Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств и активации латентной альфа-амилазы алейронового слоя и щитка зерновки пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств и активации латентной альфа-амилазы алейронового слоя и щитка зерновки пшеницы"

РГВ од

» # 1НЛ И

I ■РАЦ^ИЛЯЬНЛ^ дмдемкп РП<Л!УП.ТШ1 КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МПЛЕКУЛЯРНОЯ 1ЖШОГИ71 И РИОХШ1И им. И. А. АЙТЖЖИНА

■ НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

Акаева Мира ?Лзратсвн?з

' УЖ' 577.152. 321

ИЗУЧЕНИЕ СЕСЙСТВ И АКТШДИШ ЛДТКНТНОЯ

АМИЛАЗЫ АЛЕЙРОНОВОГО СЛОЯ И ПП1ТКЛ ЗЕРНОВКИ ЖЕНИНЫ

03. 00.04. биологическая химия

■ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата, 1993 г.

Работа хшояигна в лаборатории биохиииа зерновых культур Института молекулярной баояогвв в биохимия им.М.А. Айтхоына HAH PK.

Научны! руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

-доктор биологических наук 0.Б.Фурсов

-доктор биологических йаук

М.К.Гвльманов

-доктор биологических наук

К.Н.Сррсенбаев

Институт ботаники HAH PK

Завита оостоится 28 ывя 1993г. в 10 часов на заседании специализированного ученого совета К OC6.22.OI по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте ыояекуяярвой бвояогив и биохимии им.Ы.А.АЯтхохина HAH PK so адреоу: 460012 Г.Алка-Ата, ул.Мичурина,С 6

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке HAH PK по адресу: г.Аяма-Ата, ул.Шевченко,28

Автореферат разослан " и апреля 1993г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук ^— Н.С.Полимбетова

Актуальность проблемы. »¿-Амилаза (»с-1,4 глюканглшогидролаза) является основным ферментом, обеспечивающий гидролиз крахмала в процессе прорастания зорновгл . Большое внимание ученых К этому ферменту объясняется еще и тем, что изучение регуляции его актиз-ности лежит в основе понимания многих процессов, имеющих место при хранении и переработке зёрна важнейшей сельскохозяйственной культуры - пшеницы ( Бах, 1950, Кретобич,1958, Козьмина, 1970-, Дарканбаев, Фурсов, 1982 >. Целый ряд биологических и технологических показателей качества зерна связан с активностью этого фермента ( 01егес1,1978, Дарканбаев, 2урсов, 1984 ). Известна высокая полиморфность -ами.чазы злаковых. Этот фермент представлен генети-чесю1.детермениробанньш формами, связанными с определенными этапами эмбриогенеза зерновки: ¿¿-амилазами "созревания" и »¿-амилазами "прорастания" ( 01егес], 1979, ГиггоУ еЬ а1., 1979 ). Ка-тдая иа этих форм электрофоретйчески гстерогенпа.

Проблемой государств, эгепортируюдпх зерно на мировом рынке, является сохранение урокш , т. и: ежегодно около 30% его резко снижает качество вследствие неконтролируемого синтеза с/г амилазы "прорастания" в условиях повышенной влажности ( МзКеу, 1976 ). Однако, как показал; исследования, проведенные в. лаборатории биохимии зерновых культур Института молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхощна ИАН РК ( Дарканбаев, курсов, 1982, Аникеева и др. 1989, ГигБоу. еЬ а1. ,1986, курсов, 1989 ), определенный вклад в формирование качественных характеристик зерновки вносит «¿-амилаза "созревания" ( латентная ¡<-амилаза в покоящейся зерновке ). Этот фермент первым начинает поверхностный гидролиз крахмальных гранул на ранних этапах прорастания зерновки. При нарушении процесса ла-тентизации в созреваюяэй зерновке имеет место неконтролируемый гидролиз гранул крахмала, инициатором которого является »¿-амилаза "созревания". Следовательно роль <<.-амилазы "созревания" или латентной .¿-амилазы достаточно высока в формировании качественных показателей зерна.

В последние годы идет целенаправленный научный поиск закономерностей регуляции синтеза, секреции и постсинтётической ш- • дификации «¿-амилаз злаковых ( Нага - ШзМгшга, Лкнагака, 1989, 1991 ).

Однако, эти исследования проводятся без учета существования различных форм»е ашлазы. В связи с чем остаются практически не

изученными вопроси изменения этого фермента в процессе эмбриогенеза, латенгивации, активации и секреции в различных анатомических частях зерновки.

