Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование взаимодействия сигнальных путей этилена и абсцизовой кислоты в контроле пролиферации культивируемых клеток арабидопсиса

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование взаимодействия сигнальных путей этилена и абсцизовой кислоты в контроле пролиферации культивируемых клеток арабидопсиса"

На правах рукописи

/ " /

Степанченко Наталья Сергеевна

Исследование взаимодействия сигнальных путей этилена и абсцизовой кислоты в контроле пролиферации культивируемых клеток арабидопсиса

03.01.05 - физиология и биохимия растений

4857867

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

4857867

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва

Научный руководитель:

доктор биологических наук Новикова Галипа Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Медведев Сергей Семенович

доктор биологических наук Трофимова Марина Сергеевна

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Защита состоится «11» октября 2011 г. в 11 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (499) 977-80-18, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте www.ippras.ru.

Автореферат разослан « 7 » сентября 2011 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат биологических наук

М.И. Азаркович-

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Накопившаяся за последние годы информация об особенностях функционирования путей передачи гормональных сигналов в клетках растений позволяет заключить, что интегрированный ответ растительного организма на фитогормоны — результат переноса гормонального сигнала между различными информационными каналами (взаимодействие путей передачи гормональных сигналов). На организменном уровне такое взаимодействие проявляется в способности интегрировать вне- и внутриклеточные сигналы при помощи сети, образуемой компонентами путей передачи сигналов фитогормонов.

Известно, что при стрессах этилен и АБК влияют на синтез друг друга (Ruggiero et al., 2004), а пути передачи их сигналов в подвергнутых стрессам растениях могут взаимодействовать (Beaudoin et al., 2000; Ghassemian et al., 2000; Wang et al., 2007). Напротив, сведения о взаимодействии сигнальных путей этилена и АБК в не подвергнутых стрессорному действию клетках отсутствуют. Более того, данные, полученные на интактных растениях и/или изолированных органах/тканях растений, не позволяют сделать вывод о том, в регуляции какого ответа, проявляющегося на клеточном уровне, могут взаимодействовать сигнальные пути этилена и АБК. Для ответа на сформулированный вопрос целесообразно использовать биологическую модель, лишенную организменного уровня контроля. Последнему требованию удовлетворяют культивируемые in vitro клетки, представляющие собой популяцию клеток с вектором отбора по интенсивности и устойчивости пролиферации.

Имеется множество примеров, демонстрирующих взаимосвязь физиологических ответов растений на фитогормоны, которые выражаются в изменениях их роста и развития, где одним из основополагающих процессов является деление клеток. Если глобальная роль ауксинов и цитокининов в качестве позитивных регуляторов пролиферации клеток не вызывает сомнений (del Pozo et al., 2005), то роль этилена и АБК в делении клеток остается предметом интенсивной дискуссии, а взаимное влияние путей передачи сигналов этих гормонов в связи с делением клеток остается мало исследованным вопросом.

Цели и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в поиске пунктов возможного взаимодействия путей передачи сигналов этилена и АБК в контроле клеточных делений в культивируемых клетках Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Охарактеризовать на цитологическом и физиологическом уровнях биологическую модель - культивируемые in vitro клетки A. thaliana — для проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов.

2. Выяснить влияние экзогенной АБК на пролиферацию культивируемых клеток А. thaliana дикого типа (Со1-0), а также клеток мутантов по генам ETR1, CTR1 и E1N2.

3. Изучить влияние АБК на фосфорилирование белков в клетках Со1-0, а также этилен-нечувствительных мутантов etrl-1, ctrl-l и ein2-l, и идентифицировать АБК-регулируемые протеинкиназы и/или фосфорилируемые ими белки.

4. В культивируемых клетках Col-0, etrl-1 и ein2-l проанализировать влияние АБК на транскрипцию генов, кодирующих протеинкиназы, которые функционируют в путях передачи сигналов этилена и АБК.

Научная иовизна. В работе впервые получены, охарактеризованы и использованы в качестве экспериментальной модели суспензионные культуры клеток этилен-нечувствительных мутантов A. thaliana etrl-1, ctrl-l и ein2-l. Показано, что этилен, образующийся при культивировании клеток, необходим для их устойчивой пролиферации. Экспериментально подтверждено, что в культивируемых клетках A. thaliana нечувствительность к этилену влияет на передачу сигнала АБК. Мутации, блокирующие работу этиленового сигнального пути (etrl-1, eiti2-l), ведут к увеличению синтеза АБК в течение субкультивирования, а также к проявлению дифференциального эффекта экзогенно добавляемой АБК на синтез ДНК, пролиферацию и рост клеток, а также на образование трахеальных элементов. В культивируемых клетках A. thaliana обнаружена митоген-активируемая протеинкиназа (МАПК) ERKl-типа, идентичная МРК11. На основании данных по экспрессии генов, кодирующих МАПК, установлено, что в клетках Col-0, etrl-1 и е 'т2-1 МРК1/2/4 могут функционировать в пути передачи сигнала АБК, МРКЗ/5 - в активируемом этиленом МАП-киназном каскаде, тогда как МРК6 вовлечена в регуляцию синтеза этилена. Функционирование белков ETR1, EIN2 и энзиматическая активность МАПК МРК6 определяют баланс между пролиферацией и дифференцировкой в культивируемых клетках A. thaliana. Предложена схема взаимодействия сигнальных путей этилена и АБК в контроле пролиферации.

Научно-ппактнческое значение. Полученные результаты позволяют глубже понять молекулярные механизмы, лежащие в основе регуляции фитогормонами как пролиферации клеток в суспензионных культурах, так и при переходе культивируемых клеток к цитодифференцировке. Эти данные могут быть использованы для дальнейшего изучения взаимодействия путей передачи сигналов разных фитогормонов, которое выражается в регуляции клеточного цикла растительных клеток. Полученные результаты о взаимодействии сигнальных путей фитогормонов в активно пролиферирующих клетках могут быть использованы при чтении курсов лекций по молекулярной биологии, физиологии и биохимии растений для студентов и аспирантов биологических специальностей.

Апробация работы. Основные результаты научной работы были представлены: на XVI и XVII Международных конгрессах Федерации Европейских Обществ Биологов растений (Финляндия, Тампере, 2008; Испания, Валенсия, 2010); конференциях молодых ученых ИФР РАН (Москва, 2009, 2010); на XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009" (Москва, 2009); на международной конференции "Plant abiotic stress - from signaling to development" (Эстония,

Тарту, 2009); на Годичном собрании Общества физиологов растений России, международной научной конференции "Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера", (Апатиты, Россия, 2009); на VI Международной научной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Беларусь, Минск, 2009); на VII съезде Общества физиологов растений России "Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, Россия, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из которых 5 -в рецензируемых изданиях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включает 20 рисунков, 11 таблиц. Список литературы включает 233 наименования, из которых - 227 на иностранных языках.

Объекты и методы исследования Растительный материал и обработка клеток. Объектом исследования служили суспензионные культуры клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. четырех генотипов: дикий тип (экотип Columbia, Col-0) и этилен-нечувствительные мутанты ctrl-1 (constitutive triple response 1), etrl-l (ethylene resistant 1) и ein2-l (ethylene insensitive 2). Культуры выращивали в среде SH (Shenk and Hildebrandt, 1972) в стеклянных колбах в темноте при температуре 26°С и постоянном перемешивании. Период субкультивирования составлял 10 дней. Обработку клеток АБК (25 мкМ), U0126 (20 мкМ), BrdU (150 мкМ) проводили на 5-й день субкультивирования. Время инкубации клеток с добавленными растворами составляло 3 час. В экспериментах, в которых изучали совместное влияние перечисленных выше веществ, клетки 1 час обрабатывали АБК, а затем добавляли соответствующее соединение и инкубировали еще 2 час. По окончании обработки и удаления среды клетки замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70°С.

Рост суспензионных культур определяли весовым методом, а размер клеток оценивали по диаметру протопластов, выделение которых проводили по методу, описанному Смоленской и Носовым (1988).

Цитологический анализ суспензионных культур. Клетки фиксировали смесью уксусной кислоты с 96% этанолом (1:3). Митотический индекс подсчитывали на препаратах, окрашенных по Фельгену. Приготовленные постоянные препараты использовали для определения количества ДНК в ядрах (Greilhuber, 2005).

Цитофотометрию проводили двухволновым методом (Мендельсон, 1969) в микроспектрофотометре Univar (Reichert-Jung). В качестве стандарта использовали клетки апикальной меристемы корня Vigna radiata cv. Berken с известным количеством ДНК

(4С = 2,1 пг) (Zoriniants et ed., 2003). Данные по количеству ДНК в ядрах анализировали по методу, описанному Nosov с соавт. (1983).

Определение выделения этилена проводили в газовом хроматографе Цвет 106 с пламенно-ионизационным детектором и устройством для концентрирования углеводородов (Ракитин, Ракитин, 1986).

Определение содержания АБК в клетках суспензионных культурах проводили по методике Карягина (Карягин, 1998) в газовом хроматографе Газохром 1109 с высокочувствительным и селективным по отношению к АБК детектором по захвату электронов.

Выделение растворимых белков. Замороженные в жидком азоте клетки гомогенизировали и экстрагировали белки в (1:1,5, вес/объем) 50 мМ Трис-HCl (pH 7,6), который содержал 10 мМ MgCl2, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид (ФМСФ), 1 мМ ЭГТА, 2 мМ Na3V04, 1 мМ бензамидин, 10 мМ NaF, 50 мМ ß-глицерофосфат и 250 мМ сахарозу. Растворимые белки, полученные центрифугированием (130000 g, 3 час), переводили в 10 мМ Трис-HCl (pH 7,6) гель-фильтрацией в колонках NAP-5 (GE Healthcare Life Science). Содержание белка определяли с бицинхо-ниновым реагентом (BCA-Protein assay) (Sigma).

Фосфорилирование белков in vitro и разделение меченых белков двумерным электрофорезом (2-DE). Фосфорилирование цитозольных белков in vitro проводили в реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 10 мМ MgCI2, 1 мМ МпС12, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 2 мМ Na3V04, 10 мМ ß-глицерофосфат, 1 мМ бензамидин, 10 мкМ АТФ и 18,5 кБк [у-32Р]АТФ/мкг белка (уд. активность 110 ТБк/ммоль). Реакцию инициировали добавлением 50-100 мкг белка и проводили в течение 20 мин при 30°С. Белки осаждали при -20°С 80% ацетоном. Осадки, промытые 2-3 раза 80% ацетоном, растворяли в буфере, содержащем 7,5 М мочевину, 2 М тиомо-чевину, 1% Тритон Х-100, 4% CHAPS, 20 мМ ДТТ, 0,2% Bio-Lyte 3/10 (Bio-Rad). В аналитических целях разделение белков при помощи 2-DE осуществляли в Mini-PROTEAN 2-D Electrophoresis Cell (Bio-Rad) no O'Farrell (1975). Для идентификации фосфобелков MALDI-TOF MS и LC-ESI MS/MS продукты реакции фосфорилирования фракционировали в первом направлении на IPG Strips (длина 7 см, диапазон pH 4-7, Bio-Rad) согласно инструкции производителя. Во втором направлении проводили электрофорез в денатурирующих условиях в 12,5% ПААГ по Laemmli (1970). Гели окрашивали Кумасси G-250 (Neuhoff et at., 1985), высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой Biomax MR (Kodak). Вырезанные из 2-ОЕ-гелей полипептиды, соответствующие фосфобелкам, идентифицировали MALDI-TOF MS в центре "Постгеномные и нанотехнологические инновации" на базе Инновационного центра медицинских нанобиотехнологий ГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА, LC-ESI MS/MS анализ фосфобелков проводили в Отделе биомолекулярной масс-спектрометрии медицинского факультета Лейденского университета (Нидерланды).

Изоэлектрическое фокусирование белков в нативных условиях при помощи MicroRotofor Liquid-Phase IEF Cell (Bio-Rad) проводили согласно протоколу производителя.

Определение МАП-киназной активности in vitro проводили, инкубируя белковые образцы (10 мкг) в течение 20 мин при 30СС в реакционной смеси, содержащей 0,25 мг/мл основного белка миелина (МВР), 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 10 мМ MgCl2, 1 мМ МпС12, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 2 мМ Na3V04, 10 мМ ß-глицерофосфат, 1 мМ бензамидин, 10 мкМ АТФ и 37 кБк [у-32Р]АТФ (уд. активность 110 ТБк/ммоль). Реакцию останавливали добавлением буфера образцов для ДДС-Na-электрофореза и кипячением. Затем проводили электрофорез в денатурирующих условиях в 15% ПААГ. Для визуализации фосфорилированного МВР высушенные окрашенные гели экспонировали с рентгеновской пленкой Biomax MR (Kodak).

Определение МАП-киназной активности in situ проводили в 10% ПААГ с 0,5 мг/мл МВР, заполимеризованным в ПААГ. После электрофореза гели инкубировали в 20% изопропаноле, 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 5 мМ 2-меркаптоэтаноле (2МЕ) с последующей промывкой в 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) с 5 мМ 2МЕ. Затем белки повторно денатурировали при помощи 6 М гуанидингидрохлорида в 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) с 5 мМ 2МЕ. Ренатурацию белков проводили в 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 0,04% Твин 40 и 5 мМ 2МЕ. Далее гели предынкубировали в 40 мМ Hepes-NaOH (pH 8,0), содержащем 2 мМ ДТТ, 10 мМ MgCl2, 0,1 мМ ЭГТА и 1 мМ МпС12. Реакцию фосфорилирова-ния в геле проводили в 40 мМ Hepes-NaOH (pH 8,0), содержащем 40 мкМ АТФ, 10 мМ MgCl2, 1 мМ МпС12 и 74 кБк/мл [у-32Р]АТФ (уд. активность 110 ТБк/ммоль). Реакцию терминировали 5% ТХУ с 1% Na4P207. Высушенные гели экспонировали с рентгеновской пленкой Biomax MR (Kodak).

Вестерн блоттинг. После электрофоретического разделения (ДДС-Na ПААГ и 2-DE) белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (45 мкм, Hybond-C Extra, GE Healthcare Life Science) в Trans-Blot SD Electrophoretic Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad) при 0,8 мА/см2 в течение 2 час. Высушенные мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой Biomax MR (Kodak). После этого мембраны инкубировали с первичными антителами в TBST (10 мМ Трис-HCl pH 7,6, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20) с 2% желатиной в течение ночи при 4°С. В качестве первичных антител для иммунодетекции использовали анти-ERKl и анти-фосфоЕКК1 кроличьи поликлональные и анти-фосфотирозиновые (pY20) мышиные моноклональные антитела (Sigma), а для визуализации — антимышиные и антикроличьи антитела, меченые пероксидазой хрена (Promega).

Окраску гелей азотнокислым серебром проводили по Ansorge (1985) или Shevchenko с соавт. (1996).

Выделение ДНК из культивируемых in vitro клеток. Навеску замороженных в жидком азоте клеток (около 100 мг сырого веса) растирали в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. ДНК выделяли при помощи набора реактивов GenElute

Plant Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Концентрацию выделенной ДНК определяли спектрофотометрически.

Аллель-специфнческая ПЦР. Поскольку мутации ctrl-1, etrl-1 и ein2-l точечные, то праймеры подбирали к участку гена, где локализована мутация. ПЦР проводили в 10 мкл буфера, содержащего 60 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 25 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% Тритон Х-100, 10 мМ 2МЕ, 0,2 мМ дНТФ, 3 ед. активности Taq-полимеразы Hot-Taq (Fermentas), 0,5 мкМ праймеров, 10-100 нг ДНК. Реакцию инициировали добавлением в раствор ДНК-матрицы. Продукты реакции анализировали при помощи электрофореза в 1% агарозном геле.

ПЦР с обратной транскрипцией. Навеску замороженных в жидком азоте клеток растирали в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. РНК выделяли при помощи набора Spectrum Plant Total RNA Kit (Sigma) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию выделенной РНК определяли спектрофотометрически. Качество образцов РНК оценивали при помощи электрофореза в 1% агарозном геле. Препараты РНК очищали от примеси ДНК при помощи DNase I (Fermentas), инкубируя 1 мкг РНК с 1 ед. активности фермента в течение 1 час при 37°С в буфере, содержащем 100 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 25 мМ MgCl2, 1 мМ СаС12. Полученные препараты использовали для синтеза кДНК при помощи обратной транскриптазы SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Синтез второй цепи проводили при помощи ПЦР в 10 мкл смеси, содержащей 60 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 25 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% Тритон Х-100, 10 мМ 2МЕ, 0,2 мМ дНТФ, 3 ед. активности Taq-полимеразы, 0,5 мкМ праймеров, 2-4 мкл смеси кДНК. Продукты реакции анализировали при помощи электрофореза в 1% агарозном геле.

Количественное определение включения бромдезоксиуридина (BrdU) в ДНК

проводили как описано Ueda с соавт. (2005). Выделенную из культивируемых клеток геномную ДНК (2 мкг) денатурировали 0,4 N NaOH, затем нейтрализовали добавлением 1М Трис-HCl (pH 6,8). Нейтрализованный раствор одноцепочечной ДНК (50 нг) при помощи Bio-Dot SF Microfiltration apparatus (Bio-Rad) наносили на нитроцеллю-лозную мембрану Hybond-C Extra (45 мкм), мембрану высушивали на воздухе, а затем ДНК фиксировали ультрафиолетом. Мембрану инкубировали с моноклональными антителами против BrdU (Sigma). Для визуализации использовали антимышиные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена (Promega).

Обработку данных проводили при помощи компьютерных программ Progenesis PG220 v2006 (Nonlinear Dynamics Ltd.) и One-Dscan VI.3 (Scanalytics). В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические значения из трех независимых экспериментов и их стандартные ошибки.

Результаты и обсуждение

Характеристика суспензионных культур. Поскольку первичными эксплантами для получения клеточных суспензий были листья растений A. thaliana с точечными мутациями etrl-1, ctrl-1 и ein2-l, то при помощи аллель-специфической ПЦР мы подтвердили, что культивирование in vitro не привело к реверсии мутаций. В течение периода субкультивирования клетки в небольших кластерах имеют форму удлиненных "клеточных файлов", указывая на непрерывность их роста и деления. За период субкультивирования суспензия Со1-0 прирастала в 14,7 раз; штаммы etrl-1 и ein2-I прирастали в 7,5 и 6,4 раз соответственно, тогда как штамм ctrl-1 рос менее интенсивно (индекс роста 3,0). Удельная скорость роста (цтах, сут"1) клеток составила для Со1-0 0,43, etrl-1 0,33, ctrl-1 0,17 и ein2-l 0,34. Несмотря на различия в скорости роста, жизнеспособность всех штаммов была высокой (не менее 90%). Так как время удвоения числа клеток Со1-0 (38 час) меньше, чем у этилен-нечувствительных мутантов, то можно заключить, что для деления клеток в культуре необходима чувствительность к этилену и сбалансированная работа этиленового сигнального пути. Клетки мутантов по морфологии отличались от Со1-0: клетки etrl-1 значительно мельче, клетки ein2-l гетерогенны по размерам, а клетки ctrl-1 в 1,5-2 раза крупнее. Кроме того, у etrl-1 и ein2-l постоянно образовывались трахеальные элементы (ТЕ), которые не встречались у СоЮ и ctrl-1.

При культивировании in vitro клетки продуцируют этилен, который может влиять на скорость пролиферации и эндоредугошкацию ядерной ДНК (Dan el а!., 2003). В связи с этим мы исследовали степень гетерогенности культивируемых клеток по количеству ядерной ДНК. Количество ДНК в ядрах Col-O варьировало от 2С до 32С с преобладанием 8С (47%). Распределение ядер по количеству ДНК в культуре etrl-1 сходно с диким типом, но спектр плоидности более узкий. В культуре ein2-l число клеток с количеством ДНК 8С и 16С было примерно одинаковым и составляло 32% и 36% соответственно. Однако стоит отметить, что в культуре ein2-l ядра с 32С встречались чаще, чем в Со1-0. В популяции клеток ctrl-1 доля ядер с 16С существенно выше (~25%), чем в Со1-0 и etrl-1. Эти данные согласуются с результатами, полученными на этиолированных проростках Arabidopsis (Gendreau et al., 1999). Показано, что обработка проростков Col-O предшественником этилена АЦК вела к увеличению доли полиплоидных ядер, которая сравнима с таковой у ctrl-1, но в отсутствие этилена.

Влияние АБК на синтез ДНК и митотическую активность. Измерение содержания эндогенной АБК в клетках в течение периода субкультивирования показало, что количество гормона у etrl-1 и ein2-l имело тенденцию к повышению, тогда как у Col-O количество АБК практически не менялось. Опираясь на эти данные, клетки обрабатывали экзогенной АБК (25 мкМ) на 4-5 день после инокуляции в свежую питательную среду, когда содержание эндогенной АБК сходно у всех генотипов.

Влияние АБК на пролиферацию клеток было оценено по синтезу ДНК и митотиче-ской активности. Поскольку АБК как возможный регулятор деления клеток блокирует

клетки на границе G1/S, мы проанализировали эффект АБК на синтез ДНК, определяя in vivo включение аналога тимидина 5-бром-2-дезоксиуридина (BrdU) в ДНК. В клетках Со1-0 обработка АБК вызывала устойчивое снижение включения BrdU в ДНК (Рис. 1). Этот результат может быть следствием негативного эффекта АБК на синтез ДНК,

что согласуется с данными литературы (Swiatek et al., 2002). Включение BrdU в ДНК клеток etrl-l повышалось под влиянием АБК, тогда как у мутантов ctrl-1 и ein2-l эффект АБК достоверно не проявлялся. Следовательно, в системе, где отбор клеток осуществляется по признаку активной пролиферации, нечувствительность к этилену может влиять на передачу сигнала АБК, которая в норме ведет к ингибированию синтеза ДНК. В экспоненциальной фазе роста синтез ДНК в контрольных условиях согласуется с митотической активностью (г = 0,98), которая в свою очередь отражает процессы, происходящие в популяциях клеток. При нормально функционирующем пути передачи этиленового сигнала, как в клетках Со1-0, АБК ингибировала синтез ДНК (G1/S переход) и не влияла на величину митотического индекса (МИ) (5,4%). В суспензиях etrl-l и ein2-l массово встречаются ТЕ, то есть определенная доля клеток выходила из цикла и переходила к терминальной дифференцировке (образование ТЕ), поэтому популяции клеток etrl-l и ein2-l имели МИ 2,8% и 2,7% соответственно. Экзогенная АБК в отсутствие восприятия этиленового сигнала стимулировала синтез ДНК у etrl-1, но не у ein2-l, где этилен воспринимается, но его сигнал не проводится. Значительная часть клеток ctrl-1 отвлекается на процессы эндоредупликации ДНК и, вероятно, задерживается в фазе G2. Экзогенная АБК не влияла на синтез ДНК в клетках ctrl-1, но препятствовала переходу клеток к эндоциклам, что видно по возрастанию МИ с 3,5% до 4,3%.

Влияние АБК на рост и морфологию клеток. Чтобы выяснить влияние АБК на рост и морфологию, клетки переносили в среду, уже содержавшую АБК, и каждые двое суток измеряли сырой вес, число погибших клеток, а также количество ТЕ (Рис. 2 и Таблица 1). В конце периода субкультивирования у Со1-0 снижалась биомасса, тогда как у ein2-l в ответ на АБК не наблюдалось изменений роста. Особенно сильно эффект

ш 120 -I

5 40

1

С о 1-0 etr1-1 ctr1-1 ein2-1 □-АБК ■+АБК

Рис. 1. Влияние АБК на включение 5-бром-2-дезоксиуридина (BrdU) в ДНК клеток Col-0, etrl-l, ctrl-1 и ein2-l.

АБК проявлялся у е1г1-1: прирост биомассы был значительным, количество ТЕ снижалось, и повышалась доля живых клеток. Напротив, в культуре ет2-1 более чем в 2-3 раза увеличивалось число ТЕ, а процент живых клеток снижался. Поскольку в ходе культивирования клеток экзогенная АБК замедляла снижение продукции этилена только в культуре Со1-0, а доля живых клеток при этом увеличивалась, то можно допустить, что роль экзогенной АБК состояла в поддержании синтеза этилена на уровне, который позволял клеткам продолжать пролиферацию.

Таблица 1. Влияние АБК на число трахеальных элементов (ТЕ) и жизнеспособность клеток культур Со1-0, е1г1-1 и ет2-1.

Сутки АБК Со1-0 ет2-1

ТЕ, х 10"3 Живые клетки, % ТЕ, х 10"3 Живые клетки,% ТЕ, х 10"3 Живые клетки, %

6 - 0 91,5 ±0,5 80 ±11 90,7± 0,88 52 ±4 91,1 ±0,75

+ 0 92,8 ±0,8 67 ±12 95,1 ±0,59 118 ±6 88,4 ±1,07

11 - 0 69,5 ±0,5 49 ±2 94,2 ±1,2 33 ±3 93,4 ±0,63

+ 0 71,1 ±2,9 29 ±5 97 ±0,57 132 ±13 83,4 ±1,48

Представлены средние значения и их стандартные ошибки.

Таким образом, в культивируемых клетках А. IНаИапа нечувствительность к этилену влияла на проявление ответа на АБК. Мутации, блокирующие работу этиленового сигнального пути {е&1-1, ет2-1), ведут к увеличению синтеза АБК в течение субкультивирования, а также к проявлению дифференциального эффекта экзогенной АБК на синтез ДНК, пролиферацию, рост клеток и образование ТЕ. В норме (Со1-0) экзогенная АБК снижает синтез ДНК (Рис. 1) и последующую пролиферацию клеток, но у штам-

Со1-0 е«-(

□ -АБК И+АБК

е'т-2-1

Рис. 2. Влияние АБК на индекс роста клеток суспензионных культур А. ЛаЧапа Со1-0, е1г/-1 и ет2-1.

АБК (25 мкМ) добавляли в среду в момент пересадки клеток, индекс роста, число погибших клеток и количество трахеальных элементов культур измеряли в конце периода субкультивирования.

мов мутантов "спасает" от негативных последствий, связанных с отсутствием этиленового сигналинга (Рис. 2 и Таблица 1).

Влияние АБК на фосфорилирование растворимых белков клеток A. thaliana.

Несмотря на своеобразие судьбы клеток etrl-2, ctrl-1 и ein2-l, популяции стабильно поддерживаются в условиях in vitro, что указывает на нормальное функционирование системы циклин-зависимых протеинкиназ, которые обеспечивают прохождение клеточного цикла. Мы сосредоточили внимание на поиске макромолекул, функционирование которых не дублирует элементы универсальной циклин-зависимой машины клеточного цикла. Такими макромолекулами могут быть протеинкиназы и/или протеин-фосфатазы - ключевые компоненты пути передачи сигналов АБК и этилена (Schweig-hofer et al., 2007, Yoo et al., 2008, Fujita et al., 2009).

Клетки всех генотипов в фазе экспоненциального роста в течение трех часов обрабатывали АБК (25 мкМ). Концентрация АБК и время экспонирования были выбраны на основании наших данных об отсутствии эффекта кратковременной обработки АБК на синтез этилена. Мы не выявили различий в спектрах фосфорилированных in vitro цитозольных белков, выделенных из обработанных АБК клеток Col-0, etrl-1, ctrl-1 и ein2-l, однако имелись различия по степени фосфорилирования индивидуальных полипептидов. На рис. 3 приведен радиоавтограф 2-DE геля, где номерами 1, 10, 11, 12, 14, 17, 21, 22, 23, 30, 33 и 34 отмечены полипептиды, уровень фосфорилирования кото-

рН 7,5-4,5

•

- 225 - 150 С >

— 100 ®14 013 „ fo.

- 50 150 04 О 16 о 17 9 То

_ 35 сив © 20 21 22 19 ©30

_ 25 °24 О 25 © <§>#© 29 26 27 28

- 15 9 ОД2 О 33 34 ©

Рис. 3. Авторадиограмма фосфорилированных in vitro белков клеток Со1-0. Отмечены все проанализированные (Ьосбопоотеины.

рых дифференциально регулировался экзогенной АБК как у Со1-0, так и у всех мутантов. Эти данные указывают на присутствие в культивируемых клетках АБК-зависимых протеинкиназ, отличающихся от этилен-регулируемых.

Известно, что в клетках животных и дрожжей МАП-киназы важны как для клеточной пролиферации, так и для регуляции клеточного цикла (Pearce and Humphrey, 2001). Представлялось вполне логичным допустить, что эффект АБК мог быть связан с изменениями энзиматической активности этих протеинкиназ. МАП-кииазы работают в каскадах, включающих три функционально связанных фермента: МАГТККК-МАПКК-МАПК. Чтобы убедиться, что среди АБК-регулируемых фосфобелков могут иметься МАПКК, клетки сначала обработали специфическим ингибитором МАПКК U0126, а затем - АБК. В ответ на обработку клеток U0126 наблюдалось значительное снижение уровня фосфорилирования некоторых белков (Рис. 4), что указывало на вероятное присутствие МАПК, за активацию которых отвечают МАПКК.

20-

etr1-1, контроль 'etr1-1, АБК etrl 1, U0126, АБК

1 Р/ \ « Р/ 1

Вестерн-блот (anti-ERK1) Вестерн-блот (anti-PY20)

Рис. 4. А. Влияние ингибитора МАПКК (Ш126) на АБК-зависимое фосфорилирование белков клеток Со1-0 и е>г!-1.

Б. Вестерн-блот анализ белков, разделенных при помощи 2-ОЕ, с антителами против МАПК ЕЯК1 типа (апИ-ЕЯК!) и против фосфотирозина (апи-РУ20).

У Arabidopsis 12 из 23 МАПК относятся к МАПК ERKl-типа (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). При помощи анти-ERKl антител мы показали, что среди белков, степень фосфорилирования которых изменялась после обработки клеток АБК в присутствии U0126, имеются МАПК ERKl-типа (Рис. 4). При помощи антител против фосфоТир (анти-рУ20) было подтверждено наличие терминальных МАПК, так как только терминальные МАПК фосфорилируются по аминокислотным остаткам Тре и Тир в мотиве фосфорилирования Тре-Глу-Тир. Фосфобелки с мол. массами от 37 до 55 кД и р/ 5,5-7,0 реагировали не только с анти-ERKl, но и с анти-рУ20 антителами (Рис. 4). Таким образом, в цитозоле культивируемых клеток A. thaliana присутствуют регулируемые АБК протеинкиназы, среди которых имеются МАПК иммунологически близкие МАПК ERKl-типа.

Влияние АБК на МАП-киназную активность в клетках Со1-0 и этилен-нсчувствительных мутантов. Для обогащения фракции цитозольных белков МАПК мы применили изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) в MicroRotofor Liquid-Phase IEF Cell. При этом способе ИЭФ белки разделяются по величинам р/, которые соответствуют р/ нативных белков. В результате были получены 10 фракций (диапазон рН 3,010,0), ферментативную активность которых проверяли в реакции фосфорилирования in vitro с экзогенным субстратом МАПК МВР. Наибольший эффект АБК на МВР-киназную активность проявился во фракциях с рН от 5,1 до 6,8 (Рис. 5А). В этих фракциях содержались белки, которые наиболее активно и АБК-зависимо фосфорилирова-ли МВР. Мол. массы этих белков были определены при помощи фосфорилирования МВР in situ (в геле) (Рис. 5Б). МВР-фосфорилирующая активность ассоциирована с полипептидами 41 и 45 кД (Рис. 5Б), что соответствует мол. массам терминальных МАПК. У Со1-0 во фракции с рН 5,1-5,4 АБК активировала МАПК с мол. массой 41 кД, а у ein2-l - 45 кД. Это свидетельствует о том, что в зависимости от функциональной активности этиленового сигнального пути в ответ на АБК активируются разные

Col-0 etr1-1 ein2-1

j—, J_| 3.9 5.1 6.2 6.8 4.1 4.7 5.3 6.4 4.1 5.4 6.8 7.4

Б 75_ ■2 5037 —

f -

-шгт

АБК - + - + -

+ - + -

_ + _+ _+ _+ ДБК

Рис. 5. Влияние АБК на фосфорилирование МВР in vitro (А) и in situ (Б) фракциями белков после ИЭФ в нативных условиях.

МВР-киназы. Далее мы проверили кросс-реактивность белков с анти-рУ20, а также с антителами против фосфорилированной формы ERJC1. Так как 41-кД и 45-кД полипептиды реагировали с обоими типами антител, то дифференциально регулируемые МВР-киназы можно отнести к МАПК ERKl-типа. Чтобы установить мол. массу и р/индивидуальных МАПК, с белками фракции с рН 5,1-5,4 провели фосфорилирование МВР in situ после 2-DE. На рис. 5 видно, что у Со1-0 и ein2-l в ответ на АБК работали разные МАПК. У ein2-l конститутивная активность некоторых из них сравнима с АБК-индуцируемой у Со1-0. То есть, в клетках, где этиленовый сигнал не проводится, могут работать МАПК, которые в норме обеспечивают проведение сигнала АБК. Несмотря на высокую разрешающую способность 2-DE, попытка идентифицировать АБК-регулируемые МАПК при помощи MALDI-TOF MS оказалась неудачной из-за высокого фона МВР, запролимеризованного в гелях второго направления, и мы были вынуждены искать способы предварительной подготовки белковых фракций для идентификации фосфорилированных белков.

Идентификация предполагаемых субстратов МАПК при помощи MALDI-TOF масс-спектрометрии. Для определения уникального профиля АБК-регулируемых фосфопротеинов для каждого генотипа было выбрано по 12 полипептидов, уровень фосфорилирования которых дифференциально менялся в ответ на АБК. Эти полипептиды вырезали из 2-DE гелей, и для их идентифицикации применяли MALDI-TOF MS и LC-ESI MS/MS. В результате были идентифицированы МАПК МРК11, две енолазы, белок KRP4 (Kip-related protein), бета-субъединица АТФ синтазы, фактор инициации трансляции 4А (eF4A), фактор транскрипции SCL9 (Scarecrow-like 9), НАДФ-зависимая оксидоредуктаза, аннексии 2 (ANNAT2), альдо/кето редуктаза, PYL8, гли-церальдегид-3-фосфатдегидрогеназа (Рис. 6). Все перечисленные белки обнаружены во фракциях, обладавших МАП-киназной активностью. Проанализировав последовательности этих белков в базах данных NetPhos и NetPhosK, мы нашли, что в аминокислотных последовательностях нескольких белков имеются PX(S/T)P мотивы, которые фос-форилируют МАПК. То есть, эти белки могут быть потенциальными субстратами МАПК или других протеинкиназ, способных их фосфорилировать АБК-зависимо. Особого внимания заслуживает идентифицированная нами МАПК МРК11, являющаяся ближайшим гомологом МРК4, поскольку недавно показано, что у Arabidopsis обе МАПК участвуют в цитокинезе (Kosetsu et ai, 2010). Следует подчеркнуть, что идентификация МАПК МРК11 была подтверждена при помощи LC-ESI MS/MS.

Основываясь на имеющихся в литературе данных, в отношении некоторых из идентифицированных белков можно высказать соображения об их потенциальной роли в качестве субстратов МАПК.

Известно, что факторы транскрипции - наиболее "привычные" внутриклеточные субстраты МАПК. В этом смысле интересен белок SCL9. В покоящемся центре корня Arabidopsis дикого типа и ctrl-1 обработка этиленом приводила к увеличению числа клеток (Ortega-Martinez et al., 2007), что, по-видимому, связано с ростом экспрессии

SCR в ответ на этилен. Поскольку в нашей работе обработка АБК усиливала синтез ДНК в etrl-l, то можно думать, что АБК-регулируемое фосфорилирование SCL9 -результат функционирования как пути передачи сигнала этилена, так и АБК.

1. Аннексии 2

2. НАДФ-зависимая оксидоредуктаза,

3. Альдо/кето редуктаза,

4. PYL8

5. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа

Фракция рН 5,2-5,4

6. eF4A

7. Бифункциональная енолаза

8. МРК11

9. SCL9

10. KRP4

11. Енолаза

12. р-субъединица Фракция АТФ синтазы рН 6,2-6,8

Рис. 6. АБК-регулируемое фосфорилирование белков фракций с рН 5,2-5,4 и 6,2-6,8, полученных после ИЭФ в нативных условиях.

Цифрами отмечены фосфобелки, идентифицированные при помощи MALDI-TOF MS. Представлены авторадиограммы. Приведены списки идентифицированных белков. Подчеркнуты белки, у которых найдены потенциальные сайты фосфорилирования МАПК.

Белок KRP4 присутствует в клетках в нефосфорилированном состоянии, подтверждая, что использованные в наших экспериментах клетки митотически активны. Имеются данные, что пик экспрессии KRP4 приходится на G2 (Menges et al., 2005), а белок KRP4 необходим для прохождения S-фазы (Ormenese et al., 2004). Обнаружено также, что у Arabidopsis при обработке АБК индуцировалась транскрипции KRP1/2 (Wang et al., 1998), что позволяют думать о KRP1 как о важном регуляторе АБК-зависимого ин-гибирования роста.

В клетках высших эукариот фактор инициации трансляции eIF4A является субстратом МАРКАРК (МАРК activated protein kinase), которую фосфорилируют МАПК. В клетках млекопитающих МАРКАРК2 регулирует прохождение S-фазы, а также G2/M переход в ответ на облучение УФ-С средней интенсивности (Manke et al., 2005), причем МАРКАРК2 - внутриклеточный субстрат МАПК SAPK (Stress-activated protein

kinase). Следовательно, нельзя исключить, что eIF4A может быть потенциальным субстратом и для МАПК ERK1 -типа.

Специального внимания заслуживает белок PYL8 (Pyrabactin resistance-like), принадлежащий семейству рецепторов АБК. Кроме PYL8 в состав этого семейства входят ещё 13 белков, причем все они способны специфически связывать физиологически активную АБК (Park et al., 2009). Мы показали, что PYL8 присутствует в клетках АгаЫ-dopsis в фосфорилированном виде. Это согласуется с существующими представлениями о механизме функционирования рецепторов АБК (Miyazono et al., 2009), а с другой стороны, указывает, что в исследуемой клетках путь передачи сигнала АБК функционально активен.

Суммируя данные масс-спектрометрии, подчеркнем, что обнаруженные нами белки ассоциированы с G1- и S-

Со1-0

etr1-1 ein2-1

л

— + —

+ —

МРК1 МРК2 МРКЗ МРК4 МРК5 MP Кб actin2 АБК

etr1-1

ein2-1

Рис. 7. Влияние АБК на транскрипцию генов индивидуальных МАПК (А) и 8п11К2 (Б) в культивируемых клетках Со1-0, е1г1-1 и ет2-1.

фазами, что согласуется с результатами анализа транскриптома АгаЫскзряк, которые показали, что транскрипция генов, кодирующих идентифицированные белки, также связана с фазами и Б (Menges е/ о/., 2002).

Влияние АБК на транскрипцию генов индивидуальных МАПК. Для того чтобы все-таки подойти к анализу индивидуальных МАПК, мы изучили влияние АБК на транскрипцию генов индивидуальных МАПК. Для анализа были выбраны гены тех МАПК, о которых известно как об участниках путей передачи гормональных сигналов (МРК1/2/3/6), так и о регуляторах клеточного цикла (МРК4/5) (Menges ег о/., 2008). При помощи ОТ-ПЦР мы выяснили (Рис. 7А), что в экспоненциальной фазе роста культивируемых клеток Со1-0, и е/л2-7 конститутивный уровень транскрипции МРК4 по сравнению с генами других МАРК самый высокий и зависит от обработки АБК

только у Col-0. Напротив, гены МРК1 и МРК2 транскрибировались на крайне низком уровне, что совпадает с данными литературы (Ortiz-Masia et al., 2007). После обработки АБК транскрипция МРК1 увеличивалась в Со1-0 и ein2-l, тогда как транскрипция МРК2 существенно росла как у Со1-0, так и у etrl-1. Можно предположить, что роль МРК1/2 в пролиферирующих клетках связана с передачей сигнала АБК. В популяции клеток Со1-0 и ein2-l транскрипция МРК5 более чем в два раза повышалась в обработанных АБК клетках, а в клетках etrl-1 мы не обнаружили влияния АБК на транскрипцию МРК5. Экспрессия МРКЗ индуцировалась в клетках Со1-0 в ответ на обработку АБК, а у etrl-1 и ein2-l была низкой и не зависела от АБК. Как в популяции Со1-0, так и в клетках etrl-1 МРК6 транскрибировалась на достаточно высоком уровне и была АБК-зависимой. Поскольку etrl-1 не воспринимает этилен вследствие мутации в рецепторе этилена ETR1, то ответственной за обнаруженное изменение уровня экспрессии МРКб следует считать АБК. Согласно существующим представлениям, МАП-киназный модуль с МРКЗ/6 функционирует как при биосинтезе этилена, так и в пути передачи этиленового сигнала (Yoo et al., 2008). Однако тот факт, что при обработке АБК транскрипция МРКб усиливается и в клетках Со1-0, и в клетках обоих этилен-нечувствительных мутантов приводит нас к заключению, что в культивируемых клетках в путях передачи сигналов и АБК, и этилена может работать МАПК МРКб.

Влияиие АБК на транскрипцию генов протеинкиназ семейства SnRK2. В настоящее время принимается, что протеинкиназы семейства SnRK2 — важные компоненты путей передачи таких стрессовых сигналов, при которых растет содержание эндогенной АБК (Baena-Gonzalez et al, 2007). Мы изучили влияние экзогенной АБК на транскрипцию генов протеинкиназ SnRK2.2/2.3/2.6, для которых показано участие в передаче сигнала АБК (Hrabak et al., 2003; Boudsocq et al., 2004, Yoshida et al., 2006, Fujii and Zhu 2009). Уровень транскрипции SnRK2.2 у всех генотипов был достаточно высоким в контроле и практически не менялся при обработке АБК (Рис. 7Б). По сравнению с мутантами в Со1-0 экзогенная АБК вызывала усиление транскрипции SnRK2.6. Наиболее сильным оказался эффект АБК в отношении SnRK2.3, транскрипция которой у Col-0 увеличивалась в 16 раз, а у etrl-1 АБК индуцировала экспрессию SnRK2.3. У ein2-l высокий уровень транскрипции всех SnRK2 в контроле может свидетельствовать, что у этого мутанта путь передачи сигнала АБК работает конститутивно. Учитывая, что в середине экспоненциальной фазы роста содержание эндогенной АБК одинаково, обнаруженные изменения транскрипции SnRK2.2/2.6- результат обработки экзогенной АБК.

Заключение

Внутриклеточными регуляторами пролиферации и дифференцировки у растений являются фитогормоны, ответы на которые в растительной клетке обеспечиваются взаимодействием путей передачи их сигналов. Хотя число сообщений о наличии взаимодействия путей передачи гормональных сигналов постоянно увеличивается, сведе-

ния о молекулярных механизмах взаимодействия крайне ограничены. Предполагается, что взаимодействие может выражаться, во-первых, во влиянии на синтез друг друга, во-вторых, в наличии общего сигнального компонента в путях передачи сигналов, в-третьих, в существовании общих генов-мишеней, что приводит к кооперативной регуляции определенного ответа. Так, показано взаимодействие путей передачи сигналов этилена и АБК в таких процессах как прорастание семян (Beaudoin et al., 2000; Ghas-semian et al., 2000; Chiwocha et al., 2005), движение замыкающих клеток устьиц (Та-naka et al., 2005, 2006), изменение роста корней, включая формирование латеральных корней при тепловом стрессе (Sharp and LeNoble, 2002; Spollen et al., 2000). Однако на основании этих данных трудно высказать предположения о возможном влиянии этилена и АБК на деление клеток. Вместе с тем, нельзя исключить, что в регуляции пролиферации этилен и АБК способны быть как позитивными, так и негативными регуляторами. Действительно, недавно показано, что этилен, а не ауксин - признанный позитивный регулятор клеточной пролиферации - способен усиливать клеточные деления в покоящемся центре корня (Ortega-Martinez et al., 2007). Хотя АБК часто рассматривают в качестве гормона-ингибитора роста, имеются данные, указывающие, что АБК в низких концентрациях способна активировать рост (Sharp et al., 2000; Cheng et al., 2002).

Использовав культивируемые in vitro клетки A. thaliana Col-0, а также этилен-нечувствительных мутантов etrl-1, ctrl-l и ein2-I, мы показали, что в этой биологической модели пути передачи сигналов этилена и АБК взаимодействуют, но взаимодействие путей передачи сигналов этилена и АБК не выражается только во взаимном влиянии на синтез друг друга. Мы не обнаружили существенного роста продукции этилена в ответ на кратковременную обработку клеток экзогенной АБК, хотя известно, что в ответ на абиотические стрессы происходит значительный рост продукции этилена и АБК. С другой стороны, измерение влияния АБК на биосинтез этилена в процессе культивирования клеток показало, что только в клетках Со1-0 синтез этилена поддерживался на уровне, который позволял клеткам продолжать делиться.

Представляется весьма вероятным, что взаимодействие этилена и АБК связано с их регуляцией экспрессии генов-мишеней. Однако изучение этого вопроса не было задачей нашей работы. Более того, следует специально подчеркнуть, что гены-мишени являются эффекторами, а не компонентами сигнальных путей. Поэтому попытаемся суммировать полученные нами данные, касающиеся собственно компонентов сигнальных путей этилена и АБК.

Связывание добавленной в среду культивирования АБК с рецептором ведет к взаимодействию протеинфосфатазы РР2С с гормон-рецепторным комплексом и ее инактивации. В результате инициируется путь передачи сигнала АБК, в котором функционируют протеинкиназы семейства SnRK2, АБК-зависимо фосфорилирующие свои мишени. Среди них могут быть и МАПК, которые, по-видимому, участвуют в опосредованном АБК снижении уровня пролиферации посредством активации иден-

тифицированного в нашей работе белка КЯР4, функции которого как ингибитора цик-лин-зависимых протеинкиназ показаны (Огтепеве е/ а!., 2004).

Мы установили, что по мере культивирования клеток образуется этилен, что определяется активной работой АЦК-синтазы 6 - субстрата МАПК МРК6 (РеИпег е( а1, 2005). Сигнал о связывании этилена с его рецепторами (ЕТЯ1/2, ЕЯЭ1/2, ЕШ4) проводится через МАП-киназный модуль, в котором функционируют МАПК МРКЗ/6 (Уоо е1 а!., 2008). В ответ на этилен усиливается транскрипция генов, кодирующих РР2С (Schweighofer е/ а/., 2007). Протеинфосфатазы РР2С подгруппы В и некоторые представители подгруппы А имеют домены, обеспечивающие их связывание с МАПК, в том числе с МРК6 (8сЬ№е1§ЬоГег et а!., 2007). Связывание РР2С с МРК6 ведет к снижению активности МРКб, и, как следствие, может происходить авторегуляция биосинтеза этилена на уровне, который позволяет клеткам активно пролиферировать.

Теперь рассмотрим последствия описанных выше событий применительно к процессам, происходящим на клеточном уровне. Когда путь передачи сигнала этилена функционально активен, то клетки активно пролиферируют, а экзогенная АБК выполняет свою функцию ингибитора синтеза ДНК и деления. Если путь передачи этиленового сигнала конститутивно активен, то клетки начинают выходить из цикла и переходить к эндоредупликации. В этом случае экзогенная АБК способствует реактивации клеточных делений. При инактивации пути передачи этиленового сигнала идет активная дифференцировка на фоне незначительной пролиферации. Если этилен не воспринимается, то, вероятно, кроме дифференцировки может происходить и массовая гибель клеток, а экзогенная АБК "спасает" клетки, усиливая пролиферацию на фоне снижающейся дифференцировки. Если сигнал этилена воспринимается, но не проводится, то идет активная дифференцировка, которую усиливает экзогенная АБК, при этом пролиферация клеток снижается.

Таким образом, восприятие и передача этиленового сигнала определяет соотношение пролиферации и гибели клеток, которое может корректироваться АБК. Механизм гибели клеток в отсутствие восприятия этилена, по всей видимости, должен отличаться от запрограммированной клеточной смерти, например, сопровождающей старение. Проведение сигнала этилена определяет баланс между пролиферацией и цитодиффе-ренцировкой, которая также может быть настроена в ту или иную сторону при помощи АБК. Оба эти обстоятельства требуют дальнейшего изучения, которое проводится нами в настоящее время.

Выводы:

1. Суспензионные культуры клеток A. thaliana экотипа Columbia и этилен-нечувствительных мутантов сохраняют исходные генотипы, что делает их адекватной моделью для изучения взаимодействия путей передачи сигнала этилена и других фитогормонов в контроле пролиферации клеток.

2. Снижение числа делящихся клеток у мутантов по негативным (ETR1 и CTR1) и позитивному (EIN2) регуляторам пути передачи этиленового сигнала указывает, что для пролиферации культивируемых клеток необходима сбалансированная работа этиленового сигнального пути.

3. В культивируемых клетках A. thaliana нечувствительность к этилену влияет на передачу сигнала АБК. В норме экзогенная АБК снижает синтез ДНК и последующую пролиферацию клеток, а у штаммов мутантов "спасает" от негативных последствий, связанных с отсутствием этиленового сигналинга.

4. Мутации, блокирующие работу этиленового сигнального пути (etrl, ein2), ведут к увеличению синтеза АБК в течение субкультивирования, а также к проявлению дифференциального эффекта экзогенно добавляемой АБК на синтез ДНК, пролиферацию и рост клеток, а также на образование трахеальных элементов.

5. Экзогенная АБК регулирует протеинкиназу, которая на основании биохимических и иммунологических характеристик отнесена к МАПК ERKl-типа и идентифицирована как МРК11.

6. В клетках Col-0, etrl и ein2 экспрессия генов, кодирующих МАПК, дифференциально регулируется в ответ на обработку экзогенной АБК. Полученные данные указывают, что МАПК МРК1/2/4 могут функционировать в пути передачи сигнала АБК, МРКЗ/5 - в активируемом этиленом МАП-киназном каскаде, тогда как МРК6 вовлечена в регуляцию синтеза этилена.

7. Взаимодействие сигнальных путей этилена и АБК происходит на уровне МАПК МРК6. Функционирование белков ETR1, EIN2 и энзиматическая активность МРК6 определяют баланс между пролиферацией и дифференцировкой в культивируемых клетках A. thaliana.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Новикова Г.В., Никашин Б.А., Степанченко Н.С., Мошков И.Е. (2007) Фосфо-протеомика в исследованиях регуляторных систем растений: дивиденды секве-нированных геномов. Доклады VI съезда физиологов растений России, 1, с. 205207.

2. Stepanchenko N.S., Nikashin В.А., Nosov A.V., Novikova G.V., Moshkov I.E. (2008) Ethylene and ABA may share signaling component upon A.thaliana plants response to UV-B. Physiol. Plant., 133, P01-069.

3. Степанченко H.C. (2009) Фосфорилирование белков в листьях Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. при действии ультрафиолета В. XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009", Москва, с. 240.

4. Stepanchenko N.S., Novikova G.V., Nosov A.V., Moshkov I.E. (2009) Cross-talk between ethylene and abscisic acid signaling pathways mediates proliferation of Arabidopsis thaliana cultivated cells. Abstr. Plant Abiotic Stress - from Signaling to Development, Tartu, Estonia, p. 17.

5. Мошков И.Е., Новикова Г.В., Степанченко H.C. (2009) Этилен: маленькая молекула - большие вопросы. Годичное собрание Общества физиологов растений (тезисы докладов), Апатиты, Россия, с. 9.

6. Степанченко Н.С., Новикова Г.В., Носов А.В., Мошков И.Е. (2009) Влияние этилена и абсцизовой кислоты на фосфорилирование белков культивируемых in vitro клеток Arabidopsis thaliana, находящихся в разных фазах клеточного цикла. Годичное собрание Общества физиологов растений России (тезисы докладов), Апатиты, Россия, с. 319.

7. Степанченко Н.С., Новикова Г.В., Носов А.В., Мошков И.Е. (2009) Культивируемые in vitro клетки A. thaliana - модель для изучения влияния этилена и АБК на пролиферацию клеток. VI-я Международная научная конференция "Регуляция роста, развития и продуктивности растений ", Минск, с. 144.

8. Новикова Г.В., Степанченко Н.С., Носов А.В., Мошков И.Е. (2009) В начале пути: восприятие АБК и передача ее сигнала у растений. Физиология растений, 56, с. 806-823.

9. Stepanchenko N.S., Novikova G.V., Nosov A.V., Moshkov I.E. (2010) Ethylene and ABA affect the proliferation of in vitro cultivated A. thaliana cells. Book of Abstr., XVII Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB), Valencia, Spain, PI 1-003.

10. Мошков И.Е, Степанченко H.C., Новикова Г.В. (2010) Передача этиленового сигнала: CTR1 — вопросы и ответы. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума "Растение и стресс ", Москва, с. 246-247.

И.Степамчснко Н.С., Новикова Г.В., Носов A.B., Мошков И.Е. (2011) Взаимодействие сигнальных путей этилена и абсцизовой кислоты в контроле пролиферации культивируемых клеток A. thaliana. VII съезд Общества физиологов растений России "Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий", Нижний Новгород, с. 665.

12. Мошков И.Е., Степанченко Н.С., Новикова Г.В. Передача этиленового сигнала: CTR1 - вопросы и ответы. VII съезд Общества физиологов растений России "Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий", Нижний Новгород, с. 487.

13. Степанченко Н.С., Новикова Г.В. Мошков И.Е. (2011) Количественное определение содержания белка. Физиология растений, 58, 737-742.

14. Зорина A.A., Миронов К.С., Степанченко Н.С., Синетова М.А., Коробан Н.В., Зинченко В.В., Куприянова Е.В., Аллахвердиев С.И., Лось Д.А. (2011) Системы регуляции стрессовых ответов у цианобактерий. Физиология растений, 58, 643663.

15.Zorina A., Stepanchenko N., Sinetova М., Panichkin V.B., Novikova G.V., Moshkov I.E., Zinchenko V.V., Shestakov S.V., Suzuki I., Murata N., Los D.A. (2011) Eu-karyotic-like Ser/Thr protein kinases SpkC/F/K are involved in phosphorylation of GroES in the cyanobacterium Synechocystis. DNA Research, 18, 137-151.

16. Степанченко H.C., Фоменков A.A., Мошков И.Е., Ракитин В.Ю., Новикова Г.В., Носов A.B. (2011) Культивируемые in vitro клетки этилен-нечувствительных мутантов Aradidopsis thaliana - модель для изучения взаимодействия путей передачи сигналов фитогормонов в контроле пролиферации клеток. Представлена в Доклады РАН.

Подписано в печать:

01.09.2011

Заказ № 5842 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степанченко, Наталья Сергеевна

Список нестандартных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. МАП-киназы - компоненты пути передачи этиленового сигнала у растений.

1.1.1. Организация МАП-киназного модуля и структура МАП-киназ

1.1.2. Экспрессия генов, кодирующих МАП-киназы растений.

1.2. Этиленовый сигнальный путь.

1.2.1. Рецепторы этилена, инициирующие работу сигнального пути.

1.2.2. Белок СТШ - Яа^подобная МАПККК.

1.2.3. ЕШ2 - позитивный регулятор этиленового сигнального пути.

1.2.4. Линейный путь передачи сигнала.

1.3. Роль протеинкиназ БпИХ и протеинфосфатаз РР2С в передаче сигнала

- АБК.<.

1.3.1. Протеинфосфатазы 2С типа (РР2С) - негативные регуляторы пути передачи сигнала АБК.

1.3.2. Протеинкиназы 8пЯК2 - позитивные регуляторы АБК сигнал инга.

1.3.2.1.Участие МАП-киназ в передаче сигнала АБК.

1.3.3. РУК/РУЬ/КСАЯ - растворимые рецепторы АБК.

1.3.4. Минимальный путь передачи сигнала АБК.

1.4. Пролиферация клеток растений и ее регуляторы.

1.4.1. Механизмы регуляции клеточного цикла.

1.4.2. Регуляция пролиферации клеток фитогормонами.

1.4.2.1. Влияние ауксинов и цитокининов на пролиферацию клеток

1.4.2.2. Абсцизовая кислота и этилен в качестве контролеров клеточной пролиферации.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Растительный материал и обработка клеток.

2.2. Определение параметров роста суспензионных культур.

2.3. Цитологический анализ суспензионных культур.

2.4. Определение содержания этилена.

2.5. Определение содержания АБК.

2.6. Выделение белков.

2.7. Количественное определение белка.

2.8. Фосфорилирование цитозольных белков in vitro и идентификация фосфорилированных белков.

2.9. Определение МАП-киназной активности in vitro.

2.10. Определение МАП-киназной активности in 'situ.

2.11. Электрофорез белков в денатурирующих условиях.

2.12. Двумерный электрофорез (2-DE) белков.

2.13. Изоэлектрическое фокусирование в нативных условиях.56 '

2.14. Иммунодетекция белков (вестерн блоттинг).

2.15. Окраска гелей.

2.15.1. Окраска гелей коллоидным Кумасси G

2.15.2. Окраска гелей азотнокислым серебром.

2.16. Выделение ДНК из культивируемых in vitro клеток.

2.17. Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.18. ПЦР с обратной транскрипцией.

2.19. Количественное определение включения бромдезоксиуридина

BrdU) в ДНК.

2.20. Обработка данных.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Характеристика биологической модели.

3.1.1. Сохранность мутаций при культивировании in vitro.

3.1.2. Характеристика суспензионных культур.

3.1.3. Количество ядерной ДНК в клетках культур.

3.2. Влияние экзогенной АБК на синтез ДНК и митотическую активность

3.3. Влияние кратковременных экспозиций с экзогенной АБК на синтез этилена культивируемыми клетками.

3.4. Влияние АБК на рост и дифференцировку клеток.

3.5. Влияние АБК на фосфорилирование растворимых белков клеток А thaliana Col-0 и этилен-нечувствительных мутантов etrl-1, ctrl-1 и ein2-l

3.6. Влияние АБК на МАПК активность культивируемых клеток Col-О и этилен-нечувствительных мутантов.

3.7. Идентификация МАПК и их предполагаемых субстратов при помощи MALDI-TOF MS.

3.8. Влияние АБК на транскрипцию генов индивидуальных МАПК и генов протеинкиназ семейства SnRK2.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование взаимодействия сигнальных путей этилена и абсцизовой кислоты в контроле пролиферации культивируемых клеток арабидопсиса"

Фитогормоны и компоненты их сигнальных путей занимают центральное место в сети передачи вне- и внутриклеточных сигналов, посредством которой координируется рост и развитие растений. В последние годы в отношении фитогор-монов термин "cross-talk", под которым подразумевается взаимодействие путей передачи гормональных сигналов, стал особенно- популярным (Gazzarrini and McCourt, 2003; Mundy et al., 2006). Это представление возникло на основании анализа данных физиологических экспериментов в-связи с использованием мутантов, у которых нарушен ответ на два или более гормонов. В отсутствие представлений о молекулярных механизмах взаимодействия гормональных сигналов остается неясным, почему ответ на один гормон ведет к развитию таких изменений, которые не позволяют адекватно ответить на другой гормон. Применительно к таким случаям принято говорить, что имеет место cross-talk между путями, передачи сигналов гормонов. Такое использование этого понятия трудно назвать корректным, так как сигнальные пути двух гормонов-могут полностью не зависеть друг от друга. Однако взаимодействие (cross-talk) между путями передачи сигналов двух гормонов может иметь место, когда одним из эффектов одного гормона является изменение биосинтеза-другого гормона. К этому следует добавить, что сигнальные пути двух, гормонов могут, иметь общие компоненты, деятельность которых интегрируется силой сигнала обоих гормонов, или сигнальные компоненты могут вовлекаться в функционирование обоих путей, координируя их деятельность. В этом случае cross-talk действительно происходит в соответствии с его первоначальным определением - "вмешательство одного сигнального пути в другой" (Mundy et al., 2006). Именно в этом смысле в настоящей работе и используется термин "cross-talk".

Существование взаимодействия между сигнальными путями объясняет, как небольшое число фитогормонов может провоцировать такое большое количество ответов. С другой стороны, наличие cross-talk объясняет, как несколько гормональных сигналов могут регулировать один ответ. За последнее время появились работы. в которых показано взаимодействие как на различных этапах передачи сигналов, так и на уровне ответов, к возникновению которых ведет работа сигнальных путей (Montoya et al., 2002; Fu and Harberd, 2003; Nemhauser et al, 2004; Ruzicka et al, 2007).

Известно, что при абиотических стрессах между этиленом и АБК имеет место cross-talk, выражающийся во взаимном влиянии на биосинтез этих гормонов. Показано, что при осмотическом стрессе пониженный биосинтез АБК приводил к увеличению содержания этилена, а снижение накопления АБК вызывало повышенную чувствительность к этилену у рецессивного (LÖF, Loss-of-Function) мутанта ncedS (Ruggiero et al, 2004). Этилен индуцировал закрывание устьиц у Arabidopsis, усиливая синтез перекиси водорода (Desikan et al., 2006). Однако в комбинации с АБК предшественник этилена АЦК ингибировал АБК-индуцируемое закрытие устьиц. Этот эффект АБК не обращался добавлением АЦК у растений этилен-нечувствительных мутантов или в тканях, обработанных метилциклопропе-ном, который практически необратимо связывается с рецепторами этилена (Tanaka et al., 2005).

Имеются также сообщения, что и в отсутствие стресса в таких процессах как прорастание семян и рост корней может происходить взаимодействие сигнальных путей этилена и АБК (Beaudoin et al., 2000; Ghassemian et al, 2000). Показано, что в тесте на прорастание семян этилен-нечувствительные мутанты etrl и ein2, отличающиеся от дикого типа повышенным содержанием эндогенной АБК (Chiwocha et al., 2005; Cheng et al., 2009), гиперчувствительны к экзогенной АБК, а мутант ctrl с конститутивным тройным ответом на этилен нечувствителен к АБК. Это может означать. что при прорастании семян этилен влияет не на биосинтез АБК, а на передачу ее сигнала. Однако вопрос о взаимодействии этилена и АБК не столь однозначен, как может показаться при первом знакомстве с литературой. Так, Cheng с соавт. (2009) при помощи скрещивания мутантов по компонентам этиленового сигнального пути ctrl, ein! и етЗ с АБК-дефицитным мутантом aba2 пол\чили двойные мутанты, обладавшие миниатюрными размерами, конститутивным тройным ответом или нечувствительностью к этилену. Это привело авторов к выводу, что пути передачи сигналов. АБК и этилена работают параллельно. Однако измерение содержания этилена и АБК в растениях одинарных и двойных мутантов позволило заключить, что АВА2 - негативный регулятор биосинтеза этилена. Биосинтез АБК негативно регулируется EIN2, тогда как ETR1 - позитивный регулятор, контролирующий ABI1 (Cheng et al2009). Следовательно, подтверждается ранее сформулированное предположение о взаимодействии путей передачи сигналов этилена и АБК.

Сведения о возможном взаимодействии-путей передачи сигналов этилена и АБК, полученные на интактных растениях, их изолированных органах или тканях, не позволяют сделать вывод о том, в регуляции какого ответа, проявляющегося на клеточном уровне, сигнальные пути этих фитогормонов могут взаимодействовать. Для поиска ответа на этот вопрос целесообразно использовать биологическую модель, лишенную организменного уровня контроля. В качестве такой экспериментальной модели могут использоваться культивируемые in vitro клетки, представляющие собой популяцию клеток с вектором отбора по интенсивности и устойчивости пролиферации. - '

Из приведенных выше примеров очевидна взаимосвязь физиологических ответов растений на этилен и АБК, которая выражаются в изменениях их роста и развития, где одним из основополагающих процессов является деление клеток. Если глобальная роль ауксинов и цитокининов в качестве позитивных регуляторов пролиферации клеток не вызывает сомнений (см. обзор del Pozo et ai, 2005), то роль этилена и АБК в делении клеток остается предметом интенсивной дискуссии, а на молекулярном уровне взаимное влияние путей передачи сигналов этих гормонов в связи с делением клеток остается мало исследованным вопросом.

