Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ацидофицирующая деятельность щитка зерновки кукурузы при прорастании

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ацидофицирующая деятельность щитка зерновки кукурузы при прорастании"

V, о од

У ^ МАИ йЗб

с д российская академия наук

сибирское отделение сибирский институт физиологии и биохимии растении

РГ6 од

2 9 МАЙ 1995

На правах рукописи УДК 581.12+581.134.5

ЕГОРОВА Галина Васильевна

АЦИДОФИЦИРУЮЩАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ЩИТКА ЗЕРНОВКИ КУКУРУЗЫ ПРИ ПРОРАСТАНИИ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск 1995

российская акаделшя наук сибирское отделение сибирский институт физиологии 11 биохимии растений

На правах рукописи УДК 581.12+581.134.5

ЕГОРОВА Гадина Васильевна

ДЦИДОФИЦИРУЮЩАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ЩИТКА ЗЕРНОВКИ КУКУРУЗЫ ПРИ ПРОРАСТАНИИ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск 1996

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Санкт-Петербурского университета

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В. В.Полевой, кандидат биологических наук, С.М. Щипарев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, А. С. Романенко,

кандидат биологических наук, Л.И.Донская

Ведущее учреждение : Иркутский сельскохозяйственный институт, кафедра физиологии растений, микробиологии и агрохимии

Защита состоится " 29 " июня " 1995 г. в " 10 " час. ка заседании Специализированного совета по защитам кандидатских диссертаций при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адрес: 664003 г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132

а/я 1243

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан " МЛк$ .," 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандитат биологических наук

- Г.П.Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прорастание семян - .сложное биологическое явление, при которой происходит активация временно подавленной метаболической и ростовой активности зародыша, включение новой генетической программы развития, превращающей зародыш в проросток.

Рост и развитие зародыша на ранних этапах прорастания в большей степени определяется темпом мобилизации запасных питательных веществ эндосперма,с кх притоком из мест гидролиза (Овчаров, 1976; Илли и др.1978). В связи с этим особый интерес вызывает семядоля злаков - щиток, осуществляющий взаимосвязь между эндоспермом и зародышем при прорастании. Щиток злаков активно участвует в переваривании запасных питательных веществ эндосперма. Известно, что в ходе прорастания эпителиальные клетки щитка активно выделяют в эндосперм ряд гидролитических ферментов (Ильчуков.Ши-парев,1981;Акаева,Фурсов,19Э0;Dare, I960). Затем щиток всасывает продукты гидролиза (Щипарев и др.1990;Humphreys,1975) и транспортирует их к растущему зародышу (Wheeler,Humphreys.1979). Несмотря на многочисленность исследований, посвященных пусковым механизмом прорастания, отдельные аспекты данного вопроса остаются малоизученными, в том числе проблема кислого пищеварения в прорастающих семенах. Известно, что важной особенностью процесса внеклеточного переваривания, как было показано на примере грибов (Беккер,1983), насекомоядных растений (Дарвин.1941; Heslop- Harrison,1976) и животных (Sachs е.а.1982), является ацидофицирование питательного субстрата специализированными органами и тканями, где наряду с гидролитическими ферментами секретируются кислоты. Данных о том, что щиток злаков способен секретировать кислоты в литературе не обнаружено, однако имеется ряд-работ указывающих на способность органических кислот стимулировать прорастание семян (Земляну-хин,Макеев.1964; Благовещенский,1968) и даже индуцировать прорастание семян уже потерявших всхожесть (Radua, 1967). Эти данные позволяют предполагать индуцирующую роль органических кислот при прорастании. В связи с чем изучение роли органических кислот на ранних этапах прорастания представляет как теоретический, так и практический интерес для понимания пусковых механизмов прорастания и регуляции роста органов развивающегося проростка, и также взаимосвязи отдельных органов семени.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении ацидофицирующей Функции щитка на ранних этапах прорастания как пускового механизма мобилизации запасных питательных веществ эндосперма и возможности регуляции данного процесса фито-гормонами.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи : 1) выявить способность изолированных щитков, на примере зерновок кукурузы, секретировать кислоты; 2) исследовать динамику выделения и качественный состав кислот секретируемых щитками при прорастании; 3) изучить роль фитогормонов в процессе секреции кислот щитками; 4) выявить физиологическую роль ацидофи-цирования эндосперма щитком на ранних этапах прорастания.

Научная новизна работы. Впервые обнаружено, что щитки изолированные от зародыша и эндосперма, способны секретировать кислоты. Показано, что щитки ответственны за подкисление эндосперма в интактных зерновках на ранних этапах прорастания. Впервые исследован качественный состав кислот, секретируемых щитками и зависимость качественного состава от возраста щитков. На примере зерновки кукурузы показано, что экзогенные фитогормоны могут активировать процесс секреции кислот щитками. Установлено, что активное выделение кислой амилазы щитком начинается только после достижения эндоспермом определенного уровня закисленности, тем самым обосновано положение о пусковой роли ацидофицирующей деятельности щитка в процессе "переваривания" запасных питательных веществ эндосперма.

Практическая ценность работы. Обнаружено, что щитки зерновок кукурузы различных генераций обладают разной ацидофицирующей способностью. Установлено, что способность щитков секретировать кислоты снижается при хранений и это сказывается на понижение интенсивности процессов мобилизации запасных питательных веществ эндосперма, т.е. жизнеспособности семян. Данная особенность щитков может быть использована в качестве определяющего критерия при разработке тестов на всхожесть.зерновок злаков. Данные о способности щитков секретировать кислоты можно будет использовать в лабораторной практике для дальнейшего изучения функциональной особенности щитка.

