Влияние гипертермии и экзогенной гибберелловой кислоты на активность протеолитических и амилолитических ферментов в прорастающих семенах пшеницы

Лебедева, Александра Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние гипертермии и экзогенной гибберелловой кислоты на активность протеолитических и амилолитических ферментов в прорастающих семенах пшеницы
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние гипертермии и экзогенной гибберелловой кислоты на активность протеолитических и амилолитических ферментов в прорастающих семенах пшеницы"

004616^.____

Лебедева Александра Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ГИПЕРТЕРМИИ И ЭКЗОГЕННОЙ ГИББЕРЕЛЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ И АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ ПШЕНИЦЫ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ДЕК 2919

Нижний Новгород 2010

004616294

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии растений Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.П. Веселов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор

Новиков Николай Николаевич

кандидат биологических наук старший научный сотрудник Азаркович Марина Ивановна

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО «Казанский государственный аграрный университет»

Защита состоится «16 декабря» 2010 г. в 16-30 часов на заседании диссертационного совета Д220.043.08 при ФГОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К. А. Тимирязева» по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке имени Н.И. Железнова ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан 15 ноября 2010 года Автореферат размещен на сайте www. timacad. ru

Ученый секретарь диссертационного совета

Белопухов С.Л.

Введение

Актуальность темы.

Климатическая неустойчивость, вероятность аномальных погодных условий делают актуальной задачу изучения адаптационных реакций растений. Один из неблагоприятных абиотических факторов - высокая температура, воздействию которой могут подвергаться растения на разных стадиях развития.

Высокотемпературный стресс представляет собой один из самых значимых абиотических факторов, определяющих урожайность сельскохозяйственных культур.

Считается, что превышение оптимальной температуры для конкретного вида растений на 10 - 15 °С является стрессирующим и вызывает цепь ответных реакций в организме, направленных на передачу стресс-сигнала и повышение устойчивости, выражающейся в сдвиге многих метаболических реакций и физиологических процессов (Веселова с соавт., 1993; Кузнецов, 1993; Тарчевский, 1993; Кулаева, 1997 и др-)- К неспецифическим ответам на различные виды стресс-воздействия относятся изменения редокс-потенциала клеток, проницаемости и функциональной активности мембран, фотосинтетической активности хлоропластов, уровня экспрессии ряда генов, сдвиги в гормональном балансе, интенсивности некоторых катаболических реакций, накопление протекторных соединений и др. (Блехман, Шеламова, 1992; Глянько, 1996; Боровский, 2003; Титов, 2006; Косаковская, 2008). Адаптивному регулированию подвержены не только скорости и направленность биохимических реакций, но и структурно-функциональное состояние молекул биополимеров (Ариохов с соавт., 2004).

В большинстве работ, направленных на выявление адаптационных метаболических изменений при гипертермическом воздействии, объектами исследования являлись активно вегетирующие растения (Акимова с соавт., 1994; Ду-ховский с соавт, 2003).

Степень отрицательного влияния высокой температуры на урожайность полевых культур зависит от фазы развития растений, от продолжительности действия гипертермического воздействия. В условия повышенной температуры почвы могут попадать и прорастающие семена (Кошкин, 2010).

Прорастание семян и ранние стадии формирования проростка - важные этапы жизни растений, оптимальное их прохождение во многом определяется использованием запасных биополимеров, что обеспечивает в дальнейшем благоприятное развитие и формирование урожая. В связи с этим детальное изучение влияния гипертермии на катаболизм запасных веществ в прорастающих семенах представляет значительный теоретический интерес, а также является полезным для практики. Не менее важным является и выяснение возможного участия в ответной реакции на стрессирующее воздействие пролина, образующегося при гидролизе запасных белков, а также поиск способов коррекции возникающих при тепловом стрессе отклонений.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение интенсивности катаболизма запасных белков и крахмала, а также накопления свободного пролина в прорастающих

зерновках пшеницы при тепловом стрессе и добавлении экзогенной гибберел-ловой кислоты (ГК).

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Определить в широком диапазоне рН активность протеолитических ферментов в зерновках пшеницы в динамике их прорастания в условиях гипертермического воздействия и на фоне экзогенной ГК.

2. С использованием ингибиторного анализа оценить вклад различного типа протеаз в катаболизм запасных белков при оптимальной температуре, гипертермии и на фоне ГК.

3. Исследовать влияние высокой температуры и экзогенной ГК на активность амилолиза в прорастающих зерновках различного возраста.

4. Оценить содержание одного из протекторных соединений - свободного про-лина в проростках пшеницы при высокотемпературном воздействии.

Научная новизна.

Детально исследовано влияние гипертермии (42 °С и 46 °С, 2 часа) на активность протеолитических и амилолитическнх ферментов в семенах пшеницы на ранних стадиях формирования проростка. Продемонстрировано изменение спектра протеолитических ферментов и соотношения а- и Р-амилаз в условиях гипертермического воздействия. Установлено модулирующее влияние экзогенной гибберелловой кислоты на высокотемпературный эффект в первые дни формирования проростка. Получены данные, характеризующие динамику накопления свободного пролина в прорастающих семенах пшеницы в условиях гипертермии и на фоне экзогенной гибберелловой кислоты.

Научно-практическая значимость.

Полученные в работе результаты дополняют современные представления о роли катаболических реакций в адаптации растений на ранних стадиях развития к действию неблагоприятных абиотических факторов внешней среды, в частности, высокой температуры.

Продемонстрированное изменение реакции на гипертермию при внесении экзогенной гибберелловой кислоты может быть использовано при разработке дополнительных способов повышения устойчивости растений к стресс-воздействиям.

Проведенные исследования позволили оценить прорастающие семена как довольно надежные биологические системы, способные с относительно небольшими отклонениями в катаболизме запасных веществ переносить кратковременный высокотемпературный стресс.

Основные положения работы могут быть включены в спецкурсы по экологической биохимии, физиологии роста и развития растений, физиологии устойчивости растений.

Апробация работы.

кулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), IV и V Международных научных конференциях «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005, 2007), VI съезде общества физиологов растений России, Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), III и IV Международных конференциях молодых ученых «Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация» (Одесса, 2007, 2009), 2nd International Symposium «Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture» (Kyiv, 2007), III Всероссийской научной конференции «Принципы и способы сохранения биоразнообразия» (Йошкар-Ола, Пущино, 2008), Международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), 13-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), V Международной научно-практической конференции «Динамика современной науки» (София, 2009), Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Башкортостан, 2010).

Публикации.

По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация в объеме 134 листа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материала исследования, 3 разделов, где представлены результаты исследований и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитированной литературы (205 источников) и приложения. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками и 15 таблицами.

Объект и методы исследований

Объект исследований и постановка опытов. В качестве объектов исследования служили 2-, 5- и 7-суточные прорастающие зерновки яровой пшеницы сорта Московская-35. Отобранные семена пшеницы стерилизовали, затем промывали водой, замачивали на 5 часов в воде для набухания, после чего раскладывали в чашки Петри и проращивали на отстоянной водопроводной воде или воде с добавлением ГК (105 М). Проращивание проводили в темноте при t = 24 - 26 °С. Высокотемпературный стресс создавали выдерживанием проростков различного возраста в термостате в течение 2 часов при температуре 42 °С или 46 "С.

В опытах по определению содержания растворенного кислорода в прикорневом растворе, рН раствора и его электропроводности проклюнувшиеся 2-суточные семена (25 шт) пересаживали в сосуды с водой и продолжали выращивать в термостате при t = 24 - 26 °С еще в течение 3-х суток. Затем 5-суточные проростки переносили в такие же сосуды с предварительно прогретой

до нужной температуры водой и измеряли перечисленные выше параметры прикорневого раствора через определенные интервалы времени в продолжение 2 часов.

Определение протеолитической активности. Протеолитическую активность определяли по методу Ансона (Гильманов с соавт., 1981).

В качестве субстрата при определении кислых протеаз использовали 0,5 % гемоглобин. Субстрат готовили на основе цитратно-фосфатного буфера с рН 3,5; 4,5 или 5,5. При определении протеолитической активности щелочных протеаз использовали 0,25 % казеин на цитратно-фосфатном буфере (рН 7,8).

Для изучения соотношения протеаз различных типов в работе использовались следующие ингибиторы (ОоМЯ=МО"3М): диизопропилфторфосфат (ДФФ), йодацетамид (ИАА), 1,10- фенантролин (о - фенантролин), п - хлоромеркурио-бензойная кислота (ПХМБ), фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), этилен-диаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и пепстатин (2-10" М). Используемые соединения попарно ингибируют три типа ферментов: ИАА и ПХМБ - цистеино-вые, ДФФ и ФМСФ - сериновые, ЭДТА и о-фенантролин - металлопротеазы, пепстатин - аспартильные.

Определение амилолитической активности. Активность амилаз определяли по убыли крахмала (Гильманов с соавт., 1981). Средой выделения при определении амилолитической активности служил трис-НС1-буфер (рН 7,2). Гомогенат, полученный путём растирания навески исследуемого материала (1 г) с трис-НС1-буфером (1:20), центрифугировали 15 мин при 10000 об/мин. Для анализа ферментативной активности использовали надосадочную жидкость; в качестве субстрата - 2 % раствор крахмала в ацетатном буфере (рН 4,8). Общую активность выражали в мг крахмала ■ мин'1 • г сырой массы'1, удельную - в мг крахмала • мин"1 • мг1 белка. Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Для раздельной оценки а- и р-амилазной активностей надосадочную жидкость прогревали в течение 15 мин при 70 °С, при этом Р-амилаза как более термолабильный фермент денатурировала, а а-амилаза сохраняла свою активность.

Определение активности лизиндекарбоксилазы. Активность лизинде-карбоксилазы (ЛДК) определяли спектрофотометрическим методом (Pyan et al., 1982; Beier et al., 1987, цит. по Шорина, 2005). Активность ЛДК выражали в относительных единицах (оптич. плотн.).

Определение содержания пролина. Содержание пролина в прорастающих зерновках пшеницы оценивали по методу L. S. Bates et al. (1973). Содержание пролина выражали в мкмоль' г сыр массы'1.

Методы определения некоторых физико-химических параметров прикорневого раствора. Определение некоторых параметров прикорневого раствора осуществляли с целью быстрой оценки ответной реакции, проростков на высокотемпературное воздействие. Измерение динамики содержания растворенного кислорода в прикорневом растворе проводили с использованием анализатора растворенного кислорода - МАРК-302Э, электропроводности -кондуктометра-солемера - МАРК-603/1, а рН - рН-метра - МАРК-901.

Статистическая обработка данных. В процессе исследования проводилось по 3 - 4 опыта в 2 биологических и 2 - 3 биохимических повторностях. Статистическую обработку осуществляли методом парных сравнений для связанных выборок с использованием ^критерия Стьюдента (программа ВюБга1;). Различия в каждой паре сравниваемых значений считали статистически значимыми при р < 0,05 (Снедекор, 1961; Плохинский, 1978; Гланц, 1999).

Результаты и их обсуждение

1. Протеолитическая активность проростков пшеницы.

Определение уровня протеолгоа в динамике прорастания зерновок пшенице проводили при нескольких значениях рН, что позволило оценить потенциальную активность различных протеаз. Согласно данным, представленным на рис. 1, наибольшая протеолитическая активность наблюдалась при рН 4,5; наименьшая - при рН 7,8. Максимумы активностей при различных значениях рН в динамике прорастания не совпадали.

При рН 3,5 наибольший уровень протеолиза наблюдался на 5 сутки. На 7 сутки происходило резкое падение активности протеаз, функционирующих при рН 3,5 (аспартильные протеазы). Их участие в распаде запасных белков, согласно данным литературы, проявляется в большей мере на начальных этапах прорастания (Сарбаканова с соавт., 1988; СаШэ, 1995).

Активность в зерновках при рН 4,5 сохранялась на высоком уровне в течение всего времени исследования, достигая наивысшего значения к 7 суткам. Уровень протеолиза при рН 5,5 в процессе прорастания зерновок плавно возрастал от 2 к 7 суткам. На фоне очень низкой общей активности не отмечено существенных изменений в динамике активности протеиназ при рН 7,8.

Суммарный уровень протеолиза был более высоким у 5- и 7-дневных

прорастающих зерновок (27,9 и 28,8 мкмоль тир ■ мин'1 • г сырой массы'1, соответственно, против 20,3 мкмоль тир • мин'1 • г сырой массы'1 - на 2 сутки). Определенный нами временной максимум распада белков в семенах злаковых культур (5-7 сутки) близок к результатам других авторов (Мосолов, 1971; Шутов с соавт., 1984; Сарбаканова с соавт., 1988; Дунаевский с соавт., 1990;

Рис. 1 Протеолитическая активность в зерновках пшеницы при различных значениях рН буферного раствора

Белозерский с соавт., 1994 и др.). Такая динамика активности связана с тем, что, во-первых, при прорастании семян постепенно снижается активность ингибиторов протеолитических ферментов, которая почти полностью исчезает на 4-5 сутки (Валуева, Мосолов, 1999; Мосолов, Валуева, 2005; Домаш с соавт., 2007; Домаш с соавт., 2008); во-вторых, прорастание семян сопровождается активацией синтеза de novo гидролитических ферментов, участвующих в катаболизме запасных веществ.

