Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферменты антиоксидантной системы культивируемых растительных клеток

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферменты антиоксидантной системы культивируемых растительных клеток"

На правах рукописи

РГБ ОА

• - ьтжУ1

КИРИЛЛОВА НАДЕЖДА ВАСИЛЬЕВПА

ФЕРМЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2 ООО

Работа выполнена на кафедре биологической химии Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии (Санкт-Петербург)

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор В.П.Комов

Официальные оппоненты.

Член-корреспондент РАМН, лауреат Государственной премии РФ, профессор Хансон К.П, Доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Михайлов С.С. Доктор медицинских наук, профессор Дубинина Е.Е.

Ведущая организация:

Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Москва

Защита состоится «28» декабря 2000 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.23.01. при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу : 197022 Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, дом 12.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Пучкова Л.В.

0. П

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Метаболизм кислорода в аэробных клетках сопровождается постоянным образованием токсичных реакционноспособных свободно - радикальных продуктов. В результате эволюции у аэробов возникли защитные механизмы, к которым относятся специализированные ферментные и неферментные антиоксидантные системы. Главную роль в защите от кислородных метаболитов играют ферменты, способные обезвреживать супероксидные радикалы и перекисные соединения в клетках, например: су-пероксиддисмутаза - СОД (разрушает супероксидные анион-радикалы до перекиси водорода), каталаза (восстанавливает перекись водорода до кислорода и воды) и пероксидазы (также восстанавливающие перекись водорода до воды, но с участием органических восстановителей). (Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., 1993). Абиотические и биотические стрессы приводят к временному сдвигу тканевого балланса антиоксидантов и проокси-дантов в сторону последних. Активные формы кислорода могут участвовать в регуляции экспрессии генома, в том числе индукции/репрессии биосинтеза ферментов- антиоксидантов. (Dat IF. et al., 1998; Смирнова Г.В. и соавт., 1999). Однако в настоящее время нет целостного представления как о влиянии различных неблагоприятных факторов внешней среды на метаболизм белков и, в частности, ферментов-антиоксидантов в клетках растений, так и механизмах компенсации повреждений, вызванных этими факторами. В связи с этим, теоретическая и практическая важность решения данной проблемы требует дальнейшего исследования состояния и обмена ферментов антиоксидантной системы в ответ на различную степень воздействия стрессовых факторов внешней среды.

Для изучения многих физиологических и биохимических процессов в качестве модели широко используются клеточные культуры растений, которые дают возможность достаточно адекватно оценить процессы обмена веществ в растениях и их ответные реакции на разнообразные внешние воздействия. Культивируемые растительные клетки и органы имеют ряд преимуществ, так как выращиваются в строго контролируемых условиях и существуют в автономном режиме, в отсутствии присущих для интактного растения метаболических связей между органами и тканями, а также фитогормональной регуляции. Поэтому интерпретация ответных реакций растительных клеток на строго определенные воздействия того или иного фактора окружающей среды может быть более однозначной. (Бутенко Р.Г., 1986; Носов A.M., 1999).

Известно, что культивирование клеток in vitro приводит к репрессии генов, отвечающих за тканевую специализацию клетки на фоне индукции генов универсального клеточного метаболизма, а также генов автономного существования. (Бутенко Р.Г., 1975). Показано, что активно пролиферирующие вне организма клетки содержат высокий уровень активности антиоксидантных ферментов. Многими авторами установлена четкая и прямая корреляция между максимальной видовой продолжительностью жизни и отношением удельной активности ферментов - антиоксидантов в важнейших органах к интенсивности основного обмена. ( Tolmasolf J.M. et al., 1980; Гусев В.А.и соавт., 1982). Известно также, что содержание ферментов антиоксидантной защиты в клетках и тканях различных организмов, в том числе СОД, каталазы и пероксидаз, генетически запрограммировано. Учитывая все выше изложенное, можно полагать, что гены, несущие информацию о ферментах антиоксидантной системы организма следует отнести к генам "выживания".

В настоящее время культуры растительных клеток являются объектом биотехнологии для получения целевых продуктов, поэтому целесообразность изучения ферментов-антиоксидантов в процессе выращивания растительных тканей in vitro в стандартных условиях, при воздействии неблагоприятных воздействий, а также сопоставление продолжительности жизни биологических объектов с их обеспеченностью этими важнейши-

ми антиоксидантами, участвующими в защите организма от токсического воздействия кислорода, становится очевидным.

Кроме того, в последние годы ферменты антиоксидантной системы представляют большой интерес для практической медицины. В частности, СОД используют для лечения различных аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в качестве радиопротекторного агента при защите от ионизирующей радиации и др. (Bannister J.V., Bannister W.H, 1984; Hallewell В. et al, 1987; Максименко A.B., Тищенко Е.Г., 1997; Захарова М.И., Завалишин Н.А. и соавт., 1999). Поэтому выделение и очистка фермента может представлять большой интерес для энзимотерапии указанных заболеваний. В этой связи особое значение приобретает поиск технологически обоснованного продуцента ферментов. В настоящее время СОД получают из таких дорогостоящих источников, применяемых в пищевой и медицинской промышленности, как кровь, печень и другие органы и ткани крупного рогатого скота. Возможность использования промышленных штаммов культур растительных тканей в качестве источника СОД представляется перспективной. Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось исследование метаболизма СОД, каталазы и пероксидазы, а также общей белоксинтезирующей способности культивируемых клеток раувольфии змеиной и женьшеня. Изучение возможных путей регуляции обмена ферментов-антиоксидантов в культивируемых растительных клетках и оценка их роли в адаптации растительных клеток к неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

Непосредственными задачами работы являлись:

1.Сравнительная оценка белоксинтезирующей способности клеток различных штаммов культур клеток раувольфии змеиной и женьшеня.

2. Изучение динамики каталитической активности ферментов-антиоксидантов (СОД каталазы и пероксидазы) в процессе роста культивируемых растительных клеток, а также определение места синтеза и локализации в клетках отдельных ферментов-антиоксидантов.

3. Разработка методов выделения и очистки СОД, каталазы и пероксидазы из культур ткани различных штаммов раувольфии змеиной и женьшеня. Оценка их некоторых физико-химических параметров.

4. Исследование биосинтеза и стабильности ферментов-антиоксидантов (СОД каталазы и пероксидазы) в культивируемых оетках лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня.

5. Изучение регуляторного действия фитогормонов на метаболизм внутриклеточного белка и исследуемых ферментов антиоксидантной защиты в культивируемых клетках фитогормон-независимой ткани раувольфии змеиной.

6. Оценка влияния различных температур на белоксинтезирующую способность и обмен трех исследуемых ферментов антиоксидантов в культурах растительных клеток.

7. Разработка лабораторного регламента на выделение растительной СОД. Прове-, дение оценки острой токсичности и фармакологической активности выделенной субстанции ферментативного белка.

Научная новизна работы. Основным достижением данной работы представляется проведенное впервые широкое и систематическое исследование белоксинтезирующей способности культивируемых растительных клеток в целом, так как состояние белкового метаболизма в клетках является одним из наиболее важных показателей жизнедеятельности и продуктивности клеток. В работе были впервые рассчитаны параметры кругооборота внутриклеточного белка в культивируемых клетках лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня.

Получены новые данные, расширяющие и углубляющие современные представления о метаболизме белков в клетках растений при экстремальных воздействиях. Уста-

■ "

новлено значительное изменение количественного и качественного состава синтезируемых de novo белков в клетках каллусных культур раувольфии змеиной шт. К-27 и женьшеня настоящего при воздействии различных температур. Впервые выявлено появление полипептидов 14 кДа и 17 кДа и сильное увеличение массовой доли как высокомолекулярных (110 - 50 кДа), так и низкомолекулярных (20 - 18 кДа) полипептидов в изопро-теиновых спектрах изучаемых растительных клеток, которые, по-видимому, относятся к соответствующим семействам стрессовых белков и скорее всего участвуют в процессах адаптации растительных клеток к неблагоприятным факторам внешней среды.

Впервые проведено комплексное исследование и дана всесторонняя характеристика обмена индивидуальных ферментов антиоксиданткой системы в культивируемых клетках лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня. В ходе работы определены ранее неизвестные константы биосинтеза, распада, а также концентрация СОД, ката-лазы и пероксидазы в клетках каллусных культур ткани Rauwolfia serpentina (штаммы К-27 и К-47) и различных штаммов двух видов женьшеня Panax ginseng и Panax quinquefoüus.

Установлена избирательная чувствительность важнейших ферментов антиокси-дантной системы - СОД, каталазы и пероксидазы - к воздействию различных температур, что проявляется в усилении или ослаблении скоростей биосинтеза исследуемых ферментов на фоне количественного и / или качественного изменения состава их изо-ферментных спектров. Полученные данные дают основание сделать заключение о том, что изменение изоферментных спектров, а также скоростей биосинтеза и распада СОД, каталазы и пероксидазы при воздействии низких и высоких температур необходимо для поддержания метаболизма кислорода на оптимальном для клеток уровне и обеспечения формирования повышенной устойчивости и жизнедеятельности клеток в новых температурных условиях. Эти результаты являются основанием анализа и биохимического контроля устойчивости и стабильности культивируемых in vitro растительных тканей и клеток, так как изменение уровня активности ферментов, уровня концентрации ферментативного белка и интенсивности его биосинтеза в клетках может свидетельствовать как о степени повреждения клеточных структур, так и возможности их восстановления.

Впервые показано, что ответ растительных клеток на воздействие высоких и низких положительных температур включал как неспецифические реакции (например, подавление биосинтеза СОД и каталазы и, наоборот, индукция синтеза пероксидазы в обеих исследуемых растительньпс культурах), так и специфические ответы (например, при воздействии высокотемпературного шока наблюдали повышение (раувольфия змеиная) и, наоборот, снижение (женьшень) скорости биосинтеза внутриклеточного белка).

Изучено гормональное воздействие на биосинтез и функционирование ферментативной антиоксидантной системы в культивируемых растительных клетках раувольфии змеиной.

Предложена схема, отражающая механизмы воздействия температуры на растительный организм и объясняющая григгерные механизмы, запускающие биохимические процессы, которые в конечном счете и приводят к изменению характера обмена веществ в растительных клетках при воздействии нефизиологических температур. Научно-практическая значимость работы. Работа носит экспериментально-теоретический характер. Однако полученные результаты характеризуются практической направленностью для биотехнологии и медицины.

Разработаны методы и схемы выделения и очистки трех ключевых ферментов антиоксидантной системы из культивируемых клеток раувольфии змеиной и женьшеня. На выделение СОД из культивируемых растительных клеток получено АС (№ 1540270, 1989 г.).

На основании полученных результатов был создан лабораторный регламент на получение растительной СОД (1998 г.) и проведены оценка его острой токсичности и доклинические противовоспалительные испытания данной субстанции БАВ.

Была разработана схема совмещенной технологии СОД и аймалина из каллусных культур растительных тканей и показана принципиальная возможность получения двух высокоочшценных биологически активных веществ из культивируемых клеток Rauwolfia serpentina и с высоким выходом целевых продуктов. Выделение двух биологически активных препаратов, возможно позволит в будущем повысить рентабельность производства аймалина, а также значительно снизить себестоимость получаемых целевых продуктов.

Результаты работы были использованы при оформлении патента на способ выделения активного комплекса из культивируемых растительных клеток" (No 2136300 от 10.09.99г., приоритет от 04.11.97 г.).

Полученные результаты использовались в лекционных курсах и лабораторном практикуме на кафедре биохимии для студентов Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Данные о скорости биосинтеза и времени функционирования общего белка, а также ферментов-антиоксидангов (СОД, катадазы и пероксидазы) являются основой для реальной оценки биосинтетической способности и общего антиоксидантного потенциала культивируемых клеток лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня и могут быть использованы в полном биохимическом контроле культур растительных клеток, имеющих промышленное значение.

2. Исследования влияния высоких и низких положительных температур на изопро-теиновые спектры позволяют сделать заключение о том, что экспрессия новых белков при данных воздействиях включает в себя как неспецифические ответные механизмы ( проявляются при всех воздействиях), так и специфические, характерные только для одного вида воздействия.

3. Разработанные методики выделения ферментов антиоксидантной защиты позволяют рассматривать исследуемые, имеющие промышленное значение, культуры растительных тканей как источник таких ценных для медицины препаратов как СОД и катала-за. Данные фармакологических испытаний полученной субстанции СОД подтверждают перспективность применения препаратов растительной супероксиддисмутазы в качестве противовоспалительного средства.

Апробация работы. Материалы, использованные в диссертационной работе, докладывались и представлялись на 13 Международном конгрессе по биохимии (Нидерланды, 1985), 18 Съезде ФЕБО (Югославия, 1987), Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Россия, 1988), на I Международной конференции по традиционной реабилитационной медицине (Китай, 1989), Щ Всесоюзной конференции "Биоаетиоксиданты" (Россия, 1989), YH Международном конгрессе по растительным тканям и клеточной культуре (Нидерланды, 1990), 20 Съезде ФЕБО (Нидерланды, 1990), П Всероссийском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Россия, 1993), ШВсероссийском обществе физиологов растений (Россия, 1993), Пи Ш Российском конгрессе "Человек и лекарство" (Россия, 1995, 1996), Международном экологическом конгрессе (Россия, 1996), Международной научной школе по биотехнологии и применению пероксидазы (Россия, 1997), YII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Россия, 1997), Y Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Россия, 1998).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 печатных работ.

■ •

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 379 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований), обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (477 источника) и приложения (48 страниц). Материал диссертации проиллюстрирован 7 схемами, 65 рисунками и содержит 51 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объекты исследования. Работу проводили на нескольких объектах: стеблевой культуре ткани раувольфии змеиной Rauwolfia serpentina Benth. сем. Apocyna-сеае штаммы K-27 ( Воллосозич А.Г. и соавт., 1992) и К-47 (Николаева Л.А., 1993). Культуре ткани женьшеня (Слепян Л.И. и др., 1988): обыкновенного Panax ginseng С.А.Меу, полученной из корней нативных растений ИФРЖ - 15, ВСККК (BP) No 1; пятилистного Panax quinquefolius L. ИФРЖ - 10, BCKKKBP No 16; селективного штамма Panax ginseng LX-5 ( ИФРЖ - 5 BCKKKBP, No 11; селективного штамма Panax ginseng LX-13 ( ИФРЖ-5 BCKKKBP, No 26).

Определение активности ферментов. Активность хаталазы определяли пер-манганатометрическим методом (Комов В.П., Шмелев В.К., 1975). Активность пе-рохсидазы определяли спектрофотометрическим методом (Bovaird J.H., et al., 1982). Активность СОД определяли по методу Фридовича (Misra Y. P., Fridovich I„ 1972).

Методы выделения и очистки ферментов. Для выделения исследуемых ферментов из культивируемых растительных клеток нами были использованы фракционное высаливание сульфатом аммония, гель-хроматография на различных сефадексах, ионообменная хроматографии на КМ- и ДЕАЕ- сефадек-сах\целлюлозах, а также методы лигандообменной препаративной хроматографии ( Porath J. et al., 1983; Даванков B.A., 1989).

Электрофоретические методы. Электрофорез проводили по методу Девиса ( Davis В.Т., 1964). Локализацию СОД в 7,5% ПААГ после электрофоретического разделения определяли по методу Бьючампа (Beauchamp С., Fridovich I., 1973). Определение активности каталазы в геле проводили по модифицированному методу Вудбурга (Woodburg W., 1971), локализацию СОД - по методу Фридовича (Misra Н.Р., Fridovich I., 1977) и пероксидазы - по методу Лиу (Liu E.H., 1973) с некоторыми модификациями (Групшн A.A., Ивакин А.П., 1985; Гаянова С.С., Хавкин Э.С., 1990).

Анализ гомогенности, определение молекулярной массы каталазы, СОД и пероксидазы и исследование теопротеиновых спектров в культивируемых растительных клетках проводили методом диск-электрофореза в двухступенчатом 3% и 10% или линейном градиенте 5%-20% ПААГ с 0,1% DS-Na (Laemly U., 1970) с использованием наборов маркерных белков (Sigma, США; Serva, Швеция).

Иммунологические методы. Моноспецифическую антисыворотку к каждому из исследуемых растительных ферментов получали иммунизируя кроликов 4 мг очищенного лиофилизированного ферментативного белка. В качестве контроля использовали сыворотку крови кроликов, взятую из ушной вены кроликов до иммунизации животных. Специфичность антител оценивали методами иммунодиффузии в 1% агаре Диф-ко (Охтерлони, 1949), простой радиальной иммунодиффузией по Манчини (Пастер Е.У., 1989) и при помощи диск-электорофреза преципитатов в денатурирующих условиях (Laemmly, 1970).

Радиоиммуиологические методы. Обмен общего белка и исследуемых ферментов оценивали на 1-7 сутки после введения в каллусные культуры 3Н- или 14С-лейцина. Уровень радиоактивности в преципитатах определяли на сцинтилля-ционном счетчике ("Mark - Ш", США) с толуоловым сцинтиллятором (Kuel L., Sumsion Е., 1970) и концентрацию белка по методу Лоури (Lowry O.et al., 1951). Константы скорости синтеза (Ks) и распада (Kd) индивидуального белка и общего белка определяли по методу Шимке и Бредли (Schimke R.T., Bradly М.О., 1975), время функционирования белков (tm) - по методу Ариас и соавт. (Arias I.M. et al., 1969).

Включение меченного йода (1231) в молекулы иммуноглобулинов проводили ферментативным путем по методу (Маринченко Г.В., 1985). Процент СОД-синтезируемых рибосом от общей фракции полирибосом клеток раувольфии змеиной определяли по методу (Schechter, 1974).

Влияние различных факторов на состояние исследуемых ферментов в культурах растительных тканей. Культуры ткани раувольфии змеиной и женьшеня различного возраста подвергали высоко- (3 часа при 45°С) и низкотемпературной (при 7°С в течение 24 часов) обработке. В первой серии опытов ткань использовали для дальнейшей работы непосредственно после теплового шока (серия 1),во второй - культуру ткани после теплового стресса выдерживали сутки при 26°С в темноте (серия 2).

Индолилуксусную кислоту (ИУК), а-нафтилуксусную кислоту (НУК) и кине-тин вносили в питательную среду в концентрации 10"6 М на 1 л среды.

Статистическая обработка результатов эксперимента. Статистическая обработка экспериментальных данных проведена по ГОСТ 11.004-74.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Белоксинтезирующая способность растительных клеточных культур. Известно, что белоксинтезирующая способность клеток опосредовано влияет на все стороны обмена веществ. Установлено, что содержание внутриклеточного белка в клетках раувольфии в 3,5-4 раза выше, чем в культурах обоих видов женьшеня. Характерно, что селективные штаммы и P. ginseng (LX-5, LX-13) и P. quinquefolius (LX-5) в значительной степени отличались от соответствующих исходных штаммов женьшеня не только по относительному приросту сырой биомассы, но и уровню содержания и динамики накопления внутриклеточного белка. Полученные данные, по-видимому, обусловлены влиянием германий органических соединений на геном растительных клеток, которые выращивались на селективных средах. (Гар Т.К., Миронов В.Ф., 1982).

Установлено, что время функционирования внутриклеточного белка в обоих штаммах раувольфии было сравнительно одинаковым и составляло от 6,08 до б,86 суток. В свою очередь время "полужизни" суммарного белка в культурах женьшеня было значительно ниже и составляло 3,38 и 4,18 суток, что, по-видимому, связано как с различиями в самих объектах объектах (степень дифференциации тканей, концентрации белков, генетическими особенностями, эволюционно закрепленными условиями существования исходных растений и т. п.), так и с условиями функционирования генома (различные питательные среды, добавки и т.п.), которые оказывают влияние на скорость обновления и распада внутриклеточных белков. Показано, что скорость накопления внутриклеточного белка в клетках каллуса раувольфии змеиной составляла 0,42 % (шт. К-27) и 0,37% (шт. К-47) в час. Соответственно эти величины для культуры ткани женьшеня составляли 0,37% (Р. ginseng), 0,20% (Р. ginseng LX-5) и 0,25% (Р. quinquefolius) в час. Из данных ли-

тературы известно, что скорость обновления белка в растительных тканях лежит в пределах от 0,1 до 2% белка в час. (Huffaker R.C., Peterson L.W., J974; ХавкинЭ. Е., ¡977).

По современным представлениям, фитогормоны контролируют направленность всего метаболизма растительных клеток за счет изменения, как их структурной организация, так и функциональной активности. (Муровцев Г.С., Агнистикова В.Н., 1984; Кунаева О.Н., 1985; Полевой В.В., 19896; Гамбург К.З., 1990, Кунах В.А., 1997). Показано, что внесение кинетина в среду культивирования не оказывало существенного влияния на концентрацию белка в клетках на фоне уменьшения скоростей его биосинтеза и распада. Выявленное падение скорости распада общего белка в ткани, выра-

Таблица 1. Обмен внутриклеточного белка в растительны* тканях

Индексы Ka, t к , к„ Е,

сут'1 сут мкг/ сутки на 1 г ткани мкг/ на 1 г ткани

Rauwolfia serpentina шт. К-27

Контроль 0,101 6,86 969,6 9600,0

НУК 0,138 5,02 1005,5 7286,0

ИУК 0,114 6,08 1184,7 10392,4

Кинетин 0,089 7,79 846,4 9510,0

Влияние высокой темпе] затуры

I серия 0,128 5,41 1322,0 10330,0

П серия 0,171 4,05 1082,0 6333,0

Влияние низкой температуры

I серия 0,029 23,89 346,9 11962,0

П серия 0,098 7,07 970,2 9900,0

Rauwolfia serpentina шт. К-47

Контроль 0,113 6,13 1117,0 9890,0

Panax ginseng

Контроль 0,114 6,08 513,0 4500,0

Влияние высокой температуры

1 серия 0,235 2,95 508,8 2165,0

П серия 0,228 3,04 490,0 2131,0

Влияние низкой температуры

I серия 0,034 20,38 117,5 5220,0

П серия 0,084 8,25 457,4 5445,0

Panax ginseng LX-S

Контроль 0,205 3,38 520,0 2530,0

Влияние высокой температуры

I серия 0,199 3,48 523,0 2630,0

П серия 0,191 3,63 502,0 2630,0

Влияние низкой температуры

1 серия 0,052 13,33 154,0 2970,0

П серия 0,220 3,15 651,0 2960,0

Panax quinquefolius

Контроль 0,166 4,18 388,0 2340,0

щенной на питательной среде в присутствии кинетика., связано, по-видимому, со снижением общей протеолитической активности в исследуемых культивируемых клетках. Ранее нами было показано (Kotnov V.P., 1990), что кинетин достоверно снижал скорость биосинтеза вакуолярной протеиназы, что приводило к почти десятикратному уменьшению ее концентрации в клетках раувольфии. Скорость синтеза белка в клетках, выра -щенных на среде с ИУК, увеличивалась почти в 2 раза, что приводило к значительному увеличению содержания белка в клетках. НУК также вызывала увеличение скоростей синтеза белка, однако, деградация белка увеличивалась в большей степени, что и приводило к достоверному снижению его внутриклеточной концентрации.

Полученные данные по увеличению скорости биосинтеза общего белка при воздействии ИУК и НУК хорошо укладываются в схему механизмов действия этих фитогормо-нов. Как уже отмечалось, ауксины способны усиливать скорость транскрипции и трансляции и, таким образом, изменять количество и соотношение белков и ферментов в растительных клетках. (Якушина Н.Й., Кулакова И.А., 1984; Kurepa J. et al., 1997; Limam F. et al., 1998). Повышение скорости распада внутриклеточного белка в присутствии ауксинов, по-видимому, связано с активацией протеолиза в каллусной культуре раувольфии змеиной. Можно предположить, что ауксины, оказывая, в общем значительное влияние на весь белоксинтезирующий аппарат клеток, активируют и синтез различного рода про-теолитических ферментов. Нельзя также исключить активацию уже присутствующих в клетке лротеиназ, так как для ауксинов показано влияние их на активность функционирующих ферментов (Гамбург К.3.,1980). Таким образом, при интерпретации полученных данных можно с высокой степенью вероятности полагать, что гормональная регуляция содержания общего пула белков в клетках раувольфии змеиной обусловлена, по-видимому, влиянием фитогормонов на белок-деградирующие протеиназы или на биосинтез их белковых ингибиторов.

Специфические изменения экспрессии генов в ответ на различные неблагоприятные внешние воздействия были продемонстрированы на примере и прокариотических и эу-кариотических организмов. В особенности это касается, влияния температуры окружающей среды (одного из основных факторов в жизни любого организма) на механизмы, которые обеспечивают синтез белка и протекают, как в ядре, так и в цитоплазме. При оценке влияния теплового шока (при выдержке каллусов 45 С в течение 3-х часов) можно отметить повышение скорости биосинтеза (на 36%) и увеличение содержание белка в клетках раувольфии змеиной. В культуре ткани женьшеня наблюдали уменьшение скорости биосинтеза внутриклеточного белка на фоне резкого подавления концентрации последнего в клетках. Наименьший эффект высокие температуры оказывали на белоксинте-зирующую способность клеток селективного штамма женьшеня (LX-5). При воздействии высокой температуры скорость распада внутриклеточного белка в исследуемых нами культивируемых растительных клетках повышалась в 1,2 -1,5 раза, как в случае культуры раувольфии змеиной, так и женьшеня. Можно предположить, что после воздействия стрессовых факторов, в том числе и теплового шока, в растительных клетках появляются денатурированные белки, поэтому в клетках, подвергнутых воздействию стрессовых факторов, в том числе и температурного шока, должны активироваться процессы деградации денатурированных белков. Действительно, следует отметить, что температурной шок сопровождается усилением протеолитических процессов. Один из возможных механизмов такого усиления связан с изменением проницаемости тонопласта и выходом из вакуоли клетки в цитозоль протеолитических ферментов. (Vieira da Silva J.B., 1976; Matile Р., 1982). Кроме того, известно, что для большинства видов высших растений убиквитиновый путь расщепления белков в цитозоле является основным и его роль возрастает в условиях биотического и абиотического стрессов. Так как, ген, кодирующий убиквитин, входит в число генов БТШ, транскрипция которого активизируется при по-

вышенной температуре окружающей среды. (Gausing К., Barkardottir R., 1986; Vierstra R.D. et al., 1988). Механизм убиквитинзависимого протеолиза заключается в том, что убиквитин ковалентно соединяется с белком с помощью пептидной связи между С-концевой (карбоксильной) группой глицина в убиквитине и одной из лизиловых аминогрупп белка, предназначенною для разрушения. Образование убиквитин-белкового комплекса требует энергии АТФ и осуществляется специальным мультиферментным комплексом. (Finley D., Varshavsky А., 1985; Войников В.К., Боровский Г.Б., 1994). В клетках растений к настоящему времени обнаружены убиквитин, убиквитин-белковые конъюга-ты, АТФ-зависимая конъюгация белков с убиквитином, специфические протеазы, разрушающие убиквитин-белковые комплексы. (Тарчевский И.А., 1993). Таким образом, высоко консервативный низкомолекулярный белок - убиквитин «метит» денатурированные или иные аномальные белки, которые затем опознаются специальными нелизосомальны-ми протеазами и подвергаются гидролизу. (Finley D., Varshavsky А., 1985; Vierstra R.D. et al., 1987,1988,1989). Оказалось, что скорость распада внутриклеточных белков в исследуемых культурах ткани оставалась выше контроля (1,4 -1,7 раза) и спустя 24 часа после снятия стресса. По-видимому, после действия теплового шока в клетках культур ткани образовалось большое количество денатурированных белков, поэтому убиквити-новая система оказалась перегруженной и оставшиеся нерасщеплешыми денатурированные белки продолжают индуцировать гены, кодирующие БТШ, при этом имеет место и индукция убиквитина как одного из белков группы БТШ. (Munro S., Pelham H.R.B, 1985). Существует также мнение, что процессы биодеградации макромолекул'в клетках после стресса, по-видимому, направлены не только на разрушение денатурированных, аномальных или уже отработанных, нежизнеспособных соединений, но и на то, чтобы обеспечить необходимый для создавшихся условий пул низкомолекулярных соединений, входящих в состав макромолекул. (Vierstra R.D., 1987, 1993).

При действии низких положительных температур на каллусные культуры женьшеня и раувольфии скорости биосинтеза белка достоверно снижались по сравнению с контрольными значениями. Однако содержание внутриклеточного белка было выше, чем в контроле, за счет резкого подавления скорости деградации белка в клетках. Период адаптации (при выдерживании культуры ткани в течение 24-х часов в стандартных температурных условиях) приводил к определенной нормализации основных показателей бело-ксинтезирующей способности культивированных клеток. В настоящее время предполагают, что накопление внутриклеточных белков в растительных клетках при гипотермии, на фоне подавления их биосинтеза, по-видимому, происходит за счет снижения скорости распада этих белков, однако в этих работах не проводилась оценка скорости деградации тотального белка. (Войников В.К. и соавт., 1986; Boothe J..G. et al., 1995; Ступникова И.В.и соавт., 1998) В нашей работе было достоверно доказано, что скорость биосинтеза внутриклеточного белка в культивируемых растительных клетках раувольфии змеиной и женьшеня при гипотермии достоверно снижена, а повышение концентрации внутриклеточных белков в обоих каллусах культур тканей происходит только за счет снижения скорости их деградации (табл.1).

Для более четкой интерпретации, полученных результатов по влиянию неблагоприятных температур на синтез и распад общего белка в культивируемых растительных клетках, нами были проведены дополнительные исследования протеиновых спектров последних. Спектр белков 30-ти суточной культуры раувольфии (uit.IC-27) показал, что основная массовая доля идентифицированных белковых зон имела молекулярные массы от 40 до 14 кД, а 10-ти суточной культуры женьшеня настоящего - от 67 до 25 кДа (рис.1). При воздействии высокой температуры в клетках раувольфии змеиной наблюдали появление ранее не идентифицированной белковой зоны с молекулярной массой 17 кДа, а также увеличение доли белков с молекулярной массой около 96-98, 70, 20 и 14 кДа. В

тоже время, наблюдали снижение доли белков с молекулярной массой около 22 кДа. Исследование белкового спектра культивируемых клеток раувольфии змеиной 30-ти суточного возраста, подвергнутых воздействию низких положительных температур, выявило значительное усиление группы полипептидов с молекулярными массами 110, 98, 67, 55 и 50 кДа. Доля низкомолекулярных белков 18 кДа также увеличивалась. Адаптация культуры ткани в стандартных условиях культивирования приводила к определенной нормализации спектра белков данной культуры ткани (рисунок 1).

В протеиновых спектрах клеток женьшеня при действии температуры нами была идентифицирована дополнительная белковая зона с молекулярной массой 14кДа,

. 94 кДа

. 67кДл

■ 43 ic Да

■ 30 кДа

■ гО,1кДа . 14,4 жДя

1 1а 16 1а* 16'

2 2а 26 2а* 26*

Рис. I. Протеиновые спектры (3%-20% ПААГ-DsNa) внутриклеточных белков каллусных тканей раувольфии змеиной (I) и женьшеня (2).

Высокотемпературный шок : а -1 серия, 6-2 серия опытов; низкотемпературный шок: а*~1 серия, б* - 2 серия опытов.

на фоне снижения массовой доли белков других молекулярных масс. 24 часовая адаптация приводила к определенной нормализации протеиновых спектров обеих культур растительных тканей. При сравнении белковых спектров клеток Р. ginseng 10-ти суточного возраста, подвергнутых воздействию холода, было выявлено появление низкомолекулярных белков с молекулярной массой около 14 кДа и значительное усиление группы полипептидов с молекулярными массами 50 кДа. Через 24 часа (П серия опытов) наблюдали дальнейшее увеличение массовой доли полипептидов с молекулярными массами 120, 40 и 18 кДа по сравнению с контролем (рисунок 1).

Не смотря на то, что причиной появления новых вариантов полипептидов, отмеченных на элекгрофореграммах суммарной фракции белков клеток каллусных культур раувольфии змеиной и женьшеня, может быть не только новообразование, но и деградация высокомолекулярных внутриклеточных белков. Однако совокупность имеющихся в нашем распоряжении данных, полученных при изучении параметров кругооборота внутри-

клеточного белка, а также многочисленные литературные данные, позволяют говорить о синтезе специфических белков в период температурной адаптации растительных клеток. Выявленные нами различия в белковых спектрах в каждой из изучаемых каллусных культур растительных тканей, при воздействии высоких иди низких положительных температур, могут свидетельствовать о том, что геном растительной клетки отвечает, вероятно, на понижение и повышение температуры изменением экспрессии генов, причем, по-видимому, разных, так как при гило- и гипертермии синтезировались, как правило, разные полипептиды.

Уровень активности ферментов. При исследовании состояния ферментов ан-тиоксидантной защиты в процессе роста каллусных культур установлено фазное изменение активности СОД каталазы и пероксидазы (рис. 2), которое в основном коррелировало е установленной ранее миготической активностью культивируемых клеток и максимальным приростом культуры ткани (Писецкая Н.Ф., Бутенко Р.Г., 1971; Высоцкая Р.И., 1978; Воллосович Г.А., 1992).

Выделение и очистка ферментов. Одной из основных целей данного исследования было изучение обмена ферментов ангиоксидантной системы, поэтому в задачи работы входило разработать схемы выделения и очистки исследуемых ферментов (табл. 2). В результате нами получены высокоочищенные препараты ферментов, содержание примесей в которых по данным диск-ЭФ в ПААГ в нативных и денатурирующих условиях, аналитического центрифугирования и ВЖХ, не превышал 1%.

Предложенная нами процедура очистки СОД из биомассы раувольфии змеиной и женьшеня дает высокий выход фермента (80%) по сравнению с другими известными методами его выделения из растительных источников от 2% из зерен маиса (БсапсМов й а1., 1981) до 25% из листьев томата (Клла&эигску е1 а!., 1985). Разработанная схема позволяет выделить из 1 кг биомассы около 180 мг (раувольфия) и около 39 мг (женьшень) фермента, при содержании последнего, соответственно, 206,3 мкг и 49,7 мкг в 1 г ткани. Таким образом, разработанная схема выделения СОД позволяет получать препаративные количества высокоочищенного фермента, который по своим физико-химическим характеристикам не уступает отечественным и зарубежным аналогам.

Кроме того, показано, что культуры тканей растений являются весьма перспективным продуцентом СОД, так как выход фермента с единицы биомассы превышает в несколько раз количество СОД получаемой с 1 л эритромассы (50 мг), хотя и уступает по продуктивности биомассе рекомбинатным штаммам микроорганизмов (Дроздова Ю.И., 1997).

Предложенный метод выделения и очистки пероксидазы позволяет получить 173 мг (Р. змеиной) и около 15 мг (женьшень) фермента из 1 кг сырой биомассы культивируемых клеток. Известно, что пероксидаза широко применяется в иммуноферментпом анализе, является одним из основных ферментов диагностических наборов, а также может использоваться в качестве катализаторов различных процессов (образование смол, диме-рилизация индольных алкалоидов и др.) (Газарян, 1992). Однако до настоящею времени источником для выделения пероксидазы в промышленном масштабе по-прежнему являются корни хрена, га 50 мг данного сырья можно получить около 200 мг фермента (Уап Ниуйее, 1987), поэтому цена пероксидазы на мировом рынке достаточно высока. В связи с этим, проблема альтернативных источников для промышленного получения пероксидазы является весьма актуальной. В последние годы в качестве сырья для выделения СОД предлагаются культуры растительных клеток с высоким содержанием -пероксидазы. В частности, авторами в качестве источника для получения пероксидазы близкой по своим физико-химическим свойствам к пероксидазе хрена, была предложена суспензионная культура люцерны, при этом из 1 г сухой биомассы этого сырья можно выделить до

пероксидаза

20 25 30 35 40 Сутки роста

пероксидаза (шт. К-27)

10 20 30 40 50 _ 60 65 Сутки роста

35 т 30-I 1 25 -

О. ш

4 I 1

5 О 15-1

¡9 :

ч

5 ?

0 +-

II

а в

М I 5 *1

I * <

.5 200

..50.

СОД

10 15 20

23СуЙ1 рота каталаза

- Р. ципциеМит

- • * • Р. qu¡nquefolíum IX-

5

—•— -Р.д1п$ег>д

5 20 25 30 35 40

Сутки роста

5 |

в» -Г

I" Й ° г 5

180 160 140 -■ 120 100 во 60 40 200

_СОД (шт. К-27)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Сутки роста

II

& ш

женьшень

Сутки роста

раувольфия змеиная

о

Рис.2 Динамика уровня активности исследуемых ферментов в клеточных культурах.

Таблица 2. Схема выделения и очистки исследуемых ферментов

биомасса культуры ткани |

300 мкг фермента (Газарян и соавг., 1992). В нашем случае выход пероксидазы на 1 г сухой биомассы составляет, соответственно, 2653 (Р. змеиная) и 230 мкг (женьшень).

Использованный нами способ выделения каталазы из культивируемых растительных клеток обеспечил 27-кратную (Р. змеиная) и 33-кратную (женьшень) очистку фермента при общем выходе от 14% (Р. змеиная) до 52% (женьшень), что позволило использовать ферментативный белок для иммунизации животных и получения моноспецифической антисыворотки к каталазе, с целью изучения обмена каталазы в этих культурах тканей. Необходимо отметить, что, показанная нами возможность выделения каталазы из культивируемых растительных клеток, может в дальнейшем иметь определенное практическое применение. Потенциальная терапевтическая значимость препаратов каталазы связана с тем, что совместное действие СОД и каталазы усиливает их защитный эффект. Их совместное действие приводит к снижению концентрации в организме перекиси водорода и более эффективно предотвращает образование таких токсичных радикалов кислорода, как гидроксильный радикал. Кроме того, комбинированное применение СОД и каталазы целесообразно еще и потому, что конечный продукт реакции, катализируемой СОД - перекись водорода, приводит к инактивации СОД, тогда как каталаза превращает токсичную перекись водорода в безвредную для СОД воду и кислород.

Кругооборот индивидуальных ферментов. Используя радиоизотопный метод в сочетании с иммунохимическим анализом индивидуальных ферментативных белков, были определены количества новосинтезированных полипептидов СОД, каталазы и пероксидазы, образующихся в единицу времени, скорость их накопления в цитоплазме, а также время их функционирования и скорость распада in vivo в культивируемых каллус-ных культурах раувольфии змеиной и женьшеня.

Обмен СОД. Полученные нами данные по определению места локализации биосинтеза СОД показали, что фермент синтезируется как на свободных, так и мембраносвя-

Таблица 3. Обмен СОД в культивируемых растительных клетках

Индексы Kd, суг"1 Ы, суг Ks, мкг/г ткани в сутки Е, мкг / г ткани

Rauivolfia serpentina

Контроль 0,190 3,65 39,20 206,3

Кинетин 0,206 3,36 70,10 340,4

НУК 0,548 1,26 162,20 296,0

влияние высокой темпе ратуры

I серия 0,201 3,45 37,70 187,5

П серия 0,194 3,57 37,87 195,0

влияние низких темпе ратур

I серия 0,119 5,82 20,66 173,6

П серия 0,194 3,57 30,36 156,5

Ралах ginseng

Контроль 0,244 2,84 12,12 49,7

влияние высокой темпе ратуры

I серия 0,325 2,13 8,35 25,7

Псерия 0,260 2,67 13,34 51,3

влияние низких темпе ратур

I серия ОД 90 4,33 8,91 46,70

П серия 0,240 2,96 10,5 43.70

занных полирибосомах. Исходя из соотношения между значениями Лмп /А isa и величинами счета (имп/сек) было рассчитано, что 49% СОД-синтезирующих рибосом являются мембраносвязанными, а 51% - свободными. При исследовании кругооборота СОД в культивируемых тканях было установлено, что в 1 грамме сырой биомассы раувольфии змеиной содержится 206 мкг ферментативного белка, а в клетках женьшеня - около 50 мкг (табл. 3). Введение фитогормонов в среду культивирования оказывало значительное влияние на уровень активности СОД в клетках Р. змеиной. Установлено, что увеличение средней активности СОД на 25% при выращивании каллусов на среде как с кинетином, так и НУК обусловлено увеличением скорости биосинтеза и накопления фермента в клетках в 2-4 раза по сравнению с контролем. Полученные нами данные по интенсификации биосинтеза СОД в присутствии кинетика и НУК коррелируют с результатами, полученными в последние годы в ряде работ. Установлено, что обработка фитогормонами растительных материалов (ауксинами, кинетином, гиббереллинами и др.) приводит к экспрессии генов, которые кодируют растительные СОД. (Kupera J. et al, 1997; Schaller G.T.,1997; Guan L., Scandalios J.G. et al, 1998). Учитывая эти данные, можно полагать, что и в случае каллусной культуры раувольфии змеиной, контроль скорости биосинтеза СОД фитогормонами может также осуществляться, по-видимому, на стадии транскрипции. Скорость биосинтеза СОД и в клетках женьшеня и раувольфии змеиной была достоверно снижена по сравнению с контрольными значениями как при воздействии высоких, так и низких положительных температур, что сопровождалось уменьшением содержания ферментативного белка в клетках. (табл.З).

Обмен пероксидазы. При исследовании обмена пероксидазы (табл. 4) установлено, что скорость накопления пероксидазы в клетках раувольфии в 7-36 раз выше, чем в исследованных клетках женьшеня. Соответственно, было обнаружено, что в 1 грамме сырой биомассы раувольфии змеиной содержится в 10 раз больше ферментативного белка, чем в клетках различных видов и штаммов женьшеня. На обмен пероксидазы наибольший эффект оказывало внесение в среду культивирования кинетина, содержание фермента в клетках увеличивалось в 3 раза за счет повышения скорости его биосинтеза. Ранее при культивировании субкультуры петуньи (Petunia hybrida) на средах, содержащих кинетин, было также показано увеличение содержания пероксидазы в клетках каллуса. (Toumaire С. et al., 1996). Концентрация пероксидазы в клетках, выращенных на среде с НУК, снижалось в 1,5 раза и сопровождалось понижением усредненного уровня активности фермента практически на всех сроках роста культуры ткани. Другими авторами было также показано, что, в отсутствии ауксинов, в растительных клетках возрастает активность пероксидазы и, наоборот, в их присутствии активность фермента значительно снижается. ( Volk R. et al., 1978; Гамбург К.З. и соавт., 1990). В нашей работе установлено, что при температурном шоке происходит резкое повышение скорости биосинтеза пероксидазы и увеличение концентрации ферментативного белка во всех исследуемых клетках, что и проявляется в достоверном повышении активности фермента. Низкие температуры, в свою очередь, снижали биосинтез фермента в культуре женьшеня, а повышение концентрации внутриклеточной пероксидазы происходило только за счет снижения скорости ее деградации, а в клетках культуры ткани раувольфии - вызывали повышение, как скорости синтеза, так и концентрации пероксидазы в клетках. При изучении влияния низких температур на уровень активности пероксидазы было установлено достоверное повышение активности пероксидазы в клетках раувольфии по сравнению с нормой.

В каллусных культурах женьшеня наблюдали следующую картину: в клетках Р. ginseng происходило резкое падение активности пероксидазы, в селективных штаммах женьшеня и пятилистного - повышение активности пероксидазы. Изменялся и характер уровня кривых активности пероксидазы.

Таблица 4. Обмен пероксидазы в культуре растительных клеток

Индексы Kd, сут1 tl/2, CyT Ks, мкг / г ткани в сутки Е, мкг / г ткани

Rauwolfia serpentina шт. К-27

Контроль 0,139 4,99 67,8 487,8

Кинетин 0,154 4,50 253,1 1643,7

НУК 0,162 4,28 51,5 318,0

влияние высокой температуры

I серия 0,175 3,96 296,9 1696,7

П серия 0,156 4,44 190,2 1219,5

влияние низких температур

I серия 0,093 7,75 177,5 1908,8

П серия 0,136 5,09 168,3 1237,2

Panax ginseng

Контроль 0,163 4,25 1,87 11,5

Panax ginseng LX-5

Контроль 0,190 3,65 9,59 51,0

влияние высокой температуры

I серия 0,215 3,22 16,13 75,0

П серия 0,195 3,55 11,90 61,0

влияние низких температур

I серия 0,120 5,78 8,4 70,00

П серия 0.191 3,63 13,8 72,00

Panax quinquefolius

Контроль 0,193 3,59 8,40 43,5

Обмен каталазы. При исследовании локализации каталазы в культуре ткани женьшеня (P. ginseng) было показано, что фермент присутствует в цитозольной и суммарной мито-хондриальной фракциях клеток культуры. Причем, в процессе роста и старения ткани происходит количественное и качественное перераспределение фермента в этих клеточных компартментах. Установлено, что на 15-е сутки роста клеток более 60% всей активности каталазы локализовано в суммарной фракции митохондрий и пероксисом. В ткани более позднего возраста, наоборот, больше половины суммарной активности каталазы приходится на цитозольную фракцию клеток женьшеня. Оценка кругооборота каталазы показала, что 1 грамм сырой биомассы раувольфии содержит более 800 мкг ферментативного белка, а клетки женьшеня - только около 70 мкг (табл. 5). Скорость синтеза каталазы в клетках раувольфии в 10 раз выше, чем в клетках женьшеня. В культуре раувольфии , выращенной на среде с фитогормонами, наблюдали снижение биосинтеза каталазы de novo и уменьшение содержания внутриклеточного фермеета, что явилось причиной резкого падения активности каталазы в клетках раувольфии змеиной, соответственно, в 2-6 раз (кинетин) и на 35-50% (НУК). Эти данные коррелируют с работами японских ученых, которыми было установлено, что через 2 часа после обработки цито-кинином кукурузы снижается уровень мРНК для ряда ферментов, в том числе и каталазы (Chono J. et al., 1998). Установлено, что при действии высоких и низких положительных температур происходит резкое снижение уровня каталитической активности каталазы. Снижение активности каталазы при действии температуры отмечали для многих куль-

тивируемых растительных клеток (Петровская - Баранова Т.П., 1983). В нашем исследовании было доказано, что снижение уровня активности фермента обусловлено резким падением скорости его биосинтеза и, как следствие, снижением содержания ферментативного белка в растительных клетках. После 24 -х часовой адаптации скорость накопления каталазы в ткани раувольфии змеиной и женьшеня оставалась почти на 50 % ниже контрольных значений.

Таблица 5. Обмен каталазы в культуре растительных клеток

Индексы Kd, сут1 tía, сут Ks, мкг / г ткани в сутки Б, мкг / г ткани

Rauwolfia serpentina шт. К-27

Контроль 0,575 1Д2 468,0 814,0

Кинетин 0,545 1,27 311,0 571,4

НУК 0,756 0,92 302,3 400,0

влияние высокой температуры

I серия 0,733 0,85 425,0 580,0

П серия 0,433 1,56 210,0 476,0

влияние низких температур

I серия 0,455 1,52 104,00 228,6

П серия 0,538 1,29 102,93 191,3

Panax ginseng

Контроль 0,655 1,06 44,50 68,0

влияние высокой температуры

I серия 0,791 0,88 43,70 55,25

П серия 0,420 1,65 26,78 63,8

влияние низких температур

I серия 0,389 1,78 20,60 53,00

П серия 0,492 1,41 29,42 59,80

Общий итог результатов исследований кругооборота СОД, каталазы и перок-сидазы заключается в следующем. Распад старых, выведенных из пула функционирования ферментов в клетках раувольфии змеиной был выше на 15%-28% по сравнению с распадом ферментативных белков в культурах женьшеня. При работе с каллусными культурами P. ginseng LX-5 и Р. quinquefolius было показано, что скорость распада пероксидазы в них возрастала (примерно на 11%) по сравнению с культурой Р. ginseng, что, по-видимому, может быть в частности, связано с меньшей степенью гликозилирования новосинтезированного фермента. Ранее другими авторами было доказано, что ускорение деградации пероксидазы обусловлено степенью гликозилирования белковой глобулы при ее процессинге. (Maranon M.J.R., van Huystee R.B, 1994). Наибольшим временем «полужизни» в изучаемых растительных культурах характеризовались СОД и пероксидаза. При исследовании обмена пероксидазы в клетках суспензионной культуры арахиса было показано, что время «полужизни» пероксидазы составляло 12 суток (Maranon M.J.R., van Huystee R.B, 1994), что почти в 3 раза превышало установленное нами время функционирования фермента в культурах тканей раувольфии змеиной и женьшеня. Время функционирования каталазного белка составляло 1,0-1,1 суток, что было в 3,3 раза

(женьшень) и б раз (раувольфия змеиная) ниже, чем усредненная стабильность общего белка в клетках. Эти данные указывают на высокую степень лабильности ка-талазы из культивируемых растительных клеток, что совпадает с данными ряда авторов, работающих с ферментом из животных тканей. (Kahl G., 1979; Комов В.П., Копылов П.Х., 1981).

Данные, полученные по влиянию фитогормовдв и температуры на обмен фермен-тов-антиоксидантов в культивируемых клетках раувольфии змеиной, позволяют сделать заключение о том, что ауксины и цитокинииы оказывают избирательное воздействие на биосинтез и распад не только общего белка, но и индивидуальных ферментов, в том числе СОД, каталазы и пероксидазы. И, таким образом, по-видимому, способствуют повышению резистентности данной культуры клеток к окислительным процессам в клетках.

