Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние температурного стресса на пероксидазу в культуре ткани Rawuolfia serpentina Benth

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние температурного стресса на пероксидазу в культуре ткани Rawuolfia serpentina Benth"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

Мулла Ахмад Исмаил

Влияние температурного стресса на пероксидазу в культуре ткани ИаииоШа «егрепйпа ВепЙь

Специальность 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

? 5 СЕН Ж '

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2000 ,

Работа выполнена на кафедре биологической хилгаи Саша-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Министерства Здравоохранения РФ.

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор Комов В.П..

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Михайлов С.С. Доктор медицинских наук, профессор Шутко А.Н.

Ведущая организация: Ботанический институт Российской академии наук, СПб.

Защита состоится " ОУ дЪ- 2000 года в /часов на заседании Диссертационного Совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке СПХФА по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул проф. Попова 4/6.

Автореферат разослан & ^ 2000 года

Ученый секретарь —

диссертационного Совета ;

кандидат биологических наук Н.В. Кириллова

ЕМ- Ш. Щ о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы: В последние годы внимание исследователей все в большей мере привлекают культивируемые растительные клетки и ткали. Это связано, с одной стороны, с перспективностью их использования в качестве продуцентов ценных биологически активных веществ, а с другой - в качестве модели для изучения молекулярных; механизмов протекания тех или иных процессов в растительных клетках.

Изолированные клетки растений находят все большее применение в качестве модельных систем для изучения не опосредованных другими тканями растения реакций на действие разнообразных внешних факторов. Кроме того, исследование механизмов клеточного метаболизма в дедифференцированых т.е. находящихся в стрессовых условиях клетках создает условия для более эффективного развития биотехнологии клеточных культур.

Растения рода Rauwolfia известны как перспективный источник получения многих алкалоидов, применяемых в медицинской практике. В Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии в результате многолетней селекции культуры ткани Rauwofia serpentina получен высокоэффективный штамм - суперпродуцент антиаритмических алкалоидов. Мы исследовали пероксидазу из культуры клеток Rauwofia serpentina - один из основных ферментов метаболизма кислорода. Этот фермент принимает участие в каталитическом окислении различных субстратов, таких как фенолы, ароматические амины и др. Факт, что пероксидаза присутствует в микробных, растительных и животных клетках дает основание считать его жизненно важным соединением. Что касается растительной пероксидазы, то одной из основных ее функций является защита растения от различных неблагоприятных факторов абиотической и биотической природы. Имеется много работ, посвященных биологической активности этого фермента, однако анализ синтеза и стабильности пероксидазы ранее ни кем не изучался. Можно полагать, что такого рода исследования могут быть весьма актуальными, т.к. они дают весьма важную информацию не только об активности, но и о синтезе и распаде пероксидазы в динамике роста клеток. Задачи исследования: В работе были поставлены следующие задачи: Изучить динамику изменения активности, физико-химические свойства и молекулярную гетерогенность пероксидазы в течение роста каллусной культуры Rauwolfia serpentina.

Выделить и очистить до гомогенного состояния пероксидазу из культуры ткани Rauwolfia serpentina, изучить ее физико-химические свойства и получить к ней моноспецифические антитела.

Оценить скорость синтеза, распада и время функционирования в клетках ткани Rauwolfia serpentina.

Исследовать влияние температурного шока на содержание и свойства пероксидазы, ее молекулярную гетерогенность в культивируемых растительных клетках.

к

Научная новизна. В работе впервые была изучена динамика изменения пероксидазной активности растущей культуры клеток Rauwolfia serpentina. Также впервые были изучены такие параметры, как молекулярная гетерогенность, синтез и стабильность пероксидазы. Разработан способ ее выделения и очистки до гомогенного состояния, изучены физико-химические свойства пероксидазного белка.

В работе изучено влияние низко и высокотемпературного стресса на состояние пероксвдазы и общего белка в каллусной культуре ткани Rauwolfia serpentina. Установлено, что как при низко- так и при высокотемпературном шоке активность пероксидазы повышалась за счет увеличения ее содержания в клетках и изменения активность отдельных изоформ. Показано более выраженное повреждающее действие низкотемпературного шока. Теоретическая и практическая значимость Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные о физико-химических свойствах, скоростях синтеза и распада, времени функционирования и содержания пероксидазы в каллусной культуре ткани Rauwolfia serpentina позволяют расширить наши представления об обмене индивидуальных белков в культуре растительных клеток.

Кроме того, результаты исследования содержат информацию о влиянии экстремальных температур на состояние растительных клеток, а также о протекторном действии пероксидазы, защищающей клетку от повреждения различными токсическими продуктами, возникающими в результате температурного воздействия.