Для выяснения степени участия протеаз различных типов в гидролизе белков в прорастающих зерновках был применен ингибиторный анализ. Как видно из рис. 2, где отражены результаты опытов с 5-дневными зерновками пшеницы, характеризующимися высокой суммарной протеолитической активностью, основную роль в распаде запасных белков при рН 3,5 выполняют ас-партильные протеазы, поскольку добавление в контрольном варианте пепста-тина почти полностью (на 94 %) подавляло протеолитическую активность; вклад цистеиновых протеаз был значительно ниже (ПХМБ и ИАА снижали активность на 10 - 16 %). Добавление ЭДТА и о-фенантролина не приводило к

изменению активности, что указывает на отсутствие участия металлопротеаз в расщеплении белков при данном значении рН. Не обнаружено ингибирования протеолитической активности в 5-дневных прорастающих зерновках ячменя при рН 3,8 под влиянием ЭДТА и в исследованиях R. Wrobel, J.L. Berne (1992).

Рис. 2 Действие ингибиторов на активность протеаз 5-дневных зерновок пшеницы (рН буферного раствора 3,5)

На участие аспартильных и цистеиновых протеаз, расщепляющих запасные белки зерновок злаковых культур при кислых значениях рН, указывается и в работе Р.С. ВеЛке е! а1. (1998). Аспартильные и цистеиновые протеазы ячменя, найденные в алейроновом слое белковозапасающих вакуолей (БЗВ), имеют оптимальный уровень рН около 4,0 и неактивны при рН 6,5 и выше. Близкое к этому рН характерно для покоящихся семян. Показано, что в протопластах, выделенных из клеток алейронового слоя сухих семян ячменя, имеющих рН около 7,0; эти ферменты не проявляют активности. Как только в процессе прорастания внутреннее содержимое БЗВ закисляется до рН 5,5 и ниже, наблюдается активация протеаз. Большой вклад при рН 4,5 цистеиновых протеаз отмечен в ранее выполненной на кафедре ННГУ работе (Александрова с соавт., 1999), где показано, что внесение ПХМБ в инкубационную среду снижало активность на 87 %, а ЭДТА только на 14 %. Это также согласуется и с данными литературы,

10090- Г" 80- !

1 70' "j I 60

пепстатин ПХМБ ИМ о-фен ЭДТА

где показано, что при рН 4,2 - 5,0 высока активность цистеиновых протеаз (Шутов с соавт., 1984; Дунаевский с соавт., 1990; ВеЛке ег а1., 1998).

При рН 5,5 спектр протеаз в 5-дневных прорастающих зерновках более широк. Нами обнаружены цистеиновые, сериновые и металлопротеазы. В большей мере в контроле подавлялась активность сериновых ферментов (46 %) и в меньшей цистеиновых и металлопротеаз (17 и 17 %, соответственно) (рис. 3).

В зерновках (на 2-й день замачивания семян) при рН 5,5 также активны все три типа протеаз, но уровень подавления их активности был сходен (41 -43 %).

На 7-й день прорастания в зерновках, не подвергавшихся никаким дополнительным воздействиям, наибольшее ингибирование при

Рис. 3 Действие ингибиторов на активность протеаз 5-дневных зерновок пшеницы (рН буферного раствора 5,5)

указанном выше значении рН наблюдалось в присутствии ЭДТА, что свидетельствует о существенном вкладе металлопротеаз. К последним, в частности, относится и часть карбоксипептидаз, содержащих ион цинка в активном центре (Антонов, 1991).

Щелочные протеазы (рН 7,8) у 5-дневных зерновок в контрольном варианте представлены сериновыми и металлопротеазами. Степень подавления последних составила 67 %, а сериновых — 38 - 39 %. Снижение активности под

влиянием ингибитора цистеиновых протеаз ПХМБ было незначительным (рис. 4).

Таким образом, по результатам ингибиторного анализа протеолитических ферментов, можно сделать заключение, что в прорастающих зерновках пшеницы при рН 3,5 преобладают ас-партильные протеазы, при рН 4,5-

Рис. 4 Действие ингибиторов на активность протеаз •■■■••....■■.- ..... 1

5-дневных прорастающих зерновок пшеницы (рН буферного раствора 7,8)

100 т 9080706050' 403020100-1

ш контроль

ПХМБ ДФФ ФМСФ ЭДТА

преимущественно цистеиновые (Александрова с соавт., 1999), при рН 5,5 работают цистеиновые, сериновые и металлопротеазы, а при рН 7,8 - сериновые и металлопротеазы.

Согласно полученным результатам, гипертермия (42 °С, 2 часа) приводила к достоверному снижению активности аспартильных протеаз (рН 3,5) во все исследованные сроки прорастания (табл. 1). Наибольшее падение протеолиза в условиях гипертермии при участии аспартильных протеаз наблюдалось при прогреве 7-х суточных прорастающих зерновок.

Таблица 1

Протеолитическая активность (рН 3,5) в зерновках пшеницы различных сроков прорастания (мкмоль тир ' мин"'' г сырой массы"1)

2 сутки 5 сутки 7 сутки

Вариант актив- % к кон- актив- % к кон- актив- % к кон-

ность тролю ность тролю ность тролю

Контроль 2.36 - 9.08 - 4.74 -

42°С/К 1.73* 73.3 7.50* 82.6 1.82* 38.4

ГК/К 4.37* 185.2 13.57* 149.4 1.78* 37.6

ГК, 42°С/К 2.80 118.6 4.36* 48.0 1.44* 30.4

ГК, 42°С/42°С 2.80* 161.8 4.36* 58.1 1.44* 79.1

42°С/К - действие 42 °С по сравнению с контролем. ГК/К - действие ГК по сравнению с контролем.

ГК, 42°С/К - совместное действие ГК и-42 °С по сравнению с контролем. ГК, 42°С/42°С - действие ГК на фоне 42 °С. * - различия по сравнению с контролем статистически значимы.

Протеолитическая активность при рН 4,5 (рис. 5) под действием гипертермии на 2 и 5 сутки повышалась (на 28 - 34 %), а на 7-е - падала (на 38 %). Возрастание (на 32 %) активности в 4-дневных прорастающих зерновках при рН 4,5 показано и в работе И. Ф. Александровой с соавт. (1999).

При рН 5,5 также как и рН 3,5 под влиянием повышенной температуры наблюдалось снижение уровня протеолиза в зерновках во все исследуемые сроки. Максимальное снижение активности выявлено на 7 сутки, различия у 2-дневных зерновок были несущественны и недостоверны.

Рис. 5 Влияние гипертермии на интенсивность протеолиза (рН буферного раствора 4,5) в зерновках пшеницы

Падение протеолитической активности в варианте «42 °С» отмечено и для щелочных протеаз (рН 7,8) в ранние сроки прорастания (2 и 5 сутки прорастания - на 37 и 29 %, соответственно), в то время как у 7-суточных зерновок при гипертермическом воздействии наблюдалось противоположное изменение (повышение на 48 %).

Итак, воздействие теплового шока (42 °С, 2 часа) сказывалось на интенсивности протеолиза в зерновках пшеницы, вызывая неоднотипные изменения. В большинстве случаев отмечено падение активности и только в трех вариантах из 12 (рН 4,5, - 2 и 5 сутки; рН 7,8, - 7 сутки) увеличение. Возрастание активности в варианте с гипертермией при рН 4,5, связанное, главным образом, с работой цистеиновых протеаз, приводит к незначительному подъему суммарной протеолитической активности (на 15 % и 6 %) вследствие наиболее существенного вклада именно этого типа ферментов в распад белков. Выраженное изменение суммарной активности отмечено только у 7-дневных зерновок, падение составило 39 %, т.е. характер реакции на тепловое воздействие определялся и возрастом проростков. Возможно, у 7-дневных проростков в реакции на тепловое воздействие главная роль принадлежит хорошо сформированной надземной части. Замедление ее роста при неблагоприятных условиях, отмечаемое во многих работах, и, как следствие, снижение потребности в питательных веществах вероятно могут являться одной из причин падения активности протеаз в зерновках на этой стадии развития.

Согласно полученным нами результатам, гипертермия (42 °С, 2 часа) избирательно изменяла активность протеаз и, следовательно, их количественное соотношение. У 5-дневных прорастающих зерновок при рН 3,5 выявлено существенное подавление активности аспартильных протеаз и небольшое возрастание - цистеиновых, а при рН 5,5 и 7,8 в варианте «42 °С» снижалась активность, в основном, металлопротеаз. При рН 5,5, также как и при рН 3,5, отмечено увеличение доли цистеиновых протеаз (рис. 3, 4), а при рН 7,8 - сериновых. Очевидно, уменьшение вклада аспартильных и металлопротеаз могло и быть причиной падения уровня протеолиза при указанных значениях рН. Сдвиги в количественном соотношении протеаз могут быть связаны с их различной термостабильностью, изменениями в содержании эндогенных белковых ингибиторов, участвующих в регуляции активности протеолитических ферментов.

О важной роли протеиназно-ингибиторной системы в ответе растений на стресс указывается в работах В.В. Мосолова (1998); В.И. Домаша с соавт. (1999); В.В. Мосолова, Т.А. Валуевой (2005); В.И. Домаша с соавт. (2006,2007); С.А. Фроловой (2008); С.А. Фроловой, А.Ф. Титова (2008).

На фоне экзогенной ГК активность аспартильных протеаз (рН 3,5) возрастала на 2 и 5 сутки прорастания (на 85 % и 49 %), а у 7-ми суточных достоверно снижалась (табл. 1). Известно, что ГК синтезируется именно в ранние стадии прорастания семян злаков (1 - 2-е сутки) и участвует в регуляции процессов расщепления запасных веществ семени (ЬеЩоп е1 а!., 1994 и др.). Экзогенная ГК приводила к увеличению уровня активности аспартильных протеаз, пониженного при гипертермии (вариант ГК, 42 °С по сравнению с 42 °С, табл. 1). Т. е. при введении в среду экзогенной ГК происходит частичное или пол-

ное снятие стресс-реакции, выражающейся в падении активности аспартиль-ных протеаз. Однако такой эффект наблюдался только у 2-дневных прорастающих зерновок, различия в вариантах ГК, 42 °С были достоверны, по сравнению с «42 °С». У 5-дневных зерновок ГК не приводила к увеличению уровня протеолиза (рН 3,5), подавленного под действием высокой температуры (табл. 1).

Таким образом, на фоне ГК гипертермическое воздействие было более слабым в ранние сроки прорастания. Мы полагаем, что отмеченный эффект может быть обусловлен изменением в балансе фитогормонов. Стрессовое воздействие часто вызывает в клетках растений значительные, иногда очень быстрые, падения в содержании эндогенных гиббереллинов, ауксинов и цито-кининов, недостаток которых может приводить к торможению процессов метаболизма (Мелехов, 1985; White, Rivin, 2000; Larkindale, Knight, 2002). Введение экзогенной ГК, очевидно, изменяет соотношение фитогормонов в сторону ГК.

Однако действие ГК, модифицирующее эффект теплового шока на активность протеаз, отмечено нами только в отношении аспартильных протеаз. Экзогенная ГК при рН 5,5 не уменьшала стресс - реакцию, вызванную повышенной температурой и выражающейся в снижении уровня протеолиза. При данном значении рН, как продемонстрировано в наших опытах, напротив, наблюдалось еще большее падение активности, особенно на 5 и 7 сутки.

С целью получения более яркого эффекта гипертермии был проведен ряд опытов с использованием температуры 46 °С. В предварительных исследованиях, позволяющих быстро регистрировать ответную реакцию растений (определение содержания 02, удельной электропроводности и рН прикорневого раствора), было показано, что разница в 4 °С существенна для проростков пшеницы. При 46 °С содержание 02 в растворе, отражающее интенсивность дыхания корней, было ниже, чем при 42 °С. Показана также более высокая электропроводность прикорневого раствора в варианте «46 °С», что является результатом увеличения проницаемости клеточных мембран. Изменение рН прикорневого раствора в кислую область было более интенсивным при 46 °С. Наиболее четкая разница по всем показателям получена при 1-2 часовом температурном стрессе.