Защищаемые положения. Ацидофицирующая 1 деятельность щитка, как необходимый фактор внеклеточного переваривания запасных питательных веществ эндосперма на ранных этапах прорастания.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены ка 1-сй Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений,Москва.1981; на заселении кафедры физиологии и биохимии растений Ленинградского государственного университета.Ленинград. 1983; на 2-см Всесоюзном совещании по Физиологии кукурузы, Днепропетровск. 1984; на научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов,Якутск,1938,1990; на заседании кафедры биологической и органической химии, Ученого Совета биолого-географического факультета Якутского государственного университета, Якутск, 1994,1995.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, включает 28 рисунков и 10 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 218 наименований, из которых 131 на русском языке.

В обзоре литературы дается общая характеристика гетеротрофного питания грибов, насекомоядных растений и животных. Рассматривается анатомо-морфологическое строение и Функциональная роль щитка зерновок злаков при прорастании, механизмы мобилизации запасных питательных веществ эндосперма, влияние индуцирующих факторов, в том числе фитогормонов на процессы прорастания.

Материал и методы исследования

ОбЬектами исследований служили семена кукурузы (Zea mays L) гибрида Буковинский 3. Семена стерилизовали 15 мин 12% перекисью водорода, промывали стерильной водой и проращивали в термостате в кюветах на влажной фильтровальной бумаге при 25°. Через б, 14, 24 и 48 ч с начала набухания щитки отделяли от зародыша и эндосперма, промывали в растворе СаС1г 5 мМ в течение 3 ч, а затем в количестве 25 штук инкубировали в 5 мл среды при 25° в течение 4 ч. Составы инкубационных сред приведены в соотвествующих подписях к рисункам и таблицам.

В инкубационной среде (ИС) определяли общие содержание кислот (свободные+связанные) и количество свободных кислот.путем титрования 0.02 н раствором "JaOH до рН 8.2.0 количестве свободных кислот судили по количеству щелочи, израсходованной на титрование среды сразу после инкубации, а общее содержание кислот определяли после выдерживания ее с навеской катионита КУ-2 в Н+-форме в холодильнике в течение 12 ч и последующего титрования, 0,02 н КаОН

■ - 4 -

до рН 8.2. Изменения рН среды после инкубации щитков определяли на лабораторном рН-метре. имеющего микроэлектроды для микропроб. Количество, выделенных щитками ионов Н+ регистрировали потенцио-метрическим методом с использованием ионочувствительных датчиков (Разумова и др.1978). Количество протонов, выделяемых щитками за каждый интервал времени, рассчитывали по формуле:

тп

I - количество ионов водорода.выделенных щитками мкмоль г сырого вещества;

■Б - наклон калибровочной кривой. мВ;

. Со - исходная концентрация иона в растворе, М/л; Ео и Е - Э.Д.С. электродной системы в растворе до помещения щитков и в любой момент времени соотвественно. мВ; ш - сырая масса щитков., г: V - обьем опытного раствора, л: Ю"6 - коэффицент для перевода в мкмоль. В опытах по исследованию рН интактных и изолированных эндоспермов, готовили водный гомогенат, для этого эндосперм из сухих зерновок кукурузы, в количестве 15 штук и помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную водой, содержащей антибиотики (левомицитин 10 мг/л; стрептомицин 250 мг/л) и инкубировали в течение 2. 14, 24 и 36 ч при 25°С, затем готовили из них водный гомогенат с 15 мл дистиллированной воды. То же проводили с эндоспермами, выделенными из зерновок после 2. 14. 24 и 36 ч их набухания в тех же условиях. Измеряли рН водных гомогенатов.

Качественный состав кислот, секретируемых щитками определяли методом бумажной хроматографии с применением различных растворителей (Солдатенков,Мазурова, 1971). Для полной идентификации кислот проводили специфические качественные реакции (Пех,Тре-си,1960). Качественный состав летучих кислот в ИС определяли с помощью газовой хроматографии на хроматографе 1.ХМ-72 (Вяхирев, Шушунова, 1975). Размеры колонки 100x0,4 см. Неподвижная фаза-полих-ром1+2,5%-ная стеариновая кислота. Таз" носитель - гелий (30 см3/мин). Для анализа брали пробы ИС в объемом 0.1 мл после выдерживания в ней щитков, изолированных от эндосперма и зародыша, через 14 и 24 ч с начала набухания.

Влияния рН среды на степень распада крахмала в эндосперме

определяли по количеству редуцирующих Сахаров в инкубационной среде. Эндосперм, выделенный из сухих тщательно промытых зерновок и из зерновок через 24 и 48 ч с начала набухания, инкубировали в О,Г М ацетатном буфере с различным значением рН в конических колбах по 100 мл.помещенных на качалку. Частота качания 30-40 в мин. Время инкубации 4 ч. Редуцирующие сахара определяли по методике Вознесенского (1962). При изучении секреции ti- амилазы щитками, ферментативную активность определяли после инкубации щитков. К 2 мл ИС добавляли к 4 мл 3%-го раствора крахмала, приготовленного на 0,1 М цитратаом буфере рН 5,0 и выдерживали 30 мин при 28°С. Активность oL- амилазы рассчитывали в мкг разложенного ферментом крахмала (Чернавина и др.1978).