Молекулярная гетерогенность ферментов. Общеизвестно, что в адаптации живых организмов к изменяющимся условиям внутренней и внешней среды, в том числе и широкому диапазону температур, огромную роль играет наличие в клетках множествен-

Таблица 6. Молекулярная гетерогенность СОД (контроль)

Раувольфия змеиная шт. К-27

Сут- Активность изоформ,

ки Ус.ед. СОД 460/мл

роста 1- П- Ш-

(Rf=0,62) (Rf=0,52) (Rf=0,41)

7 25.0+5,0 68,5+8,0 46,0+4,0

10 - 100,0+7,0 60,0±3,0

20 - 67,5+3,0 67,5+2,0

30 - 42,5+3,0 42,5+3,0

40 - 91,0+5,0 39,0+4,0

Женьшень (Р. ginseng)

Rf Активность изоформ, %

10-е сутки 20-е сутки 30-е сутки

0,29 24,0+0,2 - -

0,35 - - 26,3+0,1

0,43 22,0+0,1 32,2+0,5 -

0,54 28,0+0,4 19,4+0,1 -

0,61 26,0+0,1 27,4+0,2 36,8+0,4

0,80 - 21,0+0,1 36,8+0,3

Таблица 7. Молекулярные формы пероксидазы в клетках

раувольфии змеиной шт. К-27 (контроль)

Rf Активность изоформ,%

Юсут 20сут ЗОсут 40 сут

1 2,0+0,03 3,0+0,03 4,0+0,2 5,0+0,1

0,06 77,1+1,1 75,8+1,3 76,0+2,2 49,39+0,7

0,10 16,6+0,2 18,8+0,3 19,0+0,2 15,8+0,4

0,12 2,0+0,03 2,0+0,01 0,53+0,01 29,1+0,3

0,16 2,3+0,02 1,7+0,01 2,5+0,03 4,1+0,05

0,20 - - 0,3+0,01 0,5+0,01

0,28 1,7+0,03 1,1+0,01 1,2+0,01 0,8+0,03

0,30 0,3±0,01 0,51+0,01 0,52+0,01 -

0,34 - - п 0,3+0,0)

ных молекулярных форм ферментов. При исследовании молекулярной гетерогенности изучаемых ферментов было показано, что в культивируемых растительных клетках супер-оксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза представлены множественными молекулярными формами (табл. 6-9). Эти результаты согласуется с данными литературы, так как практически все известные в настоящее время супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы при электрофорезе в полиакриламидном геле или изоэлектрофокусировании удается разделить на несколько молекулярных форм. (Gaspar Th. et al., 1982; Bamforth С. W., 1983;

Таблица 8. Молекул ирная гетерогенность исроксидазы в культуре ткани женьшеня (Ранах ginseng LX-5)

(контроль)

Сутки роста Относительная активность изоформ пероксидазы, %

Rf 0,01 0,02 0,06 0,09 0.12 0,15 0,19 0,22 0,25 0,29 0,31 0,33 0,35 0.38 0,4) 0,43 0,46 0,45 0,54 0,58 0,60 0,62 0,64 0,66 0,68

10-е 1 2 3 4 31 29 81 75 3,4 4,3 1,1 2,8 11 0,5 1,3 0.5 12 3,4 М 2,9 3,4 1,9 2,8 12 1,3 1,9 3,4 1,9 2,8 1Л 0,8 8,1 U 2,8 0,5 0,8 3,4 0,5 0,8 3,4 0,5 1,3 1,3 1Д 1.1 1.1 2,8 16 9,4 1Д 1.1 16 9,2 0,9 1,9 1,9 2,8 9 Q,S 1.9

20-е 1 2 3 4 26 26 42 50 1.4 14 2.5 2,8 14 1,0 2,8 3,0 9.3 3.4 7,0 8,4 3,4 2,9 6,4 7,4 3,4 2,7 3,1 2,7 6.4 3.5 1,7 9,5 2,4 гх 5,9 1,7 11 7,8 1.7 13 2,8 2,8 2,1 2,5 2,5 2,2 15 6,4 2,3 2,2 15 4,2 1,8 4,2 1,1 2,2 5,8 1.5 4,1

30-е 1 2 3 4 67 60 16 48 1.0 14 2,5 0,9 9.7 2,3 2,7 8,5 3,4 2,2 9,3 12 2,2 3,0 2,7 4,1 9,3 2,7 2,1 2,7 2,7 7.5 1.6 4,0 3,0 0,9 2,7 1,6 3,1 14 1,6 6,4 2,7 V 2,7 2,4 2,4 0,9 6.3 4.4 3,6 2,3 6,3 2,7 2,3 4,0 4.0 4,6 2,6 3,0 4,0

40-е 1 2 3 4 63 73 31 46 0,5 24 2,3 \л 14 0,9 2,6 2,9 4,2 1,2 6,8 12 1,2 3,8 3,4 2,3 3,3 3,8 0,5 3,8 3.4 6,3 1.5 5.0 2.1 1,2 5,7 1,5 0,5 7,2 1,5 1,7 2,6 2,6 2,0 2,3 2,3 1,2 8,0 2,2 2,3 2,2 8,01.5 1,8 3,9 3,8 U 2,0 1.5 3,8

Примечание : 1 - Р. ginseng, 2 - Р. ginseng LX-5, 3 - Р. ginseng LX-13, 4 - Р. quinquefolius

Табл. 9. Молекулярная гетерогенность катал азы в культуре клеток (контроль)

Женьшень (Panas ginseng)

Сутки роста Активность изоформ каталазы, ммоль/ мл в мин

1 2 3 4 5 6 7 8

5 - - 20,3+ 0,6 12,2+ 0,3 - - 6,5+ 0,1 -

10 - - 13,6+ 0,2 9,9+ 0,3 - 8,7+ 0,4 -

15 6,6+ 0,1 10,3+ .0,4 4,2+ 0,2 - - 8,1+ 0,3 - 5,6+ _0,1

20 - 16,1+ А5 - 10,1+ 0,4 - 11,6+ 0,3 9,7+ 0,2

25 - - 28,8+ 1,0 - - - - 10,6± 0,9

30 - - 29,0+ 0,9 - - - - 10,7+ 0,7

40 - - - - 8,8+ 0,2 13,7+ 0,8 - 16,2± 0,6

Раувольфия змеиная (Rauwolfia serpentina) (шт. К-27) шт.К-47)

Изофома (Rf) Активность изоформ,%

Сутки роста каллуса

110-е 220-е 330-е 440-е

1-(7Д) - - 36,6 ±0,7 -

2-(3,6) - - - 76,5 ±1,2

4-(2,5) - - 63,7 ±0,9 -

5-(2,1) 62,5 +0,3 - - -

6-(1,7) - 61,9 ±0,9 - 23,5 ±0,5

7-(1,4) 22,0 +0,4 - - -

9 -(0,7) 15,5 ±0,5 20,6 ±0,7 - -

10-(0,3) - 17,5 ±0,4 - -

Изоформа (Rf) Активность изоформ,%

Сутки роста каллуса

10-е 20-е 30-е 40-е

1 - (6,8) 20,1 ±0,9 19,7 ±0,6 14,0 +0,3 -

2 - (4,3) 14,3 ±0,5 - - -

3-(3,3) 11,9 ±0,3 37,2 ±0,7 61,0 ±1,3 51,2 ±0,9

4-(2,1) 49,7 ±1,2 25,2 ±0,7 17,0 ±0,5 5,6 ±0,3

5-(1,8) - - - 8,9 ±0,2

6-(1,5) - - - 19,9 ±0,3

7 -(0,9) - - - 7,4 ±0,4

8 -(0,6) - 13,3 ±0,7 4,0 ±0,1 7,0 ±0,5

9 - (0,3) 4Д ±0,1 4,6 ±0,1 4,0 ±0,2 -

Яаска В., 1984; Reddy S., Vijaya К. et al., 1984; Eising R.et al., 1990; Weiting N.et al.,1990; Xy У., van Huystee R.B., 1991; Racchimilvia L. et al., 1993; Racchimilvia L., Terragna C., 1993). Установлено, что в процессе роста культивируемых клеток происходит перераспределение активности ферментов между отдельными их изоформами. Кроме того, по мере роста и развития исследуемых каллусов происходит изменение качественного состава изоферментных спектров ферментов-антиоксидантов, а именно или увеличение массовой доли медленно мигрирующих изоформ (каталазы раувольфии и женьшеня), или увеличение массовой доли быстро мигрирующих изоформ ( пероксидаза и СОД ткани женьшеня). Активация СОД при действии фитогормонов позволила обнаружить 1-ю (наиболее электрофоретически подвижную) изоформу, до этого обнаруживаемую только на 7- сутки роста каллусов. При воздействии высоких и низких положительных температур наблюдали усложнение изоферментных спектров СОД и появление целого ряда новых, ранее не идентифицированных, в основном быстро мигрирующих к аноду изоформ фермента, что согласуется с литературными данными, полученными для других растительных объектов.

Изоферментые спектры пероксидазы в клетках раувольфии и женьшеня при действии высоко- и низкотемпературных воздействий претерпевали существенные изменения: массовая доля медленно мигрирующих изоформ увеличивалась, а быстро мигрирующих к аноду, наоборот, уменьшалась. Более глубокие изменения молекулярной гетерогенности, как правило, происходили через 24 часа после воздействия температур.

При действии высоких температур наблюдали не только перераспределение активности между отдельными молекулярными формами каталазы, но и качественные изменения ее изоферментного спектра : исчезали быстро мигрирующие к аноду изоформы фермента, как в штамме К-27, так и штамме К-47. Изоферментный спектр каталазы в каллусной культуре женьшеня, подвергнутых тепловой обработке, характеризовался усложнением спектра изоформ фермента, что, по-видимому, обусловлено метаболическими потребностями клетки.

Таким образом, в данном исследовании было установлено, что в процессе роста и развития каллусных культур раувольфии змеиной и различных видов женьшеня происходят качественные и количественные изменения изоферментных спектров, изучаемых нами ферментов-антиоксидантов - СОД, каталазы и пероксидазы. Нельзя с уверенностью говорить о том, что обнаруженные нами молекулярные формы этих ферментов являются истинными изоэнзимами, т.е. имеют детерминированные различия в первичной структуре, поскольку специальных исследований не проводилось. Однако можно предполагать, что выявленные изменения в количестве и удельной активности отдельных молекулярных форм СОД, каталазы и пероксидазы отражают проявление адаптационных способностей клеток каллусной ткани различных штаммов раувольфии змеиной и женьшеня как в ходе их культивирования, так при изменении условий внешней среды. Практические аспекты работы. На основании проведенной работы нами был разработан лабораторный регламент выделения высокоочищенной СОД из культур растительных тканей, проведена оценка острой токсичности препарата и доклинические фармакологические испытания данной субстанции*, согласно «Методическим рекомендациям Фармакологического Комитета по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических средств».

*Фармакологические испытания были проведены на базе отдела фармакологии НИЙЭМ РАМН (руководитель чл.-корр. РАМН, заслуженный деятель науки РФ, профессор Сапронов Н.С.)

Установлено, что ЛД;о растительной СОД для мышей равна 194 мг / кг. Препарат СОД в дозах 185 мг/кг массы тела животных не оказывал токсического действия.

Сравнительный анализ противовоспалительной активности исследуемого препарата, на модели каррагенинового отека, и стандартов (бутадион, вольтарен) показал большую широту терапевтического эффекта и безвредность изучаемой сравнительной СОД.

Для более детальной характеристики противовоспалительного действия препарата изучали его влияние на проницаемость сосудов брюшной полости. Показан выраженный антиэкссудативный эффект у исследуемого препарата.

Препарат растительной СОД проявлял выраженную анальгезирующую активность в дозах 5, 10 и 25 мг / кг (по изменению болевой чувствительности у мышей при химическом раздражении).

Конъюкгивадьная проба и оценка анафилактической активности (активная кожная анафилаксия) различных партий препарата СОД показали отсутствие аллергезирующих свойств. Так, в опытной группе, получавшей внутримышечно препарат в дозе 1/100 ЛД50, у 80% животных полностью отсутствовали признаки воспалительной реакции в месте введения, в тоже время в контрольной группе у 80% животных развивался обширный некроз.

Таким образом, полученные данные подтверждают перспективность применения препарата растительной СОД в качестве противовоспалительного средства.

По результатам работы имеется патент (No 2136300 от 10.09.99г., приоритет от 04.11.97 г.) на «Способ выделения активного комплекса из биомассы клеток женьшеня».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Общеизвестно, что обмен веществ представляет собой сложную систему внутриклеточных ферментативных реакций. При возникновении неблагоприятных условий внешней среды живая система стремится к сохранению целостности и направленному приспособлению. Клетка является саморегулирующей системой и приспосабливается к изменениям во внешней среде путем быстрой модификации функций регуляторных ферментов Для выживания в неблагоприятных условиях метка использует регуляторный уровень, сопряженный с активацией и репрессией генов.

Одной из самых первых неспецифических ответных реакций клеток на биотический и абиотический стрессы, в том числе высоко и низкотемпературные шоки, является генерация в них активных форм кислорода. Наиболее значительное их образование может происходить в клеточных органеллах, генерирующих энергию: митохондриях и хлоропластах (при переносе электронов по электронтранспортным цепям), дополнительным источником прооксидантов выступают ферменты микросомальной электронтранспортноЙ цепи (при работе микросомальных монооксигеназ), большие количества перекиси водорода генерируются в пероксисомах. Интенсификация образования прооксидантов происходит также при активации оксидаз, локализованных в плазматической мембране и цитоплазме и, как полагают, связанных с рецепторами, передающими сигналы клетке из вне. (Bowler С. et al., 1992; Pulvis A.C. et al., 1993; Prasad Т.к. et al., 1994; Doke et al., 1994; Baker C. J., Orlandi E.W., 1995; Dat J.F. et al, 1998; Максютова H.H., 1998).

В процессе эволюции у аэробов для защиты от прооксидантов выработались специализированные ферментативные антиоксидантные системы. Для ферментов антиоксидантной системы характерно согласованное действие. Например, такие ферменты-антиоксиданты, как СОД, каталаза и пероксидазы работают, как правило, в комплексе. (Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К.,- 1993). Ферментативные антиоксиданты, как известно, отличаются высокой специфичностью и характеризуются различной клеточной и органной локализацией, а также использованием в качестве катализаторов металлов (Cu, Zn, Fe, Мп). Кроме того, характерной особенностью данных ферментов является наличие множественных молекулярных форм, отличающихся по ряду физико-химических свойств, локализации и др. Полиморфизм особенно характерен для пероксидазы и по мнению многих авторов пероксидаза представляет собой «семейство» различающихся генетически ферментов, несущих различные функции in vivo, но могущие проявлять перекрывающуюся слецифичность к субстратам. (Андреева В.А., 1988). По аналогии с выше изложенным, можно предположить, что, по-видимому, все три фермента, работающие, как известно, в комплексе (СОД, каталаза и пероксидаза) могли произойти от одного древнего предшественника. В дальнейшем в результате эволюции, по-видимому, произошло образование «семейства» белков, выполняющих сходные функции в клетке. Примером, косвенно подтверждающим это предположение, может служить тот факт, что фермент - каталаза проявляет не только каталазную, но и пероксидазнуго активность, которая обеспечивает специфические окислительные процессы с участием перекиси водорода, приводящие к образованию важных метаболитов. (Голиков С.Н. и соавт., 1984). Относительно Си^п-СОД также известно, что при pH > 9,0 в присутствии перекиси водорода она действует как пероксидаза. Установлено, что «медь-связанные гидроксильные радикалы» - СОД2 - ОН, которые генерируются в реакции между ферментом и перекисью водорода, окисляют такие анионные лиганды, как формат, азид и нитрат. (Sankarapandi S., Zweier J.L, 1999; Goss S.P. et al., 1999; Zhang H. et af., 2000; Kim Y.S., Han S., 2000). В свою очередь пероксидазы способны проявлять и оксидазную активность, катализируя окисление целого ряда соединений (гидро- и нафтохиноны, индолил-3-уксусная кислота, НАД(Ф)Н и другие соединения) с участием молекулярного кислорода. (Андреева В. А., 1988; Zheng X., van Huystee R.B., 1997). Предположение об эволюционно образовавшимся «семействе» ферментов подтверждается некоторыми нашими данными, в частности, близкими схожими ответами на температурный стресс.

При анализе данных по обмену СОД и каталазы в растительных клетках при воздействии на них неблагоприятных факторов внешней среды установлено снижение биосинтеза этих ферментов. Известно, что перевод растительных тканей и органов в культуру является очень сильным стрессовым фактором, т.е. культивируемые растительные клетки в процессе их роста находятся в состоянии постоянного стресса. (Бутенко Р.Г., 1975). Общую интенсификацию метаболизма в культурах тканей, по-видимому, можно объяснить следующим образом: в каллусных и суспензионных культурах происходит нарушение механизмов тканевого контроля развития и клетки лишены контакта друг с другом и, поэтому, вынуждены сами обеспечивать себя всем необходимым, так как находятся в состоянии «перманентного» стресса. Поэтому интенсификацию метаболизма в данном случае следует рассматривать, как нормальную адаптационную приспособительную реакцию клеток к изменившимся условиям внешней среды. Ранее нами было также показано, что в каллусных культурах женьшеня и,

особенно, раувольфии змеиной активность всех трех изучаемых нами ферментов находится на достаточно высоком уровне, и превышают таковые на порядок по сравнению с интактным растением. (Орехова И.А., ¡997). Аналогичное повышение скорости биосинтеза пероксидазы наблюдали и при переводе арахиса в культуру (Chibbar R.N., van Huystee R.B., 1986). Из выше изложенного следует, что первичный стресс приводит к индукции биосинтеза исследуемых ферментов-антиоксидантов.

Что касается вторичного стресса (воздействие высоких или низких температур) на каллусные растительные культуры, то он, как установлено в нашем исследовании, .. сопровождался снижением скорости биосинтеза СОД и каталазы. Известно, что растительная ткань реагирует в ответ на воздействие различных неблагоприятных внешних факторов среды, в том числе различных биологических и химических агентов сходным образом, что свидетельствует об универсальности некоторых защитных реакций живых организмов на воздействие окружающей их среды. (Андреева В. А., 1988; Савич ИМ., 1989; Аверьянов A.A., 1991; Ломоносова Е.Е. и соавт., 1992, 1993; Baker С. }., Orlandi E.W., 1995; Пасечник ТД 1998). По-видимому, в результате эволюции, природой было отобрано сравнительно небольшое число биохимических механизмов, которые запускаются в растительных клетках, и используются ими при возникновении практически любых неблагоприятных условиях внешней среды. Причина однотипности (неспецифичносги) ответа растительного организма на абиотические и биотические стрессы, как полагают, заключается в том, что в ходе эволюции возникла и закрепилась «профилактическая» анпшатогенная реакция на ослабление растений при обезвоживании, повышении или понижении температуры и т.п., которое может привести к более легкому инфицированию растений патогенами. (Максютова H.H., 1998). Усиление продукции прооксидантов в ответ на заражение наблюдается у различных видов растений и при разных по природе инфекционных процессах. (Веселовский В.А., 1982; Аверьянов A.A., 1991; Doke et al., 1994). Установлено,-что при заражении растений в клетках устойчивого к инфекциям ввда падение активности СОД способствует большей активации кислорода, а в клетках восприимчивого к инфекциям растения, наоборот, активность СОД возрастает. (Чигрин В.В., 1988). Поэтому генерация активных форм кислорода растениями, по-видимому, представляет собой одно из проявлений их устойчивости к различным патогенам. В частности, супероксидные радикалы являются одним из факторов лигнификации для создания механического барьера на пути инфекции, а также служат эндогенным ивдуктором синтеза фитоалексинов, этилена и др. В связи с этим, усиление продукции прооксидантов в зараженных клетках и тканях устойчивых растений, способны подавлять развитие паразита как непосредственно, в качестве повреждающих агентов, так и косвенно, участвуя в других иммунных реакциях. (Аверьянов А. А, 1991).

Установленное нами и рядом других исследователей повышение активности и содержания пероксидазы лри различных стрессах, по-видимому, связано с тем, что пероксидазам растений свойственна уникальная метаболическая полифункциональность. Так как помимо выполнения своей основной функции - защиты клеток от токсичных перекисных радикалов, пероксидаза участвует во многих других процессах. В частности, она участвует в защитных механизмах при заражении растений патогенами, так как образующиеся при окислении фенолов токсичные продукты ингибируют рост и развитие возбудителя болезней у растений. (Gaspar ТЪ. et al., 1982; Аверьянов A.A., 1991).

Обобщая выше изложенное, необходимо отметить, что в настоящее время в литературе накоплен очень незначительный экспериментальный материал и поэтому нет ни теоретического обоснования, ни однозначного и ясного ответа на принципиальный вопрос, каким образом стрессовые факторы влияют на биосинтез ферментов

антиоксидантной системы. В данном исследовании нам удалось более детально и предметно провести как экспериментальную работу, так и интерпретацию полученных данных. Особый интерес вызывают данные показывающие, что биосинтез СОД и каталазы, в отличие от синтеза de novo пероксидазы, подавляется при воздействии на растительные клетки высоких и низких температур. По-видимому, как показывают приведенные выше литературные данные, выявленный эффект характерен для различных организмов при воздействии на них неблагоприятных факторов биотической и абиотической природы. Хотя существует вероятность и того, что при переводе в культуру растительные клетки могут частично терять способность к полноценной антиоксидантной защите от свободных кислородных радикалов («окислительному стрессу»).

Таким образом, анализ полученных результатов и данных литературы позволяет сделать заключение о том, что исследуемые ферменты-антиоксиданты (СОД каталаза и пероксидаза) способны адаптивно менять свою активность под влиянием различных сдвигов окружающей среды (температура, водный режим, гормоны, патогены и др,). При этом в растительных организмах на изменение окружающей среды, для поддержания метаболизма кислорода на оптимальном для клеток уровне, клетками используются несколько путей приспособления к изменяющимся температурным условиям, например, изменение некоторых физико-химических свойств ферментов-антиоксидантов, изменение их изоферментных спектров, а также изменение скоростей биосинтеза и распада СОД каталазы и пероксидазы.

Результаты наших исследований, а также имеющиеся в настоящее время литературные данные, свидетельствуют о том, что тепловой шок и низкие температуры оказывают влияние, как на общий спектр синтезированных белков, так и на интенсивность синтеза отдельных белков. По-видимому, избирательный синтез белков в условиях неблагоприятной температуры является следствием полного или частичного переключения программ роста и развития, которые функционируют при физиологически нормальных температурах, на генетические адаптационные программы, которые, в конечном итоге, и обеспечивают формирование повышенной устойчивости и жизнедеятельность клеток в новых температурных условиях. Дальнейшее изучение молекулярных основ функционирования систем клеточного ответа на действие неблагоприятных температур внешней среды у растений может служить теоретической основой для разработки систем адаптации растений к различным неблагоприятным факторам.

ВЫВОДЫ

1. Расчет параметров обмена внутриклеточного белка в различных штаммах каллусных культур раувольфии змеиной и женьшеня позволил установить, что белоксинтезирующая способность клеток каллусной культуры раувольфии змеиной в 2-2,5 раза превышает таковую в клетках различных видов и штаммов женьшеня.

2. Биосинтез полипептидных цепей СОД осуществляется как на свободных (51%), так и мембраносвязанных (49%) полирибосомах. Доля СОД-синтезирующих рибосом составляет 1,5% от общей фракции полирибосом культивируемых растительных клеток раувольфии змеиной.

3. Каталаза в культуре ткани женьшеня локализована в пероксисомах и в цитозольной фракции клеток. По мере роста, развития и старения каллуса происходит перераспределение активности фермента, а именно, в молодых клетках более 60% каталазы находится в суммарной фракции митохондрий и пероксисом, а в стареющей

ткани более 50% ферментативного белка сосредоточено в цитоплазме растительных клеток.

4. Скорость накопления новосинтезированных СОД каталазы и пероксидазы в клетках культуры раувольфии змеиной в несколько раз превышают таковую в

■ культивируемых клетках различных штаммов женьшеня.

5. Цитокигагаы увеличивают скорость биосинтеза и концентрацию СОД и . пероксидазы, но снижают накопление каталазы в цитоплазме клеток раувольфии.

Ауксины снижают содержание каталазы и пероксидазы в культивируемых клетках за счет ингибирования скорости их биосинтеза и в то же время повышают скорость новообразования СОД.

6. Комплексное исследование влияния различных температур на белоксинтезирующую способность и обмен трех ферментов-антиоксидантов (СОД каталазы и пероксидазы) в каллусных культурах раувольфии и женьшеня позволило установить, что при действии низких температур скорости биосинтеза общего белка в растительных клетках достоверно снижаются; при воздействии теплового шока скорость биосинтеза внутриклеточного белка в ткани раувольфии змеиной увеличивается на 36%, а в каллусе женьшеня - снижается на фоне повышения скорости его распада в 1,5 раза; скорость биосинтеза СОД и каталазы в исследуемых культурах достоверно снижалась, а пероксидазы, напротив, увеличивается как при воздействии низко-, так и высокотемпературного шоков.

7. Изменение протеиновых спектров, а также молекулярной гетерогенности исследуемых ферментов антиоксидантной защиты отражает проявление адаптационных способностей клеток каллусных растительных тканей как в ходе их культивирования, так и при различных внешних воздействиях:

а) при температурном воздействии в протеиновых спектрах клеток женьшеня было выявлено появление низкомолекулярных белков с молекулярной массой около 14 кДа на фоне снижения массовой доли белков других молекулярных масс (высокая температура) или значительного усиления группы полипегггидов с молекулярными массами 50 кДа (низкие положительные температуры).

б) при воздействии высокой температуры в клетках раувольфии змеиной была идентифицирована дополнительная белковая зона с молекулярной массой 17 кДа, увеличение содержания полипегггидов 96-98, 70, 20 и 14 кДа, а также снижение доли белков 22 кДа. В то же время низкие температуры повышали массовую долю полипептидов 1 ЮкДа, 98 кДа, 67 кДа, 55 кДа и 50 кДа, 18 кДа.

в) при действии высоко- и низкотемпературного шоков в клетках раувольфии и женьшеня увеличивалась массовая доля медленно мигрирующих изопероксидаз, а быстро мигрирующих ее изоформ, наоборот, уменьшалась;

г) при воздействии различных температур происходило усложнение молекулярной гетерогенности СОД и появление целого ряда новых, в основном быстро мигрирующих к аноду изоформ фермента;

д) при действии высоких температур в каллусных культурах женьшеня и раувольфии установлено перераспределение активности между отдельными молекулярными формами каталазы, а также исчезновение быстро мигрирующих к аноду изоформ фермента.

8. Создан лабораторный регламент на получение препаратов СОД из культувируемых растительных клеток женьшеня и раувольфии змеиной. Проведенные доклинические испытания полученной субстанции показали широкие возможности и перспективность применения исследуемого препарата в качестве противоспалительного лекарственного средства в медицинской практике.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

1. Study of enzyme degradation in eel! // 13th Intern. Congress of Biochemistry. Amsterdam. Netherlands. 1985. P. 523 (with Komov V.P., StrelkovaM.A., Suschenko S.I.).

2. Turnover of individual proteins proteins in mammalian, plant and bacrerial ceels // 13th Intern. Congress of Biochemistry. Amsterdam. Netherlands. 1985. P. 524 (with Komov V.P., Strelkova M.A., Suschenko S.I., Solovjeva N.V.).

3. Выделение и очистка альдолазы из культуры ткани раувольфии змеиной // Биохимия. 1986. Т.51. Вып.7. С. 1180-1185 (совместно с Комовым В.П. и Алехсейчух Н.В.).

4. Изучение и перспективы использования СОД выделенной из микробных и растительных клеток // 5 Всесоюзн. Конф. «Методы и анализ биохимических раективов». Рига. 1987. С.97. (совместно с Комовым В.П., Воробьевой Н.А., Рахманинов Т.Ф., Карухнишвили Н. А.).

5. Chromatographyc isolation of primary and secondary metabolites from plant cell culture // I. Chromatography. 1988.V.440. P. 53-64 (with Manoilov S.E., Komov V.P., Strelkova M. A., Samolin Ju. A, Nikolaeva N.A.).

6. Исследование активности и физико-химических свойств каталазы в культуре ткани Panax quinquefolius L. // Мевдународн. Конф. «Биология культивируемых клеток и биотехнология». Новосибирск. 1988. T.I. С.34 (совместно с Комовым В.П., Батыгиной Е.Н).

7. Гормональная регуляция ферментов в культуре ткани Раувольфии змеиной // Междунар. Конф. ««Биология культивируемых клеток и биотехнология». Новосибирск. 1988. T.I. С.36 (совместно с Комовым В.П., Воробьевой Н. А.).

8. Выделение и очистка некоторых ферментов из культуры рвастительных тканей при помощи биоаффиной хроматографии // Сборник 1 Всесоюзн. Симпозиума «Препаративная хроматография физиологически активных веществ на полимерных сорбентах». Л. 1988. С.17-18 (совместно с Комовым В.П, Стрелковой М.А., Самолиным Ю.А., Чернобородовой Л.С.).

9. Способ выделения супероксиддисмутазы // Авт. свид. No 1540207. 1989 (совместно с Комовым В.П., Воробьевой Н. А).

10. Активность каталазы в процессе роста каллусной культуры Panax quinquefolis L. // Физиология растений. 1989. Т. 36. С.159-164 (совместно с Комовым В.П., Батыгиной Е.Н).

11. Исследование каталазы из каллусной культуры ткани женьшеня // Всесоюзн. Конф. «Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии и фармации». Л. 1989. С. И (совместно с Комовым В.П., ХонПхеИлл).

12. Выделение супероксиддисмутазы и аймалина из культуры ткани раувольфии змеиной // Всесоюзн. Конф. «Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии и фармацию). Л. 1989. С. 12 (совместно с Комовым В.П., Чернобородовой Л.С., Воробьевой Н.А).

13. Study of primary metabolites from callus culture of Panax // 5 Intern. Conference on chemistry and biotechnology of biologically active natural prodacts. Varna. Bulgaria. 1989. V.4. 498-502 (with Komov V.P., Chon Pche III, Batugina E.N.).

14. Новый способ выделения СОД // П конф. «Изобретательство и рационализация в медицине и медицинской промышленности». Л. 1989. С. 139-140 (совместно с Комовым В.П., Воробьевой Н.А).

15. Pharmacological action and metabolism of the cultivated cells of Panax ginseng // lsl Intern. Conf. On traditional rehabilitation medicine. Deijing. China. 1989. P. 3-5 (with Komov V.P., Chon Phe 111, Slepjan L.I.).

16. The influence heat shock on the biosynthesis and stability of catalase in callus culture Panax ginseng // YII Intern. Congress on Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam. Netherland. 1990. P. 299 (with Komov V.P., Chon Pche 111).

17. Biosynthesis and stability of some enzymes in the dynamics of the growth of Rauwolfia serpentina // 20th Meeting of the FEBS. Budapest. Hungary- 1990. P. 285 (with Komov V.P., Samolin Ju.A, Vollosovich A.G.).

18. Выделение и исследование некоторых ферментов из культуры ткани раувольфии змеиной // Конф. «Современные направления биотехнологии». М. 1991. С.107 (совместно с Комовым В.П, Самолиным Ю.А, Воллосовичем А.Г.).

19. Влияние экстремальных воздействий на состояние пероксидазы в различных штаммах культуры ткани женьшеня // П Всеросс. Симпозиум « Новые биотехнологии растений». Пущино. 1993. С. 147 (совместно с Комовым В.П., Троицкой Л.А., Слепян Л.И.).

20. Изучение пероксидазы в различных штаммах каллусной культуры женьшеня II Ш Всеросс. Симп. Общества физиологов растений 1993. СПб. Т. 2. С.219 (совместно с Комовым В.П., Троицкой Л. А).

21. Сравнительная оценка синтеза и активности растительной и животной каталазы // Ш Всеросс. Симпозиум « Новые биотехнологии растений». Пущино. 1993. С. 131 (совместно с Комовым В.П., Хон Пхе Илл, Стрелковой М. А.).

21. Исследование каталазы в процессе роста культуры ткани раувольфии змеиной // Ш Всеросс. Симпозиум « Новые биотехнологии растений». Пущино. 1993. С. 178 ( совместно с Комовым В.П., ЦурканИ.А., Николаева Л. А.).

22. Выделение и очистка пероксидазы из каллусной культуры ткани женьшеня // Всеросс. Конф. «Химия и технология лекарственных веществ». С-Пб. 1994. С. 31 (совместно с Комовым В.П., Троицкой Л. А).

24. Супероксиддисмутаза из растительных клеток - перспективы использования в медицине // П Росс. конф. «Человек и лекарство». М. 1995. С.236 (совместно с Комовым В.П., Стрелковой М.А.).

25. Препараты растительной СОД - новое эффективное противовоспалительное средство // Научно-практическая конф. « Современное состояние и перспективы научных исследований в области фармации». Самара. 1996. С. 225-226 (совместно с Комовым В.П., Стрелковой М.А.).

26. Выделение и очистка некоторых биологически активных веществ из культур растительных клеток П Всеросс. Симп. « Биосепарация -96». Теория и методы выделения и суперочистки биологически активных веществ. С-Пб. 1996. С. 14-15 (совместно с Комовым В .П., Троицкой Л . А.).

27. New test-systems for the estimation of toxicity of some chemical substrances in pharmaceutical manufactures // Intern, ecological congress. Russia. Voronezh. 1996. P. 17-18 (with Komov V.P., Strelkova M.A.).

28. Активность и молекулярная гетерогенность пероксидазы в различных штаммах культуры женьшеня И Раст. ресурсы. 1997. Т. 33. No 1. С. 104-112 (совместно с Комовым ВЦ, Троицкой М.А ).

29. Comparative estimation of peroxidase synthesis and its properties in different Ginseng callus culture // Intern, wopr-shop on peroxidase biotechnology and application. St-Petersburg. Russia. 1997. P. 55 (with Komov V.P., Troitskaja L.A).

30. Влияние фитогормонов на метаболизм ферментов антиоксидазной системы в культуре ткани раувольфии змеиной YII Междунар. Конф. «Биология клеток растений in

vitro, биотехнология и сохранение генофонда". Москва. Россия. 1997. С. 25 (совместно с Комовым В.П., Ореховой И.А.).

31 Влияние фитогормонов на активность и молекулярную гетерогенность супероксиддисмутазы в процессе роста халлусной культуры Rauwolfia serpentina Benth. П Раст. ресурсы. 1997. Т. 33. Вып. 4. С. 86-93 (совместно с Комовым В.П, Воробьевой H.A.).

32. Peroxidase from callus culture Panax ginseng LX-5 II Plant Peroxidase Newsletter. 1997. No 9. P. 6-12 (with Troitskaja L.A., Komov V.P.).

33. Супероксидаза - эффективный биоантиоксидант растительного происхождения // Y Росс. Конгресс «Человек и лекарство». 1998. С. 372 (совместно с Комовым В.П, Стрелковой М. А.).

34. Исследование ацетилаймалин эстеразы - ключевого фермента биосинтеза аймалина // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. № 4. С. 359-364 (совместно со Смирновой М.Г, Комовым В.П.).

35. Выделение и очистка пероксидазы из каллусной культуры ткани Panax ginseng LX-5 //Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. № 5. С. 495-498 (совместно с Троицкой ЛА, Комовым В.П.).

36. Выделение и очистка супероксидазы из каллусной культуры ткани Panax ginseng // Межд. Конф. "Фармация в XXI веке: инновации и традицию). С-Пб. 1999. С.21 (совместно с Комовым В.П.).

37. Культивирование клеток Rauwolfia serpentina на крахмалсодержащих- средах // Раст. ресурсы. 1999. Т. 35. No 2. С. 25-29 (совместно с Комовым В.П, Мещеряковым HB.).

38. Peroxidase turnover in Ginseng strains under standart conditions and temperature stress // J. Plant. Physiol. 1999. V. 155. P. 281-284 (Troitskaja L. A, Komov V.P.).

38. Способ выделения активного комплекса из культивируемых растительных клеток» // Патент No 2136300 от 10.09.99г., приоритет от 04.11.97 г. (совместно со Слепян Л.И, Троицкой Л.А, Пилипенко Е.И. и др.).

39. Активность и молекулярная гетерогенность пероксидазы в процессе роста каллусной культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. штамм К-27 И Раст. ресурсы. 2000. Т. 36. Вып. 1:С. 81-85.

40. Активность и молекулярная гетерогенность каталазы в процессе роста 2 штаммов культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. // Раст. ресурсы. 2000. Т. 36. Вып. 1. С. 77 - 81 (совместно с Комовым В.П, Ореховой И. А ).

41. Влияние обработки высокой и низкой положительными температурами каллусной культуры Panax ginseng на уровень активности и молекулярную гетерогенность супероксиддисмутазы в процессе ее роста//Раст. ресурсы. 2000. Т. 36. Вып. 1. С. 71 -77 (совместно с Комовым Ю.В.).

42. Влияние фитогормонов на белоксинтезирующую способность культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. Лг°1 (в печати ). (совместно с Комовым В.П.).

43. Последовательное выделение супероксиддисмутазы и аймалина из культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 2 (в печати ). (совместно со Смирновой М.Г, Комовым В.П.).

АФК

АТФ

ДНК

мРНК

рРНК

тРНК

Е

Kd

Ks

tlJ2

ТХУ

Трис

ЭП/ЭПР

Мх

Хл

ИУК

2,4-Д

Цк

АБК

Гк

ПААГ

Km

Vmax

БШ1

Cor-белки

Rauwolña serpentina

Panax ginseng

Panax quinqefolius

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

• активные формы кислорода (прооксидакты) аденозинтрифосфат дезоксирибонуклеиновая кислота матричная рибонуклеиновая кислота

■ рибосомальная рибонуклеиновая кислота транспортная рибонуклеиновая кислота концентрация фермента

■ константа скорости деградации/распада константа скорости синтеза

- время функционирования («полужизни»)

- грихлорухсусная кислота

- трис-(оксиметил)-аминометан

- эндоплазматический регикулум

- митохондрии

- хлоропласта

- индолилуксусная кислота

■ 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

■ цитокинины

■ абсцисовая кислота

■ гиббереллиновая кислота

■ полакриламидный гель

• константа Михаэлиса

максимальная скорость ферментативной реакции

■ белки теплового шока

белки, индуцируемые низкими температурами раувольфия змеиная (R. serpentina, р. змеиная) женьшень настоящий (Р. ginseng, женьшень) женьшень пятилистный (P.quinquefolius)

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кириллова, Надежда Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Л.Антиоксидантная система клеток, биологические функции

1.2. Биотехнология культуры клеток растений

1.3. Метаболизм белка в растениях

1.3.1. Синтез и обновление белков в растительных клетках

1.3.2. Модификация программы белкового метаболизма при температурном воздействии

1.4. Гормоны растений

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ферменты антиоксидантной системы культивируемых растительных клеток"

Актуальность темы. Метаболизм кислорода в аэробных клетках сопровождается постоянным образованием токсичных реакционноспособных свободно - радикальных продуктов. В результате эволюции у аэробов возникли защитные механизмы, к которым относятся специализированные ферментные и неферментные антиоксидантные системы. Главную роль в защите от кислородных интермедиантов играют ферменты, способные обезвреживать супероксидные радикалы и перекисные соединения в клетках, например: супероксиддисмутаза - СОД (разрушает супероксидные анион-радикалы до перекиси водорода), каталаза (восстанавливает перекись водорода до кислорода и воды) и пероксидазы (также восстанавливающие перекись водорода до воды, но с участием органических восстановителей). (Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., 1993). Абиотические и биотические стрессы приводят к временному сдвигу тканевого баланса антиоксидантов и прооксидантов в сторону последних. Активные формы кислорода могут участвовать в регуляции экспрессии генома, в том числе индукции/репрессии биосинтеза ферментов- антиоксидантов. (Dat J.F. et al., 1998; Смирнова Г.В. и соавт., 1999). Однако в настоящее время нет целостного представления как о влиянии различных неблагоприятных факторов внешней среды на метаболизм белков и, в частности, ферментов-антиоксидантов в клетках растений, так и механизмах компенсации повреждений, вызванных этими факторами. В связи с этим, теоретическая и практическая важность решения данной проблемы требует дальнейшего исследования состояния и обмена ферментов антиоксидантной системы в ответ на различную степень воздействия стрессовых факторов внешней среды.

Для изучения многих физиологических и биохимических процессов в растениях в качестве модели широко используются клеточные культуры растений, которые дают возможность достаточно адекватно оценить процессы обмена веществ в растениях и их ответные реакции на разнообразные внешние воздействия. Культивируемые растительные клетки и органы имеют ряд преимуществ, так как выращиваются в строго контролируемых условиях и существуют в автономном режиме, в отсутствии присущих для интактного растения метаболических связей между органами и тканями, а также фитогормональной регуляции. Поэтому интерпретация ответных реакций растительных клеток на строго определенные воздействия того или иного фактора окружающей среды может быть более однозначной. ( Бу-тенко Р.Г., 1986; Носов A.M., 1999).

Известно, что культивирование клеток in vitro приводит к репрессии генов, отвечающих за тканевую специализацию клетки на фоне индукции генов универсального клеточного метаболизма, а также генов автономного существования. (Бутенко Р.Г., 1975). Показано, что активно пролифери-рующие вне организма клетки содержат высокий уровень активности анти-оксидантных ферментов. Многими авторами установлена четкая и прямая корреляция между максимальной видовой продолжительностью жизни и отношением удельной активности ферментов - антиоксидантов в важнейших органах к интенсивности основного обмена. ( Tolmasolf J.M. et al., 1980; Гусев В.А.и соавт., 1982). Известно также, что содержание ферментов антиоксидантной защиты в клетках и тканях различных организмов, в том числе СОД, каталазы и пероксидаз, генетически запрограммировано. Учитывая все выше изложенное, можно полагать, что гены, несущие информацию о ферментах антиоксидантной системы организма следует отнести к генам "выживания".

В настоящее время культуры растительных клеток являются объектом биотехнологии для получения целевых продуктов, поэтому целесообразность изучения ферментов-антиоксидантов в процессе выращивания растительных тканей in vitro в стандартных условиях, при воздействии неблагоприятных воздействий, а также сопоставление продолжительности жизни биологических объектов с их обеспеченностью этими важнейшими антиоксидантами, участвующими в защите организма от токсического воздействия кислорода, становится очевидным.

Кроме того, в последние годы ферменты антиоксидантной системы представляют большой интерес для практической медицины. В частности, СОД используют для лечения различных аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в качестве радиопротекторного агента при защите от ионизирующей радиации и др. (Bannister J.V., Bannister W.H, 1984; Hallewell В. et al., 1987; Максименко A.B., Тищенко Е.Г., 1997; Захарова М.И., Завалишин Н.А. и соавт., 1999). Поэтому выделение и очистка фермента может представлять большой интерес для энзимотерапии указанных заболеваний. В этой связи особое значение приобретает поиск технологически обоснованного продуцента ферментов. В настоящее время СОД получают из таких дорогостоящих источников, применяемых в пищевой и медицинской промышленности, как кровь, печень и другие ткани крупного рогатого скота. Возможность использования промышленных штаммов культур растительных тканей в качестве источника СОД представляется перспективной. Цель и задачи исследования. Основной целью работы является исследование метаболизма СОД, каталазы и пероксидазы, а также общей бело-ксинтезирующей способности культивируемых клеток раувольфии змеиной и женьшеня. Изучение возможных путей регуляции их обмена в культивируемых растительных клетках и оценка роли ферментов-антиоксидантов в адаптации растительных клеток к неблагоприятным воздействиям окружающей среды. Непосредственными задачами работы являлись:

1.Сравнительная оценка белоксинтезирующей способности клеток различных штаммов культур клеток раувольфии змеиной и женьшеня.

2. Изучение динамики каталитической активности ферментов-антиоксидантов (СОД, каталазы и пероксидазы) в процессе роста культивируемых растительных клеток, а также определение места синтеза и локализации в клетках отдельных ферментов-антиоксидантов.

3. Разработка методов выделения и очистки СОД, каталазы и пероксидазы из культур ткани различных штаммов раувольфии змеиной и женьшеня. Оценка их некоторых физико-химических параметров.

4. Исследование биосинтеза и стабильности ферментов-антиоксидантов ( СОД, каталазы и пероксидазы) в культивируемых клетках лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня.

5. Изучение регуляторного действия фитогормонов на метаболизм внутриклеточного белка и исследуемых ферментов антиоксидантной защиты в культивируемых клетках фитогормон-независимой ткани раувольфии змеиной.

6. Оценка влияния различных температур на белоксинтезирующую способность и обмен трех исследуемых ферментов антиоксидантов в культурах растительных клеток.

7. Разработка лабораторного регламента на выделение растительной СОД. Проведение оценки острой токсичности и фармакологической активности выделенной субстанции ферментативного белка.

Научная новизна работы. Основным достижением данной работы представляется проведенное впервые широкое и систематическое исследование белоксинтезирующей способности культивируемых растительных клеток в целом, так как состояние белкового метаболизма в клетках является одним из наиболее важных показателей жизнедеятельности и продуктивности клеток. В работе были впервые рассчитаны параметры кругооборота внутриклеточного белка в культивируемых клетках лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня.

Получены новые данные, расширяющие и углубляющие современные представления о метаболизме белков в клетках растений при экстремальных воздействиях. Установлено значительное изменение количественного и качественного состава синтезируемых de novo белков в клетках каллусных культур раувольфии змеиной шт. К-27 и женьшеня настоящего при воздействии различных температур. Впервые выявлено появление полипептидов 14 кДа и 17 кДа и сильное увеличение массовой доли как высокомолекулярных (110 - 50 кДа), так и низкомолекулярных (20 - 18 кДа) полипептидов в протеиновых спектрах изучаемых растительных клеток, которые, по-видимому, относятся к соответствующим семействам стрессовых белков и скорее всего участвуют в процессах адаптации растительных клеток к неблагоприятным факторам внешней среды.

Впервые проведено комплексное исследование и дана всесторонняя характеристика обмена индивидуальных ферментов антиоксидантной системы в культивируемых клетках лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня. В ходе работы определены ранее неизвестные константы биосинтеза, распада, а также концентрация СОД, каталазы и пероксидазы в клетках каллусных культур ткани Rauwolfia serpentina (штаммы К-27 и К-47) и различных штаммов двух видов женьшеня Panax ginseng и Panax quinquefolius.

Установлена избирательная чувствительность важнейших ферментов антиоксидантной системы - СОД, каталазы и пероксидазы - к воздействию различных температур, что проявляется в усилении или ослаблении скоростей биосинтеза исследуемых ферментов на фоне количественного и / или качественного изменения состава их изоферментных спектров. Полученные данные дают основание сделать заключение о том, что изменение изоферментных спектров, а также скоростей биосинтеза и распада СОД, каталазы и пероксидазы при воздействии низких и высоких температур необходимо для поддержания метаболизма кислорода на оптимальном для клеток уровне и обеспечения формирования повышенной устойчивости и жизнедеятельности клеток в новых температурных условиях. Эти результаты являются основанием анализа и биохимического контроля устойчивости и стабильности культивируемых in vitro растительных тканей и клеток, так как изменение уровня активности ферментов, уровня концентрации ферментативного белка и интенсивности его биосинтеза в клетках может свидетельствовать как о степени повреждения клеточных структур, так и возможности их восстановления.

Впервые показано, что ответ растительных клеток на воздействие высоких и низких положительных температур включал как неспецифические реакции (например, подавление биосинтеза СОД и каталазы и, наоборот, индукция синтеза пероксидазы в обеих исследуемых растительных культурах), так и специфические ответы (например, при воздействии высокотемпературного шока наблюдали повышение (раувольфия змеиная) и, наоборот, снижение (женьшень) скорости биосинтеза внутриклеточного белка).

Изучено гормональное воздействие на биосинтез и функционирование ферментативной антиоксидантной системы в культивируемых растительных клетках раувольфии змеиной.

Предложена схема, отражающая механизмы воздействия температуры на растительный организм и объясняющая триггерные механизмы, запускающие биохимические процессы, которые в конечном счете и приводят к изменению характера обмена веществ в растительных клетках при воздействии нефизиологических температур.

Научно-практическая значимость работы. Работа носит экспериментально-теоретический характер. Однако полученные результаты характеризуются практической направленностью для биотехнологии и медицины.

Разработаны методы и схемы выделения и очистки трех ключевых ферментов антиоксидантной системы из культивируемых клеток раувольфии змеиной и женьшеня. На выделение СОД из культивируемых растительных клеток получено АС (№ 1540270, 1989 г.).

На основании полученных результатов был создан лабораторный регламент на получение растительной СОД (1998 г.) и проведены оценка его острой токсичности и доклинические противовоспалительные испытания данной субстанции БАВ.

Была разработана схема совмещенной технологии СОД и аймалина из каллусных культур растительных тканей и показана принципиальная возможность получения двух высокоочищенных биологически активных веществ из культивируемых клеток Rauwolfla serpentina и с высоким выходом целевых продуктов. Выделение двух биологически активных препаратов, возможно позволит в будущем повысить рентабельность производства аймалина, а также значительно снизить себестоимость получаемых целевых продуктов.

Результаты работы были использованы при оформлении патента на способ выделения активного комплекса из культивируемых растительных клеток" (No 2136300 от 10.09.99г., приоритет от 04.11.97 г.).

Полученные результаты использовались в лекционных курсах и лабораторном практикуме на кафедре биохимии для студентов Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической Государственной академии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Данные о скорости биосинтеза и времени функционирования общего белка, а также ферментов-антиоксидантов (СОД, каталазы и пероксидазы) являются основой для реальной оценки биосинтетической способности и общего антиоксидантного потенциала культивируемых клеток лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня и могут быть использованы в полном биохимическом контроле культур растительных клеток, имеющих промышленное значение.

2. Исследования влияния высоких и низких положительных температур на протеиновые спектры позволяют сделать заключение о том, что экспрессия новых белков при данных воздействиях включает в себя как неспецифические ответные механизмы ( проявляются при всех воздействиях), так и специфические, характерные только для одного вида воздействия.

3. Разработанные перспективные методики выделения ферментов антиоксидантной защиты позволяют рассматривать исследуемые, имеющие промышленное значение, культуры растительных тканей как источник таких ценных для медицины препаратов как СОД и каталаза. Данные фармакологических испытаний полученной субстанции СОД подтверждают перспективность применения препаратов растительной супероксиддисму-тазы в качестве противовоспалительного средства.

Апробация работы. Материалы, использованные в диссертационной работе, докладывались и представлялись на 13 Международном конгрессе по биохимии (Нидерланды, 1985), 18 Съезде ФЕБО (Югославия, 1987), Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Россия, 1988), на I Международной конференции по традиционной реабилитационной медицине (Китай, 1989), Ш Всесоюзной конференции "Биоантиоксиданты" (Россия, 1989), YII Международном конгрессе по растительным тканям и клеточной культуре (Нидерланды, 1990), 20 Съезде ФЕБО (Нидерланды, 1990), П Всероссийском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Россия, 1993), III Всероссийском обществе физиологов растений ( Россия, 1993), П и Ш Российском конгрессе "Человек и лекарство" (Россия, 1995, 1996), Международном экологическом конгрессе (Россия, 1996), Международной научной школе по биотех

16 нологии и применению пероксидазы (Россия, 1997), YII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Россия, 1997), Y Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Россия, 1998).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 печатные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 379 машинописных страницах; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований), обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (477 источников) и приложения (^S страницы). Материал диссертации проиллюстрирован 7 схемами, 65 рисунками и содержит 51 таблицу.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кириллова, Надежда Васильевна

ВЫВОДЫ.

1. Расчет параметров обмена внутриклеточного белка в различных штаммах каллусных культур раувольфии змеиной и женьшеня позволил установить, что белоксинтезирующая способность клеток каллусной культуры раувольфии змеиной в 2-2,5 раза превышает таковую в клетках различных видов и штаммов женьшеня.

2. Биосинтез полипептидных цепей СОД осуществляется как на свободных (51%), так и мембраносвязанных (49%) полирибосомах. Доля СОД-синтезирующих рибосом составляет 1,5% от общей фракции полирибосом культивируемых растительных клеток раувольфии змеиной.

3. Каталаза в культуре ткани женьшеня локализована в пероксисомах и в цитозольной фракции клеток. По мере роста, развития и старения каллуса происходит перераспределение активности фермента, а именно, в молодых клетках более 60% каталазы находится в суммарной фракции митохондрий и пероксисом, а в стареющей ткани более 50% ферментативного белка сосредоточено в цитоплазме растительных клеток.

4. Скорость накопления новосинтезированных СОД, каталазы и пероксидазы в клетках культуры раувольфии змеиной в несколько раз превышают таковую в культивируемых клетках различных штаммов женьшеня.

5. Цитокинины увеличивают скорость биосинтеза и концентрацию СОД и пероксидазы, но снижают накопление каталазы в цитоплазме клеток раувольфии. Ауксины снижают содержание каталазы и пероксидазы в культивируемых клетках за счет ингибирования скорости их биосинтеза и в то же время повышают скорость новообразования СОД.

6. Комплексное исследование влияния различных температур на бело-ксинтезирующую способность и обмен трех ферментов-антиоксидантов (СОД, каталазы и пероксидазы) в каллусных культурах раувольфии и женьшеня позволило установить, что при действии низких температур скорости биосинтеза общего белка в растительных клетках достоверно снижаются; при воздействии теплового шока скорость биосинтеза внутриклеточного белка в ткани раувольфии змеиной увеличивается на 36%, а в каллусе женьшеня -снижается на фоне повышения скорости его распада в 1,5 раза; скорость биосинтеза СОД и каталазы в исследуемых культурах достоверно снижалась, а пероксидазы, напротив, увеличивается как при воздействии низко-, так и высокотемпературного шоков.

7. Изменение белковых спектров, а также молекулярной гетерогенности исследуемых ферментов антиоксидантной защиты отражает проявление адаптационных способностей клеток каллусных растительных тканей как в ходе их культивирования, так и при различных внешних воздействиях: а) при температурном воздействии в протеиновых спектрах клеток женьшеня было выявлено появление низкомолекулярных белков с молекулярной массой около 14 кДа на фоне снижения массовой доли белков других молекулярных масс (высокая температура) или значительного усиления группы полипептидов с молекулярными массами 50 кДа (низкие положительные температуры). б) при воздействии высокой температуры в клетках раувольфии змеиной была идентифицирована дополнительная белковая зона с молекулярной массой 17 кДа, увеличение содержания полипептидов 96-98, 70, 20 и 14 кДа, а также снижение доли белков 22 кДа. В то же время низкие температуры повышали массовую долю полипептидов 1 ШкДа, 98 кДа, 67 кДа, 55 кДа и 50 кДа, 18 кДа. в) при действии высоко- и низкотемпературного шоков в клетках раувольфии и женьшеня увеличивалась массовая доля медленно мигрирующих изопероксидаз, а быстро мигрирующих ее изоформ, наоборот, уменьшалась; г) при воздействии различных температур происходило усложнение микрогетерогенности СОД и появление целого ряда новых, в основном быстро мигрирующих к аноду изоформ фермента;

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Общеизвестно, что обмен веществ в клетках представляет собой сложную систему внутриклеточных ферментативных реакций. При возникновении неблагоприятных условий внешней среды живая система стремится к сохранению целостности и направленному приспособлению. Клетка является саморегулирующей системой и приспосабливается к изменениям во внешней среде путем быстрой модификации функций регуляторных ферментов. Для выживания в неблагоприятных условиях клетка использует уровень регуляции метаболизма, сопряженный с активацией и репрессией генов.

На основании полученных в работе результатов, а также используя данные других авторов, мы попытались предложить схему, обобщающую механизмы воздействия температуры на растительный организм. А также объяснить триггерные механизмы, запускающие биохимические процессы, которые в конечном счете и приводят к изменению характера обмена веществ в растительных клетках при воздействии повреждающих температур. Данные представлены на рисунке 65. Ответ клеток на тепловой шок предусматривает ядерно-цитоплазматическое взаимодействие, так как ядра не способны воспринимать температурный сигнал и экспрессировать гены.(Nover L. et al., 1984). Ранее было показано, что рецепторный белок воспринимающий сигналы, связанные с тепловым шоком, локализован в цитоплазме (Wiederrecht J. et al., 1985). В дальнейшей передаче информации о стрессе, как полагают, может принимать участие цитоскелет клетки. При тепловом шоке происходит значительное перераспределение промежуточных филаментов и они агрегируются около ядра. (Nover L. et al., 1984; Войников В.К., 1989). Кроме того, при структурных перестройках цитоскелета наблюдают переход цитоскелет-ного белка (45 кДа) в ядерную фракцию. (Falkner F.A. et al., 1981). Можно полагать, что передача сигнала от цитоплазматического рецептора может осуществляться и другими пока не выясненными путями.

Высоко/низкотемпературный шок

Рис. 65. Схема предполагаемых механизмов воздействия температуры на растительную клетку.

Некоторые исследователи полагают, что сигнал о стрессе может передаваться от цитоплазматической мембраны посредством везикул, покрытых особым белком - клатрином. (Rothman J.E., Schmid S.L., 1986). В последние годы было показано, что при различных неблагоприятных внешних воздействиях в растительных клетках увеличивается содержание цАМФ, например, в условиях пониженной температуры, при удалении клеточной стенки, при отделении ткани от целого организма, при засухе и т.д. Известно, что гидроперекиси ненасыщенных высших ясирных кислот являются Са2+-ионофорами и способны повышать внутриклеточную концентрацию ионов кальция в растительных клетках при стрессе. Поэтому, по мнению ряда авторов, в качестве вторичных посредников передачи информации с поверхности растительной клетки могут осуществлять ионы Са . (Leshem Y.Y.,1987). Кроме того, полагают, что мембранные рецепторы связаны не только с аденилатциклазой, но, в частности, с различными фосфолипазами и оксидазами, поэтому взаимодействие неблагоприятных внешних сигналов с мембранным рецептором, вызывающее изменение конформации рецепторного белка, может приводить к активации последних. (Гречкин А.И., 1992; Тарчевский И.А., 1993; Максюто-ва Н.Н., 1998). По-видимому, растительные клетки, кроме цитоплазматиче-ских рецепторов, имеют на своей поверхности мембранные белковые рецепторы, которые воспринимают сигналы об отклонении от нормы температурных условий внешней среды и передают этот сигнал клетке (рис. 65).

Таким образом, сигналы об изменении температуры внешней среды, через мембранные и/или цитоплазматические рецепторы, включают сигнальные системы, что приводит к повышению концентрации вторичных посредников в клетке. Увеличение содержания в клетке, например, цАМФ или ионов Са2+ будет приводить к активации соответствующих протеинкиназ, которые в свою очередь могут как непосредственно активировать или ингибиро-вать различные белки/ферменты, так и регулировать их биосинтез на различных его этапах (транскрипции, посттранскрипционном процессинге, трансляции, этапе созревания белка и т.д.).

Информация об изменении температуры внешней среды, которая передается в растительные клетки мембранными и/или цитоплазматическими рецепторами приводит к изменению гормонального статуса в клетках, так как стимулирует или подавляет биосинтез тех или иных эндогенных фитогормонов. (Волкова Р.И. и соавт., 1981; Skriver К., Mundy J., 1990). К настоящему времени установлено, что фитогормоны могут принимать участие в контроле биосинтеза белка как на стадиях транскрипции и трансляции, так и на стадии посттрансляционой модификации белков; кроме того, они способны контролировать уровень белка в растительных клетках, влияя на скорость его деградации. Фитогормоны могут оказывать воздействие на функциональное состояние биомебран, количество и функциональную активность рибосом и др. (Полевой В.И., 1989а; Кулаева О.Н., 1995; Танкелюк О.В., Полевой В.В., 1996). Интересным представляется тот факт, что многие фитогормоны, по-видимому, оказывают регуляторное действие на уровень активности и содержание белков/ферментов путем изменения в растительных клетках концентрации цАМФ, ионов Са и др. (Каримова Ф.Г. и соавт., 1990; Ruck A. et al., 1993; Танкелюк О.В., Полевой В.В., 1996; Schaller G.T., 1997; Trewavas A.J., Malho R., 1997). Поэтому температура внешней среды, изменяя уровень и баланс фитогормонов, будет опосредованно выступать одним из факторов регулирующих белоксинтезирующую способность клеток растений, что также нашло отражение в предлагаемой схеме.

Одной из наиболее ярких, присущей всем живым организмам, неспецифической ответной реакцией клеток на воздействие неблагоприятных внешних условий является быстрое и значительное изменение в них экспрессии генов, при этом происходит индукция или репрессия синтеза специфических РНК, что приводит, в частности, к изменению спектра синтезируемых белков в клетках. Так как, подобные изменения в экспрессии генов могут быть вызваны самыми разнообразными внешними воздействиями, то в качестве наиболее удобной модели для изучения регуляции активности генов исследователями было выбрано воздействие на организм низко- и высокотемпературных шоков. Имеющиеся в литературе данные указывают, что регуляция синтеза стрессовых белков может происходить и на уровне трансляции (дезинтеграция полирибосом, структурная модификация факторов инициации трансляции и рибосомальных белков, повышение содержания малой цито-плазматической (мц) РНК и др.). (Lindquist S. , 1986; Бочарова М.А. и соавт., 1990; Плотников В.К., 1992; Искаков Б.К., 1997). В дальнейшем было показано, что между так называемой «индуцированной толерантностью» различных организмов к нефизиологическим температурам и стрессовыми белками существует прямая связь. Была также установлена корреляция между временем развития терморезистентности клеток всех живых организмов и появлением в них шоковых (стрессовых) белков. (Parsell D.A., Libquik S., 1994; Sabehat A. et.al., 1996; Feder M.E., Hofmann G.E., 1999). Стрессовые белки, как общепринято в настоящее время, необходимы организму для выживания при неблагоприятных внешних условиях среды. Стрессовые белки выполняют самые разнообразные функции в клетках, например, неспецифическую стабилизацию внутриклеточных структур, предохраняют структуру жизненно важных биомолекул, особенно ферментов, проявляют функции шапиронов и др. (Войников В.К. и соавт., 1994; Struglics A., Hakamsson G., 1999). Кроме того, некоторые из синтезированных de novo БТШ поступают в ядро и, таким образом, по-видимому, принимают участие в регуляции транскрипции и процес-синга РНК. (Nover L. et al., 1984). Известно, что тепловой шок репрессирует биосинтез многих белков, и, наоборот, индуцирует синтез БТШ (Verling Е., 1991), поэтому мы сочли целесообразным в предлагаемой схеме выделить процесс и регуляцию новообразования стрессовых белков от биосинтеза «обычных» белков, присущих клетке также и в нормальных физиологических условиях (рис. 65).

Одной из самых первых неспецифических ответных реакций клеток на биотический и абиотический стрессы, в том числе и на высоко- и низкотемпературные шоки, является генерация активных форм кислорода. Избыточное их образование может происходить в митохондриях и хлоропластах (при переносе электронов по электронтранспортным цепям), в эндоплазматическом ретикулуме (при работе микросомальных монооксигеназ), большие количества перекиси водорода генерируются в пероксисомах. Интенсификация образования прооксидантов происходит также при активации оксидаз, локализованных в плазматической мембране и цитоплазме и, как полагают, связанных с рецепторами, передающими сигналы клетке из вне. (Bowler С. et al., 1992; Pulvis А.С. et al., 1993; Prasad Т.к. et al., 1994; Doke et al, 1994; Baker C. J., Orlandi E.W., 1995; Курганова Л.Н. и соавт., 1997; Dat J.F. et al., 1998; Максю-това H.H., 1998). Эти данные также нашли свое отражение в представленной нами схеме (рис.65).

В процессе эволюции у аэробов для защиты от прооксидантов выработались специализированные ферментативные антиоксидантные системы, к которым относятся СОД, каталаза и пероксидаза. Ферментативные антиоксиданты, как известно, отличаются высокой специфичностью и характеризуются различной клеточной и органной локализацией, а также использованием в качестве катализаторов металлов (Си, Zn, Fe, Мп). Кроме того, характерной особенностью данных ферментов является наличие множественных молекулярных форм, отличающихся по ряду физико-химических свойств, локализации и др. Полиморфизм особенно характерен для пероксидазы и по мнению многих авторов пероксидаза представляет собой «подсемейство» различающихся генетически ферментов, несущих различные функции in vivo, но могущие проявлять перекрывающуюся специфичность к субстратам. (Андреева В.А., 1988).

По аналогии с выше изложенным, можно предположить, что, по-видимому, все три фермента ферментативного антиоксидантного комплекса (СОД, каталаза и пероксидаза) могли произойти от одного древнего предшественника. Весьма возможно, что при возникновении аэробного способа существования, в результате эволюции, по-видимому, произошла дубли-кация генов, что и привело к образованию «семейства» белков, выполняющих сходные функции в клетке. Примером, косвенно подтверждающим это предположение, может служить тот факт, что фермент - каталаза проявляет не только каталазную, но и пероксидазную активность, которая обеспечивает специфические окислительные процессы с участием перекиси водорода, приводящие к образованию важных метаболитов. (Голиков С.Н. и соавт., 1986). Относительно Си^п-СОД также известно, что при рН > 9,0 в присутствии перекиси водорода она действует как пероксидаза. Установлено, что «медь-связанные гидрокильные радикалы» - СОД - ОН, которые генерируются в реакции между ферментом и перекисью водорода, окисляют такие анионные лиганды, как формат, азид и нитрат. (Sankarapandi S., Zweier J.L., 1999; Goss S.P. et al., 1999; Zhang H. et al., 2000; Kim .S., Han S„ 2000). В свою очередь пероксидазы способны проявлять и оксидазную активность, катализируя окисление целого ряда соединений (гидро- и нафтохиноны, индолил-3-уксусная кислота, НАД(Ф)Н и другие соединения) с участием молекулярного кислорода. (Андреева В.А., 1988; Zheng X., van Huystee R.B., 1992). Предположение об эволюционно образовавшимся «семействе» ферментов подтверждается некоторыми нашими данными, в частности, близкими схожими ответами на температурный стресс.

Для ферментов антиоксидантной системы характерно согласованное действие. Например, такие ферменты-антиоксиданты, как СОД, каталаза и пероксидазы работают, как правило, в комплексе. (Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., 1993). Ключевым ферментом этого мультиферментно-го антиоксидантного комплекса является СОД, так как она катализирует лимитирующую стадию процесса превращения супероксидного радикала в другие активные формы кислорода. Полученные нами результаты, а также данные литературы (Willekens Н. et al., 1995; Foyer С.Н. et al., 1997; Scandalios J.,1997; Dat J.F. et al., 1998) показывают, что при высоко- и низкотемпературном шоках в клетках растений происходит падение содержания и снижение активности СОД и каталазы. Поэтому воздействие различных температур на растительный организм существенно смещает равновесие прооксиданты-антиоксиданты, что приводит к взаимодействию активных форм кислорода с биомолекулами и различными клеточными структурами. Возникающие при этом в повышенном количестве, например, продукты перекисного окисления липидов и др. могут выступать первичными медиаторами стрессового воздействия температурного фактора и индукторами соответствующих защитных механизмов в растительных клетках (рис. 65).

При анализе данных по обмену СОД и каталазы в растительных клетках при воздействии на них неблагоприятных факторов на первый взгляд эти ферменты нельзя отнести к группе стрессовых белков. Однако известно, что перевод растительных тканей и органов в культуру является очень сильным стрессовым фактором, т.е. культивируемые растительные клетки в процессе их роста находятся в состоянии постоянного («перманентного») стресса. (Бутенко Р.Г., 1975). Общую интенсификацию метаболизма в культурах тканей, по-видимому, можно объяснить следующим образом: в каллусных и суспензионных культурах происходит нарушение механизмов тканевого контроля развития и клетки лишены контакта друг с другом и, поэтому, вынуждены сами обеспечивать себя всем необходимым, так как находятся в состоянии «перманентного» стресса. Поэтому интенсификацию метаболизма в данном случае следует рассматривать, как нормальную адаптационную приспособительную реакцию клеток к изменившимся условиям внешней среды. Ранее нами было также показано, что в каллусных культурах женьшеня и, особенно, раувольфии змеиной активность всех трех изучаемых нами ферментов находится на достаточно высоком уровне, и превышают таковые на порядок по сравнению с интактным растением. (Орехова И.А., 1997). Аналогичное повышение скорости биосинтеза пероксидазы наблюдали и при переводе арахиса в культуру (Chibbar R.N., van Huystee R.B., 1986). Из выше изложенного следует, что первичный стресс приводит к индукции биосинтеза исследуемых ферментов-антиоксидантов.

Что касается вторичного стресса (воздействие высоких или низких температур) на каллусные растительные культуры, то он, как установлено в нашем исследовании, сопровождался снижением скорости биосинтеза СОД и каталазы. Известно, что растительная ткань реагирует в ответ на воздействие различных неблагоприятных внешних факторов среды, в том числе различных биологических и химических агентов сходным образом, что свидетельствует об универсальности некоторых защитных реакций живых организмов на воздействие окружающей их среды. (Андреева В.А., 1988; Савич И.М., 1989; Аверьянов А.А., 1991; Ломоносова Е.Е. и соавт., 1992, 1993; Baker С. J., Ог-landi E.W., 1995). По-видимому, в результате эволюции, были отобраны сравнительно небольшое число биохимических механизмов, которые запускаются в растительных клетках, и используются ею почти во всех случаях при возникновении любых неблагоприятных условий внешней среды. По мнению Максютовой Н.Н. причина неспецифичности ответа растительного организма на абиотические и биотические стрессы заключается в том, что в ходе эволюции возникла и закрепилась «профилактическая» антипатогенная реакция на ослабление растений под влиянием обезвоживания, повышения или понижения температуры и т.п., которое может привести к более легкому инфицированию растений патогенами. (Максютова Н.Н., 1998). Усиление продукции прооксидантов в ответ на заражение наблюдается у различных видов растений и при разных по природе инфекционных процессах. (Веселовский В.А., 1982; Аверьянов А.А., 1991; Doke et al., 1994). Установлено, что при заражении растений в клетках устойчивого к инфекциям вида падение активности СОД способствует большей активации кислорода, а в клетках восприимчивого к инфекциям растения, наоборот, активность СОД возрастает. (Чигрин В.В., 1988). Поэтому генерация активных форм кислорода растениями, по-видимому, представляет собой одно из проявлений их устойчивости к различным патогенам. В частности, супероксидные радикалы являются одним из факторов лигнификации для создания механического барьера на пути инфекции, а также служат эндогенным индуктором синтеза фитоалексинов, этилена и др. В связи с этим, усиление продукции прооксидантов в зараженных клетках и тканях устойчивых растений, способны подавлять развитие паразита как непосредственно, в качестве повреждающих агентов, так и косвенно, участвуя в других иммунных реакциях. (Аверьянов А. А., 1991).

Установленное нами и рядом других исследователей повышение активности и содержания пероксидазы при температурных шоках, по-видимому, связано с тем, что пероксидазам растений свойственна уникальная метаболическая полифункциональность. Так как помимо выполнения своей основной функции - защиты клеток от токсичных пере-кисных радикалов, пероксидаза принимает участие во многих других процессах. У многих растений была обнаружена корреляция между уровнем активности пероксидазы и их устойчивостью по отношению к различным возбудителям болезней (Метлицкий JI.B. и соавт., 1984). Установлено, что пероксидазы могут участвовать в защитных механизмах при заражении растений патогенами, так как образующиеся при окислении фенолов токсичные продукты ингибируют рост и развитие возбудителя болезней у растений. Кроме того, фермент, наряду с другими окси-дазами, может непосредственно разрушать различные токсины микроорганизмов. (Gaspar Th. et al., 1982; Аверьянов A.A., 1991; Vanacker H., Tim L.W., 1998; Knstensen B.K. et al., 1999).

Обобщая выше изложенное, необходимо отметить, что в настоящее время в литературе накоплен очень незначительный экспериментальный материал и поэтому нет ни теоретического обоснования, ни однозначного и ясного ответа на принципиальный вопрос, каким образом стрессовые факторы влияют на биосинтез ферментов антиоксидантной системы. В данном исследовании нам удалось более детально и предметно провести как экспериментальную работу, так и интерпретацию полученных данных. Особый интерес вызывают данные показывающие, что биосинтез СОД и каталазы, в отличие от новообразования пероксидазы, подавляется при воздействии на растительные клетки высоких и низких температур. По-видимому, как показывают приведенные выше литературные данные, выявленный эффект характерен для различных организмов при воздействии на них неблагоприятных факторов биотической и абиотической природы. Хотя существует вероятность и того, что при переводе в культуру растительные клетки могут частично терять способность к полноценной антиоксидантной защите от свободных кислородных радикалов («окислительному стрессу»).

Таким образом, анализ полученных результатов и данных литературы позволяет сделать заключение о том, что исследуемые ферменты-антиоксиданты (СОД, каталаза и пероксидаза) способны адаптивно менять свою активность под влиянием различных сдвигов окружающей среды (температура, водный режим, гормоны, патогены и др,). При этом в растительных организмах на изменение окружающей среды, для поддержания метаболизма кислорода на оптимальном для клеток уровне, клетками используются несколько путей приспособления к изменяющимся температурным условиям, например, изменение некоторых физико-химических свойств ферментов-антиоксидантов, изменение их изоферментных спектров, а также изменение скоростей биосинтеза и распада СОД, каталазы и пероксидазы. В связи с выше изложенным, мы полагаем, что все три изучаемых нами фермента могут быть, по-видимому, отнесены к «стресс-специфичным» ферментам.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кириллова, Надежда Васильевна, Санкт-Петербург

1. Абрахамова И.Л., Хохлова Л.П., Абрахимова Ф.А. Особенности дыхания и морфология митохондрий узлов кущения озимой пшеницы при действии низких температур и картолина // Физиология растений. 1998. Т. 45. №2. С. 253-261.

2. Аверьянов А.А. Активные формы кислорода и иммунитет растений // Успехи совр. биол. 1991. Т. 111. Вып. 5. С. 722-737.

3. Аверьянов А.А., Веселовский В.А.Токсичное действие кислорода на растения при супероптимальных температурах // Физиология растений. 1976. Т.23. Вып. 6. С. 1248-1254.

4. Айтхожин М.А. Регуляция экспрессии генов белков теплового шока в прорастающих зародышах пшеницы // Молекулярные механизмы биосинтеза белка растений. Алма-Ата: Наука. 1989. С. 228-237.

5. Айтхожин М.А., Бельгибаев С.А., Токарев А.А. Регуляция синтеза стрессовых белков на ранних стадиях прорастания семян // Стрессовые белки растений. Новосибирск: Наука. Сибирское отд. 1989. С. 20-43.

6. Александров В.Я. Реактивность клеток и белки. М.:Наука. 1985. 318 с.

7. Ананиев Е., Шакирова Ф.М., Клячко Н.Л., Кулаева О.Н. Влияние цитокининов на образование полисом из пресуществующих мРНК и рибосом // Докл. АН СССР. 1980. Т. 255. No 2. С. 508-510

8. Андреева В.А. Фермент пероксидаза. Участие в защитном механизме растений. М.: Наука. 1988. 129 с.

9. Бабенко Л.М., Мусатенко Л.И. Белковый синтез при нарушении покоя в семенах клена татарского // Физиология растений. 1998. Т. 45. №1. С. 112116.

10. Байбурина Р.К. Микроклональное размножение взрослых гибридных деревьев Butula pendula Roth var. Carelica mersckl. //Раст. ресурсы. 1998. Т. 34. Вып. 2. С. 9-22.

11. Батыгина Е.Н. Культура ткани Panax quinquefolius L. как объект для изучения процессов роста и метаболизма in vitro // Дисс. канд. биол. наук., Л., 1990. 112 с.

12. Беккер Е.Г., Пирухалашвили Д.О., Элисашвили ВюИюЮ Синицын А.Н. Mn-пероксидазы из Pleurotus ostreatus, выделение, очистка и некоторые свойства//Биохимия. 1992. Т. 57. Вып. 8. С. 1248-1253.

13. Белянская СЛ., Шамина З.Б. Получение и характеристика клонов риса, резистентных к стрессовым факторам // Физиология растений. 1993. Т. 40. С. 681-685.

14. Берман А.Е. Метод выделения полирибосом свободных и связанных с мембранами цитоплазматической сети // Современные методы в биохимии. М.: Медицина. 1977. С.300-303.

15. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М.: Медицина. 1989. 368 с.

16. Блехман Г.И., Шеламова Н.А. Синтез и распад макромолекул в условиях стресса//Успехи совр. биол. 1992. Т.112. Вып. 2. С. 281-297.

17. Боровский Г.Б., Ступникова И.В., Пешкова А.А., Дорофеев Н.В., Войников В.К. Термостабильные белки проростков и узлов кущения растений озимой пшеницы // Физиология растений. 1999. Т.46. № 5. С. 777783.

18. Бочарова М.А., Клячко Н.Л., Дунаева К.А. Влияние отрицательных температур на белоксинтезирующий аппарат пшеницы // Тезисы докл. Второго съезда ВОФР. (Минск: 1990). М.: 1990. С.17.

19. Браун Т.Н. Механизм белкового синтеза в связи с морозостойкостью растений // Холодостойкость растений. М.: Колос. 1983. С. 124-131.

20. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. Л.: Наука. Лен. отд., 1987. С. 113-127.

21. Булко О.П., Лаптева O.K., Масный М.Н., Масько А.А., Ненадович Р.А., Решетников В.Н. Техника биохимического исследлования субклеточных структур и биополимеров растительной клетки. Мн.: Наука и техника. 1986. 197 с.

22. Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений// Физиол. растений. 1999. Т. 46. №6. С. 930-944.

23. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений. // Вестн. АН СССР. 1975. № 11. С. 92-101.

24. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и биотехнология. М. : Наука. 1986. С. 3-20.

25. Веселов А.П., Курганова Л.Н., Ручкова О.В. Влияние теплового шока на цитоплазматическую белоксинтезирующую систему листьев гороха Pisum sativumL. //Биохимия. 1997. Т.62. Вып. 5. С. 569-573.

26. Веселовский В.А. О роли биоантиоксидантов в устойчивости растений к неблагоприятным условиям существования // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М.: Наука. 1982. С. 150-162.

27. Войников В.К. Стрессовые белки растений при действии высокой и низкой температуре // Стрессовые белки растений. Новосибирск : Наука. Сибирское отд. 1989. С. 5-20.

28. Войников В.К., Иванова Г.Г., Корытов М.В. Синтез белков в растениях при действии низкой температуры // Физиология и биохимия культ, растений. 1986. Т. 18. С. 211-221.

29. Войников В.К., Корытов М.В. Влияние условий гипотермии на синтез стрессовых белков в проростках озимой пшеницы // Физиология растений. 1993. Т. 40. С.589-595.

30. Войников В.К., Боровский Г.Б. Роль стессовых белков в клетках при гипертермии // Успехи совр. биологии. 1994. Т. 114. Вып. 1. С. 85- 95.

31. Волкова Р.И., Дроздова С.Н., Сычева З.Ф., Балагурова Н.М. О регуляторной роли ауксинов у активно вегетируюгцих растений при температурном воздействии // Физиология растений. 1981. Т. 28. № 3. С. 615620.

32. Воллосович А.Г. Культура ткани раувольфии как продуцент противоаритмических алкалоидов // Автореф. дис. докт. биол. наук. СПб., 1992. 38 с.

33. Высоцкая Р.И. Культура ткани женьшеня (биология и перспективы использования в медицине) // Дисс. . канд. биол. наук. JL, 1978. 214 с.

34. Гайцхокки B.C., Тимченко П.А., Тимченко Л.Г., Пучкова Л.В., Асланов Х.А., Салихов Е.А. Биосинтез и посттрансляционное созревание трансфертна в субсклеточных фракциях печени крыс//Биохимия. 1982. Т. . . Вып. 47. С.13-18.

35. Газарян И.Г., Веревкин А.Н., Фечина В.А., Урманцева В.В., Скрипников А.Ю. Пероксидаза культивируемых клеток люцерны // Докл. Акад. наук . 1992. Т.326. No 1. С. 198-201.

36. Газарян И.Г. Пероксидазы растений // В кн. Газарян И.Г., Урманцева В.В., Решетникова И.А., Кунаева P.M., Ким Б.Б. Биотехнология пероксидаз растений и грибов. М.: Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. 1992. Т. 36. С. 4-28.

37. Газарян И.Г., Решетникова И.А., Веревкин А.Н., Фечкина В.А., Люлюлин А.Л., Шевцова Т.Н. Пероксидазы гриба Phellinus igniarius 71-31 // Докл. АН. 1993. Т.329. № 5. С. 663-665.

38. Газарян И.Г., Упоров И.В., Чубарь Т.А., Фечиня В.А., Мареева Е.А., Лагримини Л.М. Влияние рН на стабильность анионной пероксидазы табака и ее взаимодействия с перекиссью водорода// Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 5. С. 708-715.

39. Гамалец Л.В., Гамбург КЗ., Швецов С.Г., Рекославская Н.И. Взаимодействие ауксина и цитокининов в регуляции роста культуры семядольного каллуса сои // Физиология и биохимия культ, растений. 1980. Т.21. No 2. С. 147-153.

40. Гамбург К З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений // Новосибирск : Наука. Сибирское отд-ние. 1990. 243 с.

41. Гар Т.К., Миронов В.Ф. Биологическая активность соединений германия // Обзор, информ., сер. "Элементоорганические соединения и их применение". М.: НИИТЭХИМ. 1982. 25 с.

42. Гаянова С.С., Хавкин Э.С. Использование нейтрального ПААГ для изоферментного анализа пероксидаз и эстераз // Физиол. растений. 1990. Т.37. Вып.5. С. 1036-1039.

43. Генкель П.А. Физиология жаро- и засухоустойчивости растений. М.: Наука. 1982. С.278.

44. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. Л. : Медицина. 1986. 280 с.

45. Гречкин А.Н. Пути образования октадеканоидов в высших растениях // Автореф. дис. докт. хим. наук. 1992. 39 с.

46. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. Киев : Наукова Думка. 1973. 590 с.

47. Грушин А.А., Ивакин А.П. Применение метода Лиу для изучения множественных молекулярных форм пероксидазы // Физиол. растений. 1985. Т.32. Вып.4. С. 819-821.

48. Гумилева Н.А., Чумикина Л.В., Шатилов В.Р. Синтез белка и РНК в прорастающих семенах//Биохимия. 1995. Т. 60. Вып. 1. С. 35-48.

49. Гусев В.А., Брусов О.С., Панченко Л.Ф. Супероксиддисмутаза -радиобиологическое значение и возможности // Вопр. мед химии. 1980. Т.24. Вып.З. С. 291-301.

50. Гусев В. А., Панченко Л.Ф. Супероксидный радикал и супероксиддисмутаза в свободнорадикальной теории старения // Вопр. мед химии. 1982. №4. С. 8-24.

51. Даванков В. А., Навратил Дж., Уолтон X. Лигандообменная хроматография. М.: Мир. 1989. Гл.4. С.83-91.

52. Дерфлинг К. Гормоны растений. М.: Мир. 1985. 303 с.

53. Дианова И.И., Салганик Р.И. Индуцированный синтез белков теплового шока пшеницы и их роль в адаптации к действию высоких температур // Стрессовые белки растений. Новосибирск: Наука. Сибирское отд. 1989. С.43-58.

54. Доис Э. Количественные проблеммы биохимии. М.: Мир. 1983. 376 с.

55. Дроздова Ю. И. Выделение и изучение свойств супероксиддимутазы человека изрекомбинантного штамма дрожжей Saccharamyces cerevisiae // Автореф. дис.канд. биол. наук. С-Пб., 1997. 20 с.

56. Дубинина Е.Е. Биологическая роль суперокидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма // Успехи совр. биол. 1989. Т. 108. № 11. С. 3-18.

57. Дубинина Е.Е., Туркин В.В., Бабенко Г.А., Исаков В.А. Выделение и свойства супероксиддисмутазы плазмы крови человека // Биохимияю 1992. Т. 57. Вып. 12. С. 1892-1901.

58. Дубинина Е.Е., Шугалей И.В. Окислительная модификация белков //Успехи совер. Биологии. 1993. Т.113. Вып. 1. С. 71-81.

59. Дубинина Е.Е. Характеристика внеклеточной супероксиддисмутазы. Вопр. мед. химии. 1995. Т.41. № 6. С.8 -12.

60. Егорова А.Б., Романова Т.А., Иванов В.В., Нефедов В.П. Тепловой шок модулирует цитотоксичность ксенобиотиков in vivo // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1988. Т. 126. № 11. С. 546-547.

61. Еникеев А.Г. Действие ауксина на синтез белка и нуклеиновых кислот в лаг-фазе накопительного цикла выращивания клеток сои // Дис. . канд. биол. наук. Иркутск. 1988. 128 с.

62. Еремин А.Н., Метелица Д.И. Использование обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в гептане для очистке супероксидазы из эритроцитов крови // Прикп. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32. № 3. С. 284-289.

63. Еремин А.Н., Метелица Д.И. Сорбция СОД и каталазы из микроэмульсионных веществ в гептане // Прикл. биохим. и микробиол. 1997. Т. 33. №5. С. 512-518.

64. Зауралов О. А., Лукаткин А.С. Послеследствие пониженных температур на дыхание теплолюбивых растений // Физиология растений. 1997. Т. 44. № 5. С. 736-741.

65. Захарова М.И., Завалишин Н.А. и соавт. Роль СОД в патогенезе бокового аминотрофического склероза// Бюлл. эксп. биол. мед. 1999. Т. 127. №4. С. 460-462.

66. Заякин В.В., Нам И.Я., Левитин Е.И., Шевелуха B.C. Роль этилена в регуляции опадения генеративных органов на модели соцветия люпина желтого // Физиол. раст. 1999. Т. 46. № 1. С. 41-47.

67. Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б., Шегин С.М. Окислительный стресс. Диагностика, терапия, профилактика. Новосибирск. 1993. 181 с.

68. Ивакин А.П., Грушин А. А. Термостабильность пероксидазы различных видов томатов // Физиология и биохимия культ, растений. 1988. Т. 20. №4. С. 389-393.

69. Иванов Б.Н. Восстановление кислорода в хлоропластах и аскорбатный цикл // Биохимия. 1998. Т.63. № 2. С. 165-170.

70. Иванова Е.Ю. Исследование кругооборота супероксиддисмутазы в печени крыс при общем рентгеновском облучении и действии некоторых гормонов // Дис.канд. биол. наук. Л. 1983. 164 с.

71. Иванова А.Б., Анцыгина Л.Л., Ярин А.Ю. Современные аспекты изучения фитогормонов // Цитология. 1999. Т. 41. № 10. С. 835-847.

72. Искаков Б.К. Исследование молекулярных механизмов и регуляциибиосинтеза белка у растений // Автореф. дис. докт. биол. наук. Алматы.1997. 55с.

73. Канунго М. Биохимия старения. М.: Мир. 1982. 296 с.

74. Карапетян А.В., Мкртчян Н.И. Бе-содержащая супероксиддисмутаза из Pseudomonas aeruginosa//Биохимия. 1996. Т. 61. Вып. 8. С. 1480-1413.

75. Карасев Г.С., Нарлева Г.И., Боруах К.К., Трунова Т.И. Изменение состава и содержание полпептидов в процессе адаптации озимой пшеницы к низким отрицательным температурам // Физиология и биохимия культ, растений. 1991. Т. 23. С. 480-485.

76. Карасев Г.С., Нарлева Г.И., Ященко И.А., Кузнецов Вл.В., Трунова Т.И. Динамика синтеза белков при адаптации озимой пшеницы к морозу // Прикл. биохим. и микробиология. 1994. Т. 30. № 4-5. С. 667-671.

77. Каримова Ф.Г., Тарчевская О .И., Леонова С.А., Жуков С.Н. Влияние фитогормонов на содержание цАМФ в растениях // Физиология и биохим. культ, растений. 1990. Т. 22. № 6 . С. 532-537.

78. Карташов И.М., Холоденко Н.Я., Музафаров Е.Н. Влияние кинетина и абсцизовой кислоты на активность аденилаткиназы хлоропластов гороха // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т.35. №4. С. 463-467.

79. Кения М.В. Динамика свободнорадикальных процессов и продуктовкатаболизма в тканях системы крови при гипероксии // Автореф. дис.канд. биол. наук. Ростов н/Д.: НИИ биологии Ростов, гос. ун-та. 1991. 19 с.

80. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи совр. биологии. 1993. Т.ПЗ.Вып. 4. С. 456-470.

81. Ким Б.Б. Механизм действия пероксидазы // В кн. Газарян И.Г., Урманцева В.В., Решетникова И.А., Кунаева P.M., Ким Б.Б. Биотехнология пероксидаз растений и грибов. М.: Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. 1992. Т. 36. С. 126-146.

82. Кириллова Н.В. Активность и молекулярная гетерогенность пероксидазы в процессе роста каллусной культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. штамм К-27 //Раст. ресурсы. 2000. Т. 36. Вып. 1. С. 81-85.

83. Кириллова Н.В., Комов В.П. Транспорт и оборот альдолазы печени крыс крыс при общем рентгеновским облучением // Радиобиология. 1983. Т. 23. Вып. 1. С. 27-30.

84. Кириллова Н.В., Комов В.П., Бекджанян А.Г. Биосинтез и стабильность альдолазы в монослое интактных и облученных клеток печени крыс //Радиобиология. 1989. Т. 29. Вып. 2. С. 154-157.

85. Клячко Н.Д., Бочарова М.А. Активность бесклеточной трансляции полисом в связи с влиянием низких температур// Физиология растений. 1989. Т.36. № 1. С. 112-117.

86. Кобыльская Г.В., Полевой В.В., Ковалева JI.B. О неспецифичности действия ИУК на активность пероксидазы в отрезках клеоптилей кукурузы // Физиология растений. 1977. Т.24. Вып. 1. С. 185-188.

87. Колесниченко Л.С., Кулинский В.И. Биологическая роль глютатиона// Успехи совр. биол. 1990. Т.107. №2. С. 179-184.

88. Колесниченко Л.С., Кулинский В.М., Манторова Н.С., Шапиро Л.А. Влияние фенобарбитала, ионола и сАМР на активность ферментов метаболизма глутатиона у грызунов // Укр. биохим. журнал. 1990. Т.62. № 4. С. 60-65.

89. Комов В.П. Биохимическая фармакология и оборот индивидуальных белков в клетках // Всесоюзн. научн. конф. "Исследование по изысканию лекарственных средств природного происхождения". Л., 1981. С.115-120.

90. Комов В.П., Кириллова Н.В. Влияние радиации на биосинтез и молекулярную гетерогенность альдолазы в крови и печени крыс // Радиобиология. 1980. Т. 20. №1. С. 14-18.

91. Комов В.П., Кириллова Н.В. Биосинтез и распад альдолазы в печени крыс-носителей опухоли // Вопр. мед. химии. 1981. Т. 27. № 2. С. 204-206.

92. Комов В.П., Кириллова Н.В., Алексейчук Н.В. Выделенние и очистка альдолазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. // Биохимия. 1986. Т.51. Вып.7. С. 1180-1185.

93. Комов В.П., Копылов П.Х. Влияние ионизирующей радиации на скорости синтеза и распада каталазы в различных субклеточных фракциях клеток печени крыс // Радиобиология. 1981.Т.21.№З.С. 421-423.

94. Комов В.П., Шмелев В.К. О некоторых особенностях кинетики ферментативных реакций на примере каталазы // Биохимия. 1975. Т 40. Вып.40.С.21-24.

95. Комов В.П., Кириллова Н.В., Воробьева Н.А. Гормональная регуляция ферментов в культуре ткани раувольфии змеиной // Тез. докл. Междун. конф. «Биология культивируемых клеток и биотехнология». Новосибирск. 1988. Т. 1. С. 34.

96. Константинова М.Ф. Влияние температуры выращивания на активность и термоустойчивость карбоксилэстеразы озимой пшеницы Мироновская 808. Физиология растений. 1983. Т.15. №1. С. 28-33.

97. Костюк В.А., Полюхович Г.С. Влияние супероксиддисмутазы и донора N0 на репродукционные нарушения ритма сердца у крыс // Бюлл. эксп. биол. мед. 1999. Т. 127. №2. С. 137-140.

98. Критенко С.П., Титов А.Ф., Акимова Т.В. Влияние ингибиторов биосинтеза белка на физиологические процессы у растений при низких и высоких закаливающих температурах // Термоадаптация и продуктивность растений. Петрозаводск. 1986. С. 45-58.

99. Кудоярова Г.Р. Уровень фитогормонов в растении: способы регуляции выхода клеток меристемы корня из состояния пролиферативного покоя // Экологические аспекты регуляции роста и продуктивности растений. Ярославль. 1991. С. 158-169.

100. Кузнецов Вл.В., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Влияние цитокинина и нитрата на синтез РНК и нитратредуктазную активность в изолированных зародышах куколя // Физиология раст. 1979. Т.26. № 2. С. 309-317.

101. Кузнецов П.В. Синтез, исследование и применение адсорбентов аффинного типа биомедицинского и фармацевтического назначения // Автореф. дис. . докт. биол. наук. М., 1992. 32с.

102. Кузьмина Г.Р. Баланс эндогенных ИУК и АБК в листьях и репродуктивных органах на поздних этапах онтогенеза растений // Физиол. раст. 1997. Т. 44. № 5. С. 769-774.

103. Кукина И.М., Микулович Т.П., Кулаева О.Н. Изменение синтеза хлоропластных белков и структуры хлоропластов семядолей тыквы под влиянием абсцизовой кислоты // Физиология растений. 1995. Т. 42. С. 686695.

104. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка // М.: Наука. 1982. 83 с.

105. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка: XLI Тимирязевское чтение // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука. 1985. С. 62-84.

106. Кулаева О.Н. Восприятие и преображение гормонального сигнала у растений // Физиология растений. 1995. Т. 42. № 5. С. 661-671.

107. Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология. М.: Высшая школа. 1985.1. С.285.

108. Кунах В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro // Физиол. растений. 1999. Т.46. №6. С. 919-929.

109. Кунах В.А., Каухова И.Е., Алпатова Л.К. и соавт. Особенности поведения клеток в культуре тканей Rauwolfia serpentina Benth. // Цитология и генетика. 1982. Т.16. No 5. С. 6.

110. Курганова Л.И., Веселов А.П., Гончарова Т.А., Синицына Ю.В. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная система защиты в хлоропластах гороха при тепловом шоке // Физиология растений. 1997. Т. 44. №5. С. 725-730.

111. Ладыженская Э.П. Влияние фитогормонов на АТФ-зависимое накопление протонов в везикулах плазмалеммы из клубней картофеля // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 1. С. 85-89.

112. Лисков Д., Изворская Н. Состояние и дальнейшее развитие работы с культурами in vitro // Междунар. агропром. журн. 1990. № 2. С. 72-78.

113. Ломоносова Е.Е., Пикулев А.Т., Курченко В.П. Механимз антиоксидантной защиты печени крыс при действии ароматических аминов // Биохимия. 1992. Т. 57. Вып. 7. С. 1077-1082.

114. Ломоносова Е.Е., Пикулев АЛ., Курченко В.П. Активность антиоксидантной системы печени крыс при бензидиновой интоксикации и введении экомеланина// Биохимия. 1993. Т. 58. Вып. 4. С. 580-583.

115. Лосева О.И., Осипов В.В., Ванякин Е.Н., Гаврюшкин А.В. Выделение супероксиддисмутазы с использованием метода электрофореза в свободном потоке // Биотехнология. 1995. № 5-6. С. 25-29.

116. Максименко А.В. Модифицированные препаратысупероксиддисмутазы и каталазы для защиты сердечно-сосудистой системы и легких//Успехи совр. биол. 1993. Т. 113. Вып.З . С. 351-365.

117. Максименко А.В. Ковал ентная модификация субъединицсупероксиддисмутазы хондриотинсульфатом // Биохимия. 1997. Т. 62. Вып. 10. С. 1359-1363.

118. Максименко А.В., Тищенко Е.Г. Модификация каталазы хондриатинсульфатом//Биохимия. 1997. Т. 62. Вып. 10. С. 1364-1368.

119. Максимов Г.Б., Батов А.Ю. Роль цитокининов в регуляции АТФ-зависимого транспорта ионов // В кн.: Регуляция роста и развития растений. Киев: Наукова думка. 1989. С. 54-72.

120. Максютова Н.Н. Белковый обмен растений при стрессе // Автореф. дис. докт. биол. наук. М. 1998. 38 с.

121. Маринченко Г.В. Специфические протеиназы, деградирующие пролактин в молочной железе : субклеточная локализация и ингибиторный анализ//Биохимия. 1985. Т.50. Вып.2. С.200-210.

122. Маричева Э.А., Родченко О.П., Нечаев JI.B. Дыхание клеток корня кукурузы при замедлении скорости его роста пониженной температурой // Физиология растений. 1975. Т. 22. Вып. 3. С. 591-599.

123. Маркова И.В., Батов А.Ю., Машков А.В., Максимов Г.Б. Кальций -транспортирующие системы плазмалеммы колеоптилей кукурузы // Физиол. растений. 1995. Т.42. С. 262-267.

124. Маянский А.Н., Невмятуллин А.Л., Маянский Н.А. Проблемы управления фагоцитарными механизмами иммунитета // Ж. микроб, эпидем. и иммунобиол. 1995. № 3. С. 21-26.

125. Медведев С.С., Батов А.Ю., Моков А.В., Маркоса И.В. Роль ионных каналов в трансдукции ауксинового сигнала // Физиол. растений. 1999. Т.46. №5. С. 711-717.

126. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи совр. биологии. 1993. Т. 113. №4. С.442-455 .

127. Метелица Д.Н. Активация кислорода ферментными системами. М.: Наука. 1982. 256 с.

128. Метелица Д.И. Моделирование окислительно-восстановительных ферментов. Минск: Наука и техника. 1984. 293 с.

129. Метлицкий JI.B., Озерецковская О.Л., Кораблева Н.П. и др. Биохимия иммунитета, покоя, старения, (отв. редактор чл.-корр. АН СССР Березин Н.В.). М.: Наука. 1984. 264 с.

130. Мурорщев Г.С., Агнистикова В.П. // Гиббереллины. М.: Наука. 1984.208 с.

131. Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и пролиферации растений. М.: Агропромиздат. 1987. 384 с.

132. Николаева Л.А. Клеточные технологии на основе культуры Раувольфии in vitro // Дис. . докт. фарм. наук. СПб., 1993. 345 с.

133. Николаева Т.Н., Запрометов М.Н. Активность и субстратная специфичность о-метилтрасферазы чайного растения и полученной из него культуры ткани // Физиол. раст. 1990. Т. 37. № 2. С. 378-385.

134. Носов A.M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений Под ред. Бутенко Р.Г. М.: Наука. 1991. С. 5-20.

135. Носов A.M. Культура клеток высших растений уникальная система, модель, инструмент// Физиол. растений. 1999. Т. 46. №6. С. 837-844.

136. Осипов А.Н., Азизова О.А. Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и их роль в организме // Успехи биол. химии. М.: Наука. 1990. Т.31. С. 180- 208 .

137. Осипова Е.А., Цыбулько Н.С., Шамина З.Б. Вариабельность клеточных клонов // Физиол. растений. 1999. Т.46. №6. С. 908-914.

138. Орехова И.А. Изучение метаболизма и механизмов деградациикаталазы в культуре ткани раувольфии змеиной // Автореф. дис.канд.биол. наук. С-Пб. 1997. 24 с.

139. Пастер Е.У., Овод В.В., Позур В.К., Вихоть Н.Е. Иммунология (практикум). Киев.: Высша школа. 1989. С.57-59.

140. Пескин А.В. Взаимодействие активного кислорода с ДНК // Биохимия. 1997. Т.62. Вып. 12. С. 1571-1578.

141. Пескин А.В., Шарова Н.П., Димитрова Д.Д., Столяров С.Д., Филатова JI.C. Влияние окислительного стресса на ДНК-полимеразы в эмбриогенезе вьюна Misgurnus fossilis L. // Докл. РАН. 1997. Т.355. С. 262-265.

142. Петрова О.П., Колоша О.И., Мишустина П.С., Сухарева И.Б.

143. Множественность форм ферментов и ее модификация у озимой пшеницы в период адаптации к низким температурам // Физиология растений. 1985. Т. 17. №4. С. 361-366.

144. Петровская-Баранова Т.П. Физиология адаптации и интродукции растений. М.: Наука. 1983. 152 с.

145. Писецкая Н.Ф. К вопросу о подборе питальной среды для культуры ткани женьшеня // Раст. ресурсы. 1970. Т.6. Вып.4. С.516-522.

146. Писецкая Н.Ф., Бутенко Р.Г. Особенности роста тканей корня женьшеня настоящего ( P. ginseng С.А. Меу) // В сб.: "Вирусные болезни с/х растений Дапльнего Востока". Владивосток. 1971.Вып.2. С. 93-101.

147. Плотников В.К. Стабильность мРНК как фактор регуляции экспрессии генов в клетках эукариот // Успехи совр. биол. 1992. Т. 112. Вып.2. С. 186-199.

148. Полевой В.В. Роль ауксина в системах регуляции у растений. JL: Наука. Ленингр. отд-ние. 1986. 80 с.

149. Полевой В.И. Фитогормоны: мембранные аспекты действия // Регуляторы роста и развития растений. Киев: Наукова Думка 1989а. С. 49-53.

150. Полевой В.В. Физиология растений. М.: Высшая школа. 19896. 464 С.

151. Порфирова С.А., Хохлова В.А., Клюева Н.Ю., Кулаева О.Н. Влияние ингибиторов синтеза РНК и белка на ответ клеток листьев Arobidopsis thaliana (L.) на тепловой шок//Физиология растений. 1992. Т. 39. №1 . С. 159-164.

152. Пруидзе Г.Н. Окислительно-восстановительные ферменты чайного растения и их роль в биологии. Тбилиси: Мецниереба. 1987. С.55-109.

153. Рекославская Н.И., Гамбург К.З. Метаболизм ИУК в номральных и автономных культурах раститенльных тканей // Физиология растений. 1974. Т.21. Вып.4. С.721.

154. Реймерс Ф.Э., Хавкин Э.Е. Новообразование белков в растущей клетке // Физиология растений. 1970. Т. 17. Вып. 2. С. 337-347.

155. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и эффективность. М.: Наука. 1988. 247 с.

156. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Воскресенская Н.П. Действие фитогормонов in vitro на активность протеинкиназ, связанных с мембранами тилакоидов// ДАН СССР. 1990. Т. 313. Вып. 4. С. 1021-1023.

157. Романов Г.А. Рецепторы фитогормонов // В кн.: Регуляторы роста и развития растений. Киев: Наукова думка. 1989. С. 80-89.

158. Ротман Дж.Е., Ленард Дж. Мембранный транспорт в клетках животных // Перспективы биохимических исследований. М.: Мир. 1987. С. 130-136.

159. Румянцев А.П., Тиунова Л.В., Остроумова Н.А. Метаболизм органических соединений жирного ряда // Итоги науки и техники. Токсикология. М. 1981. Т.12. С. 65-116.

160. Савич И.М. Пероксидазы стрессовые белки растений // Успехи соврю биол. 1989. Т. 107. Вып. 3. С. 406-417.

161. Саляев Р.К., Озолина Н.В., Продедов Е.В. Влияние экзогенных фитогормонов и кинетина на гидролитическую активность протонных помп тонопласта в онтогенезе столовой свеклы // Физиол. раст. 1999. Т. 46. № 1. С. 5-8.

162. Самолин Ю.А. Исследование биосинтеза и стабильности вакуолярной протеиназы из культуры ткани R. serpentina // Автореферат канд. дисс. С-П6.Д992, 23 с.

163. Самуйлов В.Д. Фотосинтетический кислород: роль Н2О2 // Биохимия. 1997. Т. 62. Вып. 5. С. 531-534.

164. Сарсенбаев К.Н., Полимбетова Ф.А. Роль ферментов в устойчивости растений // Алма-Ата: Наука. 1986. 180 с.

165. Семихатова О.А. Энергетичесие аспекты интеграции физиологических процессов в растении // Физиология растений. 1980. Т.27. Вып. 5. С. 10051017.

166. Семихатова О.А. Энергетика дыхания растений в норме и при экологическом стрессе. Л.: Наука. Лен. отд. 1990. 72 с.

167. Семихатова О.А. Оценка адаптивной способности растений на основании исследований темнового дыхания // Физиология растений. 1998. Т. 45. №1. с. 142-148.

168. Сидоров В.А. // Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев: Наукова думка. 1990. 280 с.

169. Скоркин Л.В., Божно И.Г. А.с. № 449772 // БИ. №42. А 61К 27 /14.1974.

170. Скулачев В.П. Возможная роль АФК в защите от вирусных инфекций //Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 12. С. 1691-1694.

171. Слепян Л.И., Минина С.А., Старцев Ф.Н., Кудрина Л.В. и др.// Способ культивирования тканей и клеток растений продуцентов БАВ. АС № 1531488 от 11.04.88 г.

172. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховенко М.Н., Октябрьский О.Н. Устойчивость к окислительному стрессу у штаммов Е. coli, дефицитных по синтезу глутатиона//Биохимия. 1999. Т. 64. № 10. С. 1318-1324.

173. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на экстремальные воздействия // Вопр. мед. химии. 1988. Т. 34. Вып. 6. С.2 11.

174. Ступникова И.В., Боровский Г.Б., Войников В.К. Накопление термостабильных белков в проростках озимой пшеницы при гипотермии // Физиология растений. 1998. Т. 45. № 6. С. 859-864.