При тепловом шоке (46 °С) ответная реакция прорастающих семян пшеницы, как правило, отличалась от таковой при 42 °С. Так, активность протеоли-тических ферментов при рН 3,5, обусловленная, (как отмечено выше в опытах с ингибиторами), в основном, аспартильными протеазами, изменялась под влиянием гипертермического воздействия только у 5-дневных прорастающих зерновок (снижение составило 32 %), в то время как при более низкой стресси-рующей температуре 42 °С - активность в опытном варианте была снижена во все исследованные сроки прорастания зерновок пшеницы.

При рН 4,5 небольшое и недостоверное падение активности (на 8 %) наблюдалось у 2-дневных зерновок. На 5 и 7 сутки был отмечен рост протеолити-ческой активности на 92 % у 5-дневных (достоверно) и 8 % у 7-дневных (недостоверно). Т.е. и при данном значении рН также зафиксирована разница в ответ-

ной реакции на тепловой шок в 42 °С и 46 °С. При рН 5,5 уровень протеолиза, связанный с работой цистеиновых, сериновых и металлопротеаз, был более чувствителен к тепловому шоку у 2-дневных зерновок, повышение активности составило 43 %. В то время как у 5-дневных, как и в случае аспартильных про-теназ, наблюдалась тенденция падения активности.

В результате гипертермического воздействия повышалась активность щелочных протеаз 2-х и особенно 5-и суточных зерновок, а у 7-дневных, наоборот, ее снижение на 33,3 % (табл. 2).

Добавление ГК в среду для проращивания изменяло ответную реакцию на гипертермию. Характер изменений зависел от рН, при котором определялась активность, и возраста проростков. Четко выявляемой закономерности в модифицирующем действии ГК на гипертермию в 46 °С нами не зафиксировано. Таким образом, можно сделать вывод, что даже такая температура как 46 °С, превышающая на 20 °С оптимальное значение, при сравнительно коротком периоде действия (2 часа) кардинально и закономерно не изменяет процесс распада запасных веществ в семенах пшеницы. И при данной стрессирующей температуре проростки сохраняли исходную выживаемость.

Таблица 2

Изменение протеолитической активности в зерновках пшеницы при различных воздействиях (мкмоль тир мин"1' г сырой массы"1)

Вариант 2 сутки | 5 сутки | 7 сутки

изменение протеолитической активности, % к контролю

рН 3,5

Контроль - - -

46°С/К 101.6 68.3* 102.5

ГК, 46°С/К 106.4 98.2 65.1*

ГК, 46°С/46°С 104.6 143.8* 63.6*

рН4,5

Контроль - - -

46°С/К 91.8 192.1* 108.0

ГК, 46°С/К 157.9» 136.2* 87.2*

ГК, 46°С/46°С 172.0* 70.9* 80.7*

рН 5,5

Контроль - - -

4б°С/К 143.1* 80.4 101.7

ГК, 4б°С/К 82.3 93.0 134.1*

ГК,46°С/46°С 57.6* 115.8 131.9*

рН 7,В

Контроль - - -

4б°С/К 114.6 175.2* 66.7

ГК, 46°С/К 111.2 133.3* 38.2*

ГК, 4б°С/4б°С 97.1 76.1 57.2*

* - различия по сравнению с контролем статистически значимы.

Проводя сравнение действия двух температур на протеолитическую активность в прорастающих зерновках пшеницы, следует отметить, что при 42 °С чаще, чем при 46 °С наблюдали падение активности. При 46 °С обычно либо не происходило достоверных изменений, либо выявлено ее увеличение. Направленность изменений метаболических реакций зависит от стадии стресса. При 46 °С нами зафиксирована более типичная реакция на температурный стресс в виде возрастания интенсивности катаболических реакций, характерная для первой стадии стресса, называемой у растений первичная стрессовая реакция или фаза физиологической депрессии (Пятыгин, 2008). Можно предположить, что в зависимости от глубины высокотемпературного воздействия изменяется длительность прохождения стадий стресса. Чем выше стрессирующая температура, тем дольше растения находятся в состоянии первой стадии стресс-реакции, тем больше времени требуется для перехода к стадии адаптации. Вместе с тем чувствительность тех или иных метаболических реакций на внешнее воздействие может быть не однотипной и определяться физиологическим значением реакции на том или ином этапе развития растения. Поэтому заключение о стадии стресса, вероятно, может быть сделано только на основании комплекса показателей, характеризующих состояние исследуемого объекта. Мы полагаем, что при кратковременном воздействии температур 42 °С и 46 °С прорастающие зерновки находятся на разных стадиях стресс-реакции.

2. Амилолитическая активность зерновок пшеницы при гипертермии и на фоне экзогенной гибберелловой кислоты. Определение активности амилаз, так же, как и в случае протеаз, проводилось нами при двух высокотемпературных воздействиях: 42 °С и 46 °С.

На рис. 6 представлены данные, характеризующие общую активность а + Р амилаз и раздельно а- и ß- амилаз в динамике прорастания.

Суммарная активность амилаз возрастала от 2 к 8 дню прорастания семян. Максимум активности суммарных амилаз в процессе прорастания семян пшеницы обычно приходится на 3 - 6 сутки (Гильманов с соавт, 1981; Livesley, 1991 и др.). Смещение максимума на более поздний срок в наших опытах, очевидно, связано с тем, что они проводились на этиолированных проростках.

При тепловом стрессе 42 °С, во все сроки наблюдался более высокий уровень суммарной активности амилаз (на 5-16 %, рис. 6). Статистически достоверные различия не отмечены на 5 сутки прорастания.

Большая доля активности приходилась на ß-амилазы. Их активность в контроле составляла от 55 до 94 % от суммарной, а в опыте от 59 до 86 %, причем в процессе прорастания вклад ß-амилаз в расщепление крахмала постоянно снижался за счет возрастания активности а-амилаз. Увеличение суммарной активности под влиянием гипертермии на 2 - 8 дни происходит как за счет а-амилаз, так и ß-амилаз, последние относят к стресс-индуцируемым белкам (Dreier et al., 1995). Закономерности в изменении удельной активности амилаз как в динамике прорастания, так и под влиянием гипертермии аналогичны общей. Воздействие теплового шока даже становится более четким поскольку в

500

400

300-

200-

< Конроль (суммарная)

-ш-А2°С

(суммарная)

А Контроль (а) -»—42 °С (а) • Контроль (Р) ■42 °С (р)

Сутки

Рис. 6 Динамика общей активности (а +6), а- и |3- амилаз в процессе прорастания зерновок пшеницы в норме и при тепловом шоке.

опытном варианте отмечена тенденция к снижению солерастворимого белка в пробах, предназначенных для определения амилазной активности. Повышение степени гипертермического воздействия (46 °С, 2 часа) меняло ответную реакцию растений. Если при 42 "С наблюдалось возрастание амилолиза во все сроки, то при 46 °С отмечена тенденция к падению активности у 2 и 5-дневных прорастающих зерновок на 10 - 13 % и увеличению у 7-дневных на 22 %. При этом, как показали опыты с 2-дневными проростками, доля активности ¡5-амилаз повышалась, несмотря на их большую термолабильность, что могло способствовать увеличению защитного потенциала семян при неблагоприятном воздействии, поскольку работа Р-амилаз сопровождается образованием мальтозы - одного из наиболее эффективных осмопротекторов - олигосахаридов.

Более выраженным по сравнению с высокотемпературным воздействием было влияние экзогенной ГК (табл. 3). В наших опытах при проращивании на растворе с экзогенной ПС наблюдалось статистически достоверное повышение активности амилаз зерновок в 2- (54 %) и 7-дневных (47 %) проростках пшеницы и недостоверное в 5-дневных (14 %). В опытах с 2-дневными прорастающими зерновками показано, что возрастание активности амилолиза в варианте с ПС происходило за счет а-амилаз, в то время как вклад Р-амилаз снижался.

Общая активность амилаз при воздействии гипертермии (46 °С) на фоне экзогенной ПС была во все исследованные сроки прорастания выше по сравнению с контролем. Это ещё раз говорит о большей отзывчивости катаболизма крахмала на ПС по сравнению с гипертермией в условиях постановки наших

Таблица 3

Общая активность амилаз (мг крахмала' мин"1' г сырой массы"1)

Вариант 2с утки 5 сутки 7 сутки

активность % к контролю активность % к контролю активность % к контролю

Контроль 494.0 - 1090.6 - 936.9 -

46°С/К 431.0 87.2 973.4 89.3 1145.7 122.3

ГК/К 759.7* 153.8 1241.3 113.8 1374.3* 146.7

ГК, 46°С/К 636.5* 128.8 1186.0 108.7 1121.3 119.7

ГК, 46°С/46°С 636.5 147.7 1186.0* 121.8 1121.3 97.9

* - различия по сравнению с контролем статистически значимы.

опытов, поскольку при температуре 46 °С имеется тенденция к снижению уровня амилолиза на 2 и 5 сутки. Таким образом, выращивание проростков на экзогенной ГК модулировало действие теплового шока в начальные сроки роста. ГК существенно повышала активность а-амилаз, что полностью согласуется с данными литературы. Тепловой шок и на фоне ГК приводил к увеличению вклада р -амилаз.

3. Влияние гипертермии и экзогенной гибберелловой кислоты на содержание свободного пролина в проростках пшеницы. Наибольшее содержание пролина во всех вариантах опыта отмечено на 5-е сутки прорастания, наименьшее - на 2 сутки. Можно предположить, что расщепление основных запасных белков семян злаковых культур - проламинов, содержащих большое количество пролина и глутамата, на ранних стадиях происходит не столь интенсивно, как в поздние (5-, 7-е сутки). Более низкое содержание пролина в зерновках на 7-е сутки по сравнению с 5-ми, может быть связано с интенсивным оттоком аминокислот в развивающиеся надземные органы.

Тепловая обработка прорастающих семян (42 °С) приводила к небольшому (10 %), но достоверному повышению содержания пролина только в 7-ми дневных зерновках (рис. 7), несмотря на более низкую в варианте 42 °С суммарную активность протеаз (рис. 5). Можно допустить, что в про растающих зерновках, достаточно исходного

Рис. 7 Изменение содержания свободного пролина в процессе прорастания семян пшеницы

выс окого уровня свободного пролина для защиты от стрессирующих факторов.

Содержание свободного пролина под влиянием ГК возрастало у 5- и 7-дневных зерновок, но достоверно только у 7-и дневных (на 35 %). При гипертер-

мии 46 °С содержание свободного пролина в зерновках всех сроков прорастания существенно не изменялось, отмечена только тенденция к снижению его уровня (на 5-7%).

Нами была предпринята также попытка косвенно оценить уровень другого протекторного соединения - одного из полиаминов - кадаверина, образующегося из лизина при участии фермента лизиндекарбоксилазы (ЛДК). С этой целью мы определяли активность ЛДК в различных частях проростков. По данным литературы (Кузнецов с соавт., 2006), наименьшая активность фермента отмечается в семенах. Это связано с тем, что образование кадаверина из лизина при участии ЛДК происходит в строме хлоропластов побегов и в корнях, где, как известно, присутствуют пропластиды с неразвитой мембранной системой. Полученные нами результаты находятся в полном соответствии с данными, представленными в литературе. Наибольшая активность наблюдалась в побегах (рис. 8).

Тепловой шок не изменял активность фермента в зерновках и снижал в корнях и побегах.

Можно предположить, что отсутствие протекторной роли кадаверина в зерновках пшеницы связано с низким содержанием в запасных белках пшеницы незаменимой аминокислоты лизина. Рис. 8 Общая активность ЛДК

В результате проведенных исследований зафиксировано изменение активности гидролитических ферментов прорастающих семян пшеницы в ходе формирования проростков и в ответе на тепловое воздействие. Термоиндуцированные отклонения, как правило, были сравнительно небольшими, а характер изменения различных гидролитических реакций не был однонаправленным. Так, при 42 °С активность протео-литических ферментов в большинстве случаев снижалась, а амилолитическая возрастала. В реакции растений на стрессовое воздействие, очевидно, определенная роль принадлежит изменению соотношения отдельных изоформ а- и Р -амилаз в пользу изоформ более «адаптированных» к конкретным внешним условиям. Например, в прорастающих семенах жароустойчивого сорта пшеницы присутствует изофермент а-амилазы, имеющий температурный оптимум 70 °С, отсутствующий у термочувствительного сорта (Нигуап, 2006). Гипертермия 46 °С не приводила, как правило, к изменению уровня протеолиза, но имелась тенденция к снижению степени амилолиза и увеличению доли (3-амилаз.