Статистическая обработка результатов. В таблицах и на рисунках представлены средние значения и их стандартные отклонения, рассчитанные на основании результатов измерения показателей из 4-5 биологических повторностей.- О достоверности разности между вариантами судили по критерию Стьюдента при 96%-ном доверительном интервале (Маслов,1972).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. АЦИДОФИЦИРУЮЩАЯ ФУНКЦИЯ ЩИТКА

В литературе показано, что клетки алейронового слоя ячменя и пшеницы, функционально и морфологически сходных с эпителиальными клетками .щитка, способны подкислять внешнюю среду (Mlcola,Vlrta-nen, 1981; Hamabata, Garclo e. a. 1987), Нами впервые сделана попытка выявить способность щитков секретировать кислоты.

1.1. Подкисление инкубационной среды щитками

Первоначально, способность изолированных щитков кукурузы вызывать закисление инкубационной среда было показано в опытах с применением индикатора бромкрезолпурпурного. Известно, что данный индикатор способен изменять окраску от пурпурного (рН 6.8) до желтого (рН 5.2). При инкубации щитков в 1%-ном агаровом геле с добавлением индикатора выявлено, способность щитков подкислять среду' в местах соприкосновения щитков с гелем.

Результаты опытов полученные при инкубации изолированных щит-

ков кукурузы-в дистиллированной воде показали, рис.1, что достоверное подкисление инкубационной среды щитками начинается уже через 15 мин с начала инкубации. Снижение рН инкубационной среды продолжается в течение 60-80 мин, затем процесс приостанавливается и дальнейшая инкубация щитков не приводит к видимому снижению рН. Степень закисления инкубационной, среды щитками зависит от сроков их выделения. Щитки выделенные через 14-часов с начала набухания вызывают больший сдвиг рН инкубационной среды в кислую сторону, чем щитки выделенные через 6-часов с начала набухания.

О 60 120 180 240

. Время инкубации, мин Рис.1. Подкисление инкубационной среды щитками, выделенными в разные сроки с начала набухания. Щитки инкубировались в Н О.

---- — 6-часовые щитки. - 14-часовые щитки

В настоящее время считают, закисление инкубационной среды растительными объектами, определяется работой плазмалеммных ионных насосов, одним из которых является протонная помпа (Marre е.а..1988;RubensteIn,Stern,1991). В дальнейших опытах нам удалось показать, что способность щитков смещать рН инкубационной среды в кислую сторону, вызывается способностью изолированных щитков кукурузы секретировать кислоты.

Секреция кислот во внешнюю среду изолированными щитками кукурузы, позволяет предположить, возможность закисления щитком эндосперма в интактных зерновках . Известно, что в эндосперме про" растающих зерновок кукурузы отмечается повышенное содержание органических кислот по сравнению с эндоспермом сухих семян (Калугина, Нгуен,1974). Результаты наших опытов показали, рис.2, что в

процессе прорастания происходит подкисление, которое наблюдается лищь у ннтактных и почти отсутствует у изолированных эндосперм. Особенно сильное подкисление эндосперма наблюдается в первые 14 ч прораотания. Известно, что в процессе прорастания эпителиальные клетки щитка морфологически видоизменяются приобретая вид протуберанцев и внедряются в ткань эндосперма (Swift, О Bretn,1972;ZamsKl,1973), что необходимо, вероятно для нормального закиоления эндосперма щитком.

рН I 6.0f

»-!—I-1_I_I_

2 14 24 36 ч

Рис.2. Изменение рН тканей у изолированного и' интактного эндосперма зерновок кукурузы за 36 ч набухания. ---— изолированный эндосперм:- интактный эндосперм.

На основании наших данных, можно говорить, что у щитка зерновок кукурузы на ранних этапах прорастания проявляется ранее неизвестная функция щитка, связанная с секрецией кислот. Таким образом, активное участие щитка в дистантном переваривании запасных питательных веществ эндосперма монет быть связана со способностью щитка секретировать не только гидролитические ферменты, а таете кислота, вызывающие закисление эндосперма.

1.2 Динамика секреции кислот щитками

При исследовании динамики секреции кислот щитками установлено (табл.1), что наибольшее количество кислот выделяют 6-часовые

щитки. По мере прорастания количество, выделяемых щитками кислот уменьшается.

Таблица 1

Динамика выделения кислот изолированными щитками зерновок кукурузы

■ Возраст . Количество, выделенных кислот, мк-экв Н*

щитков с -------

начала Свободные Связанные Общие

набухания кислоты кислоты кислоты

6 час 16.0 + 0.6 21.4 ¿0.6 37.4 + ■0.6

14 час 7.8 + 0.6 11.8 ±0.5 19.6 + 0.5

24 час 4.4 0.6 11.4 ±0.5 15.8 + 0.5

48 час 6.8 + 0.7 4.4 4 0.7 11.2 + 0.6

Обнаружено, что процесс секреции свободных кислот щитками имеет два пика активности, которые различаются как по времени так и по интенсивности т.е. закисления эндосперма щитком может проходить в два этапа. Первый этап закисления приходится на начало латентного периода прорастания (6- и 14-часовые щитки), т.е. в период при котором наиболее активны анаэробные процессы, на данном этапе секретируется большое количество кислот. Второй этап закисления эндосперма щитком,, приходится на начало проклевывают (24-и 48-часовые щитки). На этом этапе отмечается снижение секреции кислот щитками, возможно, это определяется тем. что могут включаться другие механизмы ацидофицирования за счет активации аэробных процессов. Интенсивность секреции кислот щитками именно на ранних этапах набухания имеет, веротно, важное физиологическое значение в пусковом механизме прорастания.

1.3. Качественный состав кислот, секретируемых. щитками

При изучении качественного состава кислот секретируемых щитками обнаружено, что щитки способны секретировать глюконовую, фосфорную и лимонную кислоту, а также ряд летучих кислот (уксусную, пропионовую, масляную). Установлено, что качественный состав кислот в инкубационных средах меняется в зависимости от возраста инкубируемых щитков (табл.2). Как видно из данной таблице в ла-

тентный период прорастания, т.е.* в период анаэробных процессов, штки секретирует в эндосперм, главным образом. легксЛинтезируе-мые кислоты для синтеза которых не требуется включения сложных метаболических процессов, что невозможно при данном сроке прорастания.

Таблица 2

Качественный состав секретируемых щитками кислот

Возраст щитков Качественный состав

с начала набу- кислот секретируемых

хания, ч щитками

6-часовыь глвконовая

14-часовые глюконовая, фосфорная,

уксусная, пропионовая.

масляная

24- я 48-часовке глюконовая, фосфорная.

лимонная

Так, в инкубационной среде 6-чассвых щитков идентифицируется, татам образом глюконовая кислота. Известно, что в щитках кукурузы довольно рано начинает функционировать пентозофосфатный путь дыхания (Беяозерова.Федорова.1976), следовательно существует реальный механизм интенсивного синтеза глюконовой кислоты. В инкубационной среде 14-часовых щитков, кроме глюконовой кислоты обнаруживается фосфорная кислота. Появление фосфорной кислоты в инкубационных средах, можно связать с многочисленными запасами фи-гляа в саренхишых клетках щитка (Harvey,1874). Следует отметить, 'Что распад фитина начинается, по-видимому, через 14 часов с начала прорастания зерновок кукурузы, поскольку в инкубационных средах -6- часовых щитков фосфорная кислота не обнаружена. Источником летучих ;кислот уксусной, пропионовой, масляной, обнаруженных в инкубационных средах 14-чассвых щитков, могут быть запасы липида, которые в больших количествах сконцентрированин в эпителиальных :клет,ках щитка (Белозерова, Карпова, 1983) и запас которых снижается яочти вдвое в .первые дни прорастания (Dure, 1960; Bewley, 1985). В литературе указано, что в щитке и эндосперме прорастающих зерновок кукурузы -имеется высокое содержание летучих кислот, где доминирующими являются уксусная, пропионовая. валерьяновая и изова-

лерьяновая„кислота (Калугина, 1980). На ранних этапах прорастания в щитке в больших количествах накапливается этанол (БеЛозеро-ва, Плотникова. 1979). который может быть источником уксусной молоты. Нами установлено, что секреция летучих кислот Щйткамй происходит на первом этапе закисления (табл.2), т.е. при частичном анаэробиозе тканей щитка (Буаро, 1977). поскольку на втором этапе закисления, выделения летучих кислот не наблюдается. В инкубационных средах 24- и 48-часовых щитков обнаружены кроме глкжоновой и фосфорной кислоты обнаруживается лимонная кислота. Поскольку лимонная кислота появляется только на втором этапе закисления, то это связано, вероятно, с резкой активацией аэробных процессов дыхания (Джен,Амен,1982). В результате данной активации возникает возможность синтеза сложных метаболических веществ таких как лимонная кислота. Источником лимонной кислоты может быть как глиок-силатный цикл, так и цикл Кребса повышенная активность которых обнаруживается в различных частях прорастающих зерновок кукурузы, причем наибольшая активность показана в щитке. Активность пиру-ватдегидрогеназы и изоцитратдегидрогеназы повышается в щитке в течении первых трех суток прорастания (Радченко, Белозерова,1980). Учитывая, что глиоксилатный цикл является синтетическим, а цикл Кребса играет метаболическую роль поставляя клетке энергию, более вероятным путем образования лимонной кислоты, секретируемой щитками, представляется глиоксилатный цикл.

1.4. Роль С0г в подкислении среда щитками

Закисление внешней среда изолированными щитками может быть результатом не только протонной помпы и секретируемых кислот, а также большого количества С02, поступающей в инкубационную среду вследствии усиления дыхания. В литературе указывается на интенсивность дыхания щитков кукурузы в первые дни прорастания, причем "эндоспермальная" часть щитка дышит более активно, чем "зародышевая" часть (Белозерова,Радченко, 1977). Эта возможность исследовалась нами и было показано, что при постоянном продувании инкубационной среды (для удаления СО ).значительного смещения pH в кислую сторону не наблюдалось. В литературе отмечается существование НС0"3/ с Г антипортера в обкладочных клетках желудка (Ашмарин и др.1992;Sachs е.а. 1982).В настоящее время появляются данные о существовании анионного обмена (НС03_/ сГ антипортера) у растений

'(^офимова.Мологкоеекйй, 1993). В связи с этим мы провели ряд опыте® По йзученй» влияния !1аНС03 20мН и КНС03 20 мМ на процесс секреции кислот вдткамл.

О влиянии НС03' судили по смещению рН инкубационной среды в кислую сторону, сравнивая д рН опытных и контрольных вариантов рН разница между значением рН среды в начале й в конце инкубации). Для контроля щитки инкубировались в Н.,0 и в растворах ЙаС1 20 мМ И КС1 20 мМ.

Обнаружено (рис.3), НаНСО . . а рН составляет величину 1,5 и 2,2 (Время инкубации со-отвественно 3 ч и 18 ч), что в сравнении с контрольным вариантом (Н20) составляет разницу 0,5 и 1.2 ед. При инкубации щитков в растворах КНСО ееЮТша А. рН равна 1,7 и 2.6 (время инкубации соотвественно 3 ч й 1В Ч), Чго 6 сравнении с контрольным' вариантом (Н О) составляй1 0,7 и 1,6 ед.

что при инкубации щитков в растворах с

дрН I

^ I

2,0-1 I

I

I

Н I

0-1 'I

1 1

гЬ

I

~Н20 Контроль

А В С П

Инкубационные среды Рис.3. Действие одно- и двухвалентных катионов на подкисле-ние инкубационной среды 24-часовыми щитками.

А - МаНС0з; В - ИаС1; С -'КНС03; Б - КСI;

контроль - Н20;

Концентрация катионов 20 М. Время инкубации: незаштрихованные столбики - 3 ч; заштрихованные - 16 ч. На оси ординат л рН разница между значением рН в начале опыта и в конце инкубации.

Сравнивая результаты опытов, полученные при инкубации щитков в растворе ИаНС03 и ИаС1, видно что ионы НС03" усиливают процесс подкисления среды щитками на 0,8 ед, такой же эффект обнаружива-

ется при сравнении результатов, полученных ври инкубации кдткое в растворе КНС03 и KCL

Полученные результаты показывают, возможное участие бикарбоната в процессе секреции кислот щитками, что доказывается снижением pH инкубационной среды. Таким образом, у (прорастающих зерновок кукурузы в механизме ацидофицирующей деятельности щитка, возможно, существует аналогичный животным клеткам НС03"/ ¡R-C00 " антипортер и НС0"3 может быть одним из компонентов усиливающих ацидофицирующуи функцию щитка в закислении эндосперма.

2. МЕХАНИЗМ СЕКРЕЦИИ КИСЛОТ ЩИТКАМИ

Основываясь на литературных данных о механизме действия протонной помпы в работе транспорта веществ через клеточную мембрану (Полевой,Саламатова, 1980; Crane е.а.1985; Barr, 1991), можно предположить, что выделение кислот щитками, вызывающими подкисление внешней среды сопряжено с деятельностью протонной помпы.

2.1. Действия ауксина, кинетина и гиббереллина на подкисление инкубационной среды щитками

Известно, что выделение ионов Н\ и СГ слизистой желудка активный энергозависимый процесс, связанный с работой протонной помпы (Sachs е.а,1982). В настоящее время имеются многочисленные сведения, показывающие возможность функционирования как Н+АТФаз (Шипарев и др.1990;1993), так и редокс-цепей в плазмалемме эпителиальных клеток щитка (Белозерова, Корсакова, 1989; Щипарев, Мячин, 1990:Белозерова и др,1992). На основании этих данных можно предположить, что одним из механизмов, лежащих в основе секреции кислот щитками,может быть функционирование H*Lnoimu. Для проверки данного предположения, мы провели опыты по влиянию мИУК 10 мг/л на процесс секреции кислот щитками. Известно, что в сухих зерновках злаков содержится значительное количество связанной индоли-луксусной кислоты (ИУК), которая уже в первые два часа набухания переходит в свободную форму и транспортируется к зародышу (Полевой, 1959; Бсккср и др.1981). Известно, также способность ауксина индуцировать выход ионов Н+ из растительных объектов (Полевой.Бу-магина. 1932; Cleland,1980).

Нами обнаружено, что при инкубации изолированных щитков в

растворе мИУК (10 мг/л) значительно усиливается секреция кислот щитками. Из результатов, представленных на рис.4, видно что мИУК активирует процесс секреции кислот у 6-часовых щитков на 30%. у 14-часовых на 48% и у 24- и 48-часовых щитков соотвественно на 22 и 18% по сравнению со щитками инкубированными в дистиллированной воде. Снижение стимулирующего влияние экзогенной мИУК на секрецию кислот 24- и 48-часовыми щитками по сравнению с 6- и 14-часовыми щитками, можно объяснить увеличением в клетках 24- и 48-часовых щитков эндогенного ауксина.

Рис.4. Влияние мИУК 10 иг/л на секрецию кислот 6-. 14-. 24-и 48- часовыми щитками

Инкубационные среды: незаштрихованные столбики - Нг0 (контроль) ; заштрихованные - раствор мИУК 10 мг/л; Время инкубации-4 ч. На оси ординат - количество выделенных кислот, мк-экв Н+

Положительное влияние мИУК на подкисление инкубационной среды щитками потверждает наше предположение, что в основе секреции кислот щитками лежит сопряженйый транспорт анионов кислот в сим-порте с ионами Н*. Подобное действие показано на клетках метилот-рофных дрожжей при формальдегид - индуцируемом закислении. Закис-лительная способность метилотрофных дрожжей сопряженная с накоплением Формиата, чувствительна к ингибитору плазмалеммной Н+-АТФазы - ортованадату (Гончар и др..1994).

Известно, что не только ауксин, а также кинегин способен

мк-экв Н'

6

14

Возраст ¡зитков, ч

24

48

индуцировать закисление инкубационной среды растительными объектами (Максимов и др, 1979; Магге е.а,1988; Вагг.1991).

Результаты опытов по влиянию кинетина на процесс секреции кислот щитками показали, что положительное воздействие кинетика, на способность щитков секретировать кислоты зависит от срока выделения щитков, обнаружено, что кинетин КГ'М. 10"5М способен оказывать положительное влияние на подкисление инкубационной среда 24- (рис.5) и 48-часовыми щитками, не оказывая при этом положительного влияние на ацидофицирующую деятельность 14-часовых щитков.

мкмоль

н+

120 180 Время инкубации, мин. Рис.5. Действие кинетина и КСI на скорость выделения ионов 24-часовыми щитками.

Н О (контроль); 2 - кинетин 10"аМ;

4 - кинетин 10

-в«

5 - кинетин

Инкубационные среды: 1 ■ 3 - кинетин 10"5М + KCl 5 мМ; 10"8 М + KCl 5 мМ

Установлено, что положительное влияние кинетина на ацидофицирующую деятельность щитка повышается, при внесении .в инкубационную среду с кинетином ионов К*, возможно это связано со способностью кинетина индуцировать .поглощения калия, что приводит к усиленному выбросу протонов, следовательно и кислот, секретируе-

МЫх щйтками. Возможно, что механизм действия кинетнна схож с ме-хЬИИзНом Действия ИУК, в настоящее время известно о наличии рецепторов белковой природы для цитокининов (Кулаева. 1982;Гамбург и Д|э. 1990).

Вероятно, деятельность протонной помпы не может быть единственным механизмом осуществляющим секрецию кислот щитками. В литературе указывается положительное влияние гиббереллина (ГК) на процесс секреЦии белков щитками (Ильчуков. 1983; Щипарев,Ильчу-ков,1983), в основе которого лежит усиление им процесса формирования й ориентирования микротрубочек, осуществляющих целенаправленный транспорт секреторных везикул с гидролазами к плазмалемме, т.е. ускорением транспорта секретируемых везикул.. Подобное действие ГК Показано в клетках эпидермальных тканей эпикотиля гороха (Кагио,Й1гоМ, 1981).

В наших опытах по изучению влияния ГК (10 мг/л) на ацидофи-цируюцую деятельность щитка <рис.6) обнаружено, что ГК активирует процесс секреции кислот у -24-часовых щитков по сравнению с контрольным вариантом и не оказывает положительного влияние на секрецию кислот 48-часовыми щитками. го! мк-экв Г

о

Е

«

3 32

К

о 'И

/о

а

а

6

о «

1

а: о <-

Инкубационные среды Рис.6. Действие гиббереллина и КС1 на подкисленне инкубационной среды 24- (А) и 48-(В)-часовыми щитками .

Инкубационные среди: 1 - Н,0; 2 - ГК 10 мг/л; 3 - ГК КСI 5мМ; 4 - КС1 ЕмМ. Время инкубещш - 4 ч.

При внесении ионов К* в инкубационные среды ГК, процесс секреции кислот щитками поз влиянием ГК усиливается но сравнению с

- 16 -

вариантом, когда щитки инкубировались в КС1 (5мМ).

Положительное влияние гиббереллина на процесс секреции кислот щитками, дает возможность предположить, что кроме сопряженного транспорта кислот в симпорте с ионами Н*. существует, по-видимому, пузырьковая секреция кислот. Отсутствие положительного влияние гиббереллина на секрецию кислот 48-часовых щитков, определяется тем, что на данном этапе прорастания эпителиальные клетки щитка имеют уже достаточно развитый эндоплазматический ретикулум (гатзк1,1973) и содержание эндогенного ГК достигает максимального значения (Джонс,Стоддарт, 1982).

Полученные результаты говорят о том. что фитогормоны могут принимать активное участие в регуляции процессов порастания, осуществляя в том числе контроль над секрецией из щитка в эндосперм кислот.

2.2. Действие катионов и 2.4-ДНФ на процесс секреции кислот щитками

Доказательством электрогенной природы процесса секреции кислот щитками, могут быть данные полученные в опытах при изучении влияния ионов К*, Саг*, М^+ и Мпг* на данный процесс.

Из результатов, представленных на рис.7, видно, что у 14-часовых щитков наиболее положительное влияние на секрецию кислот оказываюи ионы К*, который как известно способен индуцировать работу протонного насоса (Бумагина,Полевой.1984). У 24-часовых щитков наибольший положительный эффект оказывают ионы Мп2*. Положительное влияние ионов Мпг* именно на данном этапе подкисления определяется тем. что ионы Нпг* способны активировать изоцитратде-гидрогеназу цикла Кребса (Попова. Деметришвили,1993) наиболее активную в щитке на данном этапе прорастания (Радченко,Белозерова. 1980). Важность ионов Саг+ в поддержании секреции кислот щитками обуславливается его положительным влиянием на всех этапах зэкнслення эндосперма щитком.Известно, что кальций является необходимым кофактором, регулирующим интенсивность переноса секрета чер°з плазмалемму (Саламатова, Зауралов,1990). Способность ионов Са'е* усиливать процесс секреции кислот щитками, связано', возможно, с его влиянием па структуру мембран, на ионные каналы комп-л-ко Сзг*-кальмолулин активирует протеинкинззн. АТФззы и другие мембршаши белки (Гамбург и дп.ЮУО). Известно также, что в при-

сутстбии 6 среде ионов Са2* усиливается выход протонов из клеток отрезкой колеоптилей кукурузы под действием ИУК (Мачче е.а,1079), уменьшается пассивный приток ионов Н*, что приводит к росту Н*-градиента (Полевой, Бумагина, 1982).

|мк-экв Н* . О

46

«Н

О L.

s

4

на секрецию

- MgCI2 (5мМ); ч.

средах ионов

2 3 4 6 Ч

Инкубационные среды Рис.7. Действие одно- и двухвалентных катионов кислот 14-(А) и 24-(Б)часовыми щитками.

Инкубационные среды; 1 - Н20; 2 - KCl (5мМ); 3

4 - СаС1г (5мМ); 5 - МпС12 (5мМ). Время инкубации-4 В наших опытах в присутствии в инкубационных Саг* положительный эффект влияние мИУК 10 мг/л на процесс секреции кислот 14-часовыми щитками повышается на 30%. Известно, что первичный механизм действия ауксина, связывают с быстрым и кратковременным входом ионов Ca2* в цитозоль, который является вторичным мессенджером, способным- увеличивать активность мембранных белков,в том числе АТФаз (Гамбург и др.1990).