175. Судачкова Н.Е., Любарская Т.Г., Кожевникова Н.Н. Изменение ферментной активности в процессе дифференцировки камбиальной зоны хвойных // Физиолого-биохимические процессы у хвойных растений. Красноярск. 1978. С. 55-63.

176. Сысоев О.В., Грузман М.Б., Иванов Е.В., Троценко Ю.А. Каталаза метиотрофных дрожжей Hansenula polymorpha: очистка и свойства. Биохимия. 1991. Т.56. Вып. 10. С.1858-1863.

177. Танкелюк О.В., Полевой В.В. Индуцируемое ауксином повышение протеинкиназной активности микросомальной фракции клеток колеоптилей кукурузы // Физиология растений. 1996. Т. 43. № 2. С. 201-207.

178. Тарчевский И.А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липидов // Физиология растений. 1992. Т. 39. № 6. С. 1215-1223.

179. Тарчевский И.А. Катаболизм и стресс у растений М.: Наука, 1993.80с. Титов А.Ф. Изопероксидазы растений//Успехи совр. биол. 1975. Т.80. Вып. 1(4). С. 102-115.

180. Титов А.Ф., Акимова Т.В., Таланова В.В., Критенко С.П. Физиологическая адаптация огурцов и томатов к холоду и повышенным температурам // Физиол. и биохимия культ, раст. 1984. Т. 16. № 6. С. 589-593.

181. Титов А.Ф., Таланова В.В., Волкова Р.И., Критенко С.П., Шерудило Е.Г. Роль фитогормонов в процессах температурной адаптации растений // Регуляторы роста и развитие растений. Киев.: Наукова Думка. 1989. С. 297.

182. Урманцева В.В. Пероксидазы культивируемых клеток растений // В кн. Газарян И.Г., Урманцева В.В., Решетникова И.А., Кунаева P.M., Ким В.В. Биотехнология пероксидаз растений и грибов. М., Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. 1992. Т.36. С. 54-70.

183. Урманцева В.В. Пероксидазы люцерны II В кн. Газарян И.Г., Урманцева В.В., Решетникова И.А., Кунаева P.M., Ким В.В. Биотехнология пероксидаз растений и грибов. М., Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. 1992а. Т.36. С. 70-88.

184. Фельдман Л.Н. Темпераутрная зависимость ферментативной активности и константы Михаэлиса кислой фосфатазы из листьев весеннего и летнего белоцветников//Цитология. 1973. Т.15. № 2. С. 170-176.

185. Фельдман Л.Н., Денько Е.И., Каменцева И.Е., Константинова М.Ф. Теплоустойчивость клеточных функций и белков двух сортов пшеницы с разной агро-биологической характеристикой П Цитология. 1981. Т.21. №11. С. 1275-1283.

186. Фельдман Л.Н., Каменцева И.Е. Роль пероксидаз в изменении активности пероксидазы из закаленных нагревом листьев пшеницы при хранении неочищенного экстракта//Цитология. 1984. Т.26. № 5. С. 583-587.

187. Хавкин Э.Е. Формирование метаболических систем в растущих клетках растений. Новосибирск : Наука (Сибирское отделение). 1977. 221 с.

188. Хавкин Э.Е., Токарева Э.В., Обручева Н.В. Скорость синтеза белка в зонах роста корней проростков кукурузы // Физиология растений. 1967. Т. 14. No 6. С. 997-1005.

189. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир. 1988.568с.

190. Черепнева Г.Н., Кукина И.М., Кузнецов Вик.В., Кулаева О.Н., Микулович Т.П. Влияние АБК на синтез суммарных и хлоропластных белков и на накопление транскриптов хлоропластных генов в семядолях тыквы // Физиол. раст. 1999. Т.46. № 1. С. 58-68.

191. Чернядьев И. И. Фотосинтез растений в условиях водного стресса и протекторное влияние цитокининов // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. Т.ЗЗ.№1.С. 5-17.

192. Четверикова Е.П. Роль абсцизовой кислоты в морозоустойчивости растений и криоконсервация культур in vitro // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 5. С. 823-829.

193. Чигрин В.В. // Физиология растений. 1988. Т. 35. № 6. С. 1198- 1204.

194. Чкаников Д.И. Метаболизм этилена // В кн.: Регуляция роста и развития растений. Киев: Наукова думка. 1989. С. 72-80.

195. Шамина З.Б. Стратегия получения мутантных штаммов продуцентов биологически активных веществ // Физиол. растений. 1994. Т.41. С. 879-884.

196. Шаронов Б.П., Чурилова Н.В. Окисление супероксиддисмутазы гипохлоридом. Появление изомеров, обладающих каталитической активностью//ДАН СССР. 1990. Т.314. №6. С. 1500-1502.

197. Швецов С.Г., Гамбург К.З. Поступление 2,4-Д в клетки кукурузы в суспензионной культуре // Докл. АН СССР. 1981. Т.257. No 3. С. 765-768.

198. Шинкоренко Н.В. Химическая основа поведения синглетного кислорода в организме человека //Вопр. мед. химии. 1986. Т.32. Вып. 5. С. 27.

199. Юдина О.С., Леина Г.Д. Температурная зависимость дыхания некоторых сортов яровой пшеницы среднего Поволжья // Физиол. и биохим. культ, раст. 1983. Т. 15. № 4. С. 315-321.

200. Яаска В. Изоферменты супероксиддисмутазы в проростках фасолиевых //Изв. АН ЭССР. Биол. 1984. Т.ЗЗ. № 1. С. 42-49.

201. Якушина Н.И., Кулакова И.А. О механизме действия ауксина // Рост растений и его регуляция. М.: Наука. 1984. С.3-9.

202. Янковский О.Ю. Кооперативные взаимодействия миелопероксидазы лейкоцитов и опсонинов плазмы крови в системах антимикробной иантиоксидантной защиты // Автореф. дисс.докт. биол. наук. СПб. 1997.33с.

203. Amstad P., Moret R., Cerutti P. Glutathione peroxidase compensates for the hypersensitivity of Cu,Zn-superoxide dismutase overproduces to oxidant stress // II Biol/ Chem. 1994. V. 269. No 3. P. 1606-1609.

204. Anderson P.C., Lovrien R.E., Brenner M.L. Energetic of the response of maize coleoptile tissue to indoleacetic acid // Planta. 1981. V.151. No 6. P. 499505.

205. Arias I.M., Dogle D., Schimke R.T. Studies on the synthesis and dagradation of the endoplasmic reticulum of rat liver // J. Biol. Chem. 1969. V.244. Nol2. P.3303-3315.

206. Asada K. Radical production and scavenging in the chloroplasts // Photosynthesis and the Environment. N.R.Baker, ed. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. The Nitherlands. 1996. P. 123-150.

207. Bachmair A., Finley D., Varshavsky A. In vivo half-life of a protein is a function of its ammo-terminal residue // Science. 1986. V. 234. N 4773. P. 179-186.

208. Baker C. J., Orlandi E.W. Active oxygen species in plant pathogenesis // Ann. Rev. Phytopathol. 1995. V. 33. P. 299-321.

209. Bamforth C.W. Superoxide dismutase in barley // Inst. Brew. 1983. V. 89. No 6. P. 420-423.

210. Bannister J. V., Bannister W.H. The biology and Chemistry of active oxigen // Development in Biochemistry (N-Y e.a.). 1984. V. 26. P. 150-162.

211. Bannister J.V., Calabrese L. Assays for superoxide dismutase // Meth. Biochem. Anal. 1987. V. 32. P. 279-312.

212. Bar-Peled M., Raikhel N.V. Characterization of AtSAC12 and AtSaRl. Proyeins likly involved in endoplasmic reticulum and Golgi transport // Plan Physiol. 1997. V. 114. P.315-324.

213. Baum J.A., Scandalios J.G. Isolation and characterization of the cytosolic and mitochondrial superoxide dismutase of maise // Arch. Biochem. Biophys. 1984. V. 206. No 2. P. 249-264.

214. Beauchamp C., Fridovich I. Isoenzymes of SOD from wheat germ // Bichem.Biophys. Acta. 1973. V.317. Nol. P.50-64.

215. Bernd L., Helmut K. Plant microbody proteins // Hoppe-Seylews Z. Physiol chem. 1976. Bd. 357. P.177-186.

216. Bienz M. Transient and developmetal activation of heatshock genes // Trends Biochem. Sci. 1985. V. 10. No 4. P. 157-161.

217. Boothe J.G., de Beus M.D., Johnson-Flanagan A.M. Expression of low temperature-induced protein in Brassica napus // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 795-803.

218. Bordo D., Dijnovic K., Bolonese M. Conserved patters in the Cu,Zn-superoxide dismutase family // J. Mol. Biol. 1994. V.238. P. 366-368.

219. Bovaird J.H., Ngo T.T., Jenhott Y.M. Optimizing the o-phenilendiame assay for horseradish peroxidase : effects of phosphate and pH, substrate and enzyme concentrations, and stopping reagents // Clin. Chem. 1982. Y.28. P.2423-2426.

220. Bowler C., Montagu M.V., Inze D. Superoxide dismutase and stress tolerance // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. V. 43. P. 83-116.

221. Bradshaw R.A. Protein translokation ana turnover in eukaryotic cells // Trends Biochem. Sci. 1989. Y. 14. No 7. P. 276-279.

222. Bray E.A. Regulation of gene expression by endogenous ABA during drought Stress // Abscisic Acid. Physiology and Biochemistry (ed. Davis. Oxford. UK : Bios Scientific Publ. 1991. P. 81-88.

223. Brickner D.G., Harada J.J., Olsen L.J. Protein transport into higher plant peroxisomes. In vitro import provides evidence for receptor involvement // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 1213-1221.

224. Bronillet L., Simon J.P. Adaptation and accumulation of higher plants at the enzyme level: thermal properties of NAD malate dehydrogenase of two species of aster and their hydrid to contrasting habitals // Can. J. Bot. 1980. V. 58. P.1474-1481.

225. BrowningK.S. //Plant Mol. Biol. 1996. V. 32. P. 107-144.

226. Burdon R.H. Heat shock and heat shock proteins // Biochem. J. 1986. V. 240. P. 313-324.

227. Burdon R.N. Free radicals and cell proliferation // Free radicals Damage and its control ( Ed. by C.A. Rise-Evans, R.N. Burdon). Amsterdam e.a. : Elsevier. 1994. P. 155-185.

228. Buryanov Ya.L, Zackarchenko N.S., Shevchuk T.V., Bogdaarina I.G. Effect of the М-ЕсоК П methyltransferase-encoding gene on the phenotype of Nicotiana tobaccum transgenic cells // Gene. 1995. V. 157. P. 283-287.

229. Calabrese L., PolticetersF. Substitution of arginine for lysine 134 alters electostatic parameters of the active site in shark Cu,Zn-SOD // FEBS Letters. 1989. V. 250. Nol. P. 49-52.

230. Chaloupkova K., Smart C.C. The abscisic acid induction of a novel peroxidase is antagonized by cytokinin in Spirodela polyrriza L. // Plant Physiol. 1994. V.105. P.497-507.

231. Chang E.C., Crawford B.F., Hong Z., Bilinski Т., Kosman D.J. Genetic and biochemical characterization of Cu,Zn-superoxide dismutase mutants in S. cereviseae//J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P.4417-4424.

232. Charles S., Brown I., Mansfield J. Localized changes in peroxidase activity accompany hydrogen peroxide generation during the development of a norhost hypersensitive reaction in Lettucel//Plant Physiol. 1998. V.118. P. 1067-1078.

233. Chibbar R.N., van Huystee R.B. Site of haem synthesis in cultured peanut cells// Phytochemistry. 1986. V. 25. P. 585-587.

234. Chono M., Nemoto R., Yamane H., Murofushi N. Characterization of a protein kinase gene responsive to auxin and gibberellin in cucumber hypocotyls // Plant Cell Physiol. 1998. V.39. No 9. P. 958-967.

235. Christensen J., Bauw G., Welinder C.K., Montagu M.V., Boerjan W. Purification and Characterization of peroxidases correlated with lignification in Pollar Xyleml //Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 125-135.

236. Cohen G. Catalase, glutation peroxidase, superoxide dismutase and cytochrome P-450 // Handbook of neurochem. Second edition. 1983. V. 4. P. 315330.

237. Cooper P., Ho T. H.D. Heat shock proteins in maize // Plant Physiol. 1983. V. 71. P. 214-222.

238. Dat J.F., Lopez-Delgado H., Foyer Ch.H., Scott I.M. Parallel changes in H202 and catalase during thermotolerance induced by salicylic acid or heat accumulation in mustard seedlings // Plant Physiol. 1998. V.116.P. 1351-1357.

239. Davis В J. Method and application to human serum proteins // In: Disk electrophoresis . Ann. N. Y. Acad. Sci. 1964. V.121. P.404-427.

240. Davis D.D. Physiological aspects of protein turnover // Encyclopedia of Plant Physiology. Nucleic acids and protein in plants I. D.Boulter and B.Parthier (eds.). Springer, Berlin, Heidelberg, New York. 1982. V. 14A. P. 189-228.

241. Davis P.J. Plant hormones and their role in plant growth and development. Dordrecheht: M. NijhoffPubl. 1987. 681 p.

242. Deisseroth A., Dounce A.L. Catalase : Physical and chemical properties, mechanism of catalysis, and physiological role // Phytochem. Rev. 1970. V. 30. No 3.P. 319-375.

243. Desideri A., Falconi M. et al. Evolutionary conservativenes of electric field in the Cu,Zn-superoxide dismutase active site. Evidence for coordinated mutation of charged amino acid residues // J. Mol. Biol. 1992. V. 223. P.337-342.

244. Desideri A., Polticelli F., Falconi M. An electrostatic enzyme-substrate recognition : the case of Cu,Zn-SOD // J. Mol. Structure. 1992. V. 256. P. 153-160.

245. Dice J.F., Goldberg A.L. A statistical analysis of the relation between degradation rates and molecular weights of proteins // Arch. Biochem. Biophys. 1975. V.170P. No l.P. 213-219.

246. Dice J.F., Hess E.J., Goldberg A.L. Studies on the relationship between the degradation rates of proteins in vivo and their isoelectric points // Biochem. J. 1979. V. 178. P. 305-312.

247. Dice J.F., Agrraberes F., Kirven-Broons M., Terlecky L.J., Terlecky S.R. Heat shock 70 kD proetins and lysosomal proteolysis // Biol. Heat Shock Proteins and Mol. Chaperones. Cold. Spring Harbor. N.-Y. 1994. P. 137-151.

248. Diezel W. Microheterogeneity of liver catalase // FEBS lett. 1970. V.6. P.166-168.

249. Duke M.V., Salin M.L. Isoenzymes of cuprozinc SOD from Pisum sativum //Phytochemistry. 1983. V. 22. No 11. P. 2369-2373.

250. Dubinina E.E., Babenko G.F., Scherbak I.G. Molecular heterogenity of plasma superoxide dismutase // Free Radical Biol. Med. 1992. V. 113. Nol. P. 1-7.

251. Dunford H.B. Peroxidase in chemistry and biology. Everse J., Eversi K.E., and Grusham M.B., eds., CRC Press, Boca Raton, FL. 1991. V. 2. P. 1-23.

252. Eising R., Gerhardt B. Activity adn hematin content from green sunflower cotyledones//Phytochemistry. 1986. V. 25. P. 27-31.

253. Eising R., Trelease R.N., Weiting N. Biogenesis of catalase in glyoxysomes and leaf-type peroxisomes of sunflower cotyledons // Arch. Biochem. Biophysic. 1990. V.278. P.258-264.

254. Ellis R.J. Role of molecular chaperones in protein folding // Curr. Opinion Struct. Biol. 1994. V.4. No 1. P. 117-122.

255. Epstein E., Lavee S. Uptake, translocation and metabolism of IAA in the olive ( Olea europea) // J. Exp. Bot. 1977. V.28. No 104. P. 619-629.

256. Ericson M.C., Alfinito S.C.H.Proteins produced during salt stress in Tobacco cell culture//Plant Physiol. 1984. V. 74. P. 506-509.

257. Espino F.J., Vazquer A.M. The influence of phytohormones on expression of two isoenzymes in Tobacco callus // Plant. Sci. 1985. V.39. No 3. P. 195-198.

258. Estelle M. Cytokinin action: two receptor better than one? // Curr. Biol. 1998. V.8N0 15. P. 539-541.

259. Halliwell B. Superoxide dismutase, catalase and glutatione peroxidase solutions to the problems of living with oxigen // New Phytol. 1974. V. 73. P. 1075-1086.

260. Halliwell B. Free radicals, antioxidants and human disease : curiosity, cause, or consequence // Lancet. 1994. V. 344. P. 72 Г-724.

261. Hamilton C.M., Frary A., Lewis C., Tranksley S.D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 9975-9979.

262. Harrington H.M., Aim D.M. Interaction of Heat and Salt Schock in cultured Tobacco cells //Plant Physiol. 1988. V. 88. No3. P.618-625.

263. Havir E.A., McHale N.A. Biochemical and developmental characterization of multiple forms of catalase in Tobacco leaves // Plant Physiol. 1987. V. 84. P. 450-455.

264. Heimberger A., Eisenstark A. Compartmentalization of catalases in E. coli // Biochem. Biophys. Res. Comn. 1988. V. 154. P. 392-398.

265. Hertwig В., Streb P., feierabend J. Light dependence of catalase synthesis and degradation in leaves and influence of interfering stress conditions // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 1547-1553.

266. Highfield P.E., Ellis R.J. Synthesis and transport of the small unit of chloroplast ribulose biphosphate carboxylase //Nature. 1978. V. 271. P.420-424.

267. Hirasawa E., Yamamoto S. Propeties and synthesis de novo of auxin-induces a-amilase in pea cotyledons // Planta. 1991. V. 184. No 4. P.438

268. Holmes R.S., Masters C. Epigenetic interconversion of the multiple forms of mouse liver catalase // FEBS lett. 1970. V. 11. P.145-149.

269. Hoopen H.J.G., van Gulik W.M., Meijer J.J., Luyben K.Ch. A.M. Scale-up of plant cell cultures // 8th Int. Biotechnol. Symp. 1988 : Proc. V. 1. Paris. 1989. P. 179-192.

270. Huffaker R.C., Peterson L.W. Protein tuenover in plants and possible means of its regulation // Annual. Rev. Plant Physiol. 1974. Y. 25. P.363 381.

271. Falkner F.A., Saumweber A., Biessman H. Two Drosophila melanogaster proteins related to intermediate filament proteins of vertebrate cells // J. Cell Biol. 1981. V.91. P.175-183.

272. Feder M.E., Hofmann G.E. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response : Evolutionary and ecological physiology // Ann. Rev. Physiol. 1999. V. 61. P.243-282.

273. Federico R., Medda R., Flories G. Superoxide dismutase from lens esculenta. Purification and properties // Plant Physiol. 1985. V. 78. No2. P. 357358.

274. Feierabend J., Dehne S. Fate of the porphyrin cofactors during the light-dependent turnover of catalase and of the photosystem П reaction-center D1 in matyre rye leaves //Planta. 1996. V. 198. P. 413-422.

275. Filek M., Baczek R., Niewiadomska E., Pilipowichz M., Koscielniak J. Effect of high temperatyre treatment of Yicia faba roots on the oxidative stress enzymes in leaves // Acta Biochem. Pol. 1997. V. 44. No 2. P. 315-321.

276. Finley D., Yashavsky S.M. The nbiquitin system: function and meshanisms // TIBS. 1985. V.10. P. 343-347.

277. Flachmann R. Funktionelle bedentung von transit peptiden // Naturwiss. Rdsch. 1991. V.44. No 5. S. 180-181.

278. Foyer C.H., Lopez-Delgado H., Dat J.F., Scott I.M. Hydrogen peroxide- and glutathione-associated mechanisms of acclimatory stress tolerance and signaling // Physiol. Plant. 1997. V. 100. P. 241-254.

279. Frigerio L., de Virgilio M., Prada A., Faoro F., Vitale A. Sorting of Phaseolin to the vacuole is saturable and requires a shot C-terminal peptide // Plant Cell. 1998. V 10. P.1031-1042.

280. Fridovich I. Biological effects of the superoxide radical // Arch. Biochem. Biophys. 1986. V.247. P. 1-11.

281. Fridovich I. Superoxide radical and Superoxide dismutase // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 97-112.

282. Fridovich I. Superoxide dismutase anion radical, Superoxide dismutases, and Related Matters. J. Biol. Chem. 1997. V.272. P. 18515-18517.

283. Frugoli J.A., Zhong H.H., Nuccio M.L., McCourt P., McPeek M.A., Thomas T.L., McClung C.R. Catalase is encoded by a multigene family in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 327-336.

284. Fryer M.J., Oxborough K., Martin В., Ort D.R., Baker N.R. Factor associated with depression of photosynthetic quantum efficiency in maize at low growth temperature //Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 761-767.

285. Gallie D.R., Le H., Caldwell C., Tanguay R.L. et al. The phosphorylation stste of translation instition factors is regulated developmentally and following heat shock in wheat // J. Biol.Chem. 1996. V. 272. P. 1046-1053

286. Gan S., Amasino R.M. Inhibition of leaf senesence by autoregulated production of cytokm// Science. 1995. V.270. P. 1986-1988.

287. Gaspar Т., Penel C1.5 Thope Т., Greppin H. Peroxidases 1970-1980. A survey of their biochemical and physiological roles in higher plants // Geneve: Univ. of Geneva, Centre de Botanique. 1982. 324 p.

288. Gaspar T. Integrated relation of biochemical and physiological peroxidase activitues // In: Greffin H. et al. Molecular and physiological aspects of plant peroxidases. Geneve : Univ. of Geneva. 1986. P. 455-468.

289. Gausing K., Barkardottir R. Structure and expression of ubiquitin genes in higher plants // Eur. J. Biochem. 1986. V. 158. P. 57-63.

290. Geller B.L., Winge D.K. A method for distinguishing Cu,Zn- and Mn-containing SOD // Anal. Biochem. 1983. V.128. Nol. P.86-92.

291. Gezoff E.D., Tainer J.A. et al. Electrostatic recognition between superoxide and copper, zinc superoxide dismutase //Nature. 1983.V. 306. P. 287-290.

292. Gonzales E., Harley S.V., Brush M.D. Purification of glyoxysomal polypeptides, immunocharacterization and subcellular localization of catalase in

293. Goodfellow V.J., Solomonson L.P., Oaks A. Characterization of a maize root proteinase//Plant Physiol. 1993. V.101. P.415-419.

294. Goss S.P.A., Singh R. J., Kalyanaramani B. Bicarbonate enhances the peroxidase activity of Cu,Zn-Superoxide Dismutase // J. Biol. Chem. 1999. Y. 274. No 40. P. 28233-28239.

295. Gould S.J., Keller G.A., Schneider M. et al. Peroxisomal protein import is conserved between yeast, plant, insects and mammals // EMBO J. 1990. V.9. P.85-90.

296. Gronwald J.W., Plaisance K.L. Isolation and characterization of glutatione-S-transferase isozymes from Sorghum // Plant Physiol. 1998. V.l 17. P. 877-892.

297. Graham D., Patterson B.D. Responses of plant to low, nonfreezing temperatures: proteins, metabolism and accumulation // Ann. Rev. Plant Physiol. 1982. V. 33. P. 347-372.

298. Guan L., Scandalios J.G. Two structurally similar maize cytosolic superoxide dismutase genes, SOD4 and SOD4A, respond differentially to abscisic acid and high osmoticum // Plant Physiol. 1998. V.l 17. No 1. P. 217-224.

299. Janssen Y.M., Marsh J.P., Absher M.P., Vacek P.M., Leslie K.O., Borm P.J., Mossman B.T. Expression of antioxidant enzymes in rat lungs after inhalation of asbestos or silica//J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 10625-10630.

300. Jones A.M. Auxin-Binding Proteins // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 1994. V. 45. P.303-322.

301. Jones R.L., Robinson D.G. Protein secretion in plants // New Phytol. 1989. V.lll. No4. P. 567-597.

302. Josu-Estanuol M., Puigdomunech P. Developmental and hormonal regulation of genes coding for proline-rich proteins in Female Inflorencebces and Kernels ofMaizel //Plant Physiol. 1998. V. 116. P. 485-494.

303. Kahl G. Mechanismen des intrazellularren enzymabbaus // Naturwissenschaftliche Rundschau. 1981. 1979. Y.32. No7. P.273-289.

304. Kemp J., Sutton D.W. Protein metabolism in culture plant tisssue. III. Changes inthe rate of protein synthesis, accumulation, and degradation in cultured pith tissue. // Plant. Physiol. 1972. V.49. No 4. P. 596-601.

305. Kende H. Ethylene Biosynthesis // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1993. V. 44. P. 283-307.

306. Kern H. Synthesis und intrazellular transport secretoriche proteine. Anatomischer Anzeiger. 1980. Y. 148. No 74. S. 79-95.

307. Khan M.J. Effect of indoleacetic acid on the metabolic activity of Taraxacum root segments // Biol. Plant. 1980. V.22. No 2. P.86-90.

308. Kim Y.S., Kim D., Yung J. Isolation of a novel auxin receptor from soluble fractions of rice ( Oryza sativa L.) shoots // FEBS Leu. 1998. V.438. No 3. P. 241244.

309. Kim Y.S., Han S. Nitric oxide protects Cu,Zn-superoxide dismutase from hydrogen peroxide-induced inactivation // FEBS letters. 2000. V. 479. P. 25-28.

310. Kimpel J.A., Key J.L. Presence of heat shock mRNA in field grown soybeans//Plant Physiol. 1985. V. 79. No 3. P. 672-678.

311. Kishor P.B.Kavi, Mehta A.R. Growth and metabolism in cotton and tobacco callus cultures // Proc. Indian. Acad. Sci. Plant Sci. 1988. V.98. No 4. P. 277-282.

312. Kitagana Y., Tanaka N. et al. Three-dimensional structure of Cu,Zn-SOD from spinach at 20 A resolution // J. Biochem. 1991. V. 109. P. 477-485.