Можно предположить, что прорастающие семена злаков обладают достаточно большой устойчивостью к относительно кратковременному тепловому стрессу и являются биологическими системами с высокой надежностью. Такая надежность, вероятно, генетически запрограммирована и обеспечивает сохранение вида. Толерантность семян злаков может быть связана с тем, что запасенные углеводы и белки в процессе их распада обеспечивают зерновку и растущий проросток в достаточном ко-

ЕЭК ■ 46°С

□ гк

□ ГК.46°С

2дн зерновки 5ДН корни 7дн корни 5дн побеги 7дн побеги

(отн.ед. ■ г" сырой массы) в различных частях проростков пшеницы

Заключение

личестве протекторными соединениями - пролином, моно- и олигосахаридами. На фоне высокого содержания свободного пролина в семенах нами не отмечено достоверных отклонений в его количестве при гипертермии 42 °С, 46 °С.

Вместе с тем, анализируемые процессы протеолиза и амилолиза, очевидно, принимают участие в адаптации к стрессирующим внешним воздействиям. Определенная роль здесь должна принадлежать не только изменению активности, но и сдвигам в соотношении различных типов протеаз и а- и Р-амилаз, что отмечено в наших экспериментах.

Более значительные, по сравнению с гипертермией, изменения наблюдались под влиянием ГК в ранние исследуемые сроки прорастания семян пшеницы. Эти изменения имели противоположную, по сравнению с тепловым стрессом, направленность, что позволяет рассматривать применение ГК как способ, с помощью которого можно усилить гомеостатические механизмы и повысить адаптивные возможности прорастающих в неблагоприятных условиях семян.

Выводы

1. Показано изменение спектра протеолитических ферментов в динамике прорастания семян пшеницы (2, 5, 7 сутки). Максимум активности аспартильных протеаз (рН 3,5) приходится на 5 сутки, цистеиновых (рН 4,5) - на 7 сутки; цистеиновых, сериновых и металлопротеаз (рН 5,5) - тоже на 7 сутки. Активность щелочных протеолитических ферментов - сериновых и металлопротеаз (рН 7,8) в зерновках остается низкой на всем этапе формирования проростков.

2. Под влиянием повышенной температуры (42 °С, 2 часа) наблюдалось снижение уровня протеолиза в зерновках, определяемого при рН 3,5 за счет падения активности аспартильных протеаз и рН 5,5, в основном, металлопротеаз во все исследованные сроки прорастания. Однако у 2- и 5-суточных стрессированных проростков существенно не изменялась благодаря возрастанию вклада цистеиновых протеаз (рН 4,5). Более жесткое гипертермическое воздействие - 46 °С, реже приводило к падению протеолитической активности по сравнению с 42 °С.

3. На фоне экзогенной ГК у 2- и 5-суточных прорастающих зерновок возрастала активность протеаз, катализирующих распад белков при рН 3,5. Это приводило к увеличению уровня активности ферментов, сниженного при гипертермии, т.е. ГК в ранние сроки модулировала тепловое воздействие. ГК снижала уровень протеолиза при рН5,5.

4. Тепловое воздействие 42 °С увеличивало уровень суммарной активности амилаз (а+Р) как за счет а-, так и р-амилаз. Эффект ГК, выражающийся в повышении амилолитической активности, был более отчетливым по сравнению с тепловым стрессом. При 46 °С не отмечено достоверных отклонений в степени амилолиза.

5. Гипертермия (42 °С и 46 °С), в большинстве случаев, не приводила к существенным изменениям в содержании свободного пролина в прорастающих зерновках на фоне его высокого содержания. Защитные механизмы зерновок в ответ на стрес-сирующее воздействие, вероятно, не связаны с накоплением этого протекторного соединения. Гипертермия не влияла на активность фермента ЛДК в зерновках, продуктом которого является кадаверин, также выполняющий защитную функцию.

Список публикаций по теме диссертации

1. Французова В.П., Ундрицова Г.М., Лебедева А.С. Динамика накопления пролина и терморезистентность проростков пшеницы // Материалы 10-й Нижегородской сессии молодых ученых (физика, химия, медицина, биология).-Н.Новгород,2005.-С. 245-246.

2. Лебедева А.С., Ундрицова Т.М., Французова В.П. Содержание свободного пролина в различных частях зеленых и этиолированных проростков пшеницы в норме и при гипертермии // Материалы XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - Москва, 2005. - С. 235-236.

3. Александрова И.Ф., Лебедева А.С. Активность кислых протеиназ и содержание свободного пролина в прорастающих зерновках пшеницы при действии повышенной температуры и экзогенной гибберелловой кислоты // Вестник Нижегородского госу-дарствешюго университета им. Н.И. Лобачевского. Серия Биология. - 2005. - вып. 2 (10).-С. 201-204.

4. Олюнина Л.Н., Александрова И.Ф., Веселов А.П., Французова В.П., Лебедева А.С., Ундрицова Т.М. Пролин и терморезистентность проростков пшеницы, выращенных в различных световых условиях // Материалы Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». - Вологда, 2005.-С. 132.

5. Александрова И.Ф., Олюнина Л.Н., Веселов А.П., Лебедева А.С., Французова В.П., Бутнякова О.А. Влияние экзогенной гибберелловой кислоты на интенсивность проте-олиза и уровень свободного пролина в прорастающей пшенице // Материалы IV Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». - Минск, 2005. - С. 9.

6. Александрова И.Ф., Веселов А.П., Лебедева А.С., Бутнякова О.А. Соотношение протеиназ в проростках пшеницы в условиях гипертермии и на фоне экзогенной ГК // Материалы VI съезда общества физиологов растений России. Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». - Сыктывкар, 2007.-С. 15-16.

7. Лебедева А.С. Влияние экзогенной гибберелловой кислота на расщепление белков в прорастающей пшенице // Материалы XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - Москва, 2007.

8. Лебедева А.С., Веселов А.П., Александрова И.Ф., Ефременко Ю.Р. Влияние экзогенной гибберелловой кислоты и гипертермии на интенсивность протеолиза в прорастающей пшенице // Материалы VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов». - Москва, 2007. - С. 120.

9. Lebedeva A., Butnykova О. Proteolysis in germinating wheat in conditions of a hyper-thermia and on a background exogenous gibberellic acid // Materials of III International young scientists conférence «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution». - Odesa, 2007. -P. 37-38.

10. Александрова И.Ф., Французова В.П., Лебедева A.C., Бутнякова О.А. Протеолиз и содержание свободного пролина в проростках пшеницы при гипертермии и воздействии экзогенной гибберелловой кислоты // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. Серия Биология.-2006.-Вып. 1 (11). - С. 91-93.

11. Бутнякова О.А., Лебедева А.С. Активность протеиназ и содержание свободного пролина в прорастающей пшенице // Материалы ХП Нижегородской сессии молодых ученых-Н.Новгород, 2007. С. 20-21.

12. Aleksandrova I.F., Lebedeva A.S., Petrunina N.A. Modulating influence of gibberellic acid in hyperthermia in wheat grains // Abstracts of 2nd International Symposium " Plant

growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture". - Kyiv, 2007.-P. 101.

13. Лебедева A.C., Александрова И.Ф., Веселов А.П., Петрунина H.A. Об участии гибберелловой кислоты в ответной реакции на тепловой шок прорастающих семян пшеницы II Материалы V Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». - Минск, 2007. С. 124.

14. Лебедева A.C., Александрова И.Ф., Петрунина H.A. Некоторые аспекты биохимической адаптации прорастающей пшеницы к гипертермии // Материалы III Всероссийской научной конференции «Принципы и способы сохранения биоразнообразия». - Йошкар-Ола, Пущино, 2008. - С. 430-431.

15. Александрова И.Ф., Веселова A.A., Лебедева A.C. Влияние гипертермии и экзогенной гибберелловой кислоты на активность амилаз в прорастающих зерновках пшеницы // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. - 2007, № 5. - С. 65-67.

16. Александрова И.Ф., Веселов А.П., Лебедева A.C., Петрунина H.A. Гидролиз запасных биополимеров в прорастающих семенах пшеницы в условиях гипертермии и на фоне экзогенной гибберелловой кислоты // Материалы Международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений». - Екатеринбург, 2008. - С. 44-45.

17. Лебедева A.C. Изменение спектра протеолитических ферментов в прорастающих семенах пшеницы при гипертермии на фоне экзогенной гибберелловой кислоты // Материалы 13-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2009. - С. 234-235.

18. Лебедева A.C., Веселов А.П., Александрова И.Ф. Амилолиз в прорастающих зерновках пшеницы под действием теплового шока и экзогенной гибберелловой кислоты // Материалы V Международной научно-практической конференции «Динамика современной науки». - София, 2009. - С. 23-26.

19. Лебедева A.C., Веселов А.П., Александрова И.Ф. Роль гидролаз в распаде запасных биополимеров прорастающих зерновок пшеницы при адаптации к гипертермии // Материалы Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды». - Иркутск, 2009. - С. 272-274.

20. Lebedeva A. Effects of heat shock and exogenous gibberellic acid on amylolysis in germinating wheat grains // Materials of IV International young scientists conference «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution». - Odesa, 2009. - P. 37-38.

21. Лебедева A.C., Александрова И.Ф., Веселов А.П. Об устойчивости прорастающих семян пшеницы к гипертермии // Материалы Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы современной науки и образования». - Башкортостан, 2010. -С. 250-253.

Список принятых сокращений

ГК - гибберелловая кислота

ДФФ — диизопропилфторфосфат

ИАА - иодацетамид

ЛДК - лизиндекарбоксилаза

ПХМБ - п - хлормеркуриобензойная кислота

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная.кислота

Подписано к печати 13.! 1.2010 г. Формат 60x84/16; усл. печ. л. 1.3. Тираж 100. Заказ № 1653 Отпечатано в типографии ОАО «НМЗ». Адрес: 603052 г. Нижний Новгород, ул. Сормовское шоссе, д. 21

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лебедева, Александра Сергеевна

Оглавление

Список принятых сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Прорастание семян и мобилизация запасных веществ.

1.2. Роль гибберелловой кислоты в процессе прорастания семян.

1.3. Характеристика протеолитических ферментов растений.

1.3.1. Аспартатные эндопептидазы семян злаков.

1.3.2. Цистеиновые эндопептидазы.

1.3.3. Сериновые протеиназы и карбоксипептидазы семян злаков.

1.4. Характеристика амилаз растений.

1.5. Протекторная роль в ответ на стресс некоторых водораство- 34 римых органических соединений в растениях.

2. Материалы и методы исследования.

2.1. Постановка опытов.

2.2. Определение протеолитической активности.

2.3. Определение амилолитической активности.

2.4. Определение активности лизиндекарбоксилазы.

2.5. Определение содержания пролина.

2.6. Методы определения некоторых физико-химических пара- 50 метров прикорневого раствора.

2.7. Статистическая обработка данных.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Протеолитическая активность проростков пшеницы.

3.1.1. Уровень протеолиза в прорастающих семенах пшеницы.

3.1.2. Ингибиторный анализ вклада различного типа протеаз в рас- 53 пад запасных белков.

3.1.3. Влияние гипертермии (42°С) на активность и спектр протеолитических ферментов в зерновках пшеницы.

3.1.4. Протеолитическая активность в надземной части проростков.

3.1.5. Влияние экзогенной ГК на уровень протеолиза в прорастаю- 69 щих зерновках пшеницы.

3.1.6. Протеолитическая активность зерновок пшеницы при 72 46°С.

3.2. Амилолитическая активность зерновок пшеницы при гипер- 80 термин и на фоне гибберелловой кислоты.

3.2.1. Активность амилаз прорастающих семян пшеницы.

3.2.2. Влияние гипертермии на амилазную активность.

3.2.3. Действие экзогенной гибберелловой кислоты на интенсив- 88 ность амилолиза в семенах пшеницы.

3.3. Влияние гипертермии и экзогенной гибберелловой кислоты 92 на содержание свободного пролина в проростках пшеницы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние гипертермии и экзогенной гибберелловой кислоты на активность протеолитических и амилолитических ферментов в прорастающих семенах пшеницы"

Актуальность темы

Считается, что превышение оптимальной температуры для конкретного вида растений на 10 — 15 °С является стрессирующим и вызывает цепь ответных реакций в организме, направленных на передачу стресс-сигнала и повышение устойчивости, выражающейся в сдвиге многих метаболических реакций и физиологических процессов (Веселова с соавт., 1993; Кузнецов, 1993; Тарчевский, 1993; Кулаева, 1997 и др.). К неспецифическим ответам на различные виды стресс-воздействия относятся изменения редокс-потенциала клеток, проницаемости и функциональной активности мембран, фотосинтетической активности хлоропластов, уровня экспрессии ряда генов, сдвиги в гормональном балансе, интенсивности некоторых ката-болических реакций, накопление протекторных соединений и др. (Блехман, Шеламова, 1992; Глянько, 1996; Боровский, 2003; Титов, 2006; Косаков-ская, 2008). Адаптивному регулированию подвержены не только скорости и направленность биохимических реакций, но и структурно-функциональное состояние молекул биополимеров (Артюхов с соавт., 2004).