Учитывая тот факт, что работа проводилась с промышленным штаммом Rauwolfia serpentina, знание белкового обмена этого штамма может оказать весьма существенную помощь при дальнейших селекционных работах. Кроме того культура ткани Rauwolfia serpentina может быть использована в качестве источника дяя получения пероксидазы. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на Межд. конф. "Фармация в XXI веке: инновации и традиции", СПб, 1999. Структура и объем диссертации. Работа изложена на страницах

машинописи, содержит таблиц и рисунков . Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в себя наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводили на культуре ткани Rauwolfia serpentina Benth., штамм К-47, стеблевого происхождения, полученной путем многолетней селекции клеток штамма Rauwolfia К-20 на агаризованной питательной среде. Продолжительность одного пассажа составляла 42-45 суток, после чего разрыхлённую ткань массой 5-6 г пересаживали на 100 мл свежей питательной среды. В работе использовали ткань из 3-4 пассажей. Оценку изменения пероксидазной активности и содержания белка проводили в течение 63 дней роста каллусной культуры с интервалом в 7 суток.

Активность пероксидазы определяли спектрофотометрическим методом с использованием в качестве субстратов перекиси водорода и

гваякола в 0,1 М нитратно-фосфатном буфере. Реакцию инициировали добавлением 100 мкл раствора фермента соответствующего разведения и измеряли абсорбцию при 470 нм через 1 мин, используя в качестве контроля раствор, содержащий субстраты реакции. Активность фермента рассчитывали по показателю удельного поглощения продукта реакции тетрагваякола (Е470=26,6 шМ^см"1) (van den Berg, van Huystee, 1984). Оптимальные условия реакции были следующие: Н202 - 3 мкмоль, гваякол -40 мкмоль,pH-оптимум - 6,4.

Концентрацию белка определяли по методу Лоури [135], используя калибровочную кривую, для построения которой готовили серию проб с различной концентрацией стандартного белка - бычьего сывороточного альбумина.

Выделение и очистку пероксидазы проводили следующим образом. Навеску сырой ткани Rauwolfía serpentina в возрасте от 30 до 35 суток гомогенизировали в охлажденной ступке в 0,2 М цитратном буфере (рН=7,4), содержащем 0,1% тритон Х-100 и 0,001 М ß-меркаптоэтанол, в соотношении 1:1. Гомогенат выдерживали 30 минут при температуре 4°С и центрифугировали при 105000 g в течение 45 минут. Из полученного супернатанта выделяли пероксидазу, используя методы фракционного высаливания сульфатом аммония, гельфильтрации на сефадексе G-100 (колонка 30x800 мм), ионообменной хроматографии на диэтиламиноэтщщеллюдозе А-50 (колонка 20x450 мм). На всех этапах выделения и очистки фермента контролировали выход активности пероксидазы и белка. Все операции проводили на холоду при 4°С. В результате пероксидаза была выделена и очищена до гомогенного состояния. Гомогенность полученной пероксидазы оценивали с помощью ступенчатого диск-электрофореза в ПААГ (3%, 10%) по методу Дэвиса (Davis, 1964). Специфическое окрашивание геля на активность пероксидазы осуществляли по методу Лиу (Liu, 1983), с некоторыми модификациями (Гаянова и соавт. 1990). Молекулярную массу выделенной и очищенной пероксидазы определяли методом электрофореза по Лэммли (Laemmly, 1970) в 3%, 10% ПААГ. Антисыворотку к пероксидазс из культуры ткани Rauwolfía serpentina получали, иммунизируя кролика гомогенным препаратом фермента. Специфичность антител оценивали методом иммунодиффузии в 1% агаре Дифко по методу Охтерлони (Ouchterlony, 1949) и диск-электрофорезом преципитатов в денатурирующих условиях (Laemmly, 1970).

При изучении обмена пероксидазы и суммарного белка использовали радиоизотопныи и иммунохимическии методы анализа. С леицин вводили в ткань в асептических условиях стерильной иглой из расчета 150 мкКи на 10 г биомассы. Далее через два часа вносили 10-ти кратное количество немеченого лейцина для предотвращения реутилизации 14С лейцина. При изучении влияния температурного стресса на обмен пероксидазы и общего белка радиоизотоп добавляли в культуру непосредственно после шока и через 24 часа после температурного воздействия. Обмен пероксидазы и общего белка оценивали на 1-7 супси после введения радиоизотопа. Радиоактивность проб измеряли на сцингилляционном счетчике Mark 3.

б

Константы скорости синтеза и распада как пероксидазы так и общего белка определяли по методу Шимке (Schimke et al, 1975). Время «полужизни» - белков по методу Ариас (Arias et al, 1969).

Для изучения влияния экстремальных температур на активность пероксидазы подвергали низко- (7°С , 24 часа) и высокотемпературной (45°С, 3 часа) обработке.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя критерий Стьюденга. Были вычислены средние арифметические значения и стандартная ошибка этих средних. Различия считались достоверными при уровне вероятности Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование активности, концентрации белка в динамике роста и молекулярной гетерогенности пероксидазы

Активность пероксидазы, содержание белка и массу ткани исследовали в течение 63 суток культивирования с интервалом в 7 дней. На рисунках 1 и 2 представлены 1фивые, отражающие процесс накопления биомассы, изменение активности пероксидазы и содержания общего белка

Максимум пероксидазной активности достигается на 35-е сутки роста. После достижения максимума наблюдается спад пероксидазной активности; на 49 сутки рост активности возобновляется. Увеличение активности к концу цикла выращивания, вообще говоря, характерно для многих клеточных культур.

Кривая тотального белка имеет более сложный профиль: на ней имеются два максимума - на 21 и 42 сутки роста. После 49-х суток рост белка снова возобновлялся. Нарастание биомассы происходит равномерно в течение всего исследуемого периода и лишь на 56 сутки начинается уменьшение биомассы, связанное с усилением процессов старения ткани.

Поскольку при культивировании Rauwoffia serpentina пероксидазная активность была обнаружена и в культуралшой среде, мы исследовали уровня пероксидазной активности и общего белка в среде. Как видно из рисунка 2, на начальном этапе культивирования (до 35 суток) активность пероксидазы и тотальный белок в культуральной среде на 1-2 порядка меньше чем активность пероксидазы в ткани. После 35 суток, однако, наблюдается резкий рост пероксидазной активности, которая к концу периода культивирования становится сопоставимой с таковой в ткани

Активность пероксидазы, мккат * 10-2

Концентрация белка, мг/r ткани

Масса ткани, г

7 14 21 28 35 42 49 56 63 Сутки роста

Рисунок 1. Уровень активности пероксидазы и содержание белка в биомассе в ходе культивирования каллусной культуры ткани Rauwolfia serpentina.

• 0,8

0,4

0,2

28 35 42 Сутки роста

49 56

Активность пероксидазы, мккат х 10-4

Концентрация балка, мг/г среды

Масса среды.

Рисунок 2. Уровень активности пероксидазы и содержание белка в культуральной среде в ходе культивирования

каллусной культуры ткани Rauwolfia serpentina,

Изоферментаый спектр пероксидазы изучали методом ступенчатого диск-электрофореза в пластинах полиакриламидного геля (3 и 10% ). В ходе исследования было обнаружено от 4 до 5 изоформ, относительная активность которых изменялась в зависимости от сроков культивирования. При изучении изоферментного спектра пероксидазы каллусных клеток культуры ткани ЯаттоШа зегрелйпа было обнаружено три группы изоформ пероксидазы: медленно-, средне- и быстро мигрирующие по отношению к аноду. Преобладали медленно мигрирующие изоформы. Сдвиг изоферментного спектра пероксидазы в сторону более щелочных множественных молеетляшшх (Ьоом связывают с почти полным отсутствием

ь

в культивируемых клетках растений процессов лигнификации, в которых непосредственно принимают участие кислые изоформы. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Зависимость изоферментного спектра пероксидазы от времени культивирования

Rf / / Сутки Относительная активность изоформ, %

1 14 21 28 35 42 48 60

0,08 55,47 69,55 77,57 67,29 65,94 68,14 55,54 56,14

0,10 37,13 14,40 19,36 22,50 21,98 22,72 37,03 37,42

0,14 5,58 8,71 1,84 8,44 8,24 7,18 5,57 4,69

0,17 - - - - 1,47 - - -

0,26 1,55 4,34 1,23 1,77 2,37 1,96 1,86 1,75

Количество изоформ в культуре ткани Rauwolfia serpentina было в два раза меньше, чем количество изоформ ранее обнаруженное нашими коллегами (Троицкая, 1995) в женьшене, однако активность их была значительны выше.Можно полагать, что молекулярная гетерогенность пероксидазы Rauwolfia serpentina обусловлена наличием изоэнзимов, кодируемых различными генами или различными локусами одного гена.

Выделение и очистка пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina.

Нами был разработан и оптимизирован метод выделения и очистки пероксидазы из каллусной ткани Rauwolfia serpentina. Выделение пероксидазы связано с некоторыми трудностями, обусловленными присутствием в растительной клетке соединений, способных изменять пероксидазную активность, и отделенных от фермента в результате компартментализации. С целью стабилизации пероксидазы, гомогенизацию ткани Rauwolfia serpentina проводили в цитратно-фосфатном буфере с добавлением р-меркаптоэтанола и тритона Х-100. Методика получения гомогенного фермента с выходом 20% при степени очистки в 54 раза включала в себя фракционное высаливание сульфатом аммония, гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию. Полученные профили элюции пероксидазы на сефадексе и диэталаминоэгилцеллюлозе представлены на рисунках 3 и 4.

D280

8 16 24 32 40485664 72 80 88 06 104112120 128138144152160 Объем элюата, мя

Рисунок 3. Профиль этощт пероксидазы hi сефздексе G-100

D280 1-2Т

q 5 Суммарная ' активность ' пероксидазы, "" 0.4 мккат

0,35

I—I—I—|—|—|—яР-10 20 33 40 50 60 70 80 SO 1CD 110 120 130 140 150 180 170 180 Объем элюяга, мл

Рисунок 4. Профиль злюции пероксидазы на Сефздексе G-100

Итоговые данные по выделению и очистке пероксидазы из культуры Rauwolfía serpentina на 35-е сутки роста представлены в сводной таблице.

Таблица 5

Выделение и очистка пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina.

Стадия выаеленга Эбъе,! Белок Пероксвдаза Удельная активность Эчислса ,раз

Ковдсн трацня, иг/мл Суммарный беяок, мг Активность ukat/мл Суммарная жтнвносгь, ukat по белку то пероксид азе

Исходный суперншанг 62.0 7,93 491,66 0,143 8,87 0,0180 - ¡00 100

Зысаливанш (0,8 н (ШЛБОд) 8.0 22.24 177.92 0.595 4.76 0.0268 1.49 36.19 53.66

Геяь-фюатраиня 30 0,425 12,75 0,092 2,76 0,2165 12,03 2,59 31,12

Ионный обмен 24 0,074 1,78 0,073 1,75 0,9831 54,62 0,36 19,73

Таким образом, с использованием предложенной схемы выделения достигалась 54 кратная очистка. Используя разработанный метод выделения

и очистки пероксидазы из Юг сырой ткани Rauwolfia serpentina можно подучить около 1,7 мг гомогенного фермента. В настоящее время основным источником пероксидазы являются корни хрена. Из 50кг этого сырья получают 200 мг фермента. Высокая цена пероксидазы на мировом рынке требует поиска новых альтернативных источников для промышленного получения фермента. Так в качестве альтернативного источника для получения коммерческих препаратов пероксидазы предложена суспензионная культура клеток люцерны, где выход фермента, близкого по физико-химическим свойствам к перожсидазе из корней хрена составляет 250-300 мг на 1 г сухой биомассы. Исследование физико-химических свойств пероксидазы.

Определение молекулярной массы выделенной пероксидазы проводили методом даск-электрофореза по Лэммли. В качестве маркеров для построения калибровки использовали следующие белки с известной молекулярной массой: Фосфорилаза В, бычий сывороточный альбумин, овальбумин, карбогидраза, ингибитор трипсина из сои, а-лактальбумин. Выделенная фракция, обладающая пероксидазной активностью была представлена двумя изоформами с молекулярной массой 30,5 и 32,7 кДа. Поскольку на долю углеводов в молекуле фермента может приходиться до 20%, в качестве одного из объяснений более высокой молекулярной массы некоторых других пероксидаз, выделенных из различных культур растительных клеток, предлагают большую степень их гликозилирования.

Обнаружено, что температурный оптимум выделенного фермента находится при 45°С, что совпадает с данными литературы для пероксидаз из других источников. Определение зависимости активности фермента от рН проводили в интервале 6,0-6,8. Установлено, что оптимум рН находится при 6,2.

Изучение параметров обмена пероксидазы и общего белка в культуре ткани Rauwolfia serpentina

Для изучения кругооборота внутриклеточного белка и пероксидазы использовали разработанные ранее метод, основанный на определении внутриклеточного уровня введенной in vivo радиоактивной кислоты, которая включается в de novo синтезированные белки. По изменению количества аминокислот, содержащих радиоизотоп в составе исследуемых полипешидов, рассчитывали степень деградации белка. При сочетании радиоизотошюго метода с иммунохимическим способом анализа индивидуальных белков было определено количество новосинтезированного пероксидазного белка.

