Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические механизмы действия гибберелловой кислоты на синтез и секрецию альфа-амилазы из изолированного алейронового слоя зерна пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические механизмы действия гибберелловой кислоты на синтез и секрецию альфа-амилазы из изолированного алейронового слоя зерна пшеницы"

Р Г Б ОД

Г. г> ГСП <рг>/-

КАЗАХСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. АЛЬ-ФАРАБИ

На правах рукописи УДК: 377.152.

БИСЕНБАЕВ Амангельды Куанбаевич

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ГИББЕРЕЛЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА СИНТЕЗ И СЕКРЕЦИЮ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ ИЗ ИЗОЛИРОВАННОГО АЛЕЙРОНОВОГО СЛОЯ ЗЕРНА ПШЕНИЦЫ

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АЛ МАТЫ 1994

Работа выполнена на кафедре генетики и молекулярной биологии Казахского государственного национального университета им.Аль-Фараби

доктор биологических наук, профессор Борсимбаев г.И.

доктор биологических науч вурсо» О.Б.

хаидидат биологических наук Еогуспа«в К.К-

Институт физиологии,генетики и биоинженерии при Национальном центре по биотехнологии Республики Казахстан

Защита состоится "_" ___1994г. в _час _мин. на заседании специализированного Ученого совета К 14/ А.01.13 при биологическом факультете Казахского государственного национального университета ии.Аль-Фараби г.Алматы, 480121, пр.Аль-Фараби» 71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Университета Автореферат расослан "_" _1994 г.

Ученый секретар специализированного совета кандидат биологических наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Т.М.Шалахметава

Актуальность проблемы. Гиббереллины являются представителями большой группы биологически активных соединении дитерпеноидной природы .которые обнаружены во всех исследованных тканях высших растений.В настоящее время гиббереллины интенсивно исследуются, поскольку они вовлекаются в самые разнообразные физиологичес кие процессы организма растений ( Кефели ,1984; СгаеЬе,1987; УоеЬ1ЬНо et а1.,1992;НооХеу,1992).Одним из наиболее изученных аспектов физиологической роли гиббереллинов является их участии в стимуляции проростания семян злаковых ,в частности у пшеницы. В ходе прорастания зерна ключевая роль принадлежит альфа-амила-эе.Которая является единственным ферментом,обеспечивающим первичный гидролиз нативного крахмала.Продуктами альфа-амилаз-ного гидролиза ногут быть простые сахара ,исЛользуёмые для роста зародыша в качестве энергетического субстрата(Н11йеЬгап1, НутоиНг,1981). Установлено,что альфа-амилаза отсутствует в сухом зерне(0аиз5заг^ е! а1.,19?7) и активация ее происходит под влиянием гибберелловой кислоты (ГК)(\/аг1у еЪ а1.,1982). До настоящего времени не проводился подробный анализ биохимического механизма действия этого фитогормона на амилазосекрети-рующие клетки зерна. Показано , что действие ГК в зерне пшеницы на секрецию альфа-амилазы опосредуется метаболизмом мембранных фосфолилидов ,в том числе фосфоииозитидов функционально тесно взаимосвязанных с изменением внутриклеточного содержания кальция^ также активацией Са2*,фосфолипкд зависимой протеинкиназы С (ПК С)(М1гЬаНаг et а1., 1982). Можно было предполагать, что мобилизация кальция , также как и активация ПК С, является необходимым звеном во внутриклеточном механизме стимулирующего действия ГК на образование и секрецию альфа-амилазы зерна пшеницы. В связи с отмеченным изучение внутриклеточного механизма действия ГК на амилазообразующую и секреторную функцию клеток алейронового слоя зерна пшеницы является актуальной задачей современной биохимии растений.

Цель я задача работы. Целью работы было изучение биохимического механизма регуляции синтеза и секреции альфа амилазы в алейроновом слое зерна пшеницы при участии гибберелловой кислоты , а также оценка роли и вклада ионов кальция и Саг+,фосфолипид зависимой протеинкиназы С в механизме действия фитогормона на биосинтез, секрецию и изоферментный спектр альфа -амилаз.

- г -

В соответствии с этой целью в настоящей работе решались следую щие задачи:

1. Изучить участие клеточного протеосинтеза в механизме стимулирующего действия ГК на активность клеточной и секретиро-ванной из алейронового слоя альфа-амилазы с помощью ингибитор-ного анализа и по включению меченых аминокислот, а также исследовать вклад индуцированного фитогормоном белкового синтеза в образовании альфа-амилазы.

2.Изучить участие внутриклеточных мессенджерных систем свободных ионов кальция и Са2 +, фосфолипид зависимой протеинки-назы С - в реализации амилазостимулирующего эффекта ГК.

3. Исследовать значимость изменения изоферментного спектра альфа-амилаз в гормонстимулированной активации ферментов. Научная новизна и практическая ценность работы. В работе показано, что экзогенно добавленные ионы Сай* не участвуя в ГК-сти-мулированном синтезе молекулы альфа-амилазы, являются необходимыми в действии ГК только на секрецию предобразованных, запасенных ранее иэоформ альфа-амилазы. Впервые установлен взаимопотенциирующий (синергетический) эффект ионов кальция на ГК стимулированную секрецию определенных групп изоферментов альфа-амилазы.С использованием специфических ингибитора и активатора Саг*,фосфолипид зависимой протеинкинаэы С установлено участие фермента в ГК активированном образовании изоформ альфа-амилазы. Выполненная работа носит теоретический характер. Полученные в ходе исследования данные расширяют представления о биохимических механизмах регуляции проростания зерна пшеницы под действием фитогормонов.

Апробация работы.Материалы работы доложены на V конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991), на III Всероссийском сьезде физиологов растений (Санкт-Петербург,1993), на конференциях молодых ученых КазГУ им. Аль-Фараби (Алматы,1990,1992) .

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 5 печатных работах.

Структура и объем работы.Диссертационная работа состоит из введения ,обзора литературы,описания материалов и методов исследования , результатов исследований и их обсуждения,заключения,выводов. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста , ил-

люстрирована 11 рисунками и 5 таблицами.Список цитированной литературы включает 188 наименований отечественных и зарубежных работ•

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследованиях использовали семена гексаплондной пшеницы (Triticum aestivum) сорта Казахстанская 3 . Изолированные алейроновые слои выделяли по кетодике описанной в pa6oTe(Chrispe-els.Varner,1967).Алейроновые слои инкубировали в 2 мл натрий-ацетатного буфера(рН 5.0),содержащей хлорамфеникол(25мкг/мл) и/или стрептомицин(5мкг/мл).Активность альфа-амилазы(КФ 3.2.1.1) определяли по стандартной методике (Chrispeels ,Varner,1964). Изоферментный состав альфа-амилазы изучали путем электрофореза в 7,5 X полиакриламидном геле(ПААГ) с использованием трис-глицино-вой буферной системы (Гильманов и др.1981). О биосинтезе клеточных белков судили по включению [35S]-метионина в кислотонераст-воримую белковую фракцию изолированного алейронового слоя(Бисен-баев и др.,1992). Электрофорез белков в ПААГ в присутствии доде-цилсульфата натрия проводили по методу Лэммли (Laemmli et al.,1975).Авторадиографию электрофоретического распределения белков ткани алейронового слоя после электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия проводили с использованием рентгеновской пленки РМ-1. Концентрацию белка определяли по Лоури (Lowry et al.,1971). В экспериментах использовали следующие реактивы: гибберелловая кислота 3, сгауроспорин,12-о-тетрадекано-ил-13-форболацетат( фирмы "Sigma", США ),трис (гидроксиметил) аминометан, циклогексимид ( фирмы "Serva",ФРГ), растворимый крахмал ,хлорамфеникол (фирмы "Merck'', ФРГ), додецилсульфатнат-рия, бета-меркаптоэтанол, альфа-амилаза из бактерии ( фирмы "Fluka".Швейцария)»стрептомицин (коммерческий медицинский препарат , Россия),бромфеноловый синий(фирма"СЬетаро1",Словакия),ак-риламид,М,Н,Н,Н'-тетраметилэтилендиамин,Н,Л'-мегилен-бйсакрила-мид, аммоний надсернокислый,глицин (фирмы "Реанал".Венгрия). [35Я)-метионин (производства Института ядерной физики АН Республики Узбекистан,Танкент,Уд.активность ЮМБк). Все остальные реактивы были отечественного производства, квалификацией не ниже "хч".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В экспериментах по изучению влияния различных доз ГК (0,01мкМ, 0,1мкМ, 1мкМ) на активность клеточной и секретированной иа изолированного алейронового слоя зерна {циеницы альфа-амилазы было показано, что для стимуляции активности клеточной альфа-амилазы достаточно присутствие в инкубационной среде ГК в дозе 0,01 мкМ, в то время как достоверная стимуляция активности секретированной в инкубационную среду альфа-амилаэы происходила при бопее высокой (в 100 раз) концентрации ГК(табл.1).

Таблица 1.

Влияние разных доз ГК на активность клеточной и секретированной альфа-анилаэы из изолированного алейронового слоя зерна пшеницы.

Условия эксперимента

Контроль ГК (0,01 нкМ) ГК (0,1 мкМ) ГК- ( 1 мкМ)

1 г

Кол-во опытов

Активность альфа-амилаэы {%), в гомогенате I в инкубационной среде

(клеточная)

100,± 13,6 175 X 7,0* 185 ± 10,0* 196 ± 9,7*

(секретированная)

100 ± 10,5 . 118 ± 11,0 125 ± 13,5 168 ± 6,2*

* - р < 0.05 по сравнению с контролем.

В представленных выше экспериментах ГК непрерывно присутствовала в среде инкубации в течение 24 часов . .

В последующих экспериментах мы исследовали активацию клеточной и секретированной альфа-амилазы в зависимости от времени присутствия фитогормона в среде инкубации (рис.1).

Результаты этих экспериментов показали, что инкубация изолированного алейронового слоя с ГК (1мкМ) в течение 8 , 16 и 24 часов приводит к линейному увеличению активности клеточной альфа-амилаэы. При этом достоверная стимуляция активности фермента происходила после 16 часов инкубации (рис.1г). Иная картина наблюдалась в активации секретированной альфа-амилазы - активность этой формы альфа-амилазы достигала достоверных значений чероэ 24 часа после добавления фитогормона (1мкМ) в инкубационную среду(рис. 1 в).

Рис.1. Влияние ГК (1 ИКМ)^ на активность клеточной . ,»s0 (г) и секретированной(в) § альфа-амилазы в зависни-ости от времени инкубации.Ь а,б - активность клеточной * и секретированной альфа- время»чай

амилазы без ГК,соответственно.

Таким образом, результаты этой серии экспериментов выявили различия между активацией клеточной и секретированной альфа-амилаз в зависимости от дозы и времени присутствия фитогор» иона. Можно было предполагать, что несмотря на тесную функциональную взаимосвязь между клеточной и секретированной альфа-амилазой, активация фитог'ормоном этих двух форм фермента может происходить разными биохимическими механизмами - эа счет активации предсуществующего фермента или за счет синтеза фермента de novo. Оказалось, что блокирование процесса трансляции цнклогексимидом полностью тормозит стимулирующее действие ГК на активность как клеточной, так и секретированной альфа-амилааи (Табл.2).

Таблица 2.

влияния циклогексимида на ГК-стимулированную активность клеточной и секретированной алфа-амилазы в алейроновом слое зерна пшеницы

I—

Т~

Условия Эксперимента

Контроль ГК (1 икМ) ЦГ{5 мкг/нл)*ГК ЦГ(5йкг/ил)

Кол-во опытов

I

Активность альфа-анилазы {%), | клеточной I секретированной I

100 ± 6,3 185 1 8,7" 105 i 11,7 102 ± 10,4

100 t 4,5 166 + 4,5* 108 i. 10,5 96 i 11,5

I

p < 0.05 по сравнению с контролем.

Эксперименты по включению [а5Э]-метионина также показали , что

Т 5

ГК в дозе ХмкМ существенно усиливает включение [в]- метионина в эндогенные кислотонерастворимые балки ткани алейронового слоя по сравнению с контролем(табл.3).

Таблица 3.

Влияние циклогексимида на ГК - стимулированное включение [355]-метионина в кислотонерастворимые белки ткани алейронового слоя зерна пшеницы.

1 | Добавляемые .......Г- 1 |Кол-во | включение [35 1 Б]-метионина |

| вещества I опытов! 1 1 ( икп/мин на 1мг белка) I

| Контроль 1 6 1 37500 ± 2600 |

| ГК (1 мкМ) 1 6 1 56000 ± 2000* 1

1 ЦГ(25мкг/мл) 1 4 1 25000 X 2800 |

| ЦГ(25мкг/мл) 1,........ +ГК| 4 | 1 1 25700 2500 | ....... 1

ЦГ и ГК присутствовали в инкубационной среде течение 24 часов инкубации.Результаты представлены с вычетом неспецифического включения 35З-метионина.* - Р<0,05 по сравнению с контролем.

Внесение только циклогексимида в дозе 25 мкг/мл к инкубируемым тканям алейронового слоя тормозило также и базальный уровень синтеза клеточных белков.

Таким образом результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о том, что под действием ГК в клетках алейронового слоя действительно усиливаются процессы белкового синтеза. Следовательно, синтез клеточных белков очевидно обеспечивает активацию как клеточной,так и секретированной формы этого гидролитического фермента.

Следует отметить ,что биосинтез альфа-амилазы в алейроновой слое пшеницы изучен очень мало. Основные данные по этому вопросу получены в исследованиях с использованием в качестве экспериментальных моделей алейронового слоя зерна ячменя и щитка риса, имеющих существенную видоспецифичность. В ряде работ подчеркивается возможное участие гормон-стимулированного протеосинтеэа в образовании как секреторных белков, так и иных клеточных структур,вовлеченных в сложный процесс секреции(Таиров и др.1990).

Поутону нельзя было исключить,что наблюдаемое в наших экспериментах включение метки может происходить в иные функциональные белки обеспечивающие созревание, реактивацию или выделение секреторного продукта. Для уточнения роли ГК-стимулированного лро-теосинтеэа в биосинтезе альфа-амилазы нами был проведен электрофорез клеточных белков с последующим авторадиографиропанием и идентификацией полученных электрофорегралм. Авторадиография электрофоретического распределения белковых зон гомогената ткани алейронового слоя выявила, что под действием ГК происходит интенсивное мечение белковой полосы соответствующей молекулярной массе альфа-амилаэы (рис.2).

Рис.2. Авторадиография электрофоретического распределения белков гомогената ткани после электрофореза в ПААГ в присутствии доде-цилсульфата натрия.1 - контроль,2 - ГК(1мкМ),3 - Са2+(10мМ), 4 -ГК( 1мкМ) + Са2* ( ЮмМ) .

Эти данные указывают на то, что процесс белкового синтеза, вовлекаемый в акилазоактивирующее действие гибберелловой кислоты необходим, в ток чисае, и для-усиления новообразования молекулы альфа-амилаэы в алейроновой слое зерна пшеницы.