Прорастание семян и ранние стадии формирования проростка - важные этапы жизни растений, оптимальное их прохождение во многом определяется использованием запасных биополимеров, что обеспечивает в дальнейшем благоприятное развитие и формирование урожая. В связи с этим детальное изучение влияния гипертермии на катаболизм запасных веществ в прорастающих семенах представляет значительный теоретический интерес, а также является полезным для практики. Не менее важным является и выяснение возможного участия в ответной реакции на стресси-рующее воздействие пролина, образующегося при гидролизе запасных белков, а также поиск способов коррекции возникающих при тепловом стрессе отклонений.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучение интенсивности катаболизма запасных белков и крахмала, а также накопления свободного пролина в прорастающих зерновках пшеницы при тепловом стрессе и добавлении экзогенной гибберелловой кислоты (ГК).

В работе были поставлены следующие задачи:

4. Оценить содержание одного из протекторных соединений — свободного пролина в проростках пшеницы при высокотемпературном воздействии.

Научная новизна.

Детально исследовано влияние гипертермии (42 °С и 46 °С, 2 часа) на активность протеолитических и амилолитических ферментов в семенах пшеницы на ранних стадиях формирования проростка. Продемонстрировано изменение спектра протеолитических ферментов и соотношения а- и р-амилаз в условиях гипертермического воздействия. Установлено модулирующее влияние экзогенной гибберелловой кислоты на высокотемпературный эффект в первые дни формирования проростка. Получены данные, характеризующие динамику накопления свободного пролина в прорастающих семенах пшеницы в условиях гипертермии и на фоне экзогенной гибберелловой кислоты.

Научно-практическая значимость.

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на X, XII Нижегородских сессиях молодых ученых (Н.Новгород, 2005, 2007), XII и XIV Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2005, 2007), Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), IV и V Международных научных конференциях «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005, 2007), VI съезде общества физиологов растений России Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), III и IV Международных конференциях молодых ученых «Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация» (Одесса, 2007, 2009), 2nd International Symposium «Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture» (Kyiv, 2007), III Всероссийской научной конференции «Принципы и способы сохранения биоразнообразия» (Йошкар-Ола, Пущино, 2008), Международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), 13-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2009), V Международной научно-практической конференции «Динамика современной науки» (София, 2009), Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Башкортостан, 2010).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 21 работа, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Лебедева, Александра Сергеевна

108 Выводы

1. Показано изменение спектра протеолитических ферментов в динамике прорастания семян пшеницы (2, 5, 7 сутки). Максимум активности ас-партильных протеаз (рН 3,5) приходится на 5 сутки, цистеиновых (рН 4,5) - на 7 сутки; цистеиновых, сериновых и металлопротеаз (рН 5,5) — тоже на 7 сутки. Активность щелочных протеолитических ферментов — сериновых и металлопротеаз (рН 7,8) в зерновках остается низкой на всем этапе формирования проростков.

2. Под влиянием повышенной температуры (42 °С, 2 часа) наблюдалось снижение уровня протеолиза в зерновках, определяемого при рН 3,5 за счет падения активности аспартильных протеаз и рН 5,5, в основном, металлопротеаз во все исследованные сроки прорастания. Однако у 2- и 5-суточных стрессированных проростков существенно не изменялась благодаря возрастанию вклада цистеиновых протеаз (рН 4,5). Более жесткое гипертермическое воздействие — 46 °С, реже приводило к падению протеолитической активности по сравнению с 42 °С.

4. Тепловое воздействие 42 °С увеличивало уровень суммарной активности амилаз (а+Р) как за счет а-, так и (3-амилаз. Эффект ГК, выражающийся в повышении амилолитической активности, был более отчетливым по сравнению с тепловым стрессом. При 46 °С не отмечено достоверных отклонений в степени амилолиза.

5. Гипертермия (42 °С и 46 °С), в большинстве случаев, не приводила к существенным изменениям в содержании свободного пролина в прорастающих зерновках на фоне его высокого содержания. Защитные механизмы зерновок в ответ на стрессирующее воздействие, вероятно, не связаны с накоплением этого протекторного соединения. Гипертермия не влияла на активность фермента ЛДК в зерновках, продуктом которого является кадаверин, также выполняющий защитную функцию.

Заключение

В ответе на стреесирующий фактор различают специфические и неспецифические реакции. Первые характерны для начального периода воздействия и зависят от вида стрессора, а последующие события, развивающиеся в организме, являются довольно общими. К специфическим реакциям, прежде всего, относится перцепция стрессового сигнала и его последующая передача на определенные гены (Новикова с сотр., 2007, ЬагктсЫе, Х^егНг^, 2008). Для этого в плазматической мембране клеток есть сенсорные белки и передающие сигнал белки. Клеточная мембрана является первичной мишенью при действии различных стрессоров на растения (А1раз1ап, випез, 2001; Ва^1 е! а1., 2003 и др.).

В типичной двухкомпонентной системе рецептор обладает протеин-киназной активностью, у растений это обычно серин-треониновая или ти-розиновая протеинкиназная активность. Рецептор имеет сенсорный домен, воспринимающий изменения в окружающей среде, в том числе, и температурные. Сдвиги в текучести мембран, происходящие при повышении температуры, улавливаются сенсорным доменом. Это ведет к автофосфорили-рованию рецептора и последующему каскаду фосфорилирования белков. Фосфорилированный белок-передатчик сигнала связывается с промотор-ными областями регулируемых им генов и изменяет (усиливает или ослабляет) уровень транскрипции. Как пишется в работе Г.В. Новиковой с сотр. (2007), I. ЬагктсЫе, Е. У1ег1^ (2008), обнаружено множество генов, отвечающих на изменение температуры. Продуктами этих генов могут быть и регуляторные молекулы - растительные гормоны АБК, этилен, салициловая кислота (Xiong е! а1., 2002; Ван с сотр., 2004; Рябушкина, 2005). Эти вторичные сигнальные молекулы запускают другие каскады событий, отличающиеся от первичных по времени, пространству. Они, в свою очередь, инициируют множество ответов, которые взаимодействуют между собой. Только один первичный стрессор может активировать большое число реакций. Такое взаимодействие различных каскадных реакций обеспечивает в итоге наличие неспецифической составляющей в ответе на различные стрессоры (Шакирова, 2001). Степень изменений, их характер, направленность, а также роль для организма определяется многими факторами.

На вопрос, являются ли отклонения вредными для организма или носят адаптивный характер, часто ответить непросто. Мы полагаем, что примененный нами абиотический стрессор (42°С и 46°С, 2 часа) и вызванные им неспецифические отклонения в распаде запасных веществ семени, можно отнести к защитно-приспособительным, поскольку стрессирующее воздействие не приводило к снижению жизнеспособности. Зафиксированные нами, как правило, относительно небольшие изменения активности гидролитических ферментов, очевидно, позволяют говорить о большой устойчивости прорастающих семян злаков к кратковременной гипертермии и о высокой надежности данной биологической системы. Такая устойчивость , вероятно, генетически запрограммирована и обеспечивает сохранение вида. Большая степень толерантности прорастающих семян пшеницы к повышенным температурам продемонстрирована G.K. Hunjan (2006). При выдерживании 2-дневных семян в течение 3 часов при t=50°C большая часть семян сохраняла жизнеспособность. Очевидно у семян высок конститутивный протекторный потенциал. В.В. Кузнецов (1993) предлагает различать конститутивный и индуцибельный механизмы адаптации. Протекторный потенциал конститутивных систем включается первым и, если он оказывается недостаточным, подключаются дополнительные физиологические механизмы защиты от стрессовых воздействий.

Следует также учитывать, что высокая устойчивость семян злаков может быть связана с тем, что запасенные углеводы и белки в процессе их распада обеспечивают зерновку и растущий проросток в достаточном количестве протекторными соединениями — пролином, олиго- и моносахаридами. Причем, как отмечает H.A. Рябушкина (2005), комбинации различных протекторных соединений даже при низких концентрациях могут быть более эффективны, чем накопление одного защитного вещества в сравнительно высоких концентрациях, благодаря синергическому или аддитивному действию. Кроме того продукты распада белков, полисахаридов обладают и регуляторными свойствами. В частности, сахара участвуют в изменении гормонального баланса растений поскольку способны образовывать конъюгаты с фитогормонами (Пахомова, Чернов, 1996). Вместе с тем, исследуемые нами процессы протеолиза и амилолиза, очевидно, принимают участие в адаптации прорастающих зерновок пшеницы и формирующихся проростков к стрессирующим внешним условиям. Определенная роль здесь должна принадлежать не только изменению активности, но и сдвигам в соотношении различных типов протеаз и а- и Р-амилаз, что отмечено в наших экспериментах.

Высокая устойчивость прорастающих семян и формирующихся проростков может быть связана и с тем, что в наших опытах они находились в условиях отсутствия света. По мнению J. Larkindale, M.R. Knight (2002), окислительный стресс, развивающийся под влиянием стрессоров различной природы и вызывающий многие последующие события, является, прежде всего, фотострессом, т.е. результатом нарушения работы фотосинтетической электронтранспортной цепи. К такому выводу авторы приходят на основании исследований с 10-дневными растениями Arabidopsis. Они продемонстрировали, что окислительный стресс и снижение выживаемости проростков, вызываемые гипертермией (1 час, 40°С), был ярко выражен, если растения сразу после стресса на 3 дня помещали на свет. При помещении в темноту эти показатели были близки к таковым у контрольных растений.

Более значительные, по сравнению с гипертермией, изменения, наблюдаемые в наших экспериментах в ранние исследуемые сроки под влиянием экзогенной ГК и имеющие противоположную направленность, позволяют рассматривать применение ГК как способ, позволяющий корректировать возникающие при гипертермии отклонения в активности катаболизма запасных. Т.е. ГК способствует повышению стресс-толерантности. Однако, подобная реакция возможна только в том случае, если воздействие не было жестким, повреждающим. На эффективность ГК в восстановлении метаболизма, нарушенного засолением, у вигны пишется в статье N. СИакгаЬагЫ, Б. МикЬег^ (2003). Предварительное опрыскивание листьев ГК в концентрации 0,1-10 мкМ приближало к контрольным значениям активность су-пероксиддисмутазы (СОД), каталазы, пероксидазы, содержание малонового диальдегида (МДА), перекисей в листьях и корнях растений.

Полученные в данной работе результаты также дают основание говорить о том, что в ответ на стресс направленность изменений различных ка-таболических реакций может быть неодинаковой. Так, при 42°С активность протеолитических ферментов в большинстве случаев снижалась, а амило-литических возрастала. Гипертермия 46°С не приводила к изменению уровня протеолиза, но наблюдалась тенденция к снижению уровня амило-лиза и увеличению доли р-амилаз.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лебедева, Александра Сергеевна, Москва

1. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов B.JL Протеасома: разрушать, чтобы жить // Молекулярная биология. - 2002. - Т. 36, № 5. - с. 761 - 776.

2. Авальбаев A.M., Юлдашев P.A., Шакирова Ф.М. Физиологическое действие фитогормонов класса брассиностероидов на растения // Успехи современной биологии. 2006. - Т. 126, № 2. - с. 192 - 201.

3. Акаева М.М., Фурсов О.В. Синтез, активация и секреция а-амилазы алейронового слоя щитка зерновки пшеницы // Физиология растений. -1990.-Т. 37.-Вып. 6. с. 1180- 1185.

4. Акимова Т.В., Титов А.Ф., Топчиева J1.B. Сравнительное изучение реакции растений на действие высоких закаливающих и повреждающих температур // Физиология растений. — 1994. — Т. 41, № 3. с. 381 - 385.

5. Александрова И.Ф., Веселов А.П., Ефременко Ю.Р. Протеолитическая активность прорастающих семян пшеницы при тепловом стрессе // Физиология растений. 1999. - Т. 46, № 2. - с. 223 - 225.

6. Александрова И.Ф., Николаева Т.Н., Веселова A.A. Влияние гипертермии на соотношение протеиназ различных типов в прорастающих зерновках пшеницы // Вестник ННГУ, сер. Биология. — 2001. — Вып. 1 (2). — с. 172 175.

7. Андреев И.М. Функции вакуоли в клетках высших растений // Физиология растений. 2001. - Т. 48, № 5. - с. 777 - 787.

8. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.- МГУ. - 1991. - 406 с.

9. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Вашанов Г.А., Наквасина М.А., Путинце-ва О.В. Тепловая денатурация олигомерных белков: структурно-функциональные изменения, последовательность стадий // Биофизика. — 2004. Т. 49. - Вып. 4. - с. 617 - 630.

10. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., Элпидина Т.А. Последовательное участие протеиназ в гидролизе главного запасного белка семян гречихи // Биоорганическая химия. 1994. - Т. 20, № 3. - с. 242 - 248.

11. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е, Протеолитические ферменты и их ингибиторы в семенах гречихи // Физиология растений. — 1999. — Т. 46, № 3.-с. 388-399.

12. Блехман Г. И., Шеламова Н. А. Синтез и распад макромолекул в условиях стресса// Успехи современной биологии. 1992. - Т. 112. - Вып. 2. -с. 281-294.

13. Богачева A.M. Субтилизины растений // Биохимия. — 1999. — Т. 64. — Вып. З.-с. 347-353.

14. Боровский Г.Б. Стрессовые белки растений при неблагоприятных температурных условиях // Автореферат диссертации. — Иркутск. — 2003. — 43 с.

15. Валиуллина Р.Н., Рябова В.В., Хохлова Л.П. Изменение экспрессии генов белков теплового шока в связи с разной устойчивостью растений к повышенной температуре // ДАН. 2008. - Т. 422, № 6. - с. 845 - 847.

16. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Белки-ингибиторы протеиназ в семенах. 1. Классификация, распространение, структура и свойства // Физиология растений. 1999. - Т. 46, № 3. - с. 362 - 378.

17. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Белки-ингибиторы протеиназ в семенах. 2. Физиологические функции // Физиология растений. — 1999. — Т. 46, № 3. — с. 379-387.

18. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений // Успехи биологической химии. — 2002. — Т. 42. -с. 193-216.

19. Ван Л-Д., Хуан В-Д., Чжан Д-Ч., Юй Ф-И. Транспорт 14С-салициловой кислоты в молодых растениях винограда, подвергнутых тепловому шоку // Физиология растений. 2004. - Т. 51, № 2. - с. 217 - 221.

20. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений. М., Моск.ун-тет. 1993. - 140 с.

21. Войников В.К., Боровский Г.Б. Роль стрессовых белков в клетках при гипертермии // Успехи современной биологии. 1994. — Т. 114. — Вып. 1. — с. 85-95.

22. Володин В.И., Гуринович О.И. Гетерогенность альбуминовой и глобу-линовой фракций белков зерновых бобовых культур. В сб. Растительные белки и их биосинтез М.: Наука. - 1975. - с. 122 - 126.

23. Вонг М., Бакуйзен Р., Хеймоваара-Диикстра С. и др. Роль абсцизовой кислоты и гиббереллина в проявлении покоя семян ячменя. Сравнение состояния покоя зародышей и клеток алейронового слоя // Физиология растений. 1994. - Т. 41, № 5. - С. 659 - 667.

24. Гильманов М.А., Фурсов О.В., Францев А.П. Методы очистки и изучения ферментов растений. Алма-Ата. - 1981 - 92 с.

25. Гималов Ф.Р., Чемерис A.B., Вахитов В.А. О восприятии растением хо-лодового сигнала // Успехи современной биологии. 2004. - Т. 124, № 2. - с. 185 - 196.

26. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика. — 1999. — 459 с.

27. Глянько А.К. Температурный стресс: механизмы термоустойчивости, рост, развитие и продуктивность растений // Сельскохозяйственная биология. 1996, № 3. - с. 3 - 19.

28. Головацкая И.Ф. Регуляция гиббереллинами роста, развития и гормонального баланса растений Arabidopsis на зеленом и синем свету // Физиология растений. 2008. - Т. 55, № 3. - с. 348 - 354:

29. Гумилевская H.A. Синтез белка в созревающих и прорастающих семенах. В сб. Растительные белки и их биосинтез. М.: Наука. 1975. - с. 195 -220.

30. Гумилевская H.A., Чумикина A.B., Шатилов В.Р. Синтез белка и РНК в прорастающих семенах // Биохимия. 1995. - Т. 60, № 1. - с. 35 - 49.

31. Дарканбаев Г.Б., Фурсов О.В. Амилазы зерновых и регуляция их активности // Успехи биологической химии. М. - 1982. - Т. 22. - с. 137 -148.

32. Джонс Р.Л., Стоддарт Дж.Л. Гиббереллины и прорастание. В сб.

33. Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. М.: Колос. 1982. - с. 99- 129.

34. Домаш В.И., Буснюк О.В., Забрейко С.А. и др. Белковые ингибиторы эндогенных протеиназ растений // Тез. докл. 4-го симпозиума: «Химия протеолитических ферментов». М. 1999. - с. 89.

35. Домаш В.И., Шарино Т.П., Забрейко С.А., Сосновская Т.Ф. Протеоли-тические ферменты и ингибиторы трипсина высших растений в условиях стресса // Тезисы доклада VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов». 2007. - с. 121.

36. Домаш В.И., Шарино Т.П., Забрейко С.А., Сосновская Т.Ф. Протеоли-тические ферменты и ингибиторы трипсина высших растений в условиях стресса // Биоорганическая химия. — 2008. Т. 34, № 3. — с. 353 - 357.

37. Ду Хай, Занг Ли, Лиу Лей Биохимические и молекулярные характеристики MYB-семейства факторов транскрипции растений // Биохимия. — 2009. Т. 74. - Вып. 1. - с. 5 - 16.

38. Дунаевский Я.Е., Сарбаканова М.Т., Белозёрский М.А., Заиров С.З. Совместное действие протеаз покоящегося и прорастающего зерна пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. 1990. - Т. 26, № 2. — с .273 -278.

39. Духовский П., Юкнис Р., Бразайтите А., Жукаускайте И. Реакция растений на комплексное воздействие природных и антропогенных стрессоров // Физиология растений. — 2003. — Т. 50, № 2. с. 165- 173.

40. Едрева A.M., Беликова В.Б., Цонев Т.Д. Фениламиды в растениях // Физиология растений. 2007. - Т. 54, № 3. - с. 325 - 341.

41. Жанг X., Чанг 3. Протеиназа человека Htr 2: температурная зависимость протеиназной активности и структурные свойства // Биохимия. — 2004. — Т. 69.-Вып. 6.-с. 843-850.

42. Замятнина В.А., Бакеева JI.E., Александрушкина Н.И. Апоптоз у этиолированных проростков пшеницы // Физиология растений. 2002. - Т. 49, № 6. - с. 828 - 838.

43. Зубо Я.О., Лысенко Е.А., Алейникова А.Ю., Кузнецов В.В., Пшибытко Н.Л. Изменение транскрипционной активности генов пластома ячменя в условиях теплового шока // Физиология растений. — 2008. — Т. 55, № 3. — с. 323-331.

44. Каракеева Р.К., Акаева М.М., Юсупова Р.К., Фурсов A.B. Протеоли-тические ферменты как активаторы р-амилазы белковых тел созревающего зерна пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. 1991.-Т. 23.-Вып. 1.-е. 114- 118.

45. Кафи М., Стюарт В., Борланд А. Содержание углеводов и пролина в листьях, корнях и апексах сортов пшеницы, устойчивых и чувствительных к засолению // Физиология растений. 2003. - Т. 50, № 2.-е. 174 - 182.

46. Келес Ю., Онсел И. Рост и содержание ряда растворимых метаболитов у двух видов пшеницы, подвергнутых совместному действию нескольких стресс-факторов //Физиология растений. 2004. - Т. 51, № 2. - с. 228 - 233.

47. Кирьян И.Г., Шевякова Н.И. Пути накопления свободного пролина у NaCl-резистентной клеточной линии Nicotiana sylvestris // Физиология растений. 1984. - Т. 31. - Вып. 4. - с. 298 - 302.

48. Климов С.В. Пути адаптации растений к низким температурам // Успехи современной биологии. 2001. - Т. 121, № 1. — с. 3 — 22.

49. Колупаев Ю.Е., Трунова Т.Я. Особенности метаболизма и защитные функции углеводов растений в условиях стрессов. // Физиология и биохимия культурных растений. 1992. - Т. 24. - Вып. 6. — с. 523 - 530.

50. Колупаев Ю.Е., Акинина Г.Е., Мокроусов A.B. Индукция теплоустойчивости колеоптилей пшеницы ионами кальция и ее связь с окислительным стрессом // Физиология растений. 2005. - Т. 52, № 2. - с. 227 - 232.

51. Конарев В.Г. Белки пшеницы. М: Колос. 1980. - 351 с.

52. Косаковская И.В. Стрессовые белки растений. Киев. 2008. — 154 с.

53. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур. М: Дрофа.-2010.-638 с.

54. Кузнецов В.В. Молекулярные механизмы устойчивости и адаптации целого растения к стрессовым факторам // 3 съезд Всерос.общ-ва физ. раст. Сп-б.- 1993.-е. 636-639.

55. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. - Т. 46, № 2. - с. 321 -336.

56. Кузнецов В.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И. Полиамины при стрессе: биологическая роль, метаболизм и регуляция // Физиология растений. -2006. Т. 53, № 5. - с. 658 - 683.

57. Кулаева О.Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к тепловому шоку // Соросовский образовательный журнал. — 1997, № 2. — с. 5 -13.

58. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов // Биохимия. 2004. — Т. 69. — Вып. 3. - с. 293-310.

59. Ладыженская Э.П., Проценко М.А. Биохимические механизмы передачи внешних сигналов через плазмалемму растительной клетки при регуляции покоя и устойчивости // Биохимия. 2002. - Т. 67. — Вып. 2. — с. 181 -193.

60. Ладыженская Э.П., Кораблева Н.П. Взаимодействие фитогормонов при регуляции протон-транслоцирующей активности плазмалеммы растительной клетки // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39, № 3. -с. 341 -345.

61. Макаренко С.П., Труфанов В.А., Путилина Т.Е. Изучение вторичной структуры проламинов пшеницы, ржи и ячменя методами ИК спектроскопии // Физиология растений. - 2002. - Т. 49, № 3. - с. 365 - 370.

62. Мелехов Е.И. Принцип регуляции скорости процесса повреждения клетки и реакция защитного торможения метаболизма (РЗТМ) // Журнал общей биологии. 1985, № 46. - с. 561 - 567.

63. Минасбекян Л.А., Явроян Ж.В., Дарбинян М.С., Вардованян П.О. Изменение состава фосфолипидов пшеницы под действием гиббереллинов // Физиология растений. 2008. - Т. 55, №3.-с. 412-418.

64. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М. - 1971. - 154 с.

65. Мосолов В. В. Новое о природных ингибиторах протеолитических ферментов // Биоорганическая химия. 1998. - Т. 26. - с. 273 - 278.

66. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений // Прикладная биохимия и молекулярная биология. — 2005. — Т. 41, № З.-с. 261 -282.

67. Нестеренко М.В., Кузолев В.А., Мосолов В.В. Выделение различных форм а-амилаз из пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. -1990. Т. 26. - Вып.5. - с. 425 - 430.

68. Новикова Г.В., Мошков И.Е., Лось Д.А.Белковые сенсоры и передатчики холодового и осмотического стрессов у цианобактерий и растений // Молекулярная биология. 2007. - Т. 41, № 3. - с. 478 - 490.

69. Новожилова O.A., Тимощенко A.C., Арефьева Л.П., Семихов В.Ф. Свободные и связанные аминокислоты семян кукурузы с внедрёнными чужеродными проламинами при прорастании // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39, № 3. - с. 343 - 352.

70. Обручева Н.В., Антипова О.В. Физиология инициации прорастания семян // Физиология растений. 1997. - Т. 44, № 2. - с. 287 - 302.

71. Павлов А.Н. Накопление белка в зерне пшеницы и кукурузы. М.: Наука. 1967.-339 с.

72. Павлов А.Н. Повышение содержания белка в зерне. М. - 1984. — 119 с.

73. Пахомова В.М., Чернов И.А. Некоторые особенности индуктивной фазы неспецифического адаптационного синдрома растений // Известия РАН, сер. биол. 1996, № 6. - с. 705 - 715.

74. Плохинский H.A. Математические методы в биологии. М. - 1978. - 261 с.

75. Прадедова Е.В., Озолина Н.В., Саляев Р.К. Влияние фитогормонов на протонные насосы тонопласта корнеплодов столовой свеклы Beta vulgaris L. в разных буферных системах // Биологические мембраны. 2004. - Т. 21, № 1. — с. 15-18.

76. Прокофьев A.A. Физиология семян. М.: Наука. 1982. - 154 с.

77. Прусакова Л.Д., Малеванная H.H., Белопухов С.Л., Вакуленко В.В. Регуляторы роста растений с антистрессовыми и иммунопротекторными свойствами // Агрохимия. 2005, № 1. - с. 76 - 86.