Констанш скорости синтеза (Ks) и распада (Kd) пероксидазы и общего белка определяли по методу Шнмке и Бредли, время функционирования белков (t ja) - по методу Ариас и соавт. Полученные в ходе исследования константы скорости синтеза (Ks) и распада (Kd) пероксидазы и общего белка, величины tie и Е представлены в таблице 10.

//

Таблица 10

Объекты исследования Kd, сут"1 tw, суг Ks, мкг/г ткани в сутки Е, мкг/г ткани

Белок 0,108 6,42 1060,6 9820,0

Пероксидаза 0,137 5,06 39,87 291,0

Влияние теплового шока на активность, изоферментный спектр и обмен пероксидазы в процессе культивирования Rauwolfia serpentina

Воздействие низких и высоких температур на состояние пероксидазы в культурах ткани Rauwolfia serpentina является распространенным видом стресса, часто применяемым для решения различных исследовательских задач. "Ответ" клетки на низко- и высокотемпературный шок осуществляется по отличным друг от друга механизмам, до конца еще не изученным. Как тепловой, так и холодовый стресс воздействуют на программу белкового метаболизма клетки и индуцируют синтез "стрессовых" белков, способствующих адаптации растений к новым условиям. С целью определения обратимости изменений, происходящих в клетке при действии повышенных температур, обмен пероксидазы и общего белка в культуре ткани Rauwolfia serpentina оценивали непосредственно после стресса и после 24 часовой адаптации. На примере семи суточной культуры можно заключить, что тепловой шок более чем в два раза снижает секрецию пероксидазы во внеклеточное пространство. Процесс этот по-видимому необратим, так как адаптация не изменяет содержания пероксидазы в среде.

Было установлено, что при высокотемпературном стрессе активность пероксидазы достоверно снижалась, причем 24 часовая адаптация не приводила к восстановлению пула пероксидазной акгавносги. Тоже самое было отмечено и для общего внутриклеточного белка. Значительное снижение его концентрации (например в 6 раз на 42-е сутки роста) было устойчивым и не компенсировалось в процессе адаптации.

Таблица

Влияние высокотемпературного стресса на активность пероксидазы и общий белок. Определено в ткани.

7 14 21 28 35 42 49 56 63

Акгамюсть Пероксидазы, UkatxlO2 контроль 5,12 5,48 8,39 13.03 16,18 13,4 8,8 10,48 12,44

пресс 8,0 3,50 4,86 4,55 7,66 3,71 4,09 6,S3 4,67

стресс + адаптация 8,72 4,09 6,60 4,89 4,12 4,41 5,17 5,79 5,72

Количество белка, мг/мл контроль 7,1 8,37 U.6 11,43 9,82 12,37 6,08 7,95 14,58

стресс 1,77 1,66 2,68 2,96 2,06 2,24 2,15 2,26 1,52

стресс + адаотадия 1,29 U5 3,30 3,16 2,17 1,84 2,59 2,77 1,71

Некоторые авторы идентифицировали наличие внеклеточных форм растительной пероксидазы (Castillo F.J., 1986). Мы также обнаружили пероксидазную активность в культуральной жидкости, сохраняющуюся на всех сроках культивирования. Если на поздних сроках роста культуры можно

допустить наличие пероксидазы в среде за счет лизиса клеток, то идентификация пероксидазной активности на ранних (7-10 суток) сроках культивирования однозначно указывает на существование механизмов секреции этого фермента во внеклеточное пространство:

Таблица.

Влияние высокотемпературного стресса на активность пероксидазы. Определено в культуральной среде.

Параметры Условия опыта 7 14 21 28 35 42 49 56 63

Активность Пероксидазы цЫхЮ4 контроль 56,74 63,66 62,64 72,06 74,33 131,77 153 169 291

стресс 20,0 37,5 37,0 38,1 88,0 97 88,1 188,0 184

стресс + адаптация 20,8 39,0 79,2 86,9 98,0 129,0 112,0 219,0 213,0

Количество Белка, мг/мл контроль 0,195 0,166 0,219 0,279 0,211 0,272 0,346 0,449 0,64

стресс 0,206 0,140 0,167 0,152 0,175 0,204 0,144 0,398 0,165

стресс + адаптация 0,097 0,159 0,258 0,190 0,177 0,167 0,244 0,372 0,364

Что касается низкотемпературного стресса, то для него также наблюдали снижение как общего белка в клетках, так и активности пероксидазы на всех сроках культивирования.

Таблица

Влияние низкотемпературного стресса на активность пероксидазы и общий белок. Определено в ткани.

7 14 21 28 35 42 49 56 63

Активность Пероксидазы, |дка1х104 контроль 5,12 5,48 8,39 13,03 16,18 13,4 8,8 10,48 12,44

стресс 4,06 6,09 8,48 7,13 7,78 7,28 7,26 8,54 6,07

стресс адаптация 5,51 6,52 4,18 6,21 6,09 6,74 6,77 7,30 7,09

Количество Белка, мг/мл контроль 7,1 8,37 11,6 11,43 9,82 12,37 6,08 7,95 14,58

стресс 2Д5 1,67 1,84 1,75 1,72 1?64 2,13 2,41 2,49

стресс + адаптация 2,77 2,64 1,56 1,86 1,77 2,22 2,50 1,99 1,61

Влияние низкотемпературно1 общин белок. Определено в к? "О СТ] рьту Таблица >есса на активность пероксидазы и ральной среде.

7 14 21 28 35 42 49 56 63

Активность Пероксидазы, Мка1х104 контроль 56,74 63,66 62,64 72,06 74,33 131,7 7 153 169 291

стресс 37 38 49 43 71 151 176 206 149

стресс адаптация 31,5 34 42,1 51 123 165 227 220 181

Количество Белка, мг/мл контроль 0,195 0,166 0,219 0,279 0,211 0,272 0,346 0,449 0?б4

стресс 0,15 0,138 0,118 0,144 0,141 0,195 0,149 0,167 0,159

гтресс + адаптация 0,219 0,223 0,150 0,232 0,261 0,295 0,284 0,336 0,259

Для более полного понимания механизмов изменения уровня как общего, так и пероксидазного белка, исследовали влияние высоко- и низкотемпературного стресса на их синтез и стабильность в культуре Rauwolfia serpentina.

Таблица

Влияние низкотемпературного шока на кинетические параметры

пероксидазы

7 14 21 28 35 42 49 56 63

Km, мМ контроль 4,55 4,48 5,38 5,03 4,31 9,71 17,86 6,17 5,29

стресс 47,62 33,33 25,00 23,81 15,63 6,71 3,40 5,81 2,56

стресс + адаптация 50,00 40,00 19,23 19,61 5,21 6,67 2,01 2,21 2,75

Vrnax, И-kat контроль 3,078 0,088 3,102 0,144 0,182 0,211 0,253 0,233 0,171

стресс 0,161 0,227 0,114 0,145 0,192 0,087 0,085 0,128 0,083

стресс + адаптация 0,385 0,270 0,065 0,156 0,048 0,076 0,055 0,073 0,083

Таблица Влияние высокотемпературного шока на кинетические параметры пероксидазы

7 14 21 28 35 42 49 56 63

Km, мМ контроль 4,55 4,48 5,38 5,03 4,31 9,71 17,86 6,17 5,29

стресс 12,66 3,95 2,40 5,65 2,99 2,79 9,09 6,17 18,52

стресс +-адаптация 10,0 4,41 4,61 3,70 10,9S 2,87 11,4S 7,63 6,71

^max, P-kat контроль р,078 0,088 0,102 0,144 3,182 3,211 3,253 >,233 0,171

стресс 0,139 0,040 0,041 0,063 0,093 0,038 0,043 0,07^ 0,088

стресс + адаптация 0,132 0,04S 0,085 0,044 0,090 0,048 0,072 0,079 0,078

Оказалось, что тепловой шок приводит к резкому снижению скорости синтеза внутриклеточного белка и времени его "полужизни". Скорость распада белка также снижена, а общее количество его в клетках меньше нормы почти в 5 раз. Что касается скорости синтеза белка в условиях низкотемпературного шока, то она снижена в еще большей степени, чем при воздействии высоких температур; сопоставимое содержание белка при высоко- и низкотемпературном стрессе обусловлено значительным снижением скорости его распада. Скорость образования пероксидазы при высокотемпературном стрессе снижена более чем на порядок, и достаточно высокое ее содержание связано со снижением скорости ее деградации. Таким образом можно полагать, что тепловой шок приводит к накоплению в культуре клеток Rauwolfia serpentina старой, менее активной пероксидазы. При низкотемпературном стрессе синтез фермента несколько выше на фоне резкого снижения скорости распада пероксидазного белка.

Действие экстремальных температур вызывало изменения

относительной активности отдельных молекулярных форм пероксидазы, причем низкотемпературный стресс оказывал более сильное влияние. При действии температурного стресса увеличивалась доля медленно мигрирующих изоформ на всех сроках культивирования, причем в процессе адаптации не наблюдалась тенденция к нормализации изоэнзимных спектров. Что касается быстро мигрирующих форм пероксидазы, то так же как и для женьшеня (Троицкая JI.A., 1995), установлено уменьшение содержания этих форм на всех сроках культивирования без нормализации в результате адаптации.

Таблица

Низкотемпературный стресс. Молекулярная гетерогенность пероксидазы

Rf Сутки 7 14 21 28 35 42 49 56 63

0,08 Контроль 55,74 69,55 77,57 67,29 55,94 68,14 55,54 56,14

Стресс 69,74 81т57 84,25 86,08 79,20 73,02 91,27 83,96 72,87

Стресс + адаптация 89,87 82,76 90,13 79,59 82,25 82,59 93,24 75,66 83,02

0,10 Контроль 37,13 17,40 19,36 22,50 21,98 22,72 37,03 37,42

стресс 27,96 16,34 13,40 11,49 15,85 21,90 5,41 8,47 21,85

стресс + адаптация 6,41 13,79 6,01 12,39 12,34 12,37 3,74 12,61 13,87

0,14 контроль 5,58 8,71 1,84 8,44 ¡8,24 7,18 5,57 4,69

стресс 1,56 1,36 1,69 1,77 3,17 4,38 2,28 5,04 4,37

стресс + адаптация 1,87 1,73 1,72 3,10 2,53 2,06 2,07 7,56 2,21

0,17 контроль 1,47

стресс ' 1,06 0,49 1,48

стресс + адаптация 1,21 1,10 1,51 3,71 1,83 1,83 0,64 3,78 0,49

0,26 контроль 1,55 1,34 1,23 1,77 2,37 1,96 1,86 1,75

стресс 0,74 0,73 0,66 0,66 0,72 0,70 0,55 1,05 0,91

стресс адаптация 0,64 0,62 0,63 1,21 1,05 1,15 0,31 0,39 0,41

Общепризнанно, что изменения в изоферментном спектре пероксидаз способствует нормальному протеканию метаболических процессов в стрессовых условиях. Имеется небольшое число работ описательного характера по этой тематике, в которых не оценивали уровень активности отдельных изоформ пероксидазы при стрессе. Сопоставление с данными литературы также осложнялось использованием исследователями различных субстратов для выявления зон с пероксидазной активностью, что могло служить источником ошибок, поскольку отдельные изоформы характеризуются различной субстратной специфичностью. Было показано, что температурный стресс наиболее сильно влияет на группу медленно мигрирующих изоформ пероксидазы.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мулла Ахмад Исмаил

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Структура пероксидазы.

1.2 Физико-химические свойства растительных пероксидаз.

1.3 Распространение и субклеточная локализация пероксидазы.

1.4 Биологическая и физиологическая роль пероксидазы. 17 1.4.1 Возможные механизмы участия пероксидазы в формировании ответных реакций на действие различных стресс-факторов.

1.5 Биосинтез пероксидазы

1.6 Молекулярная гетерогенность пероксидазы. •

1.7 Механизм действия пероксидазы. • •■=. •. 40 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования и метод культивирования ткани

2.2 Выделение цитоплазматической фракции пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina

2.3 Выделение и очистка пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina.

2.4 Определение концентрации белка

2.5 Определение активности пероксидазы

2.6 Электрофоретические методы

2.6.1 Электрофорез в пластинах полиакриламидного геля

2.6.2 Определение активности пероксидазы в геле

2.7 Иммунологические методы

2.7.1 Получение антисыворотки к пероксидазе

2.7.2 Радиальная иммунодиффузия в агаровом геле

2.7.3 Определение концентрации антигена

2.8 Радиоиммунонлогические методы

2.8.1 Определение параметров кругооборота пероксидазы и общего белка

2.9 Статистическая обработка результатов эксперимента.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Активность пероксидазы и концентрация белка в динамике роста Rauwolfia serpentina, штамм К

3.1.1 Подбор оптимальных условий определения активности

3.2 Изучение кинетики пероксидазы на разных этапах роста каллусной культуры Rauwolfia serpentina.

3.3 Молекулярная гетерогенность пероксидазы в процессе культивирования штамма Rauwolfia serpentina.

3.4 Выделение и очистка пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina.

3.4.1 Подбор оптимальных условий высаливания

3.5 Определение молекулярной массы пероксидазы, влияние температуры и рН на ее активность.

3.5.1 Влияние температуры и рН на активность пероксидазы.

3.6. Изучение параметров обмена пероксидазы и общего белка в культуре ткани Rauwolfia serpentina

3.7 Исследование специфичности антипероксидазной сыворотки

3.8 Влияние высоко- и низкотемпературного шока на активность и кинетические параметры пероксидазы в культуре ткани Rauwolfia serpentina.