Из' данных литературны известно ,что образование и выделение гидролитических ферментов, включая альфа-амилазу, отнюдь не единственственная функция клеток алейронового слоя стимулируемых гибберелловой кислотой. Показано, что гибберелловая кислота через 3- 5 минут инкубации с тканью стимулирует выделение из клеток алейрона минеральных ионов калия и кальция,приводит к изменению . мембранной проницаемости, для Сахаров, увеличивает содержание растворимых трифосфатов и т.д. ( Дерфлинг,1985 ). Следует подчеркнугь,что, например, для гормонов животных, также окаэыва-

<

12 3 4

ющих разносторонние влияния на активность клеток-мишеней, показана их "триггерная" функция, подразумевающая, что для формирования полного клеточного ответа достаточно кратковременного взаимодействия гормона с рецептором только инициирующим последующие, дистальные этапы реализации гормонального эффекта. Для фи-тогормонов подобных исследований не проводилось. Однако, как было установлено в наших экспериментах, ГК-зависииая активация клеточной и секретированной альфа-амилазы различается - она разделена по времени и для проявления активации требуются различные дозы ГК. Можно было предполагать, что "быстрые" эффекты ГК могут опосредованно приводить, в конечном счете, к стимуляции процессов и образования и.активации альфа-амилазы. Нельзя также исключить , что для гормонозависимой активации этих процессов может требоваться как кратковременное, так и непрерывное(длительное) воздействие ГК на всех стадиях образования, созревания и секреции молекулы альфа-амилазы.

Для выяснения этого вопроса, нами были проведены эксперименты по изучению необходимости присутствия гибберелловой кислоты а течение всего периода образования и активации изоферментов альфа-амилазы и при кратковременном, "запускающем" воздействии фи-тогормона. Оказалось, что инкубация изолированных алейроновых слоев с ГК (1 мкМ, в отсутствии ионов Са2*) в течение 24 часов приводило к существенному увеличению активности тканевой альфа-амилазы(рис.3). Такое продолжительное (24 часа) действие ГК на алейроновую ткань сопровождалось появлением на электрофореграмме трех отчетливых зон с активностью.альфа-амнлаэы.

1*' I*— < «а а« «и*

Рис.з. Активность (А) и иэофернентцый спектр(В), лльфа-амилазы в зависимости от продолжительности присутствия ГК (1мкМ,без ионов Саг+) в инкубационной среде. ,

При инкубации алейроновых слоев совместно с фитогормонон в течение только двух часов и последующей 22-х часовой инкубации ткани без ГК существенных различий по сравнению с продолжительным воздействием ГК обнаружено не было. Как видно из данных представ-* ленных на рис.ЗА присутствие ГК в течение двух часов с последующей 22-х часовой инкубацией ткани без ГК также приводило к увеличению активности фермента в ткани и не влияло на изменении изоферментного спектра клеточных альфа-амилаз по сравнению с эффектом продолжительного воздействия ГК (рис.ЗВ). Эти данные указывают на то, что для реализации полного эффекта ГК на активность и на изофернентный спектр амилазы достаточно только кратковременное присутствие ГК в инкубационной среде. Иными словами,ГК проявляла в этом случае свойства гормонального "триггера", который, как правило, вовлекает в свое действие внутриклеточные мессенджерные системы .

Известно,что основными этапами биохимических механизмов стимулирующего действия гибберелловой кислоты на секреторные про цессы клеток алейрона являются взаимодействие этого фитогормона с ионами кальция и их совместное азаинодейстьие при влиянии на образование и секрецию альфа-амилазы(Мо1I,Зопеы,1УВ2; Эопьц ее а1. ,1983 ;МНв1и е! а!., 1984 ). В иаших экспериментах оказалось,

о +

что увеличение концентрации Са до 20мМ,приводит к незначитель ному увеличению активности секретированной в среду инкубации альфа-амилазы(рис.4).В то же время при одновременном присутствии

Рис. 4 .Влияние ионов Сг>-г+ на активность секретированной альфа-амилазы из алейрона зерна пшеницы в отсутствии (1) и в присутствии(2) ГК(1 мкм). Данные представлены с вычетом вязального* уровня секреции | фермента.Каждая точка отражает* результат 6-7 опытов.

юо-

юо

Ж

Г*

^^^— а

--1'

ы

в среде ГК в дозе 1 мкМ и повышающихся концентраций ионоп Саг* (от 1 до 20 мМ) происходило существенное увеличение активности секретированной альфа-амилазы по сравнению и с контролем (без ГК

и ионов СаЕ+) и с. влиянием одной ГК в бескальциевой среде (рис.4).

о х

Эти данные указывают на то,что ионы Са могут проявлять активирующий эффект на стимуляцию секреции, альфа-амилаэы только совместно с ГК, не оказывая существенного влияния на секрецию этого гидролитического фермента самостоятельно. Можно думать, что ионы Са^ необходимы для реализации отдельных этапов меха-тома стимулирующрго действия ГК, таких как биосинтез и секре-нил, ипи только секреция предобразованной альфа-амилазы. В Наших :чьспрримрнтах внесение в среду инкубации ионов Са2* в дозе ЮмМ к-? влияло ни включение (35Я]-мегионина в кислотонерастворимые 5епнч по сравнению с кснтролем(рис.5).Тогда как добавление ГК в брскяльциевую среду достоверно увеличивало включение метки приблизительно но 30% .