78. Пшибытко Н.Л., Калитухо Л.Н., Жаворонкова Н.Б., Кабашникова Л.Ф. Состояние фонда хлорофилловых пигментов в проростках ячменя разного возраста в условиях теплового шока и водного дефицита // Физиология растений. 2004. - Т. 51, № 1. - с. 20 - 26.

79. Пятыгин С.С. Стресс у растений: физиологический подход // Журнал общей биологии. 2008. - Т. 69, № 9. - с. 294 - 298.

80. Радюкина Н.Л., Шашукова A.B., Шевякова Н.И., Кузнецов В.В. Участие пролина в системе антиоксидантной защиты у шалфея при действии NaCl и параквата // Физиология растений. 2008. - Т. 55, № 5. - с. 721 - 730.

81. Ротанова Т.В. Энергозависимый селективный внутриклеточный проте-олиз. Строение, активные центры и специфичность АТР-зависимых про-теиназ // Вопросы медицинской химии. — 2001, № 1. — с. 7 — 14.

82. Ротанова Т.В., Абрамова Е.Б., Шарова Н.П. От парадокса к Нобелевской премии // Биологические мембраны. 2005. - Т. 22, № 2. - с. 151 - 156.

83. Руденская Г.Н., Богачева A.M., Чикилева И.О. и др. Серино-вые протеиназы листьев подорожника Plantago major. // 4-й Съезд О-ва физиологов растений. Тез. докл. 1999. - Т. 2. - 678 с.

84. Рябушкина H.A. Синергизм действия метаболитов в ответных реакциях растений на стрессовые факторы // Физиология растений. 2005. - Т. 52, № 4.-с. 614-621.

85. Савченко Г.Е., Ключарева Е.А., Кабашникова Л.Ф. Структурная перестройка мембран этиопластов при тепловом стрессе // Биологические мембраны. 2006. - Т. 23, № 6. - с. 476 - 483.

86. Сарбаканова Ш.Т., Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., Заиров С.З. О наличии аспартильной протеиназы в семенах пшеницы. Выделение и характеристика фермента // Биохимия. 1988. - Т. 53. - Вып. 5 - с. 20 - 31.

87. Сарбаканова Ш.Т., Дунаевский Я.Е., Белозёрский М.А., Руденская Г.Н. Карбоксипептидаза семян пшеницы // Биохимия. 1987. - Т. 52. - Вып. 8.-с. 42 - 47.

88. Снедекор Д.У. Статистические методы в применении к исследованиям в сельском хозяйстве и биологии. М. - 1961.-61 с.

89. Соболев A.M., Суворов В.И. О некоторых особенностях белков алейроновых зерен. В сб. Растительные белки и их биосинтез. М.: Наука. - 1975. -с. 126- 136.

90. Соболев A.M., Жданова Л.П. Отложение веществ в запас. В кН. Физиология семян. -М.: Наука. 1982. - с. 48 - 101.

91. Соболев A.M. Запасание белка в семенах растений М.: Наука. - 1985. -113 с.

92. Стаценко А.П. О криозащитной роли аминокислот в растениях // Физиология и биохимия культурных растений. 1992. - Т. 24, № 6. - с. 560 -564.

93. Степанов В.М. Эволюция протеиназ. Аналогии и параллели. Тез.докл. 4 симпозиума "Химия протеолитических ферментов". М. 1997. - 7 с.

94. Сун С., Лян Е., Тян К. Метаболизм пролина и перекрестная устойчивость к засолению и тепловому стрессу у прорастающих семян пшеницы // Физиология растений. 2005. - Т. 52, № 6. - с. 879 - 904.

95. Сун С., Лиу С., Го С., Хуан Б., Ли В., Ван С., Тан К. Клонирование и анализ нового семейства консервативных мембранных цинк-содержащих металлопротеаз из Solanum surattense // Физиология растений. — 2007. — Т. 54, № 1.-е. 72-84.

96. Тарчевский И.А. Катаболизм и стресс у растений. М: Наука. 1993. -92 с.

97. Титов А.Ф. Устойчивость растений в начальный период действия неблагоприятных температур. М.: Наука. 2006. - 143 с.

98. Физиология и биохимия покоя о прорастания семян. Под ред. Николаевой М.Г., Обручевой H.B. М.: Колос. 1982. - 495 с.

99. Фролова С.А. Влияние низкой температуры на активность протеиназ-но-ингибиторной системы растений // Автореферат кандидатской диссертации. — 2008. Петрозаводск. — 23 с.

100. Фролова С.А., Титов А.Ф. Активность протеолитических ферментов и ингибиторов трипсина в листьях пшеницы в начальный период действия и в последействии низкой закаливающей температуры // Известия РАН, сер. Биол. 2008, № 5. - с. 549 - 552.

101. Хавкин Э. Е. Обмен веществ прорастающих семян: в кн. Физиология семян. М. - 1982. - с. 275 - 310.

102. Чеботарева H.A., Курганов Б.И., Ливанова Н:Б. Биохимические эффекты молекулярного краудинга // Биохимия. 2004. — Т. 69. - Вып. 11.-е. 1522-1536.

103. Чигрин В.В. Активность гидролитических ферментов у устойчивых и восприимчивых сортов пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной // Физиология растений. 1988. - Т. 35. - Вып. 4. - с. 781 - 786.

104. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. С-П. — 2002. 244 с.

105. Шакирова Ф.М: Неспецифическая устойчивость растений к стрессовымфакторам и ее регуляция. Уфа: Гилем. 2001. - 160 с.

106. Шакирова Ф.М., Авальбаев A.M., Чемерис A.B., Вахитов В.А. Гормональная регуляция транскрипции у растений // Молекулярная биология. — 2002. Т. 36, № 4. - с. 585 - 592.

107. Шатуня И.С. Влияние кратковременного теплового шока на свойства белков клеточных ядер и пластид озимой ржи // Автореферат диссертации.- Минск. 2008. - 20 с.

108. Шишова Т.К., Руденская Ю.А., Лихолат Т.В., Мосолов В.В. Восстановление жизнеспособности зерна пшеницы, подвергнутого стрессовому воздействию, под влиянием ризосферных микроорганизмов // ДАН. 1997.- Т. 35/6, № 2. с. 285 - 286.

109. Шорина М.В. Аккумуляция кадаверина и его физиологическая роль при действии солевого стресса: Автореферат канд. дисс. М. 2005. - 30 с.

110. Штаркман И.Н., Гудков С.В., Черников А.В., Брусков В.И. Образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах а-аминокислот при воздействии рентгеновского излучения и тепла // Биофизика. 2008.-Т. 53.-Вып. 1.-е. 5- 13.

111. Шутов А.Д., Вайнтрауб Н.А., Белтей И.К. Цистеиновая протеиназа из прорастающих семян пшеницы: частичная очистка и гидролиз клейковины до коротких пептидов // Биохимия. 1984. - Т. 49. - Вып. 7. - с. 21 - 29.

112. Ablet Н. Xinjiang nongye daxue xuebao // J. Xingjiang Agr. Univ. 2003. -Vol. 26, №4.-p. 16-19.

113. Ai S., Hideki K., Takao M. Hormonal regulation of expression of two cysteine endopeptidase genes in rice seedlings // Plant and cell physiol. — 1997. — Vol. 38, № 11.-p. 1242-1248.

114. Alpaslan M., Gunes A. Interactive effects of boron and salinity stress on the growth, membrane permeability and mineral composition of tomato and cucumber plants // Plant Soil. 2001. - Vol. 236. - p. 123 - 128.

115. Alvey L., Harberd N.P. DELLA proteins: Integrators of multiple plant growth // Phys. Plant. 2005. - Vol. 123, № 2. - p. 153 - 160.

116. Appleford N.E., Wilkinson M.D., Ma Q. et al. Decreased shoot stature and grain alpha-amylase activity following ectopic expression of gibberellin 2-oxidase gene in transgenic wheat // J. Exp. Bot. 2007, № 58/12. — p. 3213 -3226.

117. Asakura T., Matsumoto I., Funaki J. et al. The plant aspartic proteinase-specific polypeptide insert is not directly related to the activity of oryzasin // European Journal of Biochemistry. 2000. - Vol. 267, № 16. - p. 5115 - 5122.

118. Bates L.S., Walebun R.P., Feeare J.D. Rapid determination of free proline for water-stress studies // Plant and Soil. 1973. Vol. 39, № 1. P. 205 207.

119. Beer E.P., Woffenaen B.J., Zhac C. Plant proteolitic enzymes: Possible roles during programmed cell death // Plant Mol. Biol. — 2000. — Vol. 44, № 3. -p. 399-415.

120. Bethke P.C., Swanson S.J., Hillmer S., Jones R.L. From storage compartment to lytic organelle: the metamorphosis of the aleurone pritein storage vacuole // Annals of botany. 1998. - Vol. 82. - p. 399 - 412.

121. Bleukx W., Brijs K., Torrekens S. et al. Specificity of a wheat gluten aspartic proteinase. // Biochim Biophys Acta. 1998. - Vol. 1387, № 1-2. - p. 317 -324.

122. Bo J.W., Amnon L., Ella L., Nehemia A. Senescence-related serine protease in parsley // Phytochemistry. 1999. - Vol. 50, № 1. - p. 377 - 382.

123. Callis J. Regulation of protein degradation // The Plant Cell. 1995. - Vol. 7.-p. 845 -857.

124. Chakrabarbi N, Mukherji S. Alleviation of NaCl stress by pretreatment with phytohormones in Vigna radiata // Biol, plant. — 2003. — Vol. 46, № 4. — p. 589-594.

125. Chang Y.-C., Lee T.-M. High temperature-induced free proline accumulation in Gracilaria tenuistipata (Khodophyta) // Botanica bullitene academic science. 1999. - Vol. 40. - p. 289 - 294.

126. Chen P-W, Lu C-A., Tseng T-H., Yu S-M., Wang C-S., Yu T-S. Rice a-amylase transcriptional enhancers direct multiple mode regulation of promoters in transgenic rice // Journal Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - p. 13641 - 13649.

127. Chen P-W., Chiang C-M., Tseng T-H., Yu S-M. Interaction between rice MYBGA and the gibberellin response element controls tissue-specific sugar sensitivity of a-amylase genes // Plant Cell. 2006. - Vol. 18. - p. 2326 - 2340.

128. Demir Y. Growth and praline content of germinating wheat genotypes under ultraviolet light // Turk. J. Bot. 2000. - Vol. 24. - p. 67 - 70.

129. Distefano S., Palma J. M., McCarthy I. Proteolytic cleavage of plant proteins by peroxisomal endoproteases from senescent pea leaves // Planta. — 1999. -Vol. 209, №3.-p. 308-313.

130. Domingues F., Cejudo F.J. Patterns of starchy endosperm acidification and protease gene expression in wheat grains following germination // Plant Phisiol-ogy. 1999, № 119(1).-p. 81-88.

131. Dongni C, Hui C., Wei W., Meng S., Jinrong P. Gibberellin mobilizes distinct DELLA-dependent transcriptions to regulate seed germination and floral development in Arabidopsis // Plant physiol. 2006. - Vol. 142, № 2. - p. 509 -525.

132. Dreier W., Schnarrenberger C., Borner T. Light- and stress-dependent en-huncentent of amylolytic activities in white and green barley leaves: P- amylases are stress-induced proteins // Plant Physiol. 1995. - Vol. 145, № 3. - p. 342 -348.

133. Edner Ch., Li J., Albrecht T. et al. Glukan, water dikinase activity stimulates breakdoun of starch granules by plastidial p-amylases // Plant Physiol. -2007.-Vol. 145.-p. 14-28.

134. Fincher G. Molecular and cellular biology associated with endosperm mobilization in germination cereal grains // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1989. - Vol. 40. - p. 329 - 330.

135. Glathe S., Kervinen J., Nimtz M. et al. Transport and Activation of the Vacuolar Aspartic Proteinase Phytepsin in Barley (Hordeum vulgare L.) // The

136. Journal of Biological Chemistry. 1998. - Vol. 273, № 47. - p. 31230 - 31236.

137. Gocal G., Sheldon C.C., Gubler F. et al. GAMYB like genes, flowering, and gibberellin signaling in Arabidopsis // Plant Physiology. - 2001. - Vol. 127. -p. 1682-1693.

138. Goodfellow V., Solomonson L., Oaks A. Characterization of a maize root proteinase // Plant Phisiology. 1993. - Vol. 101. - p. 415 - 419.

139. Gubler F., Chaudler P.M., White R.G., Liewellyn D.J., Jacobsen J.V. Gibberellin signaling in barley aleurone cells. Control of SLN 1 GAMYB expression // Plant physiol. 2002. - Vol. 129, № 1. - p.l91 - 200.

140. Hirano K., Ueguchi-Tanaka M., Matsuoka M. GID 1 mediated gibberellin signaling in plants // Trends in plant science. — 2008. - Vol. 13, № 4. - p. 192 -199.