Цель и задачи иссдедоыанид. Целью работы Сило исследование основных физико-химических свойства «t-амилазы, синтезируемой в созревающей зерновке пшеница и переходяшэй в латентное состояние к концу полной спелости , изучение факторов активации этого фермента, его секреции и возможности синтеза в процессе прорастания. Анализ состояния исследуемой Проблемы позволил сформулировать следующие задачи:

1. Изучить локализации латентной at амилазы в различных анатомических частях зерновки пшеницы.

2. Провести сравнительное исследование физико-химических свойств я-амилазы "созревания" и активируемого из латентного состояния фермента из покоящейся зерновки, сравнить их с другими формами я-амилаза

3. Исследовать процесс активации и секреции латентной «с-ами-лазы при прорастании, а также под действием различных агентов.

4. Определить, существует да синтез de novo латентной я-амила-зы в алейроновом слое в Процессе прорастания зерновки пшеницы. Основные положения, выносимые На защиту.

1. Локализация латентной ot-амилазы в органедлах алейронового слоя и щитка ¡зерновки пшеницы.

2. Активация латентной «л-амилазц протеолитическими ферментами и гибберелдовой кислотой ( ГК ) в процессе прорастания зерновки, влияние температуры на процесс активации и секреции фермента.

3. Совокупность полученных данных говорит в пользу того, что в процессе Ирорастанйя зерновки происходит делатентизация латентных (JopM oi-амидааы, а не синтез фермента de novo.

Научная новивна. В результате проведенного исследования показано, что ai-аклилаза "созревания" переходит в латентное состояние к полной спелости зерновки, активируется в процессе прорастания. Определены основные физико-химические параметры активируемой латентной «*амилазы из покояшрйся зерновки пшеницы, установлена ее локализация в различных анатомических частях семени. "Впервые показано, что фактором активации латентной амилазы могут служить собственные протеолитические ферменты и гибберелловая

кислота. Негависимке опытн ( иммуноф^рментный анализ и действие ингибитора синтеза белка циклогекеемада) однозначно подтверждают го, иго в алейроновом слое практически отсутствует синтез de novo •«.-амилазы "созревания".

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическое значение данного исследования состоит в том, что показан переход синтезируемой в эмбриогенезе зерновки «с-амилазы через состояние покоя в прорастающее зерно. При этом выявлены факторы, способствующие активации латентной ct-амилази, ее секреции в эндосперм из шнтка и алейронового слон. Б совокупности с полученными ранее данными эти результаты указывают на важное биологическое и технологическое значение этой формы фермента. В ходе исследования отучалось, что образцы зерна с активной .ч-амилазоЯ "созревания" (при нарушении процесса латентизацин) обладают низкими хлебопекарными качествами. Следовательно, возникает необходимость тестирования обраацов зерна на наличие активности в них #£амилаэы "созревания".

Большое значение для практики лабораторных исследований в области биохимии и физиологии семян и кафедр физиологии и биохимии растений университетов и ВУЗов могут иметь разработанные нами методы активации латентной »i-амилазьг, определение ее количества методом иммуноферментного анализа.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы усвоения азота и биосинтеза белка" ( Алма-Ата, 1981 ), на 5 республиканской конференции "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур" (, Алма-Ата, 1984 ), на республиканской конференции "Современные проблемы физико-химической биологии" ( Ал-i/з-Ата, ), на Егором сьезде Всесоюзного общества фиакологол растений ( Минск, 1990 ).

Результаты исследований опубликованы в 9 печатных работа*.

Структура и обьем работы. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 16 рисунков п 3 таблицы. Список литературы включает 115 источников.

ШЕРЯАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Обьектоц исследования явились: покоящиеся, созревающее прорастающие зерновки и Сезааг-одышевые половинки зерен й клетки алейронового сдоя яровой пшеницы { Tritieum aestivum L.) сорта Саратовская 29. "

Для изучения свойств и регуляции амидолигических ферментов необходима высокая степень их очистки. С этой целью использовались различные модификации существующих методов. Один из наиболее распространенных методов - метод Марчилдо (MarchiUo.Kniger, Irvine, 1S76). Принцип данного метода состоит в аффинном связывании фермента м-амилазы с субстратом - гликогеном. Полученный препарат«*амилазы подвергали дальнейшей очнс?ке на сорбенте высокой ионной, емкости сефарозе ДЕАЕ -fast flow. Амилазную ¡активность определяли По методу, описанному в сборнике ( Гильманов, Фурсов, Францев; 1082

Гомогенность полученного препарата определяли методом электрофореза в ПААГе в присутствии SDS ( Laemmli, 1972 ). Изоферментный состав определяли по методу, разработанному в лаборатории биохимии Зерновых культур Института молекулярной биологии им. М. А. Айт-хоюша АН PR ( Фурсов/ йарканбаев, 1979 ).

Алейроновые слои из половинок йерен без зародыша получали па методу Р. Гибеова И Л. Палега ( Bibson, Paleg, 1972 ), согласно которому помол беаэародъндевых половинок обрабатывается 15 мМ растворам молочной кислот для удаления крахмала. После многократного повторений данной процедуры конечный осадок содержит б основном алейроновые клетки и внешние оболочки верна. Из отрубей беззародышевых половинок вер новок, полученных на мельнице фирмы Брабендер ( ФРГ ) , получали алейроновые зерна но методу К. Tanaka et al. ( Tanaka, Asadd, Kasai, 1973 ). Метод заключается в том, что гомо-гейат отрубей фракционировали в смеси СО - хлопковое масло различной плотности.

Дая Получения гомогенного препарата латентной я*-амилазы и проведения иммуяофермеятного анализа проводили препаративный электрофорез по методу Ю. К. Лэммли с соавт., как описано выше, определяли место нахождения фермента с помощью маркерных белков и вырезали полосу геля с ферментом. Затем проводили его зкстрак-

ЦК» из геля в течение 12 часов раствором еМ ацс-гата аммония с последующ».! центрифугированием и диализом.

Для определения концентрации латентной «¿-амйлазы в адейлаовои » слое прорастающей зерновки использовали штод пммунофермептного анализа. Для этого проводили иммунизацию ('.роликов препаратом гомогенной латентной «¿-амйлавм по известной схем'ё ( Ёеяяев и др., 1939 ). Из Полученной свворстки получали моноспеинфичесшзе антитела по методу П. Робинсона ( Robinson et al. ¡VIS'S ).

Схема йммунофэрмектноГо анализа.

Антиген, предварительно леревеДейийй в щелочную бу^зрную смесь ( 0,111 карбонатпо- бйкарбонатяая буферная Ьмесь pH 9.5 сносили по 100 мкл в каждую лунку на плашке. Связывание длится 1 ■ 2 часа при комнатной температуре. Антитела добавляли по 100 мкл, инкубировали 1 час яри комнатной температуре- Блокирования неспецифично связанных белков проводили промыванием лунок раствором IIS -теш! -20 по 200 мкл в каждую лунку триада Mrем наносили вто-: рые биотинилированные антитела ирй соответственном разведении по 100 мм. Смесь инкубировачи 30 мин. при'30е С: батей наносил'! стрептавиднн - пе'роксидазный комплекс nö 100 мкл. Инкубировали 2 часа при тех г;& условиях; ■ Промывали ТВЗ-твин 20. Нанссйий рпст- ' вор субстрата, 8атем останавливали реакцию 2 И раствором 1^50,. Считывание результатов ишунсферменгного анализа происходило На приборе ILIЗА-BIO-Rsder фирмы BIO Rad.

РЕЗУЛЬТАТУ' ИССЛЕДОВАНИЯ И Ш ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение локализация .патентной и.-амилазы й вериовче лтницы

В процессе созревания зерновки вместе с запасными вевзст&амп синтезируются и ферментные системы, необходимы1? для быстрой их утилизации во время прорастания. Такие системы сиятеэ'Лруняся в ходе позднего эмбриогенеза и находятся в зрелых семенах о неактивном, так называемом, латентном состоянии. Было высказано предположение, что¡кгамилаза, синтезируемая на ранних этапах формирования зерновки, обратимо инактивируется либо взаимодействием с инертными белками, либо с мембранами (MacGregor.Daussanb, 1979).

Во гремя прорастания происходит ее активирование (Gibson,Paleg, •f.?7P, Krufjer, Pi cgLod , 1977, Каракеева и др., 1303 ).

Б оовскуппсяли нолученннх нами реаультьЬв било покойно, что в покоящейся аерпоьке пшеницы практически вся с*, амилаза находится в латентном состоянии и может высвобождаться под действием детергента тритон-X 100 и протеааы. Латентная »¿-амилаза'прочно связана с клетками алейронового слоя с помощью гидрофобных ( освобождаемых тритоном Х-100 ) к ковалентных связей ( высвобождаемых папаином ). При этом наблюдалось значительное увеличение активности препаратов фэрькнта, полученных.после непосредственной инкубации алейроновых слоев в 0,01% ТХ-100 и 0,01% иапаине в течение суток соответствен". о в 2 и 3 раза ( по сравнению с контролем ).

Нами била научена активность к- амилазы субклеточных фршщий алейроновых клеток покоящейся зерновки пшешшы ( рис. 1 ). Обработанное тритоном Х-100 и папаином субклеточные ([¡агаиш микросоы показали.максимальные значения а<-амилаз ной активности по сравнению

Рис. 1 Активность «¿-амилазы гомогената алейроновых клеток, полученных дифференциальным центрифугированием : 1- необработанная фракция» 2 - фракция, обработанная О,012 ТХ-100, 3 - фракция, обработанная 0,03% раствором папаина.

Были изучены основные физико-химические свойства очищенного препарата фермента. Латентная «¿-амилаза сохраняет активность при прогревании до 65*С в течение 15 мин. , а-также при действии 5 М

мочешш. Методом КЭХ> били показано, что это более подвижные кислые компоненты. имеющие значение изоэлякгрических точек от 4,7 до 5,2. По электрофоретичecicoft подвм.чности висвобождаемая латентная ^-амилаза соответствует группе ft кзофэрмеитов, так называемых " green" амилаз или «<-амилазы "созревания" ( Olered, Î970 ).

При разделении как методом изоэлектрофокусировгшм, так и методом электрофореза в нативннх условиях, проявляются 3-4 компонента латентной ^ашлазы, соответствующие ira локализации в спектре компонентам ai-амилазы "созревания" ( рис.2 ). Эти компоненты обладали одной молекулярной массой примерно 45 кд при элект-рофоретическом разделении в присутствии SDS, в то время как элек-трофоретичгекий спс-етр «<-амилазы из прорастав'! зерновки состоял из двух коупснентсг с ' близкими еяаченияш молекулярных иэсс 42 и 45 кд ( рис. 3 ).

I 2 3

Г ко. 2 Сравнение спектров, полученных методом i»o-*vRF;it*rl>j • кусирогания, латентной о*- амилазы со спектрами «с-амклээи сспрггг.-:'."-ft и прорастаиарй зориовга: 1 - латеИтняя ct-em- • x'Wii, 2- спон:р <*-амилазы из прорастающей зерновки. 3 - спэ>~{.• сдаропа^й зерновки. А, В, 0 - i pynnw ?'гд-Монтер.

- iq -

Спектр фермента из црорастаодгго верна ьклечал в себа помимо активируемой из латентного состояния <А- амилазы ( М. е. 45 кд ) и компоненты л-вшлаэы "прорасташз" ( кд ).

Наш также изучался Процесс датентйзащш ^-амилазы в алейроновом слой при созревании зерновки. £ыла показано, что максимальная активность этого |£ермэйта приходится На 18 - СО день после опыления быем наблюдается спад акивности, а к концу восковой спелости обнаруживаются только следовые количества атого фермента.

Показано ^акле, что процесс Датективаций *1меет место как в алейроновой слое, так р Ъ $итке Зародила ёе|»новкЙ «Ьеиицы, Причем, 6 вятке Л-адалаЭа Мейеа яатенгизйрована к концу восковой епе-дсс^и, чем в алершюьом слое!

При научении локализации латентной амклгшы в различных тканях кекоаьййей аерйозвкй каенивд бЫо бцяЬлеко-, Что Йо 75Й активности •згого фермента лсйализовгИю в йлейроцовИХ вернах.

КзБестйи| что при прорастании алейроювие верна разрушаются, ЕкзЕслоздая Имеш^бся в Них фёрмёйти К Соболев, 1986 ).

......'; - . „, , 4ййд

43кд

. к

А Б

Рис.3 Электрофорез в присутствии о И] ( по Лэммли ) латентной ci-a'4HiaaLi (А) и (¿-амилазы ira прорастающего зерна (Б)'.

Таким образом, в алейроновом слое и щитке зародыпа поксяцейся ьерновки пвеишш имеется латентная оС-амилаза, наибольшое количество которой локализовано в алейроновых зернах.

2. Изучение активации латентной «с-амилазы из алейроновых зерен зерновки пшеницы. . .

Как было показано ранее, большинство гидролаз находится в латентном состоянии в виде определенных компартментов, сформированных в алейроновых зернах С Соболев, 1985, Элпйдина, Дунаевский, Белозерский, 1990 ), Процессы активации из Них гидролитических ферментов практически не изучены.

Нами изучалось воздействие Гибберелловой кислоты, абсцизовой кислоты, детергента ТХ-100, соСсувеиной протеиназй, {"бвделенной из прорастающего зерна), туникомицина на активаций «с-ашлазы из алейроновых зерен покоявегосй семени паенмцы. Как видно Из рис.4 ¿¿-аМилаЬиая активность; Ьысвобождаемая из алейроновых зерен, he подверженней Действию агеятой, (кслтроль) изменяется следующим образом: В первУе часы она очень низкая, обесйечивается за счет компонентов йУсвобовдаемоЙ латентной^аиялазк ( рис. 4), через 16 - iß часов активность фермента удваивается, чёрез 28- 30 часов появляются компоненты группы С, в йоследуйщие чйсы активность Практически не менялась, Через 48 часов появлялись компоненты группы В, 'относящиеся К Тан называемой "halt"- форме»* амилазы ''прорастания".

Если алейрокобые зерна обрабатывались трйтойом Х-100, То активность Незначительно превышала контрольный вариайт,. а изофермент-ный спектр представлен компонентами латентной о<-акйлазы ( рис.4). Ранее было показано, что Детергент тритон Х-100 йНгибирует процесс синтеза »tамилазы на мйкросомах щитка зерновки рйса ( Mitsui et al. , 1984 ). Мы Полагаем, что под действием детергента происходит нарушение мембранных структур алейроновых зёрен, что приЬо-дит к подавлению образования компонентов С и В, входящих в спектр et-амилазы "прорастания". При обработке алейронойьй зе^ен собственной протеиназой, выделенной из прорастаквдего семени, также наблюдалось незначительное увеличение активности «<- амилазы, при этом закономерности появления новых форм оставались теми же, что и в

закономерности появления новых форм оставались теми ке, что и в контроле. Считаем, что протеиназа действует на те пептидные фра-■ гменты, которые связывают фермент с мембранами. Наибольшее •значение <к-амилаз ной активности наблюдалось прй обработке алейроновых зерен ГИ

Нами также изучалось влияние абсцизовой кислоты ( АБК ), цнкло-гексемида и ' туникомицина на активность и элекгрсфэретический спектр Ц-амилазы из алейроновых еерен. Показано, что как тунико-мицйн, циклогексемид, та»? и АБК после 48 часов действия подавляли появление компонентов группы В, активность в этом случае пред, ставлена Компонентами группы С и А, в то время как на проявление -активности латентной ¿-амилаза ( группа А ) данные агенты не влияли. Действие циклогексемида Позволяет сделать предположение, что данный агент подавляет синтез ¿-амилазы "прорастания", а тунико-мицин - гликозилирование. Эти факторы не.влияют на активность латентной оС-амилааы, что указывает на постоянное ее присутствие в ■алейроновых-зернах.

Рис. 4 Изменение активности «¿-амилазы гз адчАронеРых героя пшениц» под действием различных агентов: 1 - доио1ипчцч)вшшс,й воды, Оодтроль), 2 -лрогеаоы из лгорзсташто сем~ни, 5 - тритона X-4 - гибРередлогоЯ кислоты ( ГК ).

г.

Таким образом, латентная .¿-амилаза может бить активирована из алейроновых зерен действием детергента ТХ-100 и собственной про-теазой. Мэлшо предположить, что происходит активация латентной . ¿гамилазы in vivo за счет воздействия собственных протеолитичес-кия ферментов. Циклогексемид и туникошцин не влияли на активность, и электрофоретический спектр латентной ot-амилазы, на подавляли проявление активности компонентов группы В электрофоретического спектра «¿.-амилазы "прорастания". Гибберелловая кислота наряду с активацией латентной ^-амилазы индуцировала синтез »(-амилазы "прорастания".

3. Изучение гормонального воздействия на синтез и секрецию «¿-амилазы в алейроновом слое и ищтке зерновки пшеницы.

Одной из задач нашей работы было сравнительное изучение индуцируемого гибберелловой кислотой появления различных изоформ -амилазы алейронового слоя, секреции фе мента, а так-чэ влияние на •этот процесс температуры. • На рис. 5 показано изменение активности х-амилааы алейронового слоя под воздействием зкаогенной ГК в концентрации 10 Ы. В течение первых 12-18 часов замачивания беззародышевых половинок покоящегося зерна пшеницы активность «¿-амилазы как в контроле, так и в опыте незначительна. Заметный рост активности фермента, связанный с появлением катодных компонентов Группы С наблюдался через 20-30 чзсов замачивания в присутствии гормона. ( рис. 5). Изменение активности до этого времени било обусловлено высвобождением латентной </-амилазы (группа А ). В контрольном варианте активность ( без ГК ) была связана только с высвобождением латентной «¿-амилазы ( рис.б ). В начальный период воздействия гормон стимулировал активность латентной формы, что видно из сравнения активностей кривых контрольного и опытного вариантов (рис.5 ). Максимум активности »«.-амилазы, включая активность в среде инкубации беззародышеЕнх половинок и активность фермента в гомогенате, наблюдался через 60 часов инкубации, как в контроле, так и в

опыте ( рис. 4 ). т4зргз 48 часов ка;с в контроле, так и в опыте ка элегарофореграмме ««-амилазы появляются компоненты группы В - основные по активности в спектре ¿-амилазы "прорастания" ( Фурсов и ДР., 1986 ).

Показано, что на каждом этапе индукций фитогормоном, электро-форетические спектры ««-амилазы, полученные из гомогенатов ее,.нов-ки и. среды инкубации беззародывевых половинок, соответствовали друг другу. В первые 64 часа действия ГК активность ^-амилазы в среде инкубации беззародышевых лоловинок превышала ее показания в гомогенате, затем наблюдался спад в &ктивносги секретируе-мого фермента ( рис.5 ).

В контрольном варианте активность фермента возрастала незначительно, что связано только с высвобождением латентной формы фермента ( рис. 5,6 ).

Изучено также влияние температуры на процесс гормональной индукции. Показано, что повышение температуры с 25°до 30еС практически не влияло на активность фермента В первые 20 часов замачивания беззародышевых половинок в присутствии ГК. В то ке время при 33°С активность ¿гамилазы увеличивалась в 2 раза по сравнению с индукцией при 25°С. В дальнейшем ho Мере увеличения срока инкубации ( до 80 часов ) различия в активности ферментов, вызванные повышенией температуры, соответственно.возрастали в 5 раз при 30®С и в 8 раз по сравнению с индукцией при 25° С . Повышение активности фермента при более высоких значениях температуры среды мы связываем с увеличением процесса секреции »с-амилазы.

Таким образом, исследование злектрофоретичегких спектров оек-ретируемых под действием температуры *».- амилазы подтверждает активирующее действие данного фактора на процесс секреции фермента.

Представляло также интерес изучение новобразования .¿-амилазы в зародышевом щитке. Как известно из литературных данных, в зародыш содержатся собственные гиббереллины, которые поступают в пегшь едтса в процессе прорастания зерновки ( Atzorn, Weiler, 1983; Муромцев, Агностикова,1984 ). В связи с чем можно предположить ускорение процесса активации «¿-амилазы в шитке по сравнении с алейроновой тканью. Для этого непроросшие зерновки пшеницы закачивали в стерильной дистиллированной воде в течение различно-

- 1Б -

к

го времени и выделяли зародышевые щитки. Необходимо отметить,

ЮО

Й

1У

ш

1

/2 20 43 № Й? /00 Дрем», </сесы .

рис. 5 Изменение активности секретируемой и нееекретируемой ^-амилазы беззародышевых половинок под г-йствиеМ ГК : 1 - суммарная активностье^амилазы в гомогенате и в среде без ГК, 11 - суммарная активность «¿-амилазы в гомогенате \л в среде рри действии ГК, 111 - активность -секретируемой ¿-амилазы в присутствии ГК, 1У -активность•«-амилазы в гомогенате бевзародыиевых половинок в присутствии ГК

что возможность ручного отделения щитка появлялась только через 1,5 - 2 часа замачивания зерновок. В сбязи с этим за исходную точку определения активности и гетерогенности и-амилазного спектра было принято двухчасовое замачивание ( рис.7 ). В первые 3 часа замачивания зерновок в воде активность .¿-амилазы возрастала в 2 раза по сравнению с исходной, а изоферментный спектр предста влен только компонентами группы А латентной .¿-амилазы.

Через 3 часа появлялись компоненты группы С (рис.7 ). Через 5 часов замачивания активность »¿/-амилазы в 3 раза превышала исходную, а злектрофоретический спектр соответствовал спектру .с-амила-

IG -

Рис.6. Изм.-наше галектрсфоретичеоксго сп--кгрп гс-гишлэды под действием I'ffc 1 -спектра амидпзы поел? £0 ч. IK, 2 -

спектр после 30 ч. действия ГК, 3 - "после 43 ч. действия ГК, 4 -после 72 ч. действия ГК, 5 - спектр Л амилазы беззародышевых половинок после 48 ч. замачивания без П1 A.B.С - группы изофер-ментов.

зы из проросшего зерна (рис. 7 Б ). Таким образом, в щитке происходит более ускоренный синтез фермента по сравнению с алейроновой тканью. Мы объясняем это поступлением фитогормонов из зародыша при прорастании семени. Показано, что в первые часы проращвания зерновок происходит высвобождение латентной формы «к- амилазы из ткани витка и алейронового слоя. ■ Активность именно этой фор»лы обеспечивает гидролиз крахмала в первые часы проращивания. Ранее было установлено, что амилазы группы А первыми атакуют крахмальные гранулы ( Аникеева и др., 1979).

Известно, что в ходе развития семян их зародыш могут преждевременно прорастать, не достигнув состояния покоя ( Казьмина, 1976 Преждевременное прорастание, контролируется уровнем абсцизовой кислоты в них ( Кефели и др., 1989 ). Добавление этого фитогормо-на в среду , на которой культивировались зародыши пшеницы, предотвращает их прорастание.

В свяви с этим нами проводилось исследование влияния этого гормона на появление *-амилазы в зерновке пшеницы при прорастании. Использовались как покоящиеся, так и подвергшиеся процессу предуборочного прорастания семена. В среду проращивания добавляли АЕК в концентрации 10 4М и стрептомицин в концентрации 50^ /мл. Через трое суток зерновки чуть проклевывались. Активность •бами.па

зы г* зорноьиа:-:, ос^лЗп-опаих ЛПК стн в 0 |.<и шли.ае, ч^м ь иц.^. ших семьнах.

к

и н о о №

О)

Й о

О {а

Время, т

12 3

Рис.7 Изменение амилазнсй ыминносш (А) и электрофоре-тического спектра (Б) в щитке зародила зерновки пшеницы в зависимости от времени замачивания: 1 - после 2 ч замачивания, 2 - после 3 ч, 3 - после 5 часов замачивания аерновок, А,В,0 - группы изо-ферментов.

На электрофореграмме видны компоненты А и С, компоненты В отсутствовали. В случае воздействия АВК на зерновки, подвергшиеся предуборочному прорастанию, компонентный спектр полностью соответствовал спектру с<-амилазы из проросшего семени, но активность фермента была в 3 раза ниже контрольных показаний . Одновременное действие двух фитогормонов на прорашивание целых зерновок также приводило к отсутствию компонентов группы В на электрофоретическом спектре, активность А-амилазы была на уровне активности, которая наблюдалась под действием АБК. Таким образом, АБК является по своему действию антагонистом ГК, препятствует появлению компонентов группы В, не влияет на высвобождение латентной ¡<-амилаэы и компонентов группы С.

- 18 -

4. Изучение количественных изменений латентной с<-амилазы в прорастающей зерновке пшеницы.

Действие на прораставшую зерновку различных факторов не приводит к подавлению активности латентной «¿-амилазы, они также не изменяют. алектрофорегический спектр фермента. Компоненты латентной ¿-амилазы первыми появляются на , электрофоретич^ском спектре буквально с первых часов-замачивания семени.

Интересно было узнать, синтезируется ли эта форма фермента в процессе прорастания эерновки или происходит процесс активации ее из латентного состояния. С этой целью Изучали ее Количественное изменение в алейроновом слое при проращивании как в присутствии ГГ., так и при воздействии АБК и папаша в концентрации 0,01%. Для этого использовали иммуноферментный анализ с применением моноспецифических антител Против латентной «¿-амилазы.

Согласно полученным данным была.составлена таблица 1, показывающая изменение содержания этой формы фермента под воздействием различных агентов.

Как видно из таблицы, в контрольном варианте (без агентов) Количество активируемой •С-амилазы возрастало незначительно с течением времени проращивания. В присутствии АБК количество фермента практически, не возрастало, что указывает на отсутствие синтеза этого фермента в процессе прорастания. Наблюдалось увеличение количества этого фермента под действием протеазы - папаина, который был добавлен в среду проращивания.

В условиях проращивания в присутствии ГК количество латентной амилазы возрастало более чем в 2 раза по сравнению с исходной точкой (3 часа). В случае, если бы ГК вызывала синтез »«-амилазы, то ее количество возрастало бы в десятки и сотни раз. Но поскольку наблюдалось двукратное увеличение ее количества, можно с достаточной уверенностью сделать вывод о том, что имеет место процесс активации латентной ¿-амилазы. Об этом т свидетельствует и временной характер увеличения количества латентной «е-амилазы под действием ГК Известно, что при запуске синтеза уже в течение первых часов наблюдается характерное увеличение количества белка.

В нашей случае двукратное увеличение количества белка под действием ГК произошло только через 48 часов. Эти данные однозначно говоря? о том, что ГК запуасает прсце-с а'-тгиваши латентной

Таблица 1. Количественное изменение латентной «с-амилазы в алейроновом слое прорайтаюшего зерновки пшеницы, определенное методом иммуноферментного анализа

Время проращивания контроль гк ю"6м АБК 10*Ы папаин 0,01%

3 часа 110 нм/мл 300 нм/мл 130 нм/мл 200нм/мл

12 часов 120 нм/мл 500 нм/мл 120 нм/мл 350нм/мл

48 часов 150 нм/мл 700 нм/мл 120 нм/мл 410НМ/МЛ

*<-амилаза lia основании полученных данных можно заключить, что активность латентной «f-амилазы возрастает по мере прорастания скорее всего за счет активации из латентного состояния, а не за счет новообразования. Эндогенными активаторами фермента по всей видимости являются собственные протеазы ( типа папаина ) и фитогормон -гибберелловая кислота.

