Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция оксидом азота клеточного цикла в культуре Arabidopsis thaliana in vitro в зависимости от функционирования пути передачи этиленового сигнала

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Регуляция оксидом азота клеточного цикла в культуре Arabidopsis thaliana in vitro в зависимости от функционирования пути передачи этиленового сигнала"

На правах рукописи

Мамаева Анна Станиславовна

Регуляция оксидом азота клеточного цикла в культуре

Arabidopsis thaliana in vitro в зависимости от функционирования пути передачи этиленового сигнала

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

11 но Я 2015

Москва, 2015

005564402

005564402

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Новикова Галина Викторовна

Официальные оппоненты: Дейнеко Елена Викторовна

доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», заведующая лабораторией биоинженерии растений, г. Новосибирск

Савченко Татьяна Викторовна

доктор биологических наук, доцент,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, старший научный сотрудник лаборатории фотоокисления воды, г. Пущино

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, г. Саратов

Защита состоится «24» декабря 2015 г. в 11 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.2110.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К .А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, г. Москва, Ботаническая ул., 35. Факс: (499)977-80-18; e-mail: ifr@ippras.m

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук www.ippras.ru

Автореферат разослан 2015 года.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Оксид азота (N0) - многофункциональный регулятор физиологических процессов, происходящих на всех этапах жизненного цикла растений. Наблюдаемый в последнее время рост интереса к изучению NO у растений, в первую очередь, связан с его ролью как сигнальной молекулы. Принято считать, что в результате проведения первичного сигнала наряду с классическими вторичными посредниками (катионы кальция, производные инозита) образуется NO и его производные, которые способны передавать информацию об изменениях уровня внутриклеточных регуляторов и чувствительности к ним клеток.

Регуляция NO клеточного цикла является общебиологической проблемой как в связи с морфогенезом, так и адаптацией к действию стрессоров различной природы. В клетках животных функции N0 в качестве регулятора клеточного цикла изучены достаточно подробно. Установлено, что «мишенями» N0 в клетках животных могут быть G1/S- и/или 02/М-переходы (Kumar et al., 2010; Napoli et al., 2013). Изучение регуляции клеточного цикла у растений является непростой задачей. В норме деление клеток у растений происходит в локализованных меристемах. Однако необходимо регулировать дедифференцировку клеток при поранении, а также «запускать» эндоциклы, являющиеся характерной особенностью дифференцирующихся клеток растений.

Основными регуляторами клеточного цикла у растений являются фитогормоны, контролирующие прохождение разных его фаз (Dudits et al., 2011). Среди фитогормонов в качестве регулятора клеточного цикла наименее изучен газообразный этилен, который часто называют «стрессовым» гормоном, хотя не вызывает сомнений его роль н в отсутствие стресса. На основании экспериментальных данных, имеющихся в настоящее время, едва ли возможно интегрировать эффекты NO с каноническим путём передачи этиленового сигнала, функционирующим в культивируемых клетках A. thaliana, которые не испытывают действия стрессоров.

Одна из самых актуальных задач современной физиологии растений — исследование проблемы взаимодействия (cross-talk) между разными фкгогормонами и регуляторами роста. Имеется в виду не химическое взаимодействие этих веществ, а взаимное влияние на синтез, транспорт, деградацию и/или взаимодействие на уровне

компонентов путей передачи сигналов. В связи с этим исследование взаимодействия в ходе регуляции клеточного цикла между этиленом и N0, которое может быть связано с влиянием N0 на синтез этилена, или с возможным вмешательством N0 в работу белков, участвующих в передаче сигнала этилена представляет существенный научный интерес.

Цель и задачи исследования. Цель исследования состояла в изучении регуляции N0 клеточного цикла в культивируемых клетках АгаЫс1орз15 ЛаИапа в зависимости от функционирования пути передачи этиленового сигнала. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить динамику образования N0 в культивируемых клетках А. ЛаИапа дикого типа (Со1-0) и этилен-нечувствительного мутанта ет2-1.

2. Установить пределы допустимых концентраций донора N0 нитропруссида натрия (вОТ), обработка которым культивируемых клеток Со1-0 и ет2-1 ведбт к внутриклеточному накоплению N0, но не оказывает влияния на жизнеспособность клеток.

3. Исследовать влияние N0 на синтез этилена культивируемыми клетками А. ЛаИапа Со1-0 и ет2-1.

4. Выявить влияние N0 на прохождение клеточного цикла в культурах клеток А. ЛаИапа 0)1-0 и ет2-1.

5. Проанализировать изменение фосфорилирования клеточных белков, выделенных из культивируемых клеток А. ¡ИаИапа Со1-0 и ет2-1, обработанных донором N0.

6. Выявить влияние ЫО-зависимых посттрансляционных модификаций на ферментативную активность МАРК А. ЛаИапа, участвующих в регуляции синтеза этилена, N0 и клеточного цикла.

Научная новизна. Настоящая работа, посвященная изучению влияния N0 и его производных на пролиферацию неподвергнутых стрессорному воздействию культивируемых клеток А. ЛаИапа, является оригинальным научным исследованием. При изучении образования N0 культивируемыми клетками А. ЛаИапа впервые показано, что уровень и динамика накопления внутриклеточного N0 зависят от сбалансированной работы пути передачи сигнала этилена. Впервые показано, что в культивируемых клетках этилен и N0 ингибируют синтез друг друга. В культивируемых клетках этилен способствует эндоредупликации: он стимулирует

С1ЛЗ-переход, но ннгибирует 02/М-переход. Снижение доли Б-фазных клеток под действием N0 связано с падением уровня этилена. Впервые показана регуляция N0 ферментативной активности МАРК, участвующих в передаче сигнала этилена и регуляции клеточного цикла у растений. Эти новые данные указывают, что N0 вмешивается в передачу сигнала этилена на уровне МАРК. Полученные в работе результаты указывают на общность молекулярных событий, происходящих в клетках всех эукариот в ответ на действие N0, а именно: значение N0 не ограничивается лишь его ролью регулятора межклеточного сигналинга при стрессах. Напротив, N0 — важный регуляторный компонент активно делящихся клеток.