141. Hou Y.-C., Liu Q., Long H., Wei Y.-M., Zheng Y.-L. Characterization of low-molecular-weight glutenin subunit genes from Hordeum brevisubulatum ssp. turestanicum // Известия РАН, серия биол. 2006, № 1. - с. 44 - 51.

142. Huang N., Sutliff Т., Litts J., Rodriguez R. Classification and characterization of the rice a-amylase multigene family // Plant Molecular Biology. 1990. -Vol. 14.-p. 655-668.

143. Hunjan G.K. Presence of an alpha-amylase isozyme with high temperature optima in the wheat tolerant to high temperature at juvenile plant stage // Acta Physiologiae Plantarum. 2006. - Vol. 28, № 3. - p. 205 - 215.

144. Ivanov Y.V., Radukina N.L., Kuznetsov VI.V. Investigation of polyamines content and composition in Geum Urbanum L. under salt stress // Kyiv. 2007.

145. Jones H. D., Smith S. J., Desikan R., Plakidou-Dymock, S., Lovegrove A., Hooley, R. Heterotrimeric G Proteins are implicated in gibberellin induction ofa-amylase gene expression in wild oat aleurone // Plant Cell. 1998.- Vol. 10.- p. 245 - 254.

146. Kaneko M., Inukai Y., Ueguchi-Tanaka M., Itoh H. et al. Loss-of-function mutations of the rice GAMYB gene impair a-amylase expression in aleurone and flower development // The plant cell. 2004. - Vol. 16. - p. 33 - 44.

147. Kaplan F., Guy G.L. p-amylase induction and the protective role of maltose during temperature shock // Plant Physiol. 2004, № 3. - p. 1674 - 1684.

148. Khakimzhanov A.A., Yrginbaeva S.M., Kuzovlev V.A. Fursov O.V. Pecu-larity of hormonal regulation of a-amylase isoenzymes in embryo and aleurone of cereal grains. Kiev. - 2007. — p. 130.

149. Kervinen J., Tormakangas K., Runeberg Roos, Guruprasad K., Blundell T., Teeri. Structure and possible functions ofaspartic proteinases in barley and other plants // Adv. Exp. Med. Bid. - 1995. - Vol. 362. - p. 241 - 254.

150. Kervinen J., Tobin G.J., Costa J. et al. Crystal structure of plant aspartic proteinase prophytepsin: inactivation and vacuolar targeting // The EMBO Journal. 1999. - Vol. 18, № 14. - p. 3947 - 3955.

151. Kwak J.M., Nguyen V., Schroeder J.I. The role of reactive oxygen species in hormonal responses // Plant physiol. 2006. - Vol. 141, № 2. - p. 323 - 329.

152. Laby R. J., Kim D., Gibson S. I. The ram 1 mutant of Arabidopsis exhibits severely decreased P-amylase activity // Plant Physiol. 2001. - Vol. 127. - p. 1798-1807.

153. Larkindale J., Knight M.R. Protection against heat stress-induced oxidative damage in Arabidopsis involves calcium, abscisic acid, ethylene and salicylic acid // Plant Physiol. 2002. - Vol. 128. - p. 682 - 695.

154. Larkindale J., Vierling E. Core genome responses involved in acclimation to high temperature // Plant Physiol. 2008. - Vol. 146. - p. 748 - 761.

155. Lenton I.R., Appleford N.E.J., Croker S.I. Gibberellins and a-amylase gene expression in germinating wheat grains // Plant growth regulation. — 1994. — Vol. 15, №3.-p. 261-270.

156. Livesley M.A. a-amylase isoenzymes in aged wheat aleurone layers // Biochemical Society Transaction. 1991. - Vol. 19, № 4. - p. 360 - 364.

157. Loreti E., Alpi A., Perata P. Glucose and disaccharide — sensing mechanisms modulate the expression of a-amylase in barley embryos // Plant Physiol.- 2000. Vol. 123. - p. 939 - 948.

158. Lovegrove A., Hooley R. Gibberellin and abscisic acid signalling in aleurone // Trends in Plant Science. 2000. - Vol. 6, № 3. - p. 102 - 110.

159. Lowry O.N., Rosenbrough N.Y., Tarr A.L., Ranball N.Y. Protein measurement with the Folin Rhenol Reagent // Y. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193, №1. -p. 265 - 275.

160. Lu C., Ho T., Ho S., Yu S. Three novel MYB proteins with one DNA binding repeat mediate sugar and hormone regulation of a-amylase gene expression // The Plant Cell. 2002. - Vol. 14. - p. 1963 - 1980.

161. Madhava Rao K.V., Raghavendra A.S., Janardhan Reddy K. Physiology and molecular biology of stress tolerance in plants. — 2006. — p. 1-14.

162. Masatomo K., Masahiro G., Junichi A., Tadao A. Fluctuation of endogenous gibberellin and abscisic acid levels in germinating seeds of barley // Bio-sci., Biotechnol. andBiochem. 1995. - Vol. 59, № 10. - p. 1969 - 1970.

163. Mehta R.A., Warmbardt R.D., Mattoo A.K. Tomato fruit carboxypeptidase: Properties, induction, upon wounding, and immunocytochemical localization // Plant Physiol. 1996. - Vol. 110, № 3. - p. 883 - 892.

164. Moon J., Parry G., Estelle M. The Ubiquitin-Proteasome Pathway and Plant Development//The Plant Cell. 2004. - Vol. 16. - p. 3181 - 3195.

165. Mrva К., Wallwork M., Mares DJ Alpha-amylase and programmed cell death in aleurone of ripening wheat grains // J. Exp. Bot. 2006. - Vol. 57, № 4. -p. 877 - 885.

166. Ogawa M., Hanada A., Yamauchi Y., Kuwahara A., Kamiya Y. Gibberellin biosynthesis and response during Arabidopsis seed germination // Plant Cell. -2003.-Vol. 15.-p. 1591 1604.

167. Olszewski N., Sun T-P., Gubler F. Gibberellin signaling: biosynthesis ca-tabolism and response pathways // Plant Cell. — 2002. — Vol. 14. — p. 61 80.

168. Ozolina N.V., Pradedova E.V., Salyaev R.K. The effect of gibberellin on hydrolytic activity of tonoplasts photon pumps in red beetroot outogenesis // Annual. Symp. Phys. Chem. Basis Plant Physiol. 1996. - p. 54.

169. Pandey R., Agarwal R.M. Water stress induced changes in proline contents and nitrate reductase activity in rice under light and dark conditions // Physiol. Mol. Biol. Plants. - 1998. - Vol. 4. - p. 53 - 57.

170. Payie K.G., Tanaka Т., Gal S. et al. Construction, expression and characterization of a chimaeric mammalian-plant aspartic proteinase // Biochemical Journal. 2003. - Vol. 372. - p. 671 - 678.

171. Parrott D., Yang L., Shama L., Fischer A.M. Senescence is a celerated and several proteases are induced by carbon «feast» condition in barley (Hordeum vulgare L.) leaves // Planta. 2005, № 222. - p. 989 - 1000.

172. Poustini K., Siosemardeh A., Ranjbar M. Proline accumulation as a response to salt stress in 30 wheat (Triticum aestivum L.) cultivars differing in salt tolerance // Genet. Resour. Crop. Evol. 2007. - Vol. 54. - p. 925 - 934.

173. Qi P.F., Wei Y.M., Yue Y.W., Yan Z.H., Zheng Y.L. Глиадины: молекулярные и биохимические свойства // Молекулярная биология. — 2006. — Т. 40, №5.-с. 796-807.

174. Rathinasabapathi В., Kaur R. Metabolic engineering for stress tolerance // Physiology and molecular biology of stress tolerance in plants. 2006. - p. 255 -300.

175. Roberts I.N., Passeron S., Barneix A. The two main endoproteases present in dark-induced senescent wheat leaves are distinct subtilisin-like proteases // Planta. 2006. - № 224. - p. 1437-1447.

176. Runeberg-Ross P., Kervinen J., Kovaleva V., Raikhel N., Gal S. The as-partic proteinase of barley is a vacuolar enzyme that presses probarley lectin in vitro // Plant Physiol. 1994. - Vol. 105. - p.321 - 329.

177. San Taiping, Fauk G. Molecular mechanism of gibberellin signaling in plants // Annual review of plant biology. 2004. - Vol. 55. - p. 197 - 223.

178. Schlereth A., Standhardt A., Mock H. et al. Stored cysteine proteinases start globulin mobilization in protein bodies of embryonic axes and cotyledons during vetch (Vicia sativa L.) seed germination // Planta. 2001. - Vol. 212. - p. 718 -727.

179. Shewry P.R., Napier G.A., Tatham A.S. Seed Storage Proteins: Structures and Biosinthesis // The Plant Cell. 1995. - Vol. 7. - p. 945 - 956.

180. Simoes L, Faro C. Structure and function of plant aspartic proteinases // Eur. J. Biochem. 2004. - Vol. 271. - p. 2067 - 2075.

181. Smalle J., Vierstra R.D. The Ubiqutin 26S Proteasome Proteolitic Pathway // Plant Biol. 2004. - Vol. 55. - p. 555 - 590.

182. Sopanen T., Lauriere Ch. Release and activity of bound (3-amylase in a germinating barley grain // Plant Physiol. 1989. - Vol. 89. - p. 244 - 249.

183. Sparla F., Costa A., Lo Schiavo F., Pupillo P., Trost P. Redox regulation of a novel plastid-targeted P-amylase of Arabidopsis // Plant Physiology. 2006, № 141.-p. 840-850.

184. Sticher L., Jones R.L. a amylase isoforms are posttranslationally modified in the endomembrane system of the barley aleurone layer // Plant Physiol. -1992. - Vol. 98, № 3. - p. 1080 - 1086.

185. Subbarao K. V., Datta R., Sharma R. Amylases synthesis in scutellum and aleurone layer of maise // Phytochemistry. 1998. - Vol. 48, № 3. - p. 657 -666.

186. Swain S.M, Olszewski N.E. Genetic analysis of gibberellin signal transduction // Plant Physiol. 1996, - № 112. - p. 11 - 17.

187. Thakur P.S., Thakur A. Protease Activity in Response to Water Stress in Two Differentially Sensitive Zea mays L. // Plant Physiol. Biochem. 1987. -Vol. 14.-p. 136- 139.

188. Tyndall J.D.A., Nail F., Fairlie D.P. Proteases universally recognize buta strands in their active sites // Chem. Rev. 2005. - Vol. 105, № 3. - p. 973 -999.

189. Ullah H., Chen J-G., Wang S. Role of a heterotrimeric G-protein in regulation of Arabidopsis seed germination // Plant physiol. — 2002. — Vol. 129, № 2. -p. 897-907.

190. Viestra R.D. Protein Degradation in Plants. //Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1993. - Vol. 44. - p. 385 - 956.

191. Villasuso A.L., Molas M.L., Racagni G., Abdala G., Machado-Domenech E. Gibberellin signal in barley aleurone: early activation of PLC by G protein mediates amylase secretion // Plant growth regul. 2003. - Vol. 41, № 3. - p. 197-205.

192. White C.N., Rivin C.J. Gibberellins and seed development in Maize. Gibberellin synthesis inhibition enhance abscisic asid signaling in cultured embrios // Plant Physiol. 2000. - Vol. 122. - p. 1089-1098.

193. Woodger F.J., Gubler F., Pogson B.J., Jacobsen J.V. A Mak-like kinase is a repressor of GAMYB in barley aleurone // Plant journal. 2003. - Vol. 33, № 4. -p. 707-717.

194. Wrobel R, Berne J.L. Appearance of endoproteolytic enzymes during the germination of Barley // Plant Phisiol. 1992. - Vol. 100, № 3. - p. 1508 - 1607.

195. Xiong L., Schumaker K.S., Zhu J.K. Cell signaling during cold, drought and salt stress // The Plant Cell. 2002. - p. 165 - 183.

196. Zeigler P., Loos K., Wagner G. Posttranslational origin of wheat leat P-amylase polymorphism // J. Plant Physiol. 1997. - Vol. 150, № 5. - p. 537 -545.

197. Zhang N., Jones B.L. Polymorphism of Aspartic Proteinases in Resting and Germinating Barley Seeds // Cereal Chem. 1995. - Vol. 76 (1). - p. 134 - 138.

198. Zhang H., Shen W.B., Zhang W., Xu L.L. A rapid response of P-amylase to nitric oxide but not gibberellin in wheat seed during the early stage of germination // Planta. 2005, № 220. - p. 708 - 716.

Информация о работе

Лебедева, Александра Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Влияние гипертермии и экзогенной гибберелловой кислоты на активность протеолитических и амилолитических ферментов в прорастающих семенах пшеницы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы