 раза больше (0,45+0,05) по сравнению с аналогичным показателем умеренно устойчивых и восприимчивых сортов (0,20+0,06). При заражении растений патогеном отмечается увеличение содержания ингибиторов протеиназ в зерне растений. Причем наиболее выраженная индукция ингибиторов отмечается для умеренно устойчивых сортов. Восприимчивый сорта содержат низкие количества ингибиторов как в норме, так и при заражении растений.

Ингибиторы трипсина были обнаружены также в негистоновых белках ядер клеток проростков ячменя. Ядерные лротеиназы и ингибиторы выполняют важные регуляторные функции, связанные с активацией и репрессией генома. Подтверждением этого вывода являются данные по исследованию влияния протеиназ и их ингибиторов на выраженность внутриядерного биосинтеза белка. При этой установлено, что обработка ядер трипсином достоверно повышает в 1,5 раза включение ^^С-1-лейцина в ядерные белки, а ингибитор трипсина конт-рикал на 60% снижает скорость биосинтеза белка.

П. Взаимосвязь между активностью пштеолитической системы и содержанием белка и лизина в зерне злаков. Биосинтез и накопление проламинов в созревающей зерновке протекает на фоне изменения содержания протеолитических ферментов и их ингибиторов. Для выяснения взаимосвязи между этими процессами нами изучена динамика накопления запасных белков, скорость их биосинтеза, а также активность протеиназ и их ингибиторов на различных этапах созревания зерновки.

С помощью электрофореза и гель-фильтрации было установлено, что пролаиины начинают накапливаться в созревающей зерновке на

10-15 день после цветения. Аминокислотный состав этих белков стабилизируется к 20-28 дню, однако окончательный белковый спектр формируется к периоду полной зрелости зерновки. В первую очередь это относится к глютелинам и и -глиадинам. В первые две недели в зерновке преобладают олигопептиды и свободные аминокислоты, на долю которых приходится 60-90% всех азотсодержащих веществ. В зрелой зерне основное количество белка представлено высоко-, средне- и низкоыолекулярными фракциями, а общее количество свободных аминокислот составляет около 5% (рис.5).

ы «о ео аа га по

Рис.5. Гель-фильтрация на сефэдексе Г-50 .белков различной степени зрелости зерна пшеницы. А - 7-дневное зерно; Б - 14-дневное зерно; В - зерно полной спелости. Элюция 0,1М глицин-НС! буфером рН 3,0. I - белок; 2 - пролип.

Накопление запасных белков в развивающейся зерновке происходит равнойерно вплоть до полной зрелости. Однако скорость биосинтеза проламинов в различные периоды созревания весьма значительно иэиеняется. Так, скорость биосинтеза глиадинов возрастает в 3-4 раза с I по П неделю после цветения, а затеи падает более чей в 2 раза к ill неделе (рис.б). Причиной такого несоответствия ыевду характером изменения биосинтеза и содержанием глиадинов является, по всей видимости, изменение выраженности внутриклеточного протеолиза, на величину которого указывает про-теолитический индекс, определяемый по соотношению процентной концентрации аминокислот и белка. Аналогичная закономерность была получена по отношению к глвтенинаы.

х10^мкмашь/г £

Рис.6. Содержание глиадинов (А) и глзотенинов (Б), скорость их биосинтеза и протеолитический индекс при созревании зерновки озимой мягкой пшеницы. I- содержание запасных белков; 2- скорость биосинтеза; 3- протеолитаческий индекс.

Для выяснения возможных причин снижения протеолиза нами была изучена активность протеолитических ферментов в развивающейся зерновке. При этом было установлено, что активность ферментов, определяемых по гидролизу гемоглобина, увеличивается в процессе созревания, а содержание протеиназ, определяемых по расщеплению казеина и клейковины, - снижается (рис.7). Повышение активности гемоглобинрасщепляюцих ферментов сопровождается преимущественным увеличением содержания "связанных" (неэкстраги-руемых) форм в созревающей зерновке. Так, если на ранних этапах

пкат/зврно 160

■ь

14 21 28 45

пкат/зврно 2« .

20

обдая активность

"свободная" активность

12

1 1

1

1

И

7 14 21 28 45 дни после цветения

1

4-

1+

Рис.7. Активность протеиназ в эндосперме созревающей зерновки пшеницы.

А - активность по гемоглобину (рН 3,5); Б - активность по казеину (рН 6,0).

развития (7 день после цветения) в связанном состоянии находится около 20% этих ферментов, то к периоду полной зрелости на долю "связанных" протеиназ приходится 75-80$ от общей гемоглобин-расщепляющей активности. Наряду с этим протеиназы, расщепляющие казеин, на всем протяжении созревания представлены на 60-70$ в виде "свободных" ферментов. Д.пя протеиназ, гидролизующих клейковину , также соотношение меаду "свободными" и "связанными" формами остается постоянным и составляет для легко экстрагируемых форм 40-60% их общего количества.

Перевод ферментов из свободного состояния в связанное следует рассматривать как один из механизмов регуляции их активности. По всей видимости, образование "связанных" форм протеиназ приводит к снижению метаболической активности и препятствует внутриклеточному лротеолизу белков. Аналогичная закономерность была установлена и для амилаз (Фурсов и др., 1967), что указывает на универсальность данного способа регуляции активности различных классов гидролаз.

Для выяснения возможной роли ингибиторов протеиназ в регуляции активности этих ферментов значительный интерес представляют данные по изменению содержания этих белков в развивающейся зерновке. Накопление ингибиторов протеиназ начинается на 12-14 день' после цветения и достигает максимальной величины к периоду полной зрелости. Причем эта закономерность проявляется как по отношению к ингибиторам сериновых, так и тиоловых протеиназ (рис.8). Несмотря на одинаковый характер накопления ингибиторов при согревании,по абсолютным величинам содержания данных белков . имеются определенные сортовые различия. Так, наиболее высокий уровень ингибиторов трипсина обнаруживается в зерне высокобелковых сортов пшеницы, а ингибиторов химотрипсина - в зерне высоко-лизинового и высокобелкового мутанта Хайпроли.

Проведенный анализ на гибридах пшеницы показал, что количество ингибиторов трипсина генетически связано с белковостью зерна и его содержание находится в прямой корреляционной зависимости от уровня белка (г = +0,65- +0,84 при 2). Эти результаты позволили нам предложить использование показателя ингибиторов трипсина для отбора высокобелковых генотипов озимой мягкой пшеницы. Наряду с более простор. и экономичной процедурой определения ингибиторов по сравнению с методом Кьельдаля, преимущест-

Рис.8. Динамика накопления ингибиторов сериновых и тиоловых лротеиназ в развивающейся зерновке пшеницы и ячменя. 1-3 ингибиторы трипсина (ИТ) зерна пшеницы (сорта - Одесская зернокормовая, Питикул, Безостая I - соответственно); 4-5 -ингибиторы химотрипсина зерна ячменя (мутант Хэйпроли, сорт Черноморец - соответственно); б - ингибиторы пзпаина зерна пиеницы (среднее по б сортам).

вом этого метода является высокий коэффициент наследуемости ингибиторов трипсина (Н2 = 0,902-0,952) по сравнению с величиной наследуемости белка (Н2 = 0,150-0,450).

Наряду с высоким содержанием ингибиторов химотрипсина, вы-соколизиновый мутант ячменя Хэйпроли характеризуется самым низким уровнем накопления ингибиторов трипсина. В связи о этим по

показателю ингибиторов трипсина и химотрипсина, а также по соотношению между ними было предложено выявлять гибридные формы, содержащие лиз-ген из Хайпроли (табл.7). В зерне других высоко-лизиновых мутантов и обычных сортов ярового ячменя это соотношение почти на порядок ниже. Коэффициент корреляции между уровнем лизина и содержанием ингибитора трипсина равен -0,77, для ингибитора химотрипсина +0,83, а для соотношения ингибиторов +0,88.

Повышенное накопление белка в зерновке происходит не только на фоне высокого содержания ингибиторов протеиназ, но и при более низком уровне протеиназ. У сортов с высоким содержанием белка (13,4+0,24) прослеживается более низкая активность протеиназ, расщепляющих казеин и протамин (93+12 и 110+28 соответственно) по сравнению с активностью ферментов в зерне низкобелковых (10,9% +0,10) сортов (118+10 и 140+18).

Таблица 7

Содержание лизина, ингибитора химотрипсина и ингибитора трипсина в зерне ячменя

Сорт, мутант

Лизин в белке,

Ингибитор, г/кг

химотрип-- трипсина сина

Ихтр* К " Йтр

Хайпроли 4,26 1,6 0,4 4,00

С1-4362 4,10 0,9 1,6 0,56

М-1508 4,18 0,9 1,4 0,64

Л-76 4,09 0,5 1,6 0,31

Одесский 86 3,35 0,2 1,8 0,11

Нутане 306 3,73 0,2 1,4 0,14

Оксамит 3,09 0,1 1,2 0,08

Черноморец 3,30 0,3 1,5 0,20

й Ихтр - ингибитор химотрипсина; Итр - ингибитор трипсина

Таким образом, функциональная взаимосвязь между активностью системы протеолиза и содержанием пролаыинов прослеживается на всех этапах развития зерновки. Высокая активность протеиназ и отсутствие их ингибиторов в первые 10-15 дней после цветения препятствуют накоплению запасных белков. Только при снижении активности протеолитических ферментов за счет их иммобилизации или ингибирования белками-ингибиторами создаются необходимые условия

для отложения в запас проланинов. На более поздних этапах созревания зерновки также прослеживается взаимосвязь между высоким уровнем белка и ингибиторов протеиназ, с одной стороны, и низкой активностью этих ферментов - с другой.

1. Протеолиз проламинов и качество клейковины. Молекулярная конформация проламинов, характер межмолекулярных взаимодействий и особенности протеолиэа запасных белков оказывают решающее значение а формировании качества клейковины. Исследования, проведенные на большом материале, показывают, что различные по силе сорта озимой мягкой пшеницы значительно отличаются друг от друга как по активности протеолитических ферментов зерна, так и по физико-химическим свойствам проламинов. Этими.различиями определяется степень протеолиэа запасных белков, которая в свою очередь является основным фактором регуляции качества клейковины и хлебопекарных свойств в целом.

Зрелое зерно сортов пшеницы с низкими хлебопекарными свойствами характеризуется в 1,5 раза (р = 0,01) более высокой активностью протеиназ, определяемых по БАПНА, а клейковина этих сортов значительно легче подвергается прогеолизу (табл.8).

Таблица 8

Протеолиз клейковины озимой мягкой пшеница

Показатели : Слабая : пшеница : Сильная пшеница

Седиментация, мл 61+5 85+2 (р = 0,004)

Растворимость в ЗМ мочевине, % 46+2 36+3 (р = 0,04)

Протеолиз в Присутствии ЗМ мочевины (наноыоли тирозина/мин):

I. -химотрипсином 1,37+0,09 0,91+0,05 (р в 0,004)

2. трипсином 0,93+0,03 0,6610,04 (р =. 0,002)

3. эластазой 1,54+0,02 1,31+0,02 (р = 0,001)

Различия в способности проламинов гидролизоваться протеина-зами в наибольшей мере проявляются в присутствии ЗМ мочевины и тесно коррелируют с общепризнанным показателем муки, таким как седиментация. Коэффициент корреляции между показателем седиментации и протеолизоы клейковины химотрипсином равен -0,89 (р =0,001), трипсином - -0,68 (р = 0,05) и эластазой - -0,80 (р = 0,01). Высокая корреляционная зависимость (г= +0,75- +0,82) была установ-

лена также между лротеолизом и таким технологическим показателем клейковины как сопротивление деформирующей нагрузке сжатия, определяемом на приборе ИДК-1.

Величина протеолиэа зависит как от количественного содержания в клейковине отдельных фракций проламинов, так и от физико-химических свойств основных компонентов этих белков. Исследования, проведенные на выделенной из зерна различной степени зрелости клейковине, показали, 470 протеиназы лучше всего гидроли-зуют белки зерна полной зрелости, В таблице 9 представлены данные по действию протеиназы, выделенной из созревающего зерна пшеницы, на белки клейковины. Аналогичные результаты были получены по отношению к трипсину, химотрилсину и палаину. ,

Таблица 9

Действие эндогенной протеиназы на клейковину созревающего зерна пшеницы (наноиоли тирозина/мин) .

Дни после цветения • Статистичес-; . кий показа-, таль Без иеркаптозга-? нола ; С церкаптоэтано-: лом

28 и + ш 32,9+3,1 94,1+8,3

35 М + т 43,7+4,7 127,7+14,8

полная зрелость М + т 49,1+5,3 147,8*20,6

Данные различия в протеолизе клейковины созревающего зерна обусловлены прежде всего количественными изменениями отдельных белковых компонентов. С помощью электрофореза и гель-фильтрации было установлено, что в клейковина 28-дневного зерна содержится относительно меньше высокомолекулярных глиадинов (ШГ) и и -глиа-динов. На долю этих фракций в зрелом зерне приходился 40-45^ от суммы всех белков, в то время как в клейковине 2С-дневмого зерна их содержится всего около 30/5. Исследование продуктов гидролиза клейковины показало, что под действием протеиназ прежде всего снижается содержание £МГ и ь> -глиадинов (рис.9). В исходном про-парате клейковины на долю этих белков (без учеса небелковых соединений) приходится около 60%, а посла ферментативного гидролиза их содержится около 40$. На долю л-,/-, ^-глиадинов в обоих случаях приходится всех белков. Низкий уровень ИГ и и) -глиадинов приводит к току, что клейковина 28-дневного зерна значительно слабее гидролизуется лротеиназани по сравнению с клейковиной зрелого зерна. Высокомолекулярные глиадшш и и/ -глиэдшш

номера фракций

Рис.9. Гель-фильтрация на сефадексе Г-100 клейковины зрелого зерна (I) и продуктов ее гидролиза (2) после воздействия протеиназой созревающего зерна пшеницы.

значительно легче расщепляются также папаином и трипсином. Слабее подвержены протеолизу Л,-, ^ - и £ -глиадины. Причем по отношению к лапаину наиболее выраженную устойчивость проявляют ^-глиадины. Данные по протеолизу проламинов показывают, что глютенины играют решающую роль в агрегации белков и образовании тех ассоциаций, которые приводят к формированию полноценной клейковины. Обработка клейковинного комплекса протеиназами сникает содержание высокомолекулярных компонентов, что приводит к дезагрегации белков, нарушении коллоидных свойств клейковины и тем самый ухудшает ее качество.

Способность клейковины гидролизоваться протеолитическиыи ферментами зависит не только от количества В51Г и а-бедных (ь>-) глиадинов, но и от физико-химических свойств этих белков. Исследование аминокислотного состава и) -глиадинов показало, что наиболее устойчивы к действий протеинэз белки, содержащие значительные количества гидрофобных аминокислот, гистидина, асларагв-новой кислоты и относительно меньше пролива. Такой аминокислотный состав характерен для з -бедных пролаиинов сортов пшеницы о высокими хлебопекарными качествами (табл.10).

24. . .

• Таблица 10

Частичный аминокислотный состав (^-глиадинов различных по качеству сортов озимой мягкой пшеницы

Аминокислоты, моль%

Сорта

Обрий :Безостая I (очень сильный):(сильный)

Б-16 (слабый)

Пролин 17,90

Гистидин 1,21

Аспарагиновая кислота 1,05

Гидрофобные аминокислоты (аланин + валин +

+ изолейцин + лейцин) 10,97

19,24 1,02 0,90

9,67

24,91 0,40 0,35

7,61

Взаимосвязь между аминокислотным составом и ферментативным гидролизом белков была подтверждена также на отдельных фракциях и) -глиадинов. С помощью гель-фильтрации на сефадексе Г-100 и ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе было получено три индивидуальных компонента -глиадинов сорта Безостая-1, кодируемых локусом виз |В1. Данные белки отличались друг от друга по молекулярным массам, аминокислотному составу и устойчивостью к действию протеиназ. Молекулярная масса ьз1 -компонента равнялась 61,7 кД, и)2- 68,2 кД, 76,5 кД. Два компонента (и>2и ь'з ) имели гомологичную "лизиновую" н -концевую аминокислотную последовательность, в то время как у ь^-глиадина была обнару- ' жена "аланиновая" последовательность (табл.II).

Таблица II

К-концевые аминокислотные последовательности компонентов глиадинов сорта Безостая I

5 10

ш 1 Ala-Arg-Glu-Leu-Asn-Pro-Ser-Asn-ljrs-Glu-Leu-Gln-Ser-Ь) 2 Lya-Glu-Xeu-Gln-Ser-Pxo-31n-Glu-Ser-íhe-Ser-HÍQ-Gln-2 Lys-Glu-leu-Gln-Ser-Pro-Gin-Glu-Ser-Phe-Ser-Hia-Gln-

15 20

ь* 1 Pro-Gln-GXu-Ser-Phe-Ser-Pro-Gln-Gln-Gln-i>> g Gln-Gln-Pro-Phe-Pro-Gln-Gln-Pro-Tyr-Pro-0^ GlB-Gln-Pro-Phe-Pxo-Gln-GXn-Pro-Tyr-Pro-

Наиболее значительные различия в аминокислотном составе и способности гидролизоваться прогеолитическими ферментами были отмечены для и)г- и и)компонентов. Так, уже через I мин инкубации ^2-глиадин полностью гидролизуется папашом и не обнаруживается на электрофорегранме (рис.Ю). В то не время при тех же условиях протеолиза концентрация u>j-компонента в пробе снижается незначительно. Промежуточное положение по устойчивости к действию протеиназы занимает uJ ^компонент.

По сравнению с легко гидролизуемым о)2-глиадином самый устойчивый к действию папаина u>¡ -компонент содержал повышенные количества аспарагиновой и глутаминовой кислот, аланина и изо-лейцина. В то же время в молекуле данного белка' содержалось меньше треонина, серина, лролина, лейцина и тирозина. Из данных аминокислотного состава следует, что -глиадин характеризуется более высокой степенью гидрофобности по сравнению с и^и u>2-roi-адинами. Низкий уровень гидрофобных аминокислот изменяет физико-химические свойства и> -глиадинов, что является причиной их повышенной способности гидролизоваться протеиназами и приводит к снижению реологических свойств клейковины.

Таким образом, взаимосвязь между физико-химическими свойствами и протеолизом белков установлена на уровне всего клейко-винного комплекса, суммарной фракции 0 -глиадинов и на уровне отдельных компонентов s-бедных проламинов. Эти результаты являются теоретическим обоснованием возможного практического ис-

А Б

«»i ■

12 3' Г 2 3 3 2 I

Рис.Ю. Гидролиз папаином индивидуальных компонентов

^-глиадинов. Электрофорез в 8,5/& ПААГе рН 3,1. А - -компонент ; Б - и)^ -компонент; В - ^'т-ксипонент. Вреая протеолиза: 1-0 шш; 2-1 tilín; 3-10 мин.

—. '■—(■« ■ -1

1

пользования показателя протеолиза проламинов в оценке хлебопекарных качеств озимой мягкой пшеницы.

Вопросы протеолиза проламинов являются составной частью более общей проблемы - ферментативной переваримости зерновых белков. Повышение переваримости растительных белков представляет важную народнохозяйственную задачу, так как донный показатель является одним из критериев биологической ценности белка. Для определения переваримости растительных белков нами была исполь-т зована методика с применением в качестве источника протеолити-ческих ферментов препарата проназы, а также разработан экспресс-метод с использованием препарата протеиназ поджелудочной железы свиней. С целью упрощения и уснорения определения переваримости зерновых белков было предложено навеску исследуемого материала помещать в пакет из фильтровальной бумаги, который погружают в раствор панкреатина в фосфатном буфере с рН 7,0. Количество непереваренного белка определяют по содержанию азота, оставшегося в пакете после инкубации. При этом возможно инкубировать в ферментном растворе от одного до нескольких десятков проб, что имеет большое преимущество при проведении массового анализа.

Определение переваримости белков семян различных культур показало, что самой высокой переваримостью обладают белки зерна пшеницы, сои, тритикале, подсолнечника. Несколько ниже переваримость белков зерна овса, гороха, ячменя, кукурузы, а самой низкой переваримостью обладают белки зерна сорго. Следует отметить, что по величине переваримости зерновых белков даже в пределах одного вида имеются весьма существенные сортовые различия, позволяющие использовать данный показатель при селекции сортов с -улучшенными кормовыми достоинствами.

На основании полученных результатов в настоящее время предложены и внедрены следующие практические рекомендации:

1. Использование показателя ингибитора трипсина для отбора высокобелковых генотипов пшеницы (рацпредложение).

2. Использование показателя ингибитора хиыотрипсина, ингибитора трипсина и их соотношения для идентификации высоколизино-вых гибридов ячменя, содержащих лиз-ген Хайпроли (методрекомен-дации, ВСГИ, 1984).

3.' Биохимический метод определения переваримости зерновых

белкой (A.c. Ils 1247750, ыетодрекомевдэции, ВСГИ, 1985).

4. Способ выделения ироламинов и определение степени их чистоты по содержанию в препаратах ингибиторов трипсина.

5. Использование показателя ингибитора трипсина для определения устойчивых форы озимой мягкой пшеницы к мучнистой росе.

6. Методика очистки протеиназ и ингибиторов трипсина из зерна пшеницы и ячменя.

ВЫВОДЫ

1. В зерне пшеницы и ячменя обнаружены различные типы пеп-тигидролаз, а также лептидазы, способные расцеплять белковые субстраты, в том числе и проламины. Из созревающего зерна озимой мягкой пшеницы с помощью гель-фильтрации, аффинной хроматографии и изоэлектрофокусирования выделена эндопептидаза с pi 4,45, молекулярной массой 11,4-12,1 кД, обладающая иирокой субстратной специфичностью при оптимуме pH 4,4-4,6, ингибируеиая ПХМБ и незначительно фенилметилсульфонилфторидои и СИТ.

В индосперме, зародыше зерновки пшеницы и ячменя, а также в негистоновых белках ядер проростков ячменя обнаружена протеи-наза, расщепляющая ядерные белки (протамины и гистоны), ингибируеиая СИТ и нечувствительная к действию ПХМБ.

2. 3 зерне злаков обнаружены ингибиторы сериновых (трипсина, химотрипсина, протаыинрасщепляющего фермента) и тиоловых (папаи-на) протеиназ. Показана их гетерогенность и способность агрегировать с запасными белками. Рад ингибиторов с помощью методов гель-фильтрации и ионообменной хроматографии выделены в чистом виде. Сорта озимой пшеницы, устойчивые к мучнистой росе, содержат почти в 2 раза больше ингибиторов трипсина и химотрипсина, уровень которых возрастает в еще больней степени при инокуляции возбудителя.

3. Обоснована роль протеиназно-ингибиторной системы в регуляции накопления запасных балков, что подтверждается фактом высокой активности протеиназ в ранний период созревания зерновки (первые 10-14 дней), когда не происходит накопления проламинов, данными радиоизотопных исследований по включению в белки созревающей зерновки меченных, аминокислот, характером накопления ингибиторов в динамике созревания и прямой корреляционной зависимостью между уровнем белка и содержанием ингибиторов.

4. Установлено, что у высоколизиновых мутантов ячменя наблюдается активация протеолиза проламинов, снижается содержание ингибиторов трипсина и увеличивается уровень ингибиторов химотрипсина, что позволяет использовать эти показатели для отбора высоколизиновых гибридов в процессе селекции.

5. Про л амины, выделенные из зерна различными методами,' отличаются друг от друга своими физико-химическими свойствами, а по уровню ингибиторов протеиназ можно судить о наличии в данных белках низкомолекулярных примесей альбумин-глобулиновой природы.

6. Хлебопекарные свойства озимой пшеница связаны отрицательной корреляционной зависимостью со способностью белков клейковины гидролизоваться протеиназами. Показана решающая роль в этих процессах и - ( s-бедных) проламинов, способность которых подвергаться протеолизу зависит от аминокислотного состава отдельных компонентов, существенно различающихся по своей первичной структуре.

7. Протеолиз является тонким аналитическим методом исследования физико-химических свойств запасных белков, с помощью которого можно проводить комплексную оценку белков злаковых культур в связи с селекцией на качество.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение протеолитических ферментов зерна пшеницы и ячменя. - Вовчук C.B., Левицкий А.П., Адаыовская В.Г., Манко-вич Л.Е. // Азотный и белковый обмен растений: Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума. -Тбилиси. 1973. - С.40-41.

2. Участие протеиназ и их ингибиторов в регуляции синтеза белка в семенах растений. - Левицкий А.П., Вовчук C.B., Малиновский В.А. и др. // 1У Всесоюзный биохимический съезд: Тезисы научных сообщений. - М. : Наука, 1979. - T.I. - С.14.

3. Выделение, очистка и биохимические свойства трипскно-подобных ферментов ячменя. - Вовчук C.B., Левицкий А.П., Чар-ский В.В. и др. // Химия протеолитических ферментов. Материала П Всесоюзного симпозиума, по химии протеолитических ферментов. -Углич. 1979. - С.65-66. "

4. Выделение, очистка, биохимические свойства и биологическая роль ингибиторов протеаз зерна злаков. - Левицкий А.П., Вовчук C.B., Зелинский В.Г. и др. // Там же. - C.I07.

5. Левицкий А.П., Вовчук C.B. Биохимический метод определения переваримости растительных белков // Биохимические методы исследования селекционного материала. Научные труды Всесоюзного селекционно-генетического института. - 1979. - Бш.ХУ. - С.54-58.

6. Вовчук C.B. Определение активности протеолитических ферментов в зерне злаковых культур // Гам же. - С.59-67.

7. Методы экстракции ингибитора трипсина из зерна злаковых культур. - Вовчук C.B., Малиновский В.А., Адаиовская В.Г. и др. // Там же. - С.73-77.

8. Адамоэская В.Г., Левицкий А.П., Вовчук C.B. Взаимосвязь между уровнем протеиназ, их ингибиторами и хозяйственно-полезными признаками зерна пшеницы // Научно-технический бюллетень Всесоюзного селекционно-генетического института. - 1980. - te 3 (37). - С.32-37.

9. Обнаружение протеолитических ферментов и их ингибиторов в ядрах, выделенных-из проростков ячменя. - Вовчук C.B., Левицкий А.П., Чарский В.В. и др. // Там же. - I98I.-N? I (39). -

С.42-49.

10. Зелинский В.Г., Вовчук C.B., Малиновский В.А. Выделение и изучение свойств ингибиторов трипсина из зерна ячменя Ц Там же. - 1981. - S3 2 (40). - С.48-55.

11. Левицкий А.П., Адамовская В.Г., Вовчук C.B. Распределение ингибиторов трипсина по белковым фракциям зерна пшеницы сорта Мироновская 808 Ц Гам же. - 1981. - № 3 (41). - С.41-45.

12. Активность ингибиторов трипсина в зерне ярового ячменя. - Левицкий А.П., Вовчук C.B., Наволоцкий В.Д. и др. // Там же. - 1981. - № 4 (42). - С.30-33.

13. Вовчук C.B. Регуляторная роль протеолитических ферментов при прорастании зерна злаковых растений // Биохимические аспекты изучения и рационального использования животного и растительного мира. - Рига. IS8I. - С.242-243.

14. Выделение и свойства белковых ингибиторов протеиназ из семян злаковых и зернобобо8ых растений. - Левицкий А.П., Зелинский В.Г., Вовчук C.B. и др. ¡J Производство и использование растительного белка. Тезисы докладов к Всесоюзному совещании. -Краснодар. 1981. - С.98-99.

15. Роль протеаз и их ингибиторов в накоплении и распаде запасных белков зерна. - Левицкий А.П., Вовчук C.B., Пыльне-ва П.Н. и др. U Там же. - С.99-100.

16. Levitskiy A.P., Vovtchouk S.Y., Adaraovskaya V.G. Fermenta de l'hydrolyse des proteines et leurs inhibiteurs dana le grain de ble d'hiver// Biochimie et genetique des proteinea du Ъ1е. 4-еше Symposium Franco-Sovietique.- Clermont Ferrsnd.-France. - 1981. - P. 1-1Q.

1?. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в зерне злаковых культур. - Вов чу к C.B., Левицкий А.П., Зелинский В.Г. и ДР- // 1У Украинский биохимический съезд. - Киев: Наукова думка. 1982. - te I. - С. 205-206.

18. ВовчукС.В., Левицкий А.П., Адамовская В.Г. Активность лротеолигических ферментов и содержание ингибитора трипсина в зерне пшеницы при созревании // Научно-технический бюллетень Всесоюзного селекционно-генетического института. - 1982. -

№ I (43). - С.39-44.

19. Вовчу.с C.B., Левицкий А.П., Адамовская В.Г. Система протеолиза и динамика накопления о'елков ъ зерне пшеницы при созревании // Tau же. - 1982. - Иг 4 (46). - С.48-51.

20. Вовчук C.B. Характеристика протеолитических ферментов зерна ячменя // Протеолитические ферменты и их ингибиторы в семенах зерновых и зернобобовых культур. Сборник научных трудов Всесоюзного селекционно-генетического института. - Одесса: ВСГИ, 1982. - С.20-2?.

21. Левицкий А.П., Вовчук C.B., Адамовская В.Г. Протеолитические ферменты и ингибиторы трипсина в эндосперме и зародите зерна пшеницы // физиология и биохимия культурных растений. -1982. - Т.14, № 6. - С.545-548.

22. Вовчук C.B., Яукьянюк С-Ф-, Игнатова С.А ✓ Динамика изменения активности протеиназ и ингибитора трипсина'в зерне "ячменя при созревании // Там же. - 1983. - Т. 15, (й 3. - С.262-266.

23. Использование показателя ингибитора трипсина и химотрип-сина в селекции кукурузы и ячменя. - Левицкий А.П., Вовчук C.B., Пыльнева Б.Н. и др. /'/ Методические рекомендации. - Одесса. 1984. - 16 с.

24. Шведов Г.Г., Левицкий А.П., Вовчук C.B., Особенности биохимического состава зерна высоколизииового мутанта ячменя 0дМ-45/70 // Сельскохозяйственная биология. - 1984. - te 10. -С.45-47.

25. Левицкий А.П., Вовчук C.B., Дохиленко Л.И. Физико-хими-

il.

ческая характеристика гордеинов, вццеленных разними методами // Научно-технический бюллетень Всесоюзного селекционно-генетического института. - 1984. - te 4 (54). - G.31-35.

26. Левицкий А.П., Похиленко Ji. И., Вовчук C.B. Биохимический метод определения переваримости зерновых белков // Методические рекомендации. - Одесса. 198э. - 12 с.

ZI. Распределение ингибиторов протеолитических ферментов но белковым фракциям зерна пшеницы. - левицкий A.n., Вовчук C.B., Адамовская В. Г. и др. // Физиология и биохимия культурных растений. - 198э. - T.I7, № 6. - С.5?б-Ь80.

28. Шведов Г.Г., Левицкий A.Ü., Вовчук C.B. Биохимические особенности зерна высокооелковых мутантов ячменя // Вопросы селекции и генетике ¿¡ерноных культур. - София: Бемиздат, 1985. -С. 30-37.

29. Биохимические и селекционно-генетические аспекты исследования ингиоитороз протеинаэ семян. - Левицкий А.II., Вовчук C.B., Белинский В.Г. и др. // Всесоюзный биохимический съезд: Гезисы. - „1.: Наука, 1985. - № 3. - С.215-214.

30. Леиицкий А.П., Вовчук С.й., Карпович С. А. Взаимосвязь меэд кораовой ценностью зерна ярового ячменя и уровнем ингибитора химотрипсина // Научно-технический бюллетень Всесоюзного селекцконно-генетичесного института. - 1985. - № 3 (57). -

С.36-39.

31. Связь устойчивости озимой пшеницы к мучнистой росе с активностью ингиоиторов про^еаз. - Бэбаянц Л.Г., Смилннец С.П., Левицкий А.П., йовчук C.B. / Там ,«е. - Т986. -tel (59). -

С.51-55.

32. Вовчук C.B., Дымковская C.B., Левицкий А.П. Протеоли-тическое расцепление глиэдина папэнном и трипсином // Там же. -1986. - S; 3 (61). - С.37-40.

33. Новые методы оценки количества и качества белка в зерне. - левицкий А.П., Вовчук C.B., йожжов й.ф. и др. // Теоретические и прикладные аспект селекции и семеноводства пшеницы, . ржи, ячменя и тритикале. Сборник резюме Международной научной конференции. - Прагэ-рузыне. 1986. - С.103.

34. Левицкий A.Ü., Вовчук C.B., Похиленко Л.И. Способ определения переваримости зерновых белков // Авторское свидетельство К? I24775U.

35. Левицкий А.П. . Вовчук G.B. Характеристика белков созревающего зерна пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. - 1987. - Т.19, te 2. - С.125-129.

36. Вовчук C.B., Левицкий А-П., Адамовская В.Г. Действие протеолитических ферментов на белки клейковины созревающего зерна пшеницы // Там же. - 1987. - Т. 19, № 4. - С. 372-3751

37. Вовчук C.B., Левицкий А.И. Основные закономерности протеолизз запасных белков злаковых культур // Там же. - 1987. -Т. 19, te 6. - С.523-535.

38. The use of Mocatalyaators tor estimation, end iraprov-ment o£ seed protein quality. - levitaky A.P., Vovchuk S.V., Malinovsky V.A. et al. // Proc. 4th European Congress on Biotechnology. - Amsterdam. 1987. - V.2. - P. 353-355.

39. Физико-химические свойства клейковины созревающего зерна пшеницы. - Вончук C.B., Левицкий А.П., Адамовская В.Г.

и др. // Проблемы селекции злаковых и бобовых культур на кормовую ценность зерна. Сборник научных трудов Всесоюзного селекционно-генетического института. - Одесса: ВСГЙ, 1987. - С.52-58.

40. Прогеолиз запасных белков злаковых культур и его регуляция. - Вовчук C.B., Левицкий А.П., Адамовская В.Г. и др.

// У Украинский биохимический съезд. Тезисы докладов. -.Киев: Наукова думка, 1987, te Ï. - С.236.

41. Протеолиз клейковины различных по технологический свойствам сортов озимой мягкой пшеницы. - Левицкий A.1I., Вовчук C.B., Адамовская В.Г. и др. JJ Прикладная биохимия и микробиология. -

1987. - Т.23, № 6. - С. 806-811.

42. Дымковская C.B., Левицкий А.П., Вовчук C.B. Сравнительная биохимическая характеристика глиадинов различных по технологическим качествам сортов озимой мягкой пшеницы // Сельскохозяйственная биология. - 1988. - fâ 2. - С.17-19.

43. Левицкий А.П., Вовчук C.B., Дымковская C.B. Выделение и биохимическая характеристика трех компонентов «¿-глиадинов сорта Безостая I, кодируемых локусом оы> idi пшеницы // Генетике. -

1988. - Т.24, to 6. - С. 1066-1071.

БР02142 Поа.%к печати 2C.C0.S8r. Формат 60x84 1/16. Об'ем 1,3уч.и;>0.л. 2,0л.л. Заказ № 5401. Тираж 100зкз.

Гсртипогра^ия Одесского облполнгрй^азойто.це.ч 3 Ленина 49.