Положительное влияние ионов Mg2* и Мп2* на процесс секреции кислот 24-часовыми щитками, определяется, вероятно, их влиянием на редуцирующую активность щитков, т.е. на функционирование ре-докс-цепей (Щипарев, Мячин, 1990;Rubenstein, Stern,1991).

Таким образом, одно- и 'двухвалентные катионы значительно увеличивают выход кислот изолированными щитками кукурузы, что может указывать на электрогенный характер данного механизма.

Очевидно, что выделение кислот щитками осуществляется против градиента концентрации Н* и R-C00", и следовательно проходит с затратой энергии. Одним из доказательств активного транспорта является его энергозависимость, в связи с этим мы исследовали влия-

8

. ние 2,4-динитрофенола (2.4-ДНФ, разобщитель окислительного фасфо-рилирования и протонофор) на процесс секреции кислот щцдами. Из табл. 3, видно, что инкубация изолированных щитков Е) растворе 2,4-ДНФ 10"3М приводит к значительному подавления ИМ секреции кислот. Возможно, что при данной концентрации 2,4-ДНФ подавляет синтез АТФ, не нарушая перенос электронов, за счет повышение пассивной протонной проводимости, и хотя перекачивание протонов может происходить, в этих условиях не создается достаточный градиент рН, который был бы способен обеспечивать синтез АТФ. Доказательством, что подавляющее действие 2,4-ДНФ на секрецию кислот щитками определяется нарушением энергетического обмена было показано при совместном воздействии мИУК и 2,4-ДНФ, так как мИУК устраняет ингибирующее воздействие 2,4-ДНФ, усиливая пропускную способность редуцированной редокс-цепи в плазмалемме, обеспечивая тем самым синтез АТФ. На основании полученных данных можно говорить, что процесс секреции кислот щитками является энергозависимым процессом.

Таблица 3

Действие 2.4-ДНФ на выделение кислот 6-часовыми щитками в присутствии мИУК

Инкубационные среды Количество, выделенных кислот, мк-экв Н+ % к контролю

Н20 (контроль) 2.6 ± 0.03 100

мИУК (10 мг/л) 3.4 + 0.06 130

2.4 ДНФ'10"3м' 1.81 ± 0.03 70

мИУК+2,4-ДНФ 2.82 + 0.04 105

3. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ АЦИДОФИЦИРУЮЩЕЙ ФУНКЦИИ ЩИТКА В ПРОЦЕССЕ ПРОРАСТАНИЯ

Стимулирующее действие органических кислот на прорастание семян отмечено во многих работах (Землянухин,Симонова, 1964; Благовещенский, 1968) причины, лежащие в основе данной стимуляции не достаточно исследованы. По нашему мнению, процесс подкисления эндосперма щитком является одним из пусковых механизмов мобилизации запасных питательных веществ эндосперма.

3.1. Влияние рН среды на степень распада крахмала 6 эндосперме

Под пищеварением в прорастающих зерновках злаков обычно понимают процесс распада запасных питательных веществ эндосперма на более простые соединения и всасывания их щитком для дальнейшей транспортировки к растущему зародышу. По нашему мнению, выделение кислот щитком в эндосперм на ранних этапах прорастания зерновок ведет к активации кислых гидролаз, локализованных в эндосперме, и является одним из важнейших пусковых механизмов прорастания. Под-кисление эндосперма, видимо первый этап в переваривании запасных тщательных веществ. Только вслед за подкислением начинается, вероятно, активная секреция амилазы и ряда других гидролитических ферменЧМв в эндосперм щитком. Данные опытов по выяснению влияния рН среда на распад крахмала в эндосперме, табл.3, показали, что степень распада крахмала в изолированных на различных стадиях прорастания эндоспермах зависит от рН среды. Количество редуцирующих Сахаров в инкубационной среде больше в 1.2-1,8 раза при величине рН 4.0 по сравнению с вариантами при рН 6,0.

Таблица 3

Степень распада крахмала в изолированных эндоспермах в зависимости от рН среды.

Инкубационные Количество редуцирующих Сахаров, среды мкг мальтозы на 100 эндосперм

рН 0,1М аце- Сухой через 24 ч через 48 ч татного буфера эндосперм набухания набухания

рН 3.2 330 + 1.2 636 ± 3, 0 945 + 3, 0

рН 4.0 465 + 3,0 720 + 4.5 1380 7, 5

рН 5. 0 375 + 3,0 510 + 1.5 1020 + 3, 0 ■

рН 6.2 315 + 1, 5 405 + 1,2 930 + 5, 0

Судя по литературным данным, интервал рН 3,8-4,4 является оптимальным для работы амилаз (Кретович, 1986). протеина.:, (А.Ьот е. а. 1975), мальтаз (ДаФ!-уо, ДгиИ-У«. 1 :*й7>.

Таким образом, результаты опытов с, изолированными '-нд;е!ыр

мамй потверждают, высказанную нами точку зрения о том, что подкисление эндосперма кислотами, выделяемыми щитком на ранних стадиях прорастания ускоряет гидролиз запасных питательных веществ эндосперма.

3.2. Подкисление эндосперма и амилазная активность щиткз

Известно, что амилаза имеет важное биологическое значение при прорастании, семена не имеющие этого фермента в активной форме, вообще не обладают способностью к прорастанию (Tkacljijfc. Tipples,1966). При прорастании семян амилазная активность обнаруживается сначала в щитке, а затеи уже появляется в эндосдер-ме, в связи с чем особое значение приобретает способность щитка секретировать х, - амилазу, которая участвует в мобилизации запасных питательных веществ эндосперма вместе с J3 - амилазой, которая обнаруживается лишь в эндосперме (Dure,1969;Okomoto, К1taño, 1980;Ranh, Soponen.1984). Сведения о времени секреции st- амилазы щитками кукурузы противоречивы (Dure,1960). Активная секреция гидролаз щитком в эндосперм начинается, видимо, только после того, как произошло его подкисление. Действительно, по нашим данным, представленными в табл. 4, активная секреция J. - амилазы щитками начинается только через 14 ч с момента набухания зерновок. По нашим данным, секреция кислой амилазы начинается раньше.чеч это указано в литературе (Dure.i960), таким образом видно, ■ что процессу активного выхода кислой амилазы, предшествует снижeuffc рН тканей эндоспрма в близлежащих к щитку зонах.