313. Komov V.P., Kirillova N.V., Samolin Yu.A., Vollosovich A.G. Biosynthesis and stability of some enzymes in the dynamics of the growth of R. serpentina // 20th Meeting of FEBS.Hungary. 1990. P. 285.

314. Konofsky J R. // Photochem. and Photobiol. 1990. V. 51. P. 299

315. Koppenol W.H. Study of superoxide dismutase // In : Oxigen and Oxyradicals in chemistry and biology. ( Rodgers M.A.J, and Powers E.L., eds.). 1981. P.671-674.

316. Kristensen B.K., Bloch H., Rasmussen S.L. Barley coleoptile peroxidases, purification, vjlecular cloning, and induction by pathogens 1 // Plant Physiol. 1999. v. 120, p.501-512.

317. Kunce C.M., Trelease R.N., Turley R.B. Purification and biosynthesis of cottonseed ( Gossipium Hisutum) catalase // Biochem. J. 1988. V.251. P.147-155.

318. Kurepa J., Hurouart D., Van Montagu M., Inzu D. Differential expression of Cu,Zn- and Fe,Mn-superoxide dismutase genes of tobacco during development, oxidative, and hormonal treatments // Plant Cell Physiol. 1997. V.38. No 4. P. 463470.

319. Y.T., Dharmasiri M.A., Harrington H.M. Characterization of a cDNA encoding a novel heat-shock protein that binds to calmodulin // Plant Physiol. 1995. V. 108. P.1197-1202.

320. Maliga P. Plastid transformation in flowering plants // Trends biotechnol. 1993. V.l 1. P. 101-106.

321. Manno M., Ioannides C., Giobson G.G. YI Int. Symp. Microsomes and Drug Oxid. Brighton/ 5-10 Aug., 19*84. Abstr. London: Philadelfia. 1984. P.lll.

322. Manoilov S.E., Komov V.P., Kirillova N. V. et al. Chromatographic isolation of primary and secondary metabolites from plant cell cultures // J. Chromatography. 1988. V. 440. P. 53-64.

323. Maranon M.J.R., van Huystee R.B. Plant peroxidases : interaction between their prostetic groups//Phytochemistry. 1994. V. 37. P. 1217-122.

324. March H., Doug L., Middaugh C.R., Levis V. Conformational stability of Cu,Zn-SOD, the apoprotein, and derivative spectroscopy of phenylalanine and tysosine reciduers // Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 287. Nol. P. 41-47.

325. Matile P. Cell biology monographs, V.l. // The Lytic compartment of plant cells. Vien-N.Y.: Spring-Verlag. 1982. P. 183.

326. Matters G.L., Scandalios J. Effect of the free radicals-generating herbicide paraquat on the expressing superoxide dismutase genes in maize // Biochem. Biophys. Acta. 1986. V.882. P. 29-38.

327. McDonald M.L., Augustine S.L., Burk Т.1., Schwick K.W. A compaarision of methods for measurement of proteins turnover in vivo // Biochem. J. 1979. V.184. P.473-476.

328. McKersie B.D., Chen Y., de Beus M., Bowler C., Hallium K.D., Botterman J. Superoxide dismutase enhances tolerance of freezing stress intransgenic Alfalfa // Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 1155-1163.

329. Miyahara Т., Takeda A., Hachimary A., Samejima T. On the heterogeneity of catalase from goat liver // J.Biol. Chem. 1978. V.86. P.1267-1276.

330. Misra H.P., Fridovich I. The univalent reduction of oxygen by reduced flevins and quinones // J. Biol. Chem. 1972. V.247. Nol. P.188-192.

331. Misra H.P., Fridovich I. Superoxide dismutase and Peroxidase : a positive activity stain applicable to polyacrylamide gel electrophoregrams // Arch. Biochem. Biophys. 1977. V.183. P.511-515.

332. Mohan Kumar G.N., Houtz R.L., Knowles N.R. Age-induced protein modification and increased proteolysis in Potato Seed-Tubers 1 // Plant Physiol. 1999. V. 119. P. 89-100.

333. Moore A.L., Wood C.K., Watts F.Z. Protein import into plant mitochndria // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1994. V. 45. P. 545-575.

334. Moreno V., Oscar A., Vazquez-Duhalt R., Nolasco H. Extracellular accumulation of high specific activity by cell suspension cultures of compea // Plant Cell Repts. 1990. V. 9. No 3. P. 147-150.

335. Mueller S., Riedel H.-D., Stremmel W. Direct evidence for catalase as the predominant H202-Removing enzyme in human erytrocytes. 1997. V. 90. P. 49734978.

336. Munro S., Pelham H.R.B. What turns on heat shock genes // Nature. 1985. V. 10. P. 157-161.

337. Munro S., Pelham H.R.B. An hsp70-like protein in the ER : idebstity with the 78 kd glucose regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein // Cell. 1986. V.46. P. 291-300.

338. Murachige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plantarum. 1962. V.15. No5. P.473-497.

339. Murata M. Effects of auxin and cytokinin on induction of sister chromatid exchanges in cultured cells of wheat (Triticum aestivum L.) // Theor. And Appl. Genet. 1989. V.78. No 4. P. 521-524.

340. Muriyasy Y. Examination of the contribution of vacuolar proteases to intracellular protein degradation in Chara corallina // Plant Physiol. 1995. V.109. P. 1309-1315.

341. Murshudov G.N., Grebenko A.L, Barynin V., Dauter Z., Wilson K.S. et al. Structure of the Heme d of Penicillium vitale and Escherichia coli Catalases // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 8863-8868.

342. Nover L., Hellmund D., Neumann D et al. The heat shock response of eukariotic cells //Biol. Zbl. 1984. V.103. No 2. P.357-435.

343. Okita Th.W. Compartmentation of proteins in the endomembrane system of plant cells // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. P.327-350.

344. Okuda Т., Matsuda Y., Sagisaka S. Abrupt increase in the level of hydrogen peroxide in leaves of winter wheat is caused by cold treatmant // Plant Physiol. 1991. V. 97. P. 1265-1267.

345. Ordas R.J., Fernandez В., Radriquez R. // Benzyladenine controlled protein synthesis and growth in apple cell suspensions // Physiol. Plant. 1992. V. 84. No 2. P. 229-235.

346. Ortiz de Motellano P.R., Kerr D.E. Inactivation of catalase by phenylhydrazine. Formation of a stable aryl-iron heme complex // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 10558-10563.

347. Panniers R. Translational control during heat shock // Biochemie. 1994. V.76. No 8. P. 737-747.

348. Paoletti F., Aldimecci D., Mocali A., Caparrini A. Sensitive spectrophotometric method of determination of SOD activity in tissue extracts // Anal. Biochem. 1986. V.154. No2. P.536-541.

349. Park J.-L, Grant C.M., Davis M.J., Dawes I.W. The cytoplasmasmic Cu,Zn-SOD of Saccharamices cerevisiae is Required for resistece to freeze-tham stress geberation of free radicals during freezing and thawing // J. Biol. Chem. 1998. V. 36. P. 22921-22928.

350. Parsell D.A., Lindquik S. Heat shock protein and stress tolerance // Biol. Heat Shock Proteins and Mol. Chaperones. Cold. Spring. Yarbobor. N.-Y. 1994. P.457-494.

351. Pattabhi V. Plant growth regulators their structure and interactions // Curr. Sci. (India). 1990. V. 59. P. 1228-1235.

352. Peaumont F., Jouve H.M., Garon J., Caillard J., Pelmont J. Purification and properties of a catalase from potato turbers ( Solanum tuberosum) // Plant. Sci. 1990. V.72. P.19-26.

353. Pelham H. Activation of heat-shock genes in eukaryotes // Trens in Genetics. 1985. V.l. No 1. P.31-35.

354. Pool M.R., Lypez-Huertas E., Baker A. Characterization of intermediates in the process of plant peroxisomal protein import // EMBO J. 1998. V. 17. P. 68546862.

355. Popov A.S., Volkova L.A., Butenko R.G. Cryopreservation of germplasm of Dioscorea deltoidea (Medicinal Jam) // Biotechnology in Agroculture and Forestry // Berlin: Springer. (Ed. Bajaj Y.P.S.). 1995. V.32. P. 487-498.

356. Porath J., Olin B. Immobised metalion affinity adsorbtion and immobilised metal ion affinity chromatography of biomaterials serum protein affinities gel -immobilised ion and nickel ions // Biochemistry. 1983. V.22. No7. P. 1621-1630.

357. Prassad Т.К., Anderson M.D., Martin B.A., Stewart C.R. Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatory role for hydrogen peroxide // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 65-74.

358. Pressey R., Shaw R. Inhibitor control of invertase turnover // Plant Physiol. 1966. V. 41. P. 1657-1661.

359. Pulvis A.C., Shewfeit R.L. Does the alternative pathway ameliorate chilling injury in sensitive plant tissue? //Physiol. Plant. 1993. V. 88. P. 712-718.

360. Racchimilvia L., Terragna C. Catalase isoenzymes are useful markers of differentiation in maize yissue culture // J. Cell Biochem. 1993. Suppl. 17B. P. 34.

361. Ramasarma T. Generation of H202 in bimembranes // Biochem. Biophys. Acta. 1982, V. 694. P. 69-93.

362. Racchimilvia L., Terragna C. Catalase isoenzymes are useful markers of differentiation in maize yissue culture // J. Cell Biochem. 1993. Suppl. 17B. P. 34.

363. Reddy S., Venkaiah B. Purification and characterization Cu,Zn-superoxide dismutase from mungbean ( Vigna radiata) seedlings // J. Biosci. 1984. V.6. No 1. P.115-123.

364. Reddy S., Vijaya K., Venkaiah B. Subcellular localization and identification of superoxide dismutase isoenzymes from Pennisetum typhoideum seedlings // J. Plant Physiol. 1984. V.l 17. No 1. P. 81-85.

365. Reddy S., Vijaya K., Savithiri H., Venkaiah B. Isolation of isoenzymes of superoxide dismutase of isoenzymes of superoxide dismutase from bajra (Pennisetum typhoidam) seedlings // Biochem. Int. 1986. V.13. No4. P.649-657.

366. Reeves R.B. The interaction of body temterature and acid-base balance in ectotermic verterbrates //Ann. Rev. Physiol. 1977. V. 39. P.559-586.

367. Ridge J., Osborne D.J. Regulation of peroxidase activity by ethylene in Pisum sativum; requirements for protein and RNA synthesis // J. Exp. Bot. 1970. V. 21. P. 720-734.

368. Roads R.E. Regulation of eukaryotic protein synthesis by initiation factors // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P.3017-3020.

369. Roberts V.A., Fisher C.L. et al. Mechanism and atomic structur of SOD // Free Rad. Res. Comm. 1991. V. 12-13. P. 269-278.

370. Rothman J.E., Schmid S.L. Enzymatic recycling of clatrin from coated vesicles // Cell. 1986. V. 46. P. 5-9.

371. Ruck A., Palme K., Venis M.A., Napier R.M., Felle H.H. Patch-Clamp analysis establishes a role for an auxin bioding protein in the auxin stimulation of plasma membrane current in Zea mays protoplasts // Plant J. 1993. V. 4. P. 41-46.

372. Russell D.A., Sachs M.M. Differantial expression and sequence analysis of the maize glyceraldehyde-3-phophate dehydrogenase gene family // Plant Cell. 1989. V. l.P. 793-803.

373. Sabehat A., Weiss D., Lurie S. The correlation between heat-schock protein accumulation and persistence and chilling tolerance in tomato fruit // Plant Physiol. 1996. V. 110. P.531-537.

374. Saez-Vasquez J., Raynal M., Delseny M. A rapeseed cold-inducible transcript encodes a phosphoenolpyruvate carboxykinase // Plant Physiol. 1995. V. 109. P.611-618.

375. Sankapandi S., Zweier J.L. Bicarbonate is required for the peroxidase function of Cu,Zn-superoxide dismutase at physiological pH // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. No 3. P. 1226-1232.

376. Santos Ph., Chupeau Y. Penicillins and activity of nitrogen metabolism enzymes in plant tissue culture // Plant. Sci. 1989. V. 59. No 1. P. 119-125.

377. Scandalios J.G. Molecular genetics of superoxide dismutase in plants / J. Scandalios, ed., Oxidative stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.-Y. 1997. P. 527-568.

378. Schaller G.E. Ethylene and cytokinin signalling in plants : the role of two-component systems // Essays Biochem. 1997. V.32. P. 101-111.

379. Schechter I. Use of entibodies for the isolation of biologically pure messenger ribonucleic acid from fully functional eucaryotic cells // Biochemistry.1974. V. 13. No 9. P. 1875-1885.

380. Schiavone J.R., Hassan H.M. Biosynthesis superoxide dismutase in eigth prokaryotes: effect of oxigen, paraquat and an iron chelator // FEMS Microb. Lett. 1987. V. 42. Nol.P. 33-38.

381. Schimke R.T., Doyle D. Control of enzymes in animal tissues // Ann. Rev. Biochem. 1970. V.39. P. 929-976.

382. Schwechleineer C., Lourelidon M., Bean M.W. Plant Transcription factor studies // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V. 49. P. 127-150.

383. Sevanian A., Davies K.J., Horrrchstein P. // Amer. J. Clin. Nutr. 1991. V.54. P.SI 129.

384. Shuey D.J., Parker C.S. Binding of Drosophila heat-shock gene transcription factor to the hsp70 promoter // J. Biol. Chem. 1984. V. 261. P. 7934-7940.

385. Simon L.P. Adaptation and acclimation of higher plants at the enzyme level: latitudinal variation of thermal properties of NAD-malate dehydrogenase in Lathyrus japonicus Willd // Oecologia. 1979. V. 39. No 3. P.273-287.

386. Skriver K., Mundy J. Gene expression in response to abscosic acide and osmotic stress // Plant Cell // 1990. V. 2. P. 503-512.

387. Soto A., Allono I., Collada C., Guevara M.-A. et al. Heterologous expression of a plant small heat-schok protein enhances E. coli viability under heat and cold stress // Plant Physiol. 1999. V. 120. P. 521-528.

388. Stadtman E.R. Covalent modification reaction are marking step in protein turnover//Biochemistry. 1990. V. 29. No 27. P. 6323-6331.

389. Storozhenko S., De Pauw P., Montagu M.V., Inzft D., Kushnir S. The heat-shock element is a functional component of the Arabidonsis APX1 gene promoterl //Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 1005-1014.

390. Struglics A., Hakansson G. Purification of serine and histidine phosphorylated mitochondrial nucleoside diphosphate kinase from Pisum sativum // Eur. J. Biochem. 1999. V. 262. P. 765-773.

391. Sun Y., Carnero N., Clore A.M., Moro G.L., Habben J.E., Larkins B.A. Charactirization of maize elongation factor 1A and its relationship to protein quality in the endosperm//Plant Physiol. 1997. V.115. P. 1101-1107.

392. Teeri J.A. Adaptation of kinetic properties to temperature variabylity // Adaptation of plants to water and high temperature stress. New-York, etc.: A Willey Inster Sci. Publ. 1980. P.251-260.

393. Teeri Teemi, Tormala Timo. Biotekniikka kasvinjalostuksessa ja kasvien lisayksessa // Luonnon. Futkija. 1990. V. 94. No 1-2. P. 43-49.

394. Thieringer R., Shio H., Han Y.S. et al. Reroxisomes in Saccharamyces cerevisiae : immunofluorescence analysis and import of catalase A into isolated peroxosomes //Mol. Cell Biol. 1991. V. 11. P. 510-523.

395. Tibell L., Aasa R., Marklund S.L. Spectral and physical properties of human extracellular superoxide dismutase : a comparison with Cu,Zn-SOD // Arch. Biochem. Biophys. 1993. V. 304. No 2. P. 429-433.

396. Thomashow M.F. Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms //Annu. Rev. Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 571599.

397. Tolmasoff J.M., Ono Т., Cutler R.G. Superoxide dismutase: correlation with life-span and specific metabolic rate in primate species // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V.77. No 5. P.2777-2781.

398. Tournaire C., Kushnir S., Baum G., Inze D., Teyssendier de la Serve, Renaudin J.P. A thiol proteinase abd an anionic peroxidese are induced by lowering cytokinin during callus growth in Petunia // Plant Physiol. 1996. V. 111. P. 159-168.

399. Trewavas A. Determination of the rates of protein synthesis and degradation in Lemna minor // Plant. Physiol. 1972. V.49. No 1. P. 40-46.

400. Trewavas A., Malho R. Signal perception and transduction: the origin of the phenotype//Plant. Cell. 1997. V. 9. P. 1181-1195.

401. Vanacker H., Tim L.W., Foyer Ch.H. Pathogen-induced changes in the antioxidant status of the apoplast in Barley leaves // Plant Physiol. 1998. V. 117. P. 1103-1114.

402. Varchavsky A., Bachmair A., Finley D. The n-end rule of selective protein turnover : Mechanistic aspects and functional implications // Biochem. Soc. Trans. 1987. V. 15. No 5. P. 815-816.

403. Varchavsky A. The N-end rule: functions, mysteries, uses // Plant Physiol. 1996. V. 93. P. 12142-12149.

404. Vences F.J., Vaquero F., Vazquez A.M., Rerez de la V.M. Izoenzymatic changes during in vitro morphogenetic processes in selfpollinated spesies of Secale //J. Plant. Physiol. 1986. V. 123. No 1. P. 31-36.

405. Verling E. The roles of heat shock proteins in plants // Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 1991. V.42.P. 579-620.

406. Vierstra R.D. Protein degradation in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1993. V. 44. P.385-410.

407. Venis M. Hormone binding sites in plants. New-York. London: Longman Inc., 1995. 192 p.

408. Volk R., Harel E., Mayer A.M., Gan-Zvi E.E. Catechol oxidase in suspension cultures of apple fruit the effects of growth regulators // J. Exp. Bot. 1978. V. 29. No 112. P. 1099-1109.

409. Wallace S.S. Oxidative stress and the Molecular Biology of Antioxidant defenses ( Scandalios J.G., ed.). CSHL Press. 1997. P. 49-90.

410. Walter P., Gilmore R., Blobel G. Protein translocation across the endoplasmic reticulum // Cell. 1984. V.38.P.3-8.

411. Wan L., van Huystee R.b. A study on glycosylation of cationic peanut peroxidase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 194. No 3. P. 1398-1405.

412. Wang P., Chen H., Qin H., Sankarapandi S., Becher M., Wong P.C., Zweier J.L. Overexpression of Human copper,zinc-superoxide dismutase (SOD) prevent postischemic injury // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. P. 4556-4560.

413. Weiting N., Trelease R.N., Eising R. Two temporally synthesized charge subunits interact to form the five isoforms of cottonseed catalase // Biochem. J. 1990. V.290. P. 233-238;

414. Weretilnyk E., Orr W., White T.C., Iu В., Singh J. Characterization of three related low-temperature-regulatted cDNAs from winter Brassica napus // Plant Physiol. 1993. V. 101. P. 171-177.

415. Westerbeek-Marres C.A.M., Moore M.M., Autor A.P. Regulation of manganese superoxide dismutase in Saccharomyces cerevisiae. The role of respiratory chain activity // Eur. J. Biochem. 1988. V.174. No 4. P. 611-620.

416. Wiederrecht J., Parker C. Purification and properties of the Drosophyla heat shock transcription factor // Abstracts of papers of heat shock meetings. New-York.: Cold Spring Harbor. 1985. P.12.

417. Willekens H., Inze D., Van Montagu M., Van Camp W. Catalase in plants // Molecular Breeding. 1995. V.l. P. 207-228.

418. Wolfraim L.A., Langis R., Tyson H., Dhindsa R.S. cDNA sequence, expression, and transcript stability of a cold accumulation-specific gene, casl8, of alfalfa (Medicago falcata) cells //Plant Physiol. 1993. V. 101. P. 1275-1282.

419. Woodburg W. Determination of catalase isoenzymes in polyacrylamide gels with ferricianide using // Anal. Biochem. 1971. V.44. P.51-56.

420. Xy Y., van Huystee R.B. Identification of an antigenic determinant on anionic peanut peroxidese by monoclonal antobodies // J. Epr. Bot. 1991. V. 42. P. 935-945.

421. Yamaguchi S., Nishimura M., Akazava T. Purification and characterization of heme-containing low-activity form of catalase from greening pumpkin cotyledons //Eur. J. Biochem. 1986. V. 159. P. 315-322.

422. Yamaguchi S., Nishimura M., Akazava T. Distribution of 59- and 55-kDa catalase in dark and light-grown pumpkin and various other plant tissue // Plant. And Cell Physiol. 1987. V. 28. P. 219-226.

423. Yamashita Y., Ashihara H. Characterization of hexokinase from suspensioncultured Catharanthus roseus cells // Z. Naturforsch. 1988. V. 43. No 1112. P. 827-834.

424. Young2 M.E., Keegstra K., Frochlich I.E. GTF promoters the formation of early-import intermediates but is not required during the translocation step of protein import into chloroplasts 1 //Plant Physiol. 1999. V. 121. P.237-244.

425. Zaal E.J. van der, Mennes A.M., Libbenga K.R. Auxin-induced rapid Chages in Tranlatable in tobacco cell suspension // Planta. 1987. V.172. no4. P.514-519.379

426. Zenk M.N. Enzymatic synthsis of alkaloids via plant cell cultures 11 Int. Conf. Chem. and biotechnol. Biologically act. Natur. Prod. Sofia. 1981. V.l P. 213-232.

427. Zheng X., van Huystee R.B. Anionic peroxidese catalased ascorbic acid and IAA oxidation in the presence of hydrogen peroxide : a defence system against peroxidative stress in peanut plant//Phytochemistry. 1992. V. 31.P. 1895-1898.

428. Zheng H., Fisher von Mollar G., Kovaleva V., Stevens Т., Raikhel N. The Plant vesicle-associated SNARE AtVTIla likely mediates Vesicle transport from the trans-Golgi network to prevacuolar compartment // Mol. Biol. Cell. 1999. V.10.No7. P. 2251-2264.

429. Zimniak R., Harter E., Woloszczuk W., Ruis H. Catalase biosynthesis in yeast: formation of catalase A and catalase T during oxygen adaptation of Saccharomyces cerevisiae //Eur. J. Biochem. 1976. V. 71. P. 393-398.

430. Для служебного пользования Экз.No .

431. Министерство здравоохранения Российской Федерации Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия1. ЛАБОРАТОРНЫЙ РЕГЛАМЕНТна производство растительной супероксиддисмутазы (СОД) ЛР -98

432. Срок действия регламента до .200 г.1. Санкт-Пе тербург 1998 г.1. Содержание регламента1. Содержание: стр.

433. Характеристика конечной продукции производства . 3

434. Химическая схема производства .4 ЗЛекнологическая схема производства . 5

435. Аппаратурная схема производства к спецификация оборудования . 8

436. Характеристика сырь я,мат ериалов,полупродуктов ., 17

437. Изложение технологического процесса . 217.Материальный баланс . 28

438. Переработка и обезвреживание отходов производства . . 29

439. Контроль производства и управление технологическим процессом . 30

440. Техника безопасности,пожарная безопасность и производственная санитерия . 34

441. Охрана окружающей среды . 40

442. Перечень производственных инструкций . 41

443. Технико-экономические нормативы . 42

444. Информационные материалы . 44

445. Характеристика конечной продукции производства.

446. Супероксиддисмутаза ( СОД, КФ 1.15.1.1 ) препарат, предназначенный для лечения ряда аутоиммунных заболеваний,в кардиологии и как высокоэффективное противовоспалительное средство.

447. Описание.Белый или светло-серый с желтоватым оттенком лиофильновысушенный порошок .Гигроскопичен.

448. Подлинность. Определяют по биологической активности по отношению к двум субстратам:рибофлавину и о-дианизидину.Удельная активность препарата по отношению к субстратам (рибофлавину,о-ди-анизидину) должна быть не менее 250 Ед.сод на 1 мг препарата.

449. Оптимум поглощения раствора препарата ( "1 мг / мл ) должен находится при 212 + 4 нм.

450. Испытание на токсичность. Тест-доза "190 мг препарата в 0,5 мл дистиллированной воды для инъекций внутрибрюшинно (ГФ XI вып.2,стр.182).Срок наблюдения 48 час.

451. ГОСТ 10700-89 или стружкой древесной по ГОСТ 5244-79.

452. Транспортирование.В соответствии с ГОСТ 11768-80.

453. Хранение.В сухом,защищенном от света месте при температуре от о0 4°.

454. Срок годности.6 месяцев (срок наблюдения).

455. Химическая схема производства.

456. Дистиллированная h I BP.|Подготоввода || |4.1|ка буфер-1 НН |ных раст

457. ЫаНгР04 х 6 Н2О Н I |воров1. NagHP04 х 6 Н2О Н

458. ТП.1j Гомогенизирование j -зН | клеток культуры I1. J !

459. П.2| Центрифугирова- { | I ние |1.j-f-1

460. Дистиллированная h I BP.|Обработвода1. Сорбент (сефа-|декс G-75)|4.2|ка и под-Н |—| |готовка III I сорбента1. Н 1—'

461. ТП.51Лиофилъ ная сушка | |фракций обогащен-| j ных СОД

462. I пыль продукта | | в атмосферу1.I

463. Дистиллированная |-I вода |-Н ТП.б| Растворение1 г

464. Дистиллированная h !BP. |Подгото-|вода || |7.1 |вка бу-1 НН IФерных

465. NaH2P04 х 6 HgO Н I |растово1.II I 1ров1. Na.2HP04 х 6 Н20 Н '-Н1.гвода1.I11 НН

466. Сорбент (сефа- || | |деке G-25) Н L7.2|и подго-|товка j сорбента1. НШ.7| Обессоливаниепромывные воды |фракции не со-|держащие актив-|ноети СОД в |промышленный I стокв поз. ТП 8- 9

467. Аппаратурная схема производства и спецификация оборудования 4.1. чертеж аппаратурной схемы производства1

468. Ведомость спецификаций оборудования, контроль но- измери-• тельных и регулирующих приборов