Ю-5» имп/мин

Гис.5.Влияние ионов кальция на включение [353]-метиЪнина в кислотонерастворимые белки ткани алейронового слоя.1~ контроль, 2 -ГК(1мкМ),3 - Сае*(10мМ),4 - ГК+Са2* .В скобках указаны количество опытов. * -Р < 0,05 по сравнению с контролен.

Совместное внесение ГК(1мкМ) и-Са2* (ЮмМ) в инкубационную среду не приводило к дальнейшему увеличению включения метки по сравнению с действием одного гсрмона Ь бескальциевой среде (рис.5). Из этих данных можно сделать вывод о том,что ионы, Са2*. очевидно участвуют в активирующем эффекте ГК только на секрецию, но не на клеточный протеосинтеэ альфа-амилазы.

Анализ активности и изоферментного спектра секретироввнкой

альфа-амилазы выявил,что активность фермента в контроле (без ГК Н ионов кальция) и в присутствии в среде инкубации ЮмМ Саг* не отличалась друг от друга (рис. ~ ба).В этих случаях гистохимическая окраска не выявила зон активности фермента на электрофорег-рамме (рис. бб: 1 и 2). Внесение в среду инкубации ГК в дозе 1икН увеличивало секретированнуо ферментативную активность на б5*(рис.ба-3). Это действие ГК сопровождалось появлением трех отчетливо регистрируемых и одной следовой зон на электрофорег-рамме с активностью альфа-амилазы (группа изоферментов А) (рис. 66 - 3). Совместное добавление к изолированным алейроновым слоям ГК (1ккК> и Саг* (ЮмМ) приводило к резкому повышению общей аль-фа-амилазной активности в среде инкубации (рис. ба-4).

Следует отмстить,что эффект совместного действия ГК и Сл2* ид активность секретированного фермента значительно превышал 'заштрихованная область столбика) теоретическую сумму эффектов зтих агентов взятых в отдельности. Такой взаимопотенцнирующий эффект сопровождался изменением в изоферментном спектре секрети-рованной альфа-амилазы: к изоферментам группы А добавлялось еще более электроотрицательных элеятрофоретических зон альфа-амилазы (группа Б) (рис.664).

г» м* м» • 00

Рис.6.Изменение ферментативной активности (А) и изоферментного спектра(В) альфа-анилазы секритированной из алейронового слоя зерна пшеницы.1- контроль,2- Са2+(ЮмМ),3- ГК(1мкМ),4-ГК + Са2* Заштрихованная часть столбика -'превышение над теоретической

суммой ( синергетический эффект ) А и Б группы изоферментов альфа-амилазы. В скобках указано число опытов. * - р< 0.05 по сравнению с контролем.

Эти данные позволяют заключить, что если активирующее действие ГК на секретированный фермент обеспечивается четырьмя изоформами альфа-амилазы,то при совместном действии ГК с ионами Саг+ , происходит дополнительная секреция новых изоформ (группа Б), обеспечивающих дальнейшее увеличение ферментативной активности.

Ранее было высказано предположение о том , что взаимопотенцирование конечного клеточного эффекта может происходить между гормональными агентами, оперирующими разными внутриклеточными механизмами действия, с вовлечением разных мессенджерных систем, что, возможно, отражает физиологически целесообразную модуляцию клеточного ответа (Берсимбаев и др.1990,1991). В представленной работе, показана еще одна разновидность синергетического эффекта регуляторных агентов в клеточном ответе, которая может обеспечиваться на уровне образования дополнительных изоформ фермента.

Взаимопотенциирование клеточного ответа при совместном дейс-? +

твии ГК и ионов Са , очевидно указывает на тесную взаимосвязь и взаимозависимость этих агентов и может также указывать на наличие их относительно самостоятельных и/или тесно взаимосвязанных альтернативных путей регуляции функциональной активности в гиббереллин-чувствительных, амилазосекретирующих клетках алейронового слоя зерна пшеницы.

Одним из возможных подходов в изучении роли и участия ионов Са2* в механизме действия ГК могло бы явиться исследование взаимосвязи этого фитогормона с Саг* , фосфолипидзавнсимой ПК С. Известно, что ПК С,участвует в гормоизависимой стимуляции процессов синтеза и секреции белков-ферментов в клетках животных (ШвМгика е1 а1.,198б). Является ли активация протеинкиназы С необходимым условием и в ходе реализации эффекта ГК на аль-фа-амилазную активность и на образование иэоферментов альфа-амилазы в алейроновом слое зерна пшеницы ?

В наших экспериментах внесение в инкубационную среду стаурос-порина - специфического блокатора ПК С значительно тормозило ГК стимулированную активность альфа-амилазы в гомогенате ткани алейронового слоя зерна пшеницы., Стауроспорин не влиял на 6а~ зальный уровень активности .клеточной альфа-амилазы (таблица 4).

Таблица 4.

Влияние стауроспорина на активность альфа-амилазы в ткани алейронового слоя зерна пшеницы.

( — ■ | Добавляемые г Кол-во 1 1 Активность альфа-амилазы |

1 вещества опытов| <*) 1

| Контроль 5 1 100 ± 10,6 I

| ГК (1мкМ) 5 1 185 i 7,5* |

I стауроспорин(ЮОнМ) 4 1 ' 100 i 6,0 |

1 стауроспорин+ГК 4 1 125 ± 4,7 1

1 1 I

Стауроспорин добавляли в инкубационную среду,за час до внесения ГК. * - р <0.05 по сравнение с контролен.

Полученные результаты указывают на важную роль ПК С в стимулирующем действии ГК на активность альфа-амилазы в ткани алейронового слоя. Можно было предпологать, что ингибирование стаурос-порином стимулирующего эффекта ГК на активность клеточной альфа-амилазы ноже? проявляться и на уровне гормоистимулированного образования иэоферментов . Гистохимическое выявление зон активности клеточной аяьфа-амилазы на электрофореграмме показало, что если инкубация алейронового слоя с ГК в дозе 1мкМ приводит к появлению иэоферментов группы А, то предварительное (за 1 час'до ГК) внесение в инкубационную среду стауроспорина блокировало ГК зависимой образование иэоферментов.группы А (рис.?- в) до уровня контроля. Внесение в сроду-инкубации только ионов калЬция (ЮкМ) не приводило к выявлению зон альфа-амилазной активности, тогда как совместное внесение в инкубационную среду ионов Са2* и ГК сопровождалось появлением изофернентоь альфа-амилазы группы А и группы Б (рис.7- г.). Предварительное внесение стауроспорина 100 нМ (за 1 час до добавления ГК) в инкубационную среду, содержащую ионы^хальция и ГК, полностью блокировало появление зон активности иэоферментов .группы А и не влияло на'появление иэоферментов группы Б (рис. 7 -д).

Рис.7.Влиянич craypotЗорина на ГК стимулированное образование иэофсрчвнточ альфа - амилазы И клетках алейронового слоя зерн пшеницы.а -Саг ' (ЮмИ) ,б гК(1мкМ в - стауроспорин(ЮонМ)>ГК(1мкМ> г-ГК + Сз?* .д-ста)4юспорин+ГК+Са

«о • Г д

А

Б

Таким образом, на основании этих данных и результатов опытов по влиянию стауроспорина на ГК-стимулированную активность клеточных альфа-амилаз(табл.4) можно заключить,что ПК С опосредует стимулирующее действие гибберелловой кислоты на активацию и образование изофернентов альфа-амилазы А группы и не участвует в активирующем действии фитогормона на секрецию из клеток изофер-ментов группы Б.

Наличие элементов фосфоиноэитидной системы проведения гормонального сигнала,включая и ПК С, показано в клетках растений, в том числе и у nmeimubi(OIah,Kiss,1986).Установлено также ГК зависимое изменение внутриклеточного распределения этого фермента в гтаремхимных клетках картофеля(Ладыженская и др.1987). Для более детального анализа участия ПКС в ГК- индуцированном биосинтезе белков (включая и альфа-амилазу) в последующем нами был использован специфический активатор этого фермента - 12-о-тетрадекано-илфорбол-13-ацетат (ТФА), который в отличие от другЯх внутриклеточных агентов (ионы Слг* , фосфолипиды, диацилглицерол) необратимо активирует ПК С. Как видно из результатов приведенных в табл. внесение в среду инкубации ТФА в дозе 0,01мкМ сущест-

венно усиливало процесс протеосинтеза в ткани алейронового слоя. Добавление в среду инкубации ионов Саг* не влияло на ТФА-стиму-лированный синтез клеточных белков. В то же время, совместное внесение в среду инкубации и ТФА и ГК достоверно стимулировало протеосинтез в клетках алейронового слоя по сравнению и с .контролем и с действием только ГК. Добавление к инкубируемым тканям ионов Саг+ не усиливал эффект ГК на биосинтез клеточных белков (табл. 5).

Таблица 5.

Влияния ТФА на ГК стимулированное включение [заБ]-метионина » кислотоиерастворимую белковую фракцию изолированного алейронового слоя зерна пшеницы.

Т-г

Кол-во опытов

~г

Условия эксперимента

Контроль ГК (1 мкМ) Саг* (10 ММ) ГК + Саг* ТФА (0,01 мкМ) ТФА+ Са2* ГК + ТФА ГК +ТФА+Са2 *

Включение

35

Б-метионина

имп/мин х 10 на 1мг белка

39.5 ± 3,7 50,9 ± 2,0*

41.4 ±. 3,6 53,2 * 1,8' 57,2 ± 3,0*

57.6 х 1,9* 67,0 X 2,6**

68.5 * 4,0**

(X)

100,0 130,0* 104,0 134,0* 148,0* 14 8,7* 170.0" 173 ,4'*

[352]-метионин (20мкКи) добавляли в инкубационную среду после инкубирования изолированного алейронового слоя в течение 3.0 часов в натрий-ацетатном буфере (рН 5,0) содержащей 2ймкг/мл хло~ рамфеникола.Включение метки в кислотоиерастворимую белкоьуо фракцию определяли в гомогенате после 24 часов инкубации. *-Р<0,05 по сравнению с контролем,** -Р<0,05 по сравнений! г действием ГК в бескальциевой среде.