•/ ВЫВОДЫ

1. В процессе созревания в алейроновом слое и щитке верновки пшеницы имеет место латентизация так называемой я-амилазы "созревания". В алейроновых зернах содержится до 75Х активности латентной формы фермента.

2. Латентная .(-амилаза активируется на самых ранних этапах прорастания зерновки. Эндогенными активаторами латентной «("-амилазы могут быть собственные протеолитические ферменты и фитогормон -

гибберелловая кислота.

3. Установлена временная зависимость активации определенных форм амилазы в процессе замачивания как беззародывдвых половинок

зерновок, так и в алейроновых зернах. В первые часы замачивания появляются компоненты латентной амилазы ( группа А ), через 28-

г:о -

00 часов появляются компоненты хрунпы С еЬ амилазы "прорастания", и только через 48 часов компоненты группы В электрофоретического спектра *(- амилазы "прорастания".

4. Показана температурная стимуляция процесса активации и секреции е<-амилазы в прорастающей зерновке. При этом отмечается, что индуцируемые гормоном ГК процессы активации латентной^амилазы и синтеза амилазы "прорастания" происходят в шшг.е в 7-9 раз быстрее, чем в алейроновой ткани.

Б. Установлено, что АБК, циклогексемид, туникомицин подавляли образование, некоторых компонентов ( группы В амилазы "прорастания", не влияя яз электрофоретическую гетерогенность и активность латентной «с-амилазы.

G. В результате изучения действия различных факторов на актив' ность и электрофоретический спектр «<- амилазы, активируемой из латентного состояния , а таив на основании результатов иммуно-ферментного определения количества этого фермента в прорастающей зерновке делается заключение, что изменение активности этой формы ttамилазы при прорастании связано в большей степени с активацией, а не с синтезом de novo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Акаева М. Е , Байтуллина Г. И. , Фурсов O.E. Латентные формы et-и ß- ашлаз и их активация протеолитическими ферментами. //Тез. докл. Всесоизн. симп. "Механизмы усвоения азота и биосинтеза белка в растениях", Алма-Ата, 1981, С. 110.

2. Акаева ML М. Изучение латентной амилазы созревающего зерна пшеницы. //Тез. Б респ. конф. "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерноввых культур", Целиноград, 1984, С. 167.

3. Акаева М. Ы., Фурсов О. В. Латентная «/-амилаза зерна пшеницы. /Лизиол. и оиохим. культ, раст. ,1984, t.16.N4, С. 382-386.

4. Акаева М.М., Фурсов 0. Е Синтез, активация и секреция »г-амилазы алейронового сдоя и щитка зерновки пшеница //1изиол. раст., 1990. т. 37, ВЫП. 6, С. 1180-1186.

5. Акаева U. Ы., Каракеева P. К., Юсупова Р., курсов О. R Протео-литические ферменты как активаторы ^амилээы белковых тел созре-ггиопрго згрна пшеницы. //Зиэиол. и биохим. культ, раст. ,1991, т. Г«, рыл. 1, С. 97-102.

6. Акаева Ы. II , Кузоьлев H.A., Фурсов О. Е Стйсхвя и осойь-и-HociH амилаз зерна злаковых. //Сб. " Яерменш и качество acpin", 198?, С. 41-46.

7. Акаева М. М. , Каракьева Р. К.. Юсупова Р. , 1урсов О. В. Активация ^амилазы из алейроновых зерен пшеницы. //Извест. АН Каз.ссм-, Серия биологическая, 1990, т. 6. выл. 162. С. 35-38.

8. Фурсов 0. Е , Аникеева JL А. , Хайдарова Ж. С. , Кузовдеи В. А. , Каракеева Р. К , Акаева М. М. Надмолекулярная регуляция амилаз сор на злаковых.//Респ. . научн. конф. "Современные проблемы фиаико-химической биологии и биотехнологии", Алма-Ата, 1989, С. SO.

9. Оурсов О. Е. , Аникеева Л. А. , Хакимжанов А. А. , Кузовлев R А. , Акаева М. М. , Каракеева Р. К., Хайдарова 58. С. Регуляция i идролиза крахмала на ранних этапах прорастания зерна. //Tea. докл Вгорогс сьезда Всесоюзн. общ. физиол. раст. , Минск, 1930, С. Бб. ■