Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение свойств и стабильности α-амилазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мещеряков, Никита Викторович, Санкт-Петербург

Министерство Здравоохранения Российской Федерации Санкт-Петербургская Химико-Фармацевтическая Академия

На правах рукопт

Мещеряков Никита Викторович

Выделение и изучение синтеза и стабильности а-амилазы из культуры ткани ЯаихуоШа Бегрепйпа ВепШ.

Специальность 03.00.04 - Биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

На соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор В.П.Комов

Санкт-Петербург 1999

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................10

1.1 Практическая значимость а-амилазы.....................................................10

1.2 Использование культивируемых тканей в биохимии и биотехнологии................................................................................................12

1.3 Структура а-амилаз.....................................................................................15

1.4 Физико-химические свойства а-амилаз и специфичность их

действия..........................................................................................................21

... ,

1.5 Механизм действия фермента...................................................23

1.6 Молекулярная гетерогенность а-амилазы..............................................26

1.7 Методы выделения и очистки а-амилазы...............................................27

1.7.1 Осаждение органическими растворителями и высаливание нейтральными солями..........................................................................27

1.7.2 Ионообменная хроматография............................................................29

1.7.3 Аффинная хроматография...................................................................30

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................36

2.1 Объекты исследования и методы культивирования............................36

2.2 Методы получения цитозольной фракции..............................................38

2.3 Методы определения активности а-амилазы.........................................39

2.4 Подбор оптимальных условий ферментативной реакции а-амилазы. ...........................................................................................................................43

2.5 Определение концентрации белка............................................................44

2.6 Выделение и очистка....................................................................................46

2.6.1 Фракционное осаждение растворами солей.......................................46

2.6.2 Гель - хроматография...........................................................................46

2.6.3 Аффинная хроматография...................................................................47

2.7 Электрофоретические методы анализа фермента.................................48

2.7.1 Электрофорез в пластинах полиакриламидного геля.......................48

2.7.2 Окраска полиакриламидных гелей для выявления белковых полос. .................................................................................................................50

2.7.3 Окраска геля для выявления амилолитической активности............51

2.7.4 Электрофорез с добавлением 8Б8......................................................52

2.8 Иммунологические методы.........................................................................52

2.8.1 Получение антисыворотки к а-амилазе............................................52

2.8.2 Радиальная иммунодиффузия в агаровом геле..................................53

2.8.3 Радиоизотопный метод определения обмена а-амилазы и общего белка.......................................................................................................53

2.9 Статистическая обработка результатов..................................................53

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................................55

3.1 Динамика уровня активности а-амилазы, содержания белка и

накопления биомассы культурой ткани И.вегреп^па...........................55

3.1.1 Параметры контрольной культуры, выращенной на стандартной

питательной среде.................................................................................55

3.1.2 Параметры культуры, выращенной на питательной среде с крахмалом..............................................................................................57

3.1.3 Исследование влияния гибберелловой кислоты на синтез и секрецию а-амилазы культурой ткани раувольфии змеиной..........62

3.2 Определение изоферментного спектра а-амилазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina на разные сроки культивирования.....................65

3.3 Выделение а-амилазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina........68

3.3.1 Выделение а-амилазы методом гель-хроматографии.....................68

3.3.2 Получение высокоочищенной а-амилазы методом аффинной хроматографии......................................................................................71

3.4 Влияние диметилсульфоксида на активность а-амилазы...................73

3.5 Влияние ингибиторов на активность а-амилазы раувольфии змеиной............................................................................................................74

3.6 Изучение физико-химических свойств а-амилазы................................75

3.6.1 Влияние температуры и рН среды на активность фермента............75

3.6.2 Кинетические параметры а-амилазы из культуры ткани раувольфии змеиной..................................................................................................75

3.6.3 Определение молекулярной массы изоферментов а-амилазы........75

3.7 Изучение кругооборота а-амилазы и общего белка в культивируемых клетках раувольфии змеиной.....................................................................75

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................78

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

93

Список сокращений

1. ААЭ - ацетилаймалинэстераза,

2. Дак -декстриногенная амилолитическая активность,

3. Е - концентрация фермента,

4. Ка - константа скорости деградации фермента,

5. к8 - константа скорости синтеза фермента,

6. Т1/2 - время полужизни фермента,

7. ПААГ - полиакриламидный гель,

8. ТРИС - трис-(оксиметил)-аминометан,

9. - додецилсульфат натрия,

10.ПХМБ - парахлормеркурийбензоат,

11 .МР8 - метилфенилсульфофлуорид.

Введение.

Актуальность темы. Амилолитические ферменты были известны человеку уже в бронзовом веке . Первые упоминания о продуктах, полученных путем сбраживания крахмалсодержащего сырья, относятся к VI - VII векам до н.э. В настоящее время амилазы и родственные им ферменты широко используются в промышленности, медицине и биотехнологии.

Несмотря на тот факт, что именно растительные амилазы положили начало науке о ферментах, в последнее время амилолитическим ферментам растений уделяется значительно меньше внимания, чем грибным или бактериальным. Гидролазы культур растительных клеток вообще изучены недостаточно и в современной литературе имеются лишь единичные сведения о структурно - функциональных особенностях а-амилаз каллусных тканей.

Получение растительных гидролаз перспективно, прежде всего, для пищевой и медицинской промышленности. К сожалению, содержание амилаз в тканях взрослого растения невелико, а использование солода требует жесткого контроля зерна, как по микробиологическим показателям зараженности, так и по физико-химическим свойствам ферментативного комплекса. Одним из решений данной проблемы является использование высокопродуктивных культур клеток растений. Методами генной инженерии и целенаправленной селекции можно получать линии растительных клеток -суперпродуцентов, как по первичным метаболитам, например ферментам, так и по вторичным, таким как углеводы или алкалоиды.

Получение а-амилазы из раувольфии змеиной интересно еще и тем, что данная культура является продуцентом спектра алкалоидов, обладающих антиаритмическим действием. Таким образом, разработка оптимальных схем разделения и очистки ферментов и низкомолекулярных БАВ может

значительно повысить экономическую эффективность промышленного культивирования каллусных клеток этого растения.

Таким образом, изучение обмена амилолитических ферментов в культурах растительных клеток не только пополнит скудную копилку знаний в данной области, но и сыграет немаловажную роль в промышленном использовании растительных гидролаз.

Задачи исследования.

1. Изучение динамики активности а-амилазы в культуре ткани R.serpentina, динамики накопления белка, биомассы ткани, обводненности клеток.

2. Разработка методов выделения и очистки а-амилазы из культуры ткани R.serpentina.

3. Изучение физико-химических и кинетических свойств фермента, разработка и оптимизация метода определения амилолитической активности применительно к культурам ткани.

4. Изучение изоферментного спектра а-амилазы из культуры ткани R.serpentina.

5. Изучение обмена а-амилазы в культуре ткани R.serpentina.

Научная новизна. Амилазы являются одними из ключевых ферментов метаболизма, как растений, так и клеточных культур растительного происхождения. Таким образом, фундаментальные исследования в этой области представляют несомненный научный интерес. Кроме того, незначительное количество литературных данных по изучению гидролаз именно растительных клеточных культур заставляет обратить пристальное внимание на обмен амилазы в дедифференцированных клетках растений.

В настоящей работе представлены данные по кругообороту а-амилазы в штамме К-27 каллусной культуры ткани R.serpentina, определены

константы синтеза и деградации, время полужизни и концентрация фермента в пассируемой культуре.

Кроме того, проведен ряд работ, направленных на увеличение синтеза а-амилазы культурой клеток Я.зегрепйпа путем субстратной индукции. Отмечена интересная особенность культуры к секреции в окружающую среду белка, обладающего декстриногенной активностью, предприняты попытки увеличения количества секретируемого белка.

Модифицирован и оптимизирован к особенностям а-амилазы из клеточных культур метод определения декстриногенной активности ферментов (метод Каравея).

Разработан ряд методов высокой очистки а-амилазы растительного происхождения, в том числе и с помощью колоночной хроматографии на аффинном сорбенте.

Теоретическая и практическая значимость. Наряду с теоретическим, диссертация имеет также и практическое значение. Первое связанно, прежде всего, с исследованиями метаболизма а-амилазы в штамме К-27 культуры ткани Я-Бегрепипа в плане изучения биохимии и молекулярной биологии клетки. Впервые было проведено исследование обмена а-амилазы в пассируемой культуре раувольфии, результаты которого углубляют наши знания об обмене индивидуальных белков в культурах растительных тканей. Результаты исследования физико-химических и кинетических свойств а-амилазы - одного из ключевых ферментов метаболизма растений, -дополняют наши представления о путях деградации крахмалоподобных полисахаридов в организмах растительного происхождения, а изолирование и изучение свойств гидролаз может стать необходимой предпосылкой для осуществления внеклеточных реакций по биотрансформации ряда биологически-активных веществ различного происхождения.

Практическая значимость работы заключена, прежде всего, в тех перспективах, которые открывает промышленное использование

■'> .' - .'>>.--л , ,

культивируемых растительных клеток - продуцентов гидролаз. Исследование способов увеличения синтеза амилаз растительными клетками способно свести на нет одно из главных преимуществ грибов и бактерий - более высокую амилолитическую активность в клетке, а разработка методов увеличения секреторной способности растительной клетки нанесет удар и по второму преимуществу суспензионных культур микроорганизмов. Кроме того, высокие органолептические показатели даже плохо очищенных препаратов амилаз растительного происхождения позволяют использовать их в производственном цикле, например пищевой промышленности, тогда как амилазы микробного и бактериального происхождения нуждаются в тщательной, и, зачастую, дорогостоящей очистке.

Установлено, что растительная а-амилаза является менее иммунотоксичной для человека, чем амилаза микробного происхождения, а методы выделения растительных амилаз из клеточных культур обходятся дешевле, чем получение высококачественной а-амилазы из тканей животного происхождения. Это является мощным стимулом для внедрения в медицину препаратов растительных амилаз, как для внутривенного введения, так и для создания мультиферментных препаратов для перорального использования.

Предложенные в данной работе методы выделения и очистки ос-амилазы позволяют существенно уменьшить число операций, требующих применения вредных органических растворителей, а так же повысить выход конечного продукта.

1. Обзор литературы.

1.1 Практическая значимость а-амилазы.

Человечество с давних пор использовало амилазы при получении пищевых продуктов. Амилазы проросших зерен злаков (пшеницы, ржи, ячменя, овса, сорго и др.) были активным началом при изготовлении солода, о производстве которого имеются сведения за 7000 лет до н.э. Амилазы ячменного солода играли основную роль в пивоварении за 5000 лет до н.э. К древнейшим отраслям промышленности, в которых использовался гидролиз крахмала амилазами, относят хлебопечение, виноделие, производство спирта и др. Специфика климата и демографии стран Востока (Китай, Япония, Корея) определила направление развития таких традиционных технологий, как виноделие и переработка зернопродуктов, в сторону использования грибных и микробных амилаз, в отличие от Европы и Америки, где в качестве источника амилаз преимущественно применяли солод или проросшее зерно злаков. [35, 40]

Амилазы вошли в историю энзимологии, как первые научно описанные ферменты.

30 ноября 1814 года академик К.С.Кирхгофф на заседании Петербургской Академии наук сделал доклад "О получении сахара при осолаживании злаков и при обваривании муки кипятком", в котором изложил некоторые идеи по получению сахара из крахмала. В то время этот вопрос имел большое значение для России в связи с поисками замены импортируемому сахарному тростнику. Изучая различные виды крахмалов, Кирхгофф обнаружил, что в пшеничной муке содержится "некое клейковатое вещество" - белковая компонента зерна, нагревание с которым крахмала при 40 - 60°С в течение 10 часов, без минеральной кислоты, приводит к гидролизу крахмала с образованием сахара. В результате

последующих экспериментов было выяснено, что гидролиз крахмала осуществлялся именно белком [43], который был назван диастазой, а затем, амилазой. Таково было открытие первого фермента, положившее начало науке о биологических катализаторах.

Сейчас к амилазам относят несколько ферментов: а-амилазу, (3-амилазу, экзо-1,4-а-глюкозидазу (глюкоамилазу, или у-амилазу), олиго-1,6-глюкозидазу, амило-1,6-глюкозидазу, пуллуланазу, изоамилазу [32, 67, 69]. Установлено, что они гидролизуют а-1,4- и(или) а-1,6-глюкозидные связи в крахмале, гликогене и родственных им олиго- и полисахаридах. По номенклатуре ферментов они относятся классу гидролаз, подклассу гликозидаз. Растительные ткани, как правило, содержат только а- Р- и у-амилазу. В настоящей работе внимание будет уделено только первой из них.

По интенсивности использования в различных отраслях промышленности амилазы занимают первое место среди других ферментов, ибо во многих производственных процессах при обработке различных видов сырья возникает необходимость в более или менее глубоком расщеплении крахмала.

Несмотря на то, что в последние годы наиболее широко используются амилазы бактериального и грибного происхождения, растительные амилазы прочно занимают свою нишу, прежде всего в пищевой промышленности, корнями своими уходящую в прошлое, и опирающуюся на традиции. Кроме того, растительные амилазы более безопасны для человека, в отличие от ферментного комплекса микроорганизмов, требующего тщательной очистки от токсичных продуктов метаболизма, что позволяет широко использовать растительные амилазы в медицине.

Помимо хлебопечения, спиртовой и пивоваренной промышленности амилазы применяют в кондитерской и крахмалопаточной промышленности (выработка паток, сиропов, глюкозы), при производстве крупяных изделий, овощепродуктов, изделий из фруктов (соков, варений, экстрактов, пектина),

детской пищи, а так же в текстильной (крашение, расшлихтовка волокна), бумажной промышленности, и при производстве моющих средств [6, 35, 42].

1.2 Использование культивируемых тканей в биохимии и

биотехнологии.

В последние годы все большее значение стало приобретать развитие новых биохимических методов в исследовании молекулярных механизмов жизнедеятельности различных организмов, протекании биохимических процессов на клеточном уровне. Большие перспективы в изучении широкого круга проблем открывает метод культуры in vitro изолированных органов, тканей и клеток высших растений.

Зарождение метода культивирования растительных тканей и клеток относится к середине XIX века, когда Шлейден [119] и Шванн [120] независимо друг от друга создали основу клеточной теории и постулировали тот факт, что клетка способна к автономии, что она тотипотентна. Но после этого прошло почти 130 лет, прежде чем была продемонстрирована способность соматических клеток трансформироваться в целостные организмы. Первые попытки получить каллус на основе эксплантов из растительного материала были предприняты в 1893 году Рехингером [113]. Однако принципы клеточной культуры были сформулированы Габерландтом лишь спустя 9 лет. На основе клеточной теории он предположил, что не может быть ограничений в делении клеток in vitro. Им были проделаны успешные эксперименты по поддержанию процесса митоза единичных изолированных клеток. Подобные эксперименты проводились и в по