Таблица 4

Динамика выделения кислой амилазы щитками кукурузы.

Возраст Количество редуцирующих Сахаров в среде

щитков ( мкг мальтозы в час на I щиток )

6 час. 14 час. 24 час. 48 час.

21. 2 + 0.2 43.3 + 0.5 55.2 + 0.6 73. 0 + 0.7

Результаты нашей работы позволяют по-новому взглянуть на роль щитка в процессах прорастания. Ранняя активация ацидофициру-

щей функций ¡цитка,- вызывает закисление эндосперма, вслед за ки-Торым начинается активная секреция кислой амилазы щитком, что свидетельствует 0" Пусковой роли ацидофицирующей функции ощтка в Мо&Шзациа зайа'сных питательных веществ эндосперма.

На осноШШ вышеизложенного можно сделать следующие выводи:

ВЫВОДЫ

1.- Впервые установлена способность щитков кукурузы секрета-роей'/ь кислоты,- вызывающие закисление как внешней среди, так и эндосперйа интактных зерновок.

2. Выявлено, что наиболее интенсивное выделение кислот щит-камчи ййблюдается через 6 часов с начала набухания зерновки. Следовательно, ацндофицирующая функция щитка проявляется уже на санах ранних этапах прорастания.

3. Обнаружено, что щитки секретируют глюконовуо, фосфорную, лимонную и ряд Летучих кислот таких,как уксусная, пропионовая и масляная кислоты. Качественный состав кислот зависит от возраста щитков, что указывает на зависимость качественного состава кислот от метаболических процессов, происходящих при прорастании.

4. Выявлено, способность мИУК. кинетина и гиббереллина активировать процесс секреции кислот щитками кукурузы. Положительное действие мИУК усиливается в присутствии в среде ионов кальция, что указывает на специфическую роль ионов кальция в активировании кИУК ацидофицирующей деятельности щитка. Таким образом, полученные результаты указывают на возможность участия эндогенных гормонов в регуляции секреции кислот щитками, т. е. в процессе кислого пищеварения.

5. Установлено, что секреция кислот- щитками стимулируется одно- и двухвалентными катионами (Кт, Саг*, и !"п2*), что указывает на электрогенный характер данного механизма секреции кислот.

6. Обнаружено, что секреция кислот щитками значительно подавляется 2,4-динитрофенолом, что свидетельствует о зависимости данного процесса от энергетического метаболизма.

7. Установлено, что активное выделение кислой амилазы щитком начинается только после подкисления эндосперма до определенного уровня рН, что свидетельствует о пусковом механизме ацпдофипирую-щей деятельности щитка в процессе мобилизации запасных питатель-

- 22 -

них веществ эндосперма на ранних этапах прорастания.

Список работ.опубликованных по теме диссертации:

1. Щипарев С. М.. Чупрова Г. В., Полевой В.В. Секреция кислот изолированными щитками кукурузы //Вестник Ленингр. ун-та. - 1976. 1! 21 (серия Биология). - С. 130-133

2. Чупрова Г.В., Щипарев С.М. К изучению пищеварительных процессов в прорастающих зерновках кукурузы // Вестник Ленингр. ун-та,- 1977, N 21 (серия Биология).- С.113-114

3. Щипарев С.М.. Чупрова Г. В. Выделение кислот щитками прорастающих зерновок кукурузы и его физиологическая роль // Фотосинтез. дыхание и органические кислоты. - Воронеж: Воронеже, ун-т. -1980,- С.149-154

4. Ильчуков В.В., Щипарев С.И., Егорова (Чупрова) Г.В. Изучение дыхания щитков кукурузы, обработанных ауксином и его синтетическим аналогом // Регуляторы роста.- Л.: Ленингр. технологический институт.-1980.- С.60-64

5. Шипарев С.М., Ильчуков В.В-, Егорова Г. В. .Прудникова Н. Г. Действие фитогормонсв на секреторную активность щитков зерновок кукурузы // Тезисы 1-ой Всесоюз. конференции "Регуляторы роста и развития растений"-. - М. - 1981

6. Щипарев С.М., Белозерова Л.С., Егорова Г.В. Ацидофицирую-щая деятельность щитков зерновок кукурузы при прорастании // Тезисы 2-го Всесоюзного совещания по физиологии кукурузы.- 1984.-Днепропетровск. - 1984

7. Егорова Г.В. Механизм "кислого пищеварения" и его роль в инициации прорастания зерновок кукурузы // Научные записки ЯГУ.-Якутск: Якутский ун-т.- 1994, серия Биология.- С.150-159

1ДЙД0ФИЦИРУШШЛЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ЩИТКА ЗЁРНоЬКИ КУКУРУЗЫ ПРИ ПРОРАСТАНИИ

Г. В, Егорова Автореферат

Подписано в печать 16.05.95. Формат 60x84/16. Бумага тип. №2 Печать офсетная. Печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,8. Тираж 100 экз.

______Заказ 61 .____________

Издательство ЯГУ. 677891, г. Якутск, ул. Белинского, 58