3.8.1. Влияние температурного шока на кинетические параметры пероксидазы

3.9 Молекулярная гетерогенность пероксидазы при высоко- и низкотемпературном шоке.

3.10 Обмен внутриклеточного белка и пероксидазы в культуре ткани 72 Rauwolfia serpentina

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние температурного стресса на пероксидазу в культуре ткани Rawuolfia serpentina Benth"

В последние годы внимание исследователей все в большей мере привлекают культивируемые растительные клетки и ткани. Это связано, с одной стороны, с перспективностью их использования в качестве продуцентов ценных биологически активных веществ, а с другой - в качестве модели для изучения молекулярных механизмов протекания тех или иных процессов в растительных клетках.

Изолированные клетки растений находят все большее применение в качестве модельных систем для изучения не опосредованных другими тканями растения реакций на действие разнообразных внешних факторов. Кроме того, исследование механизмов клеточного метаболизма в дедифферепцировапых т.е. находящихся в стрессовых условиях клетках создает условия для более эффективного развития биотехнологии клеточных культур [65].

Растения рода Rauwolfia известны как перспективный источник получения многих алкалоидов, применяемых в медицинской практике. В Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии в результате многолетней селекции культуры ткани Raiiwofia serpentina получен высокоэффективный штамм - суперпродуцент антиаритмических алкалоидов. В процессе селекции использованы различные мутагены и иные стрессовые факторы, что привело к существенному изменению биохимических процессов, протекающих в культивируемых клетках Rauwofia serpentina. В рамках осуществления биохимического контроля за состоянием клеточных культур анализировали пероксидазу - один из основных ферментов метаболизма кислорода. Этот фермент принимает участие в каталитическом окислении различных субстратов, таких как фенолы, ароматические амины и др. Факт, что пероксидаза присутствует в микробных, растительных и животных клетках дает основание считать его жизненно важным соединением. Что касается растительной перокеидазы, то одной из основных ее функций является защита растения от различных неблагоприятных факторов абиотической и биотической природы. Имеется много работ, посвященных биологической активности этого фермента, однако анализ синтеза и стабильности пероксидазы ранее ни кем не изучался. Мы полагаем, что такого рода исследования могут быть весьма актуальными, т.к. они дают весьма важную информацию не только об активности, но и о синтезе и распаде пероксидазы в динамике роста клеток. Задачи исследования: В работе были поставлены следующие задачи: Изучить динамику изменения активности, физико-химические свойства и молекулярную гетерогенность пероксидазы в течение роста каллусной культуры Rauvvolfia serpentina.

Выделить и очистить до гомогенного состояния пероксидазу из культуры ткани Rauvvolfia serpentina, изучить ее физико-химические свойства и получить к ней моноспецифические антитела.

Оценить скорость синтеза, распада и время функционирования в клетках ткани Rauvvolfia serpentina.

Исследовать влияние температурного шока на содержание и свойства пероксидазы, ее молекулярную гетерогенность в культивируемых растительных клетках.

Научная новизна. В работе впервые была изучена динамика изменения пероксидазной активности растущей культуры клеток Rauvvolfia serpentina. Также впервые были изучены такие параметры, как молекулярная гетерогенность, синтез и стабильность пероксидазы. Разработай способ ее выделения и очистки до гомогенного состояния, изучены физико-химические свойства пероксидазиого белка.

В работе изучено влияние низко и высокотемпературного стресса на состояние пероксидазы и общего белка в каллусной культуре ткани Rauvvolfia serpentina. Установлено, что как при низко- так и при высокотемпературном шоке активность пероксидазы повышалась за счет увеличения ее содержания в клетках и изменения активность отдельных изоформ. Показано более выраженное повреждающее действие низкотемпературного шока.

Теоретическая и практическая значимость Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные о физико-химических свойствах, скоростях синтеза и распада, времени функционирования и содержания пероксидазы в каллусиой культуре ткани Rauwolfia serpentina позволяют расширить наши представления об обмене индивидуальных белков в культуре растительных клеток.

Кроме того, результаты исследования содержат информацию о влиянии экстремальных температур на состояние растительных клеток, а также о протекторном действии пероксидазы, защищающей клетку от повреждения различными токсическими продуктами, возникающими в результате температурного воздействия.

Учитывая тот факт, что работа проводилась с промышленным штаммом Rauwolfia serpentina, знание белкового обмена этого штамма может оказать весьма существенную помощь при дальнейших селекционных работах. Кроме того культура ткани Rauwolfia serpentina может быть использована в качестве источника для получения пероксидазы.

Структура и объем диссертации. Работа изложена па 111 страницах машинописи, содержит 19 таблиц и 24 рисунка . Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в себя наименований.