Практическая значимость. Полученные в работе данные имеют, прежде всего, фундаментальный характер. Вместе с тем, они могут иметь и практическое значение ввиду того, что в клетках высших эукариот N0 — патофизиологический регулятор клеточного цикла, старения и запрограммированной клеточной смерти. В связи с этим в настоящее время синтезируются новые доноры N0 для их использования в терапии серьёзных заболеваний человека, в том числе, онкологических. Для выяснения свойств вновь синтезируемых доноров N0 необходимо применять неинвазивные способы оценки их биологической активности, исключающие использование изолированных органов и тканей. Полученные в настоящей работе данные указывают, что культивируемые клетки растений могут оказаться перспективными для рациональной биохимической манипуляции пролиферацией растительных клеток, а также при осуществлении доклинического тестирования новых фармакологических препаратов.

Материалы, изложенные в диссертации, также могут быть использованы в учебной работе при подготовке лекционного материала для чтения курсов лекций по физиологии и биохимии растений в высших учебных заведениях.

Степень достоверности работы. Достоверность полученных результатов обеспечена использованием в работе комплекса методических подходов. При выполнении работы применены современные адекватные и высокочувствительные методы исследования: молекулярно-биологические, цитологические, биохимические и физиологические. Эксперименты проведены в достаточной биологической повторности. Полученные в работе результаты оценены с использованием адекватных

методов статистической обработки данных. Выводы обоснованы экспериментальными данными и отражены в печатных работах.

Апробация результатов. Полученные в работе данные доложены на VIII съезде Общества физиологов растений «Растения в условиях глобальных и локальных природно-климатических и антропогенных воздействий» (Петрозаводск, 2015); XXII Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2015» (Москва, 2015); Международном симпозиуме «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013); Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013); Международной научно-практической конференции «Клеточная биология и биотехнология растений», (Минск, 2013); XIX Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2012» (Москва, 2012).

Положения, выносимые на защиту.

1. Чувствительность к действию NO культивируемых клеток А. thaliana Col-0 и ein2-l зависит от функциональной активности белков, ответственных за передачу этиленового сигнала.

2. Клетки А. thaliana Col-0 активно синтезируют этилен и накапливают NO по мере роста числа клеток. Напротив, клетки этилен-нечувствительного мутанта ein2-l в момент выхода из лаг-фазы характеризуются повышенной продукцией NO, тогда как синтез этилена в них существенно снижен. То есть, в культивируемых клетках этилен и NO влияют на синтез друг друга.

3. Для регуляции клеточного цикла необходимы этилен и NO. В культуре клеток Col-0 и ein2-l под действием низких (до 100 мкМ) концентраций донора NO наблюдается тенденция к увеличению доли S-фазных клеток. При концентрациях донора выше 100 мкМ в культуре клеток Col-0 NO останавливает клеточный цикл на уровне G1/S-перехода, а в культуре ein2-l — на уровне G2/M-nepexofla.

4. Под действием NO в клетках Со1-0 и ein2-l отличаются спектр и уровень фосфорилирования белков. Эти отличия могут быть ключом к пониманию разного физиологического действия NO на клетки Со1-0 и ein2-l, у которых вследствие мутации в гене EIN2 путь передачи этиленового сигнала не работает.

5. В присутствии донора NO в клетках СоЮ и ein2-l образуется пероксинитриг, способный модифицировать аминокислотные остатки Тир, что приводит к появлению в клетках нитрированных белков.

6. Нитрирование и Х-нитрозилирование МАРК A. thaliana, участвующих в передаче этиленового сигнала (AtMPK3 и AtMPK6), регуляции деления клеток (AtMPK4) и синтеза этилена и NO (AtMPK6), влияет на их ферментативную активность.

7. В культивируемых клетках A. thaliana NO выполняет регуляторные функции, направленные на поддержание синтеза этилена на уровне, обеспечивающем активное деление клеток in vitro.

Связь с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнялась в 2012-2015 гг. в соответствии с планом научных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук (ИФР РАН) по теме: «Изучение функций и взаимодействия протеинкиназ цианобактерии Sinechocystis в условиях температурного стресса» (номер государственной регистрации 01200901964). Исследования автора как исполнителя поддержаны грантом РФФИ № 14-04-00333 «Необходимо ли функционирование пути передачи этиленового сигнала для реализации эффектов NO на пролиферацию клеток растений?». Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из которых 6 - в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Объекты и методы исследования, Результаты и их обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Рабата изложена на 179 страницах машинописного текста, включает 31 рисунок и 7 таблиц. Список литературы включает 260 наименований, из которых — 258 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Объект исследования. В качестве объектов исследования использовали суспензионные культуры клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. экотипа Columbia дикого типа (Col-0) и этилен-нечувствительного мутанта по гену EIN2 (ein2-l).

Клетки выращивали в темноте, при 2б°С, 70% влажности, при постоянном перемешивании, в стеклянных колбах в среде SH (Schenk, Hildebrandt, 1972) с 3% сахарозы, 1 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л кинетина. Длительность пассажа составляла 10 суток.

Обработка суспензионных культур Со1-0 н ein2-l донором NO. Клетки инкубировали на свету (140 мкМ/мгхсек) с донором N0 нитропруссидом натрия (SNP) в концентрациях от 5 мкМ до 2 мМ. Все эксперименты проводили на четвёртые сутки после инокуляции клеток в свежую среду, когда клетки как Со1-0, так и ein2-I находились в фазе активного деления.

Накопление активных форм азота (АФА) и АФК культивируемыми клетками Со1-0 н ein2-l определяли при помощи флуоресцентных красителей. Для выявления NO применяли DAF-FM DA (4-амино-5-метиламино-2',7'-дифлуоресцеин диацетат, 5 мкМ), ONOO" - APF (аминофенил флуоресцеин, 5 мкМ), АФК - DCFH-DA (дихлорофлуоресцеин диацетат, 1 мкМ), Ог~ — DHE (дигидроэтидиум, 10 мкМ). Флуоресценцию анализировали при помощи флуоресцентой микроскопии и/или Typhoon Trio+ Imager (GE Healthcare) при X« 480 нм и Xm BP 520 нм/40 нм для DAF-FM DA, DCFH-DA, APF и Xc 480 нм и X™ BP 580 нм/ЗОнм для DHE. Определение жизнеспособности культивируемых клеток производили при помощи 0,02% раствора Erythrosin В.

Определение доли клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла, и оценка распределения ядер проводили по включению 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) в ДНК. За час до окончания инкубации с SNP добавляли EdU до концентрации 20 мкМ. Реакцию останавливали дезокситимидином (200 мкМ), после чего выделяли протопласты. Для детекции EdU, включившегося в ДНК, использовали набор Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS (Invitrogen). ДНК окрашивали DAPI. Интенсивность флуоресценции оценивали при помощи проточного цитофлуориметра Gallios (Beckman Coulter). Для регистрации флуоресценции Alexa Fluor 488 использовали канал FL1 (X«, 488 нм, Х^, 505-545 нм), DAPI - FL9 (Х„ 405 нм, Хеш 430-470 нм). Данные анализировали в программе FlowJo 7.6.2 (http://www.fIowjo.com). Флуоресцентная микроскопия. Флуоресценцию регистрировали при помощи микроскопа Axio Imager Z2 (Zeiss) с цифровой камерой AxioCam MR и блоками фильтров. Фильтр № 44 (X« BP 475 нм/40 нм; Хеш BP 530 нм/50 нм) использовали для

регистрации флуоресценции Alexa Fluor 488, DAF-FM DA, DCFH-DA, APF; фильтр № 02 (Xex G365 нм; X«m LP420 нм) - для регистрации флуоресценции DAPI. Для регистрации флуоресценции витальных препаратов использовали модуль АроТоше (Zeiss). Изображения обрабатывали в программе AxioVision 4.8 (Zeiss). Определение продукции этнлена проводили в газовом хроматографе Цвет 106 с пламенно-ионизационным детектором и устройством для концентрирования углеводородов (Ракитин, Ракитин, 1986).

НИР после обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). РНК выделяли из 100 мг растёртых в жидком азоте клеток при помощи Spectrum Plant Total RNA Kit (Sigma). Концентрацию выделенной РНК определяли спектрофотометрически при Х=260 нм (Specrtophotometer ND-1000 NanoDrop). Препараты РНК очищали от примеси ДНК при помощи ДНКазы I (Fermentas). Обратную транскрипцию проводили при помощи обратной транскриптазы SuperScript Ш First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. ПЦР проводили в 20 мкл буфера, содержащего 60 мМ Трис-HCl (рН 8,5), 25 мМ КС1, 1,5 мМ MgCh, 0,1% Тритон Х-100, 10 мМ Р-меркашоэтанол, по ОД мМ дНТФ, 3 ед. акт. Taq-полимеразы HotTaq (Fermentas), по 2 пмоль каждого из праймеров, 10-100 нг ДНК. Продукты реакции разделяли при помощи электрофореза в 1% агарозном геле. В качестве гена сравнения использовали EF1A.

Выделение белков нз культивируемых клеток Со1-0 и ein2-l. Белки из растёртых в жидком азоте культивируемых клеток экстрагировали в течение 30 мин на льду в буфер, который содержал 50 мМ Трис-HCl (рН 8), 10 мМ MgCh, 2 мМ ЭДТА, 250 мМ сахарозы, 1 мМ бензамидина, 1 мМ ДТТ, 50 мМ Р-глицерофосфата, 2 мМ NaîVO.», 10 мМ NaF, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ФМСФ. Полученный экстракт центрифугировали 30 минут при 16000xg, при 4°С. Полученный супернатант переводили в 10 мМ Трис-HCl буфер (рН 7,6) при помощи гель-фильтрации в колонке NAP-5 (GE Healthcare). Содержание белка определяли при помощи бицинхонинового реагента (Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination, Sigma).

Фосфорилирование цитозольных белков (16000*g) in vitro проводили в реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCb, 1 мМ МпСЬ, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 2 мМ Na3V04,10 мМ р-глицерофосфат, 1 мМ бензамидин, 10 мМ АТФ и по 37 кБк [у-32Р]АТФ (уд. акт. 110 ТБк/ммоль) на

каждые 6 мкг белка. Реакцию инициировали добавлением к реакционной смеси белка, проводили в течение 20 мин при 30°С и останавливали добавлением ацетона до конечной концентрации 80%.

Для определения МАРК активности in vitro образцы (до 10 мкг белка) инкубировали 20 мин при 30°С в реакционной смеси (объёмом 25 мкл), содержащей 0,25 мг/мл МБР (Myelin basic protein), 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 10 мМ MgCh, 1 мМ MnCh, 1 мМ ЭГГА, 1 мМ ДГТ, 1 мМ ФМСФ, 2 мМШэУОд, 10 мМ ß-глицерофосфат, 1 мМ бензамидин, 10 мкМ АТФ и 37 кБк [у-иР]АТФ (уд. акт. 110 ТБк/ммоль). Реакцию инициировали добавлением к реакционной смеси исследуемого белка, останавливали трёхкратным буфером образцов для ДЦС-Na-IIAAr электрофореза и кипячением. Затем проводили электрофорез в денатурирующих условиях в 15% ПААГ. Для визуализации фосфорилирования МВР окрашенные Кумасси СВВ R-250 гели высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой Kodak Biomax MR-1. Электрофорез белков в денатурирующих условиях (ДДС-Na-HAAr) проводили в 12,5%, 13% и/или 15% ПААГ (Т=30%, С=2,67%) по Laemmli (1970). Двумерный электрофорез (2-DE) белков. Препараты белков, выделенные из клеток Со1-0 и ein2-l, инкубированных в течение шести часов с SNP, после реакции фосфорилирования in vitro разделяли при помощи двумерного электрофореза (2-DE). Белки, осаждённые ацетоном, собирали центрифугированием (16000xg, 20 мин при 4°С), очищали при помощи ReadyPrep™ 2-D Cleanup Kit (Bio-Rad) и растворяли в буфере, содержащем 6 М мочевину, 1,5М тиомочевину, 3% CHAPS, 66 мМ ДТТ, 0,5% биолитов pH 3/10 (Bio-Rad) и бромфеноловый синий. По 125 мкл растворённого белка наносили на поверхность 7-см полоски (стрип, Bio-Rad) с градиентом pH 4-7. Изоэлектрическое фокусирование производили в аппарате Protean IEF Cell (Bio-Rad). После изоэлекгрофокусирования стрипы последовательно инкубировали (по 15 мин) в двух буферах. Первый буфер содержал 50 мМ Трис-HCl (pH 8,8), 6 М мочевину, 30% глицерин, 2% ДЦС-Na, 10 мг/мл ДТТ. Второй буфер содержал 50 мМ Трис-НС1 (pH 8,8), 6 М мочевину, 30% глицерин, 2% ДДС-Na, 25 мг/мл йодоацетамида. После этого располагали на поверхности 12,5% ПААГ и проводили ДЦС-Na-IIAAr. Вырезанные из 2-ОЕ-гелей полипептиды, соответствующие фосфобелкам, идентифицировали при помощи MALDI-TOF MS в центре «Постгеномных и

нанотехнологических инноваций» на базе Иннов анионного центра медицинских нанобиотехнологий ГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА. Полусухой перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra 0,45 мкм (GE Healthcare) проводили при помощи Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad). После этого мембраны блокировали в TBST-буфере (10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20) с 2% желатины (Cold Water Fish Skin Gelatin, Sigma), затем инкубировали с первыми антителами. В работе использовали первые моноклональные антитела мыши (Sigma) против дважды фосфорилированной формы МАРК ERK1/2, тирозинилированного тубулина, а-тубулина, 3-нитротирозина и фосфотирозина. Реакцию первых антител с белками выявляли при помощи антител кролика против антител мыши, конъюгированных со щелочной фосфатазой (Promega). Комплексы антиген-антитело визуализировали при помощи Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit (Bio-Rad).

Получение и очистка рекомбинантных белков. Белкам A. thaliana AtMPK3, AtMPK4 и AtMPKö соответствуют локусы AT3G45640, AT4G01370 и AT2G43790, а белкам AtMKKl и AtMKK2 - AT4G26070 и AT4G29810. В качестве матрицы для амплификации кодирующих областей генов использовали кДНК, которую синтезировали в ходе обратной транскрипции. В реакционную смесь добавляли специфичные обратные праймеры для AtMKKl/2 или олипмЛго для AtMPK3/4/5. Для клонирования ПЦР-продуктов применяли вектор рЕТ41а (Novagen). Для экспрессии рекомбинантных белков использовали клетки Е. coli штамм Rosetta (DE3) pLysS. Бактериально экспрессированные белки очищали при помощи аффинной хроматографии на Bio-Scale™ Mini Profinity™ GST Cartridge (Bio-Rad). Соответствие очищенных рекомбинантных белков AtMPK3, AtMPK4, AtMPKö, AtMKKl и AtMKK2 подтверждали при помощи MALDI-TOF MS.

Нитрирование рекомбинантных белков. Экспрессированные в бактериях очищенные при помощи аффинной хроматографии белки GST-AtMPK3/4/6 и GST-AtMKKl/2 инкубировали с 0,1-1 мМ SIN-1 при 37°С в течение двух часов, после чего удаляли SIN-1 при помощи гель-фильтрации в колонке NAP-5 (GE Healthcare) и использовали для проведения реакций фосфорилирования in vitro. 5-ннтрознлированне рекомбинантных белков. Очищенные при помощи аффинной хроматографии белки GST-AtMPКЗ/4/6 и GST-AtMKKl/2 инкубировали 30 мин при

25°С в 10 мМ Трис-НС1 буфере (рН 7,6) с добавлением 10 мМ ДТГ. Не прореагировавший ДТТ удаляли при помощи гель-фильтрации в колонке КАР-5. Затем белки инкубировали с 0,1-2,5 мМ ОЭЫО (^-нитрозоглутатион) при 25°С в течение 30 мин, после чего удаляли ОБЖ) при помощи гель-фильтрации в ИАР-5 и использовали для проведения реакций фосфорилирования т \itro. Окраска полиакриламидных гелей. После электрофор етического разделения белки в гелях окрашивали коллоидным Кумасси СВВ С-250 или Кумасси СВВ11-250. Статистическая обработка данных. Все эксперименты проводили не менее чем в трёх биологических повторностях. На рисунках и в таблицах представлены среднеарифметические значения и их стандартные ошибки. Статистическую обработку результатов проводили с использованием ^критерия Стьюденга при Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние БОТ на жизнеспособность, накопление N0 я АФК культивируемыми клетками Со1-0 и ап2-1. Известно, что эффект N0, как любого регулятора роста растений, зависит, в том числе, от использованной для обработки клеток концентрации. Мы установили, что на свету 24-час обработка клеток Со1-0 донором N0 (БЫР) в концентрации до 50 мкМ не влияла на их сырую массу, при 500 мкМ БОТ рост снижался на 15%, а при 2 мМ - на 25%. Изменение сырой массы клеток Ып2-1 при этих же концентрациях БОТ не превышало 10% по сравнению с контролем. При этом культуры сохраняли жизнеспособность даже при действии 2мМ БОТ. При помощи спектрофлуориметрии показано, что обработка БЫР клеток Со1-0 и ет2-1 уже через 3 час приводила к увеличению содержания N0 в клетках обоих генотипов (рис. 1). Для доказательства специфичности использованного донора N0 мы применили скавенджер N0 2-(4-карбоксифенил)-4,4,5,5-тетраметилимидазолин-1-оксил-З-оксид (сРПО). В присутствии 100 мкМ сРТЮ флуоресценция БАР-ЕМ значительно снижалась (рис. 1). То есть, обработка БОТ, действительно, приводила к росту уровня внутриклеточного N0. При помощи флуоресцентной микроскопии в обработанных ЭЫР клетках Со1-0 и ет2-1 мы наблюдали накопление N0 в цитоплазме, ядре и отдельных органеллах (рис. 2),

Действительно, на фоне высокого содержания в клетках ет2-1 N0 (рис. ЗБ), продукция этилена этими клетками крайне мала и составляла 0,65 нл/(гхчас). Эти данные говорят в пользу того, что в культивируемых клетках этилен и N0 ингибируют синтез друг друга. Более того, можно предположить, что в регуляции клеточного цикла у растений этилен и N0 способны действовать совместно.

Влияние N0 на прохождение клеточного цикла культивируемыми клетками Со1-0 и ет2-1. Чтобы убедиться в непротиворечивости высказанного предположения, мы изучили влияние обработки на переход клеток к синтезу ДНК. У СоЮ через шесть часов обработки вОТ в концентрациях 5 и 20 мкМ наблюдалась тенденция к увеличению количества 5-фазных клеток (рис. 4). Увеличение концентрации донора до 100 и 500 мкМ значительно снижало долю Б-фазных клеток (рис. 4). Донор N0 в концентрации 5 мкМ увеличивал количество 8-фазных клеток и в культуре е1п2-1 (рис. 4). Большие концентрации БОТ (20, 100 и 500 мкМ) в культуре ет2-1 не вызывали такого сильного падения числа Б-фазмых клеток, как в культуре Со1-0.

По окрашиванию клеток Со1-0 и ет2-1 ОАР1 мы оценили их распределение по классам плоидности. В культуре Со1-0 преобладали клетки с тетраплоидными (4С, 36%) и октаплоидными (8С, 38%) ядрами, но присутствовали также клетки и с большей плоидностью (18%). Диплоидные (2С) клетки встречались редко: лишь 2% от общего их числа. Мы не выявили значительного влияния использованных концентраций БЫР на спектр плоидности ядер в культуре клеток СоЮ. Распределение по плоидности ядер клеток мутанта е\п2-1 сходно, но не идентично таковому в культуре клеток СоЮ. Под действием БЫР у еш2-1 доля клеток, ядра которых содержали более 8С ДНК (16С и 32С), увеличивалась с 22% в необработанном ЭЫР контроле до 31-33% после шести часов обработки 20-500 мкМ

Снижение доли 5-фаз в клетках Со1-0 под действием 100 и 500 мкМ ЭИР сопровождалось падением уровня экспрессии СУСйЗ;1, тогда как экспрессия СУСА2;3 и СУСВ1; 1 не изменялась (рис. 5). В клетках ет2-1 наблюдалось снижение экспрессии СУСВ1;! под действием 500 мкМ БЫ Р. Экспрессия СУСА2;3 и СУСйЗ;! под действием 8ЫР не изменялась (рис. 5).

Col-0

ein2-l

5 20 100 500 SNP, M KM

5 20 100 500 SNP, MKM

Рис. 5. Влияние шести часовой обработки SNP на экспрессию генов циклинов CYCA2.-3, CYCB1;1, CYCD3;1. В качестве гена сравнения испопьчпвапи F.F1 А.

Рис. 4. Бипараметрические диаграммы плотности

распределения протопластов,

выделенных из клеток Col-0 (слева) и ein2-l (справа), после шести часовой обработки клеток SNP.

На оси абсцисс флуоресценция DAPI,

соответствующая количеству ядерной ДНК, на оси ординат - флуоресценция Alexa Fluor 488, конътогированното с EdU. Гейтами очерчены клетки, находящиеся в S-фазе. Цифрами внутри гейта обозначен процент S-фазных клеток от общего количества клеток. Справа приведены

концентрации SNP, использованные для обработки клеток Col-О и ein2-l.

Данные об изменении экспрессии генов циклинов также согласуются с результатам проточной цитофлуориметрии, а именно: отсутствие значительного влияния NO на Gl/S-переход и остановку G2/M-nepexofla в культуре клеток ein2-l. Таким образом, мы показали, что обработка клеток Col-0 SNP в концентрации выше 100 мкМ нарушала Gl/S-переход, тогда как эти же концентрации NO не препятствовали переходу клеток к синтезу ДНК в культуре ein2-l. Однако переход клеток ein2-I к

которыми могут быть митохондрии или пероксисомы, как показано другими авторами (Ortega-Galisteo е/ а/., 2012).

Рис. 1. Накопление N0 в клетках Со1-0 (слева) и е1п2-1 (справа) через 3 час инкубации с Пробы, в которые добавляли 100 мкМ сРТЮ, выделены штриховкой.

Кроме того, обнаружено, что SNP снижал уровень АФК в клетках обоих генотипов, то есть окислительный взрыв не происходил. Такой результат можно объяснить тем, что NO способен регулировать

«тонус» антиоксидантной защиты как на уровне транскрипции, так и на посттрансляционном уровне, влияя на активность белков антиоксидантной системы (Chaki et al., 2009; Fares et al., 2011; Lozano-Juste et al., 2011). Отсутствие

.. V •

Рис. 2. Внутриклеточная локализация N0 (А, Б) и ОЫОО" (В, Г) после инкубации клеток с 2 мМ ЙОТ.

Накопившийся в клетках N0 выявляли по их окрашиванию ОАР-РМ ОА (А, Б), ONOO" - по флуоресценции АРР (В, Г). А и В - Со1-0; Б и Г - ет2-1. Масштабные линейки

соответствуют 20 мкм.

окислительного взрыва

указывает, что при выбранных концентрациях 8ОТ клетки не подвергались действию стресса. Следовательно, их можно использовать для решения стоявших перед нами задач.

Накопление N0 в клетках Со1-0 и с'т2-1 в ходе периода субкультивирования. Нам удалось показать, что выход клеток из лаг-фазы в культуре Со1-0 сопровождается синтезом этилена (рис. ЗД), тогда как в культуре ет2-1 - N0 (рис. ЗБ).

0123456789 10 Сутки культивирования

0123456789 10 Сутки культивирования

Рис. 3. Изменение накопления N0 (А, Б), числа клеток (В, Г) и продукции этилена (Д, Е) в культурах клеток Со1-0 (слева) и ет2-1 (справа) в ходе периода субкультивирования.

Пунктиром (на А и Б) проведена линия тренда. ОЕ — относительные единицы.

Хотя в литературе имеются сведения о стимуляции N0 выхода клеток из вО (Соггеа-Ага§ип<1е е? я/., 2006; 8Ьеп е/ а/., 2013), сложно сказать, являются в данной ситуации N0 и этилен триггерами выхода клеток из 00, или увеличение концентрации

этих регуляторов - всего лишь последствие перехода клеток к активной пролиферации. Однако необходимость нормального функционирования белка EIN2 для регуляции синтеза как этилена, так и N0, является очевидной.

Влияние SNP на выделение этилена культивируемыми клетками Со1-0 и ein2-l. О справедливости вывода об отсутствии при обработке SNP окислительного взрыва говорит и снижение продукции этилена клетками Со1-0. Продукция этилена в необработанных клетках Со1-0 составляла 54,6 нл/(гхчас), 20-мкМ SNP снижал этот параметр до 46,3 нл/(гхчас), 100-мкМ - до 27,8 нл/(гхчас), а 500-мкМ - до 30,9 нл/(гхчас). Мы не выявили такого эффекта в культуре е'т2-1, что и не удивительно.

14

митозу нарушался (рис. 4, 5). Поскольку при концентрациях донора NO ниже 100 мкМ мы наблюдали стимуляцию синтеза ДНК как в клетках Со1-0, так и ein2-l (рис. 4), то важный вывод, который можно сделать на основании этих данных, состоит в том, что чувствительность клеток к NO зависит от функционирования пути передачи этиленового сигнала.

Влияние SNP на фосфорилирование белков, выделенных из культивируемых клеток Со1-0 и ein2-l. У интактных растений фосфорилирование белков - сигнальное событие, вовлечённое в передачу многих сигналов, в том числе, этилена. Мы задались вопросом, фосфорилирование каких белков меняется в результате ЕШ2-зависимой регуляции NO клеточного цикла. Среди белков, фосфорилирование которых изменялось в ответ на обработку NO, обнаружены ферменты первичного метаболизма и регуляторные белки (рис. 6). Среди белков, фосфорилирование которых изменялось в ответ на обработку NO, обнаружены ферменты первичного метаболизма (пятна №2 — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, №4 - енолаза), а также регуляторные белки (пятна №3 — 14-3-3-подобный белок GF14 омега, протеин-дисульфидизомераза-подобный белок, №1 _ шаперонин-60 альфа, №5 - Н8Р70-связывающий белок, №6 -NAPl-related protein).

Факт обнаружения NO-зависимого фосфорилирования белка 14-3-3 омега (пятно №3) представляет особый интерес, поскольку белки группы 14-3-3 могут регулировать клеточный цикл (Gremlund et al., 2009), синтез этилена (Yoon, Kieber, 2013) и NO (MacKintosh, Meek, 2001), а также работу МАРК-модулей (Lalle et al.,

2005). Одно из возможных последствий обнаруженного фосфорилирования 14-3-3 могло выражаться в изменении сродства между фосфоформами 14-3-3 и их белкам-партнёрам и - как результат — изменению клеточного цикла, синтеза этилена, NO и активности МАРК. Крайне интересным представляет выявленное изменение под действием NO фосфорилирования цитозольной глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPC, пятно №2). В клетках животных этот белок первичного метаболизма может подвергаться ^-нитрозилированию, связываться с ЕЗ-убиквитин лигазой и после транслокации в ядро медиировать клеточную смерть (Нага et al.,

2006). У растений вопрос об ядерной транслокации GAPC нельзя назвать решённым.

р/4-7 р/ 4-7 р/4-7

А ; so— г г --• 25 _ Д» â 4 20- is —ЯК.'. Ш11ЩЙ • i -г в * ^ 3 Щ 1 ■ ■

75— ji'W* "-'J »- ( ' f' 15 * J •

Рис. 6. Фосфорилирование in vitro фракции растворимых (16000xg) белков клеток Col-0 (А-В) и eiп2-1 (Г-Е) после обработки 100 мкМ (Б, Д) и 2мМ (В, Е) SNP в течение шести часов.

А, Г - необработанный SNP контроль. Стрелками отмечены полипептиды, идентифицированные при MALDI-TOF MS. Слева - величины мол. масс (кД) белковых маркеров, сверху - величина рН стринов, использованных для изоэлектрофокусирования.

Показано, что в суспензионной культуре клеток Nicotiana tabacum при солевом стрессе росло ^-нитрозшшрования GAPC, а две изоформы GAPC взаимодействовали с протеинкиназой NtOSAK и в цигозоле, и в ядре (Wawer et al., 2010). То есть, подобно клеткам животных, растительная GAPC проявляла свойства отличные от её привычных свойств фермента гликолиза. Транслокация GAPC в ядро показана и в корнях проростков Arabidopsis при стрессе, вызванном катионами Cd (Vescovi et al., 2013), причём перемещение GAPC в ядро усиливалось, если в её молекуле аминокислотный остаток Цис заменяли на Сер. Иными словами, у Arabidopsis при Cd-стрессе 5-нитрозилирование не имело отношения к перемещению GAPC в ядро. Работает ли GAPC у растений так, как показано Нага с соавт. (2006) в клетках животных, неясно. Однако исследования в этом направлении определённо заслуживают продолжения.

Влияние NO-зависимых посттрансляционных модификаций на энзиматическую активность рекомбинантных МАРКК и МАРК. На основании физических и химических свойств NO можно предположить, что у него нет

18

собственного белкового рецептора. Этот факт усложняет «расшифровку» пути передачи сигнала NO. Вместе с тем известно, что при биотическом стрессе происходят изменения активности МАРК (Meng, Zhang, 2013). Но в ответе на разные патогены участвует не только N0, но и этилен, салициловая и жасмоновая кислоты. По этой причине не всегда возможно заключить, что обнаруживаемые изменения активности МАРК связаны исключительно с работой NO.

МРКЗ МРК4 МРКб

¡■¡ии •*- МРК

д ........ ...

W 1,1 Щ МВР

о ад 0,5 1 0 0ь1 0,5 1 SIN-1, мМ 0 ОД 03 1

SIN-1, UM Б SIN-1, UM

О 0,1 1 0 0,1 1

МРКЗ .......¿ИД 11 I МРКЗ „

— мвр

МРК4 - мвр

МРКв • .-»-мер

Рис. 7. Влияние нитрирования на рис. 8. Влияние нитрирования GST-

автофосфорилирование и МВР- AtMPK3/4/6 (А) и GST-AtMKKl (Б) на

фосфорилирующую активность GST- способность GST-AtMKKl активировать

А1МРКЗ (МРКЗ), GST-AIMPK4 (МРК4) и GST-AtMPK3 (МРКЗ), GST-AtMPK4 (МРК4)

GST-AtMPK6 (МРК6). и GST-AtMPK6 (МРК6).

Могут ли МАРК отвечать за передачу сигнала NO? На примере объектов животного происхождения показано: да, могут (Bapat et al., 2001; Jeon et al., 2005; Webster et al., 2006a; Narang et al., 2007; Feng et al., 2013). В литературе имеются данные о влиянии NO на активность МАРК ERK1/2, аналогами которых является 12 из 23 МАРК растений. Один из молекулярных механизмов действия NO — нитрирование и 5-нитрозилирование белков. Мы выяснили, что нитрирование ингибирует автофосфорилирование и ферментативную активность AtMPK3/4/6 (рис. 7), но увеличивает их способность активироваться AtMKKl (рис. 8). То есть, нитрирование, скорее, происходит не в сайте фосфорилирования AtMPK3/4/6, поскольку не влияет на взаимодействие этих белков с антителами против фосфотирозина и дифосфорилированной формы МАРК (рис. 9). 5-Нитрозилирование не изменяло активность GST-AtMAPK3/4/6 (рис. 10), тогда как ферментативная активность GST-AtMKKl существенно снижалась (рис. 11). Более того, S-нитрозилирование нарушало способность GST-AtMAPK4/6 активироваться GST-AtMKKl (рис. 11).

Рис. 9. Влияние обработки 3114-1 на нитрирование (А) и фосфорилирование (Б, В) ОЗТ-А1МРКЗ (МРКЗ), ОЭТ-А1МРК4 (МРК4) и С8Т-А1МРК6 (МРК6).

В качестве первичных антител для вестерн-анализа использовали антитела против 3-нигротирозина (А), антитела против фосфотирозина (Б) и антитела против дифосфорилированной МАРК (В).

Таким образом, мы впервые показали NO-зависимые изменения как ферментативной активности белков AtMPK3/4/6, так и способности AtMKKl фосфоршшровать AtMPK3/4/6 in vitro. Хотя эти сведения относятся к рекомбинантным белкам AtMKKl и AtMPK3/4/6, они показывают, во-первых, принципиальную возможности NO-зависимых посттрансляционных модификаций МАРК, которые вовлечены в передачу сигнала этилена (AtMPK3/6) и регуляцию

О 0,1 0,5 1 2 GSNO, мМ

Рис. 10. Влияние ^-нитрозилирования на ферментативную активность GST-AtMPK3/4/6 (МРКЗ/4/6) in vitro.

Рис. 11. Влияние GSNO (2,5 мМ) на МВР-фосфорилирующую активность GST-AtMKKl и GST-AtMAPK3/4/6 (МРКЗ/4/6).

Реакционная смесь содержала: GST-AtMKKl (А); S-шпрозилированную GST-AtMKKl (Б); GST-AtMPK3/4/6 и GST-AtMKKl (В); GST-AtMPКЗ/4/6 и S-нитрозилированную GST-AtMKKl (Г); S-нитрозилированную GST-AtMPK3/4/6 и GST-AtMKKl (Д); ¿"-нитрозилированную GST-AtMPK3/4/6 и 5-ншрозилированную GST-AtMKKl

(Е).

клеточного цикла (А1МРК4). Во-вторых, указывают, что интервенция N0 в передачу сигнала этилена может осуществляться на уровне МАРК.

20

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящее время сложилось представление, что этилен индуцирует эндоредупликацию (Оепскеаи ег а1., 1999; Пап е1 а1., 2003). Эти представления не потеряли своей актуальности. Показано, что у АгаЬШорш этилен стимулирует выход клеток корня из меристематической зоны. Так, ситуация в корнях проростков сходна с таковой в проростках дикого типа, обработанных этиленом, тогда как мутант еь-1 похож на дикий тип, но без обработки этиленом. Мутант ет2 «проявил себя» неожиданно: у ет2 эндоредупликация начиналась раньше, чем в необработанных, но позже, чем в обработанных этиленом клетках корней проростков дикого типа (50"ее1 ег а/., 2015). Следовательно, у растений ет2 работает какой-то «неучтённый» фактор, регулирующий эндоредупликацию. Мы предположили, что таким фактором может быть N0, накапливающийся в клетках ет2-1 в отсутствие этилена (рис. ЗБ).

Если А1МРКЗ/6, активность которых модулируется N0 (рис. 7-11), фосфорилируют ЕЩЗ (Уоо ег а!., 2008), то N0 в отсутствие этилена имитирует этиленовый сигнал. Так как у ет2-1 накапливается много N0 (рис. 1, 3), понятно, почему у этого мутанта по сравнению с Со1-0 повышена экспрессия одного из генов ответа на этилен (£/0*7) (Фоменков А.А., персональное сообщение), и идёт эндоредупликация (рис. 4, 5). Если объединить сведения литературы и наши наблюдения, то очевидно, что этилен нужен для индукции эндоциклов: он стимулирует 01/3-переход, но ингибирует С2/М-переход. Следовательно, в Со1-0 снижение доли Э-фазных клеток связано именно с падением под действием N0 уровня этилена. Более того, в такой ситуации клетки Со1-0 ведут себя как ет2-1, где много N0 и мало этилена. Действительно, при обработке БЫР у Со1-0 Б-фазных клеток становится столько же, сколько у ет2-1 (рис. 4). Тогда в клетках и N0, и этилена должно быть столько же, сколько у Со1-0, а спектры плоидности е!г! и Со1-0 не должны отличаться, что и было показано Степанченко с соавт. (2012). Напротив, в клетках с!т1 должно быть очень мало N0. Таким образом, за ингибирование синтеза N0 должен отвечать именно белок ЕВД2. Отсюда становится понятно, почему у еЬ-1 число трахеальных элементов растёт и от этилена, и от МСР (Степанченко с соавт., 2012): МСР нарушает передачу сигнала этилена, поскольку необратимо связывается с его рецепторами, и вследствие этого растёт содержание N0, который запускает экспрессию ЕЯГ1. Становится также понятно, почему у Со1-0 под действием 100 и

Рис. 12. Возможный механизм действия NO на клеточный цикл.

В присутствии этилена функционирует путь передачи этиленового сигнала, что приводит к эндоредупликации: ингабированию С2/М-перехода и возможной стимуляции Gl/S-перехода. Вовлечённый в передачу этиленового сигнала МАРК-каскад включает МРКЗ/6, которые фосфорилируют EIN3. В результате такой активации ЕШЗ индуцирует экспрессию генов ответа на этилен (ERF). Под действием NO происходит нитрирование МРКЗ/6, что увеличивает их способность активироваться МКК, в результате чего можно наблюдать эффекты этилена на клеточный цикл (эндоредупликацию) даже в отсутствие этилена. С ростом концентрации NO может снижаться продукция этилена вследствие ингибирования NO работы ферментов биосинтеза этилена (МАТ, ACS, ACO) путём N0-зависимых посттрансляционных модификаций либо снижения активности МРКЗ/6, которые в немодифицированном состоянии фосфорилируют ACS2/6, что ведёт к увеличению их стабильности.