Эти данные позволяют предположить,что в стимулирующем действии ГК на биосинтез альфа-амилазы может принимать участие Са'* ,<$юс~ фолипид зависимая протеинкинаэа С. Это, в частности, подтверждается как ГК-подобной стимуляцией протеосинтеэа под действия ТФА,так и аддитивностью эффектов совместного действия ГК и ТФА Экзогенно добавленные в среду инкубации ионы саг*, невидимому нг участвуют в ГК-аКтивиронанном белковом синтезе альфа-амила^ссек-ретирующих клеток алейронового слоя. Однако, вместе с тем, с ;•.-«ует подчеркнуть,что экзогенные ионы играют большую роль в

секреции предобразованны* иэоформ альфа-амилазы (включая и изо-формы группы Б, см.рис.

Совокупность полеченных экспериментальных результатов позьо-

ляет предложить следующую схену регуляции синтеза и секреции изофериентов альфа-анилазы в клетках алейронового слоя зериа пшеницы под действием гибберелловой кислоты (сн рис.8).

Ж Ш

1Са2+1

[протеосинтеэ!-

ооразование изофермвнтов а-амилазы группы А

стауроспорин

реактивирование ранее синтезированных изофоры а-амилазы гр.Б

►[экструзия)

КО

Рис.7. Биохимический механизм регуляции гибберелловой кислотой синтеза и секреции альфа-амилаэы в клетках алейронового слоя зерна пшеницы.ГК-гибберелловая кислота,ЦГ-циклогексикид,ТФА-12 -О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат,Э -стауроспорин,© - усиливающий эффект,- еингибирующий эффект,ПК-плазматическая мембрана. (Саг*]ех- экзогенно добавленные ионы кальция.

Согласно этой схеме действие гибберелловой кислоты направлено на стимулирование процессов синтеза клеточных белков .что обеспечивает как новообразование изофериентов , так И выделение иредоб-разованных, запасенных ранее изофори альфа-амилазы в крахмальный эндосперм. Вместе с тем представляется вероятным, что внутриклеточные механизмы реализующие эффекты гибберелловой кислоты в отдельности на синтез и на реактивирование ранее синтезированных ферментов и на их последующее выделение различаются. После рецепции гибберелловой кислоты на мембранах или в цитоплазме клеток-мишеней действие этого фитогоркона направлено на стимуляцию синтеза клеточных белков, включая и изофериентов альфа-амилазы,а именно группы А. Это действие гибберелловой кислоты может опосредоваться усилением обмена фосфолипидов и зависиной от этого активации Саг*,фосфолипид зависимой протеинкиназы С. С другой стороны, эффект гибберелловой кислоты на реактивацию ранее синтезированных, запасенных изофорк альфа-амилазы (группа изофериентов Б) и на последующее выделение (экструзию) секреторных

продуктов опосредуется изменением содержания внутриклеточных ио-р +

нов Са

ВЫВОДЫ

1. Установлены дозоэависимые различия в активации клеточной и секретированной альфа-амилазы алейронового слоя зерна пшеницы под действием гибберелловой кислоты.Показано,что для стимуляции активности клеточной альфа-амилазы достаточно присутствия в среде инкубации ГК в дозе .0,01 мкМ ,в то время как достоверная стимуляция активности секретированного фермента происходить при более высокой(в 100 раз) концентрации ГК .

2. В экспериментах с использованием циклогексимида и по включению [35Э]-метионина в кислотонерастворимые клеточные белки с последующей авторадиографией электрофореграмм показано,что процесс белкового синтеза, вовлекаемый в амилазоактивирующее действие ГК, необходим для новообразования собственной молекулы альфа-амилазы.

3. Биохимическими и авторадиографическими методами показано, что экэогенно добавленные ионы Саг+ не участвуют в ГК-стимулирован-ном синтезе клеточных белков.Ионы кальция являются посредниками в действии ГК только иа активацию и секрецию предобразованных , запасенных ранее изоформ альфа-амилазы.

4. Установлен взаимопотенцирующий (синергетический) эффект между ионами кальция и гибберелловой кислотой на уровне активации и секреции иэоферментов альфа-амилазы из изолированного алейронового слоя зерна пшеницы. Показано, что секреция изоферментов альфа-амилазы группы А происходит при внесении в инкубационную среду ГК, тогда как для секреции изоферментов группы Б требуется одновременное присутствие и ГК и ионов кальция.

5. Установлено, что для реализации стимулирующего эффекта ГК на активность и на образование изоформ альфа-амилазы в клетках алейронового слоя пшеницы достаточно кратковременное("запускающее") воздействие фитогорнона на клетки-мишени. Высказано предположение о "триггерной" роли гибберелловой кислоты в стимуляции амилазопродуцирующей активности клеток алейронового слоя зерна пшеницы.