500 мкМ SNP выделение этилена падает, но растёт экспрессия ERF1 (Фоменков A.A., персональное сообщение). То есть, в клетках Со1-0 в ответ на обработку SNP нарушается существующий баланс между N0 и этиленом. Основываясь на полученных в работе данных, мы считаем, что NO и этилен являются сигналами, которые запускают в отсутствие стресса эндоредупликацию и переход к дифференцировке. Механизмы действия NO на клеточный цикл у растений,

выявленные в ходе работы и рассмотренные в контексте уже известных закономерностей регуляции клеточного цикла, схематически представлены на рис. 12.

Таким образом, значение N0 не ограничивается лишь его ролью регулятора межклеточного сигналинга при стрессах. Напротив, N0 - важный регуляторный компонент активно делящихся клеток.

ВЫВОДЫ

1. Чувствительность культивируемых клеток А. гИаИапа к действию оксида азота (N0) связана с функционированием пути передачи этиленового сигнала.

2. В культивируемых клетках А. ЛаНапа этилен и оксид азота ингибируют синтез друг друга.

3. Под действием низких концентраций оксида азота в клетках А. ЛаНапа дикого типа (Со1-0) и мутанта по позитивному регулятору пути передачи этиленового сигнала ЕШ2-1 наблюдается увеличение доли Э-фазных клеток. Высокие концентрации оксида азота в клетках Со1-0 останавливают 01/8-переход, тогда как в клетках ет2-1 — С2/М-переход. То есть, и этилен, и N0 необходимы для регуляции клеточного цикла в культивируемых клетках.

4. Дифференциальная регуляция N0 фосфорилирования белков оксидом азота — необходимая составляющая механизма действия N0 на клеточный цикл.

5. Оксид азота регулирует клеточный цикл путём интервенции в сигнальный путь этилена вследствие прямого влияния на активность МАРКЗ/б.

6. Оксид азота регулирует работу МАРК-модулей посредством нитрирования аминокислотных остатков тирозина, которые располагаются вне сайтов фосфорилирования АОЛРКЗ, АЙЛРК4 и Л1МРК6.

7. Совокупность полученных в работе данных указывает на общность молекулярных событий, происходящих в клетках всех эукариот в ответ на действие N0, а именно: значение N0 не ограничиваются лишь его ролью регулятора межклеточного сигналинга при стрессах. Напротив, N0 является важным регуляторным компонентом активно делящихся клеток.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ

1. Breygina М., Matveyeva N., Polevova S., Meychik N., Nikolaeva Y., Mamaeva A., Yermakov I. (2012) Ni(2+) effects on Nicotiana tabacum L. pollen germination and pollen tube growth. Biometals., 25, 1221-1233.

2. Новикова Г.В., Носов A.B., Степанченко H.C., Фоменков A.A., Мамаева A.C., Мошков И.Е. (2013) Пролиферация клеток растений и её регуляторы. Физиология растений, 60, 529-536.

3. Фоменков A.A., Носов A.B., Ракитин В.Ю., Мамаева A.C., Новикова Г.В. (2014) Цитофизиологические особенности культивируемых клеток Arabidopsis thaliana с нарушенным восприятием сигнала этилена рецептором ETR1. Физиология растений, 61, 640-650.

4. Носов A.B., Фоменков A.A., Мамаева A.C., Соловченко А.Е., Новикова Г.В. (2014) Дополнительные возможности использования клик-реакции 5-этинил-2'-дезоксиуридина с азидами флюорохромов в изучении клеточного цикла и метаболизма дезоксирибонуклеозидов. Физиология растений, 61, 893-904.

5. Мамаева А С., Фоменков A.A., Носов A.B., Мошков И.Е., Мур JI.A. Дж., Холл М.А., Новикова Г.В. (2015) Регуляторная роль оксида азота у растений. Физиология растений, 62,459-473.

6. Фоменков A.A., Носов A.B., Ракитин В.Ю., Суханова Е.С., Мамаева A.C., Соболькова Г.И., Носов А.М., Новикова Г.В. (2015) Этилен сопровождает пролиферацию культивируемых клеток растений или участвует в ее регуляции? Физиология растений, 62, 839-846.

Публикации в сборниках и материалах конференций

1. Мамаева A.C. (2012) Действие ионов никеля на прорастание пыльцы табака. Тезисы докладов XIX международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2012», Москва, с. 237-238.

2. Фоменков A.A., Носов A.B., Мамаева A.C., Новикова Г.В., Ракитин В.Ю., Мошков И.Е. (2013) Функционирование этиленового сигнального пути необходимо для активной пролиферации культивируемых клеток растений in vitro. Тезисы докладов Международной научно-практической конференции «Клеточная биология и биотехнология растений», Минск, с. 82.

3. Мамаева A.C., Фоменков A.A., Носов A.B., Новикова Г.В. (2013) Клеточный цикл - мишень действия N07 Тезисы докладов Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений», Москва, с. 147-148.

4. Новикова Г.В., Мамаева A.C., Фоменков A.A., Носов A.B. (2013) Модификация N0 белков высших растений в нормальных условиях и при стрессе. Тезисы докладов I Международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений», Казань, е.46

5. Мамаева A.C. (2015) Этилен-зависимая регуляция клеточного цикла оксидом азота. Тезисы докладов ХХП международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2015», Москва.

6. Мамаева A.C., Фоменков A.A., Носов A.B., Миронов К.С., Ракитин В.Ю., Новикова Г.В. (2015) Роль взаимодействия этилдена и NO в контроле пролиферации культивируемых клеток Arabidopsis. Тезисы докладов Всероссийской научной конференции с международным участием «Растения в условиях глобальных и локальных природно-климатических и антропогенных воздействий», Петрозаводск, с. 331.

7. Фоменков A.A., Ракитин В.Ю., Мамаева A.C., Новикова Г.В., Носов A.B. (2015) Гипоксия в культивируемых клетках Arabidopsis thaliana — этилен необходим. Тезисы докладов Всероссийской научной конференции с международным участием «Растения в условиях глобальных и локальных природно-климатических и антропогенных воздействий», Петрозаводск, с. 555.

Подписано в печать 21.10.2015 г. Бумага офсетная. Печать цифровая. Формат А4/2. Усл. печ. л.1. Заказ № 338. Тираж 160 экз. Типография «КОПИЦЕНТР» 119234, г. Москва, Ломоносовский пр-т, д.20 Тел. 8 (495) 213-88-17 \\г\т.аии>геГегаЙ .ги