6.Установлено участие 'Са2*,фосфолипид зависимой протеинкиназы С в ГК-активированном клеточном протеосинтезе ткани алейронового слоя. Показано, что ПК С участвует в ГК стимулированном синтезе

i-олько компонентов нчофори альфа-амилазы группы А. 7. Из основании полученных результатов предложена схема биохимических механизмов регуляции альфа - амилаэопродуцирующей функции клеток алейронового слоя зерна пшеницы. Высказано предположение о необходимости образования различных форм альфа-амилазы на разных стадиях развития зерна. ■

(^руководителем работы на всех стадиях ее выполнения является доцент,кандидат биологических наук Таиров H.H.

Результаты исследований опубликованы в следующих сообщениях:

1. Г.нсенбаев А.К.,Таиров М.М.,Берсимбаев Р.И. Участие синтеза белка и ионов кальция в механизме стимулирующего действия гибберелловой кислоты на секрецию альфа-анилазы из изолированного алейронового слоя зерна пшеницы.//Биохимия.-1992.т.57,вып.12, с.1634-1840.

2.Бисенбаев Е.К.,Таиров М.М.,Берсимбаев Р.И.Участие Саг*,фосфо-липид зависимой протеинкиназы С в механизме действия гибберелло-вой кислоты на синтез и секрецию альфа-амилазы в клетках алейронового слоя зерна пшеницы.// Вестник КазГУ,-1994,т.1.с.9-1Э.

3.Бисенбаев А.К.,Таиров М.М.,Берсимбаев Р.И.Внутриклеточные механизмы стимулирующего действия гибберелловой кислоты на синтез м секрецию альфа-амилазы в алейроновом слое зерна пшеницы.//

III Всероссиский сьезд физиологов и биохимиков растений , тез. ДОКЛ. - С-т Петербург-1993,ВЫП.8,с.850.

4.Берсимбаев Р.И., Таиров М.М.,Котлярский Д.М.,Бнсенбаев А.К., Сарбасов Д.Д. Молекулярные неханиэмы гормональной регуляции функционирования секреторных клеток .//Конференция биохимиков республик Средней Азии и Казахстана,тезисы докладов, ноябрь 12-16,1991 г. Ташкент,тезисы докладов.стр.26.

б.Бисенбаев А.К.,Таиров М.М.,Берсимбаев Р.И. Внутриклеточные механизм действия гибберелловой кислоты на секрецию альфа-амилазы из изолированного алейронового слоя зерна пшеницы. //Известия HAH PK (серия биологическая)- 1994,вып.4.о.32-38.

Е;иог,пбаев Амангелд1 Куьнбай ¥лы "Бидай дет алейрон кабатындаги альфа-амшшз&цид синтез 1 м»н оекрециясына гиббереллин кышкылы ecapiaiH, оиохммиллык мвха)ш:,ы1"

Б уд жумыс бидай алейрон клеткаларыннд njib.!« j - мшшаз а онд|ру Кызимвт1н1ц гиббереллин кушкулымен(FK) рвттелуI.еоишьа катар альфа-амилаза синтез1 ,секрецинси кьнв изооньимднс опыирпь ГК-нын, есвр в ту механизм1ндег1 кальций ионы м^н Са^+,фосфолш1ВДК» баганшты С протвшмшазанич мацы;««! -чиртгоуга арналган .Авторадиографиялщ кене биохиминлик ндЬзтнрд! поддана отырып Са2+ иондарынын, ГК, жандандырган альфа-амилала синтосПни катнсиай .аталмнш фитогормонныц (фермент еькрецилениа ьсер1ндог1 данеквр! оквн! аныкталдн.Алгашки рот Са':' иондарьшцц ГК. - ниц альфа-амилаза свкрвциясына синергетика лык ecupi кврсь'Илгнн. Ca2f .фосфолинидкв багынншты С иротеишшшзашщ актива гори мои ингибиторын колдана отырып .оси ферментн, альфа-амилаза изоформаларыныц синтез!ндег! тщзрц рсл! анш<.талган.

Bieenbaev Araangeldy Kuanbanvioh " Bioohemioal meohaniema of stimulating aotiun of gibbu! el lio aold on alpha-amylaee eyntheele arid Beoretjon from aliHii^n».» layers of ivheat seeds".

The present work ie devoted to tlta ¿¡tuny of bloohtnnioal moohunitjme of regulation of alpha-aiiiyl ast» bioaynthesi в by gibberellio aoid(GA) .Possible. patioipation ot Ca''1 lonee and

о»

Ga .phospholipid dependent protein kinase О (PK G) in the meohanieme of aotion of GA on the formation arid eeoretion of various alpha-amylaao isoenzymes from the alaurone layer was investigated. Autoradiogi-aphio study ot [ S l~mathionin« incorporation into aoid insoluble protein« of aleuron« jells revealed that GA activates biosynthesis of alpha-amylase ,1't lias been shown siriergetieal effects of 0a^f lonee on stimulatory effect of GA on secretion alpha-amylase Ыгл-глу'^^-Еу using the aotivator and inhibitor of PK С oonepiououe vole of this kinase in the mechanisms of action of GA on the formation alpha-amylase isoenzymes shown.