В связи с этим исследование того, на каком этапе или биосинтеза, или передачи сигналов АБК и этилена, или на уровне транскрипции генов ответа на тот или другой гормон, или на всех этих уровнях происходит cross-talk между этиленом и АБК, представляет существенный научный интерес.

Цель настоящей работы состояла в поиске пунктов возможного взаимодействия путей передачи сигналов этилена и АБК в контроле клеточных делений в культивируемых клетках Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Охарактеризовать на цитологическом и физиологическом уровнях биологическую модель - культивируемые in vitro клетки A. thaliana - для проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов.

2. Выяснить влияние экзогенной АБК на пролиферацию культивируемых клеток A. thaliana дикого типа (Со1-0), а также клеток мутантов по генам ETR1, CTR1 и EIN2.

3. Изучить влияние АБК на фосфорилирование белков в клетках Со1-0, а также этилен-нечувствительных мутантов etrl-1, ctrl-1 и ein2-l и идентифицировать АБК-регулируемые протеинкиназы и/или фосфорилируемые ими белки.

4. В культивируемых клетках Col-0. etrl-1 и ein2~l проанализировать влияние АБК на транскрипцию генов, кодирующих протеинкиназы, которые функционируют в путях передачи сигналов этилена и АБК.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Степанченко, Наталья Сергеевна

выводы

Суспензионные культуры клеток A. thaliana экотипа Columbia (Col-0) и этилен-нечувствительных мутантов сохраняют исходные генотипы, что делает их адекватной моделью для изучения взаимодействия путей передачи сигнала этилена и других фитогормонов в контроле пролиферации клеток.

Снижение числа делящихся клеток у мутантов по негативным (ETR1 и CTR1) и позитивному (EIN2) регуляторам пути передачи этиленового сигнала указывает, что для пролиферации культивируемых клеток необходима сбалансированная работа этиленового сигнального пути.

В культивируемых клетках A. thaliana нечувствительность к этилену влияет на передачу сигнала АБК. В норме экзогенная АБК снижает синтез ДНК и последующую пролиферацию клеток, а у штаммов мутантов "спасает" от негативных последствий, связанных с отсутствием этиленового сигналинга.

Мутации, блокирующие работу этиленового сигнального пути (etrl, ein2). ведут к увеличению синтеза АБК в течение субкультивирования, а также к проявлению дифференциального эффекта экзогенно добавляемой АБК на синтез ДНК, пролиферацию и рост клеток, а также на образование трахеальных элементов.

Экзогенная АБК регулирует протеинкиназу, которая на основании биохимических и иммунологических характеристик отнесена к МАПК ERKl-типа и идентифицирована как МРК11.

В клетках Col-0. etrl и ein2 экспрессия генов, кодирующих МАПК. дифференциально регулируется в ответ на обработку экзогенной АБК. Полученные данные указывают, что МАПК МРК1/2/4 могут функционировать в пути передачи сигнала АБК, МРКЗ/5 - в активируемом этиленом МАПК каскаде, тогда как МРК6 вовлечена в регуляцию синтеза этилена.

7. Взаимодействие сигнальных путей этилена г АБК происходит на уровне МАПК МРК6. Функционирование белков ETR1, EIN2 и энзиматическая активность МРК6 определяют баланс между пролиферацией и дифференцировкой в культивируемых клетках A.thaliana.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Внутриклеточными регуляторами пролиферации и дифференцировки у растений являются фитогормоны, ответы на которые в растительной клетке обеспечи

I i ваются взаимодействием путей передачи их сигналов. Хотя число сообщений о наличии взаимодействия путей передачи гормональных сигналов постоянно увеличивается, только в последние несколько лет стали появляться сведения о молекулярных механизмах этих взаимодействий. Предполагается, что взаимодействие может выражаться в том, что, во-первых, гормоны могут влиять на синтез друг друга, во-вторых, в путях передачи их сигналов может функционировать общий сигнальный компонент, в-третьих, взаимодействующие пути могут иметь общие гены-мишени, что приводит к кооперативной регуляции определенного ответа. Так, в отношении этилена и АБК, изучению взаимодействия которых в культивируемых клетках Arabidopsis посвящена наша работа, показано взаимодействие путей передачи сигналов этой пары фитогормонов в таких процессах как прорастание семян (Beaudoin et al., 2000; Ghassemian et al., 2000; Chiwocha et al., 2005), влияние на движение замыкающих клеток устьиц (Tanaka et al., 2005, 2006), изменение роста корней, включая влияние на формирование латеральных корней при тепловом стрессе (Spollen et al., 2000; Sharp and LeNoble, 2002). На основании данных перечисленных исследований трудно высказать предположения о возможном влиянии этилена и АБК на деление клеток. Вместе с тем, нельзя исключить, что в регуляции пролиферации этилен и АБК способны быть как позитивными, так и негативными регуляторами. Действительно, недавно показано, что этилен, а не ауксин - признанный позитивный регулятор клеточной пролиферации - способен усиливать клеточные деления в покоящемся центре корня (Ortega-Martinez et al., 2007). Хотя АБК часто рассматривают в качестве гормона-ингибитора роста, имеются данные, указывающие. что АБК в низких концентрациях способна активировать рост (Sharp et al. 2000:-"Cheng et al. 2002).

Использовав культивируемые in vitro клетки A. thaliana Col-О, а также этилен-нечувствительных мутантов etrl-1, ctrl-1 и ein2-l, нам удалось показать, что в этой биологической модели пути передачи сигналов этилена и АБК взаимодействуют, но взаимодействие путей передачи сигналов этилена и АБК не выражается.во взаимном влиянии на синтез друг друга (Таблицы 7 и 9).

Измерение содержания этилена в газовой среде в процессе культивирования клеток показало, что только в случае клеток Col-О содержание этилена в газовой среде увеличивалось. Измеренное количество этилена выше, чем в воздухе, но, как показывают наши эксперименты, этилен необходим для пролиферации клеток (Таблица 10).

С другой стороны, мы не обнаружили существенного роста продукции этилена в ответ на кратковременную обработку клеток экзогенной АБК, хотя известно, что в ответ на абиотические стрессы происходит значительный рост продукции этилена и АБК. Однако культивирование клеток в условиях, когда АБК постоянно присутствовала в питательной среде, показало, что только у Col-О экзогенная АБК поддерживала биосинтез этилена в течение субкультивирования на уровне, который обеспечивал деление клеток (Таблица 7). То есть, при оптимальных условиях культивирования существуют другие пункты взаимодействия путей передачи сигналов этилена и АБК.

Представляется весьма вероятным, что взаимодействие этилена и АБК связано с их регуляцией экспрессии генов-мишеней. Однако изучение этого вопроса не было задачей нашей работы. Более того, следует специально подчеркнуть, что гены-мишени являются эффекторами, а не компонентами сигнальных путей. Поэтому попытаемся суммировать полученные нами данные, касающиеся собственно компонентов сигнальных путей этилена и АБК (Рис. 20).

В соответствии с "минимальным" путем передачи сигнала АБК, связывание добавленного в среду культивирования фитогормона с его рецепторами PYR/PYL/RCAR ведет к связыванию РР2С с рецептором и инактивации этой про-теинфосфатазы. В результате инициируется путь передачи сигнала АБК, в котором

АВА

1 АСБб-> С2Н4

Деление Деление Деление

Рис. 20. Гипотетическая схема взаимодействия сигнальных путей этилена и абсцизо-вой кислоты в контроле пролиферации культивируемых клеток А. ИпаНапа. функционируют протеинкиназы семейства 8пЯК2. В культивируемых клетках АгаЫйор51$ в пути передачи сигнала АБК, скорее всего, функционирует 8пЯК2.3, транскрипция гена которой сильнее всего активируется экзогенной АБК (Рис. 19).

Протеинкиназы этого семейства АБК-зависимо фосфорилируют свои мишени, среди которых могут быть и различные МАПК. Активированные фосфорилированием МАПК, по-видимому, могут участвовать-в опосредованном АБК снижении уровня пролиферации посредством, например, активирующего фосфорилирования идентифицированного в нашей работе белка KRP4, функции которого как ингибитора циклин-зависимых протеинкиназ установлены (Ormenese et al., 2004).

По мере культивирования клеток образуется этилен (Таблица 7), что определяется активной работой АЦК-синтазы 6 - субстрата МРК6 (Feilner et al., 2005; Taj et al., 2011). Сигнал о связывании этилена с его рецепторами (ETR1/2, ERS1/2, EIN4) проводится через МАП-киназный модуль, в котором функционируют МРКЗ/6 (Yoo et al., 2008). Активированные терминальные МАПК могут трансло-цироваться в ядро, где фосфорилируют связанные с ДНК факторы транскрипции. Показано, что в ответ на этилен увеличивается, в том числе, транскрипция генов, кодирующих РР2С (Schweighofer et al, 2007). Протеинфосфатазы РР2С подгруппы В и некоторые представители подгруппы А имеют домены, обеспечивающие их связывание с МАПК, в том числе с МРК6 (Schweighofer et al., 2007). Связывание РР2С с МРК6 ведет к снижению активности МРК6, и, как следствие, может происходить снижение биосинтеза этилена в течение периода субкультивирования. Действительно, мы показали, что в клетках всех использованных в работе генотипов, продукция этилена падает (Таблица 7). Однако при внесении в среду культивирования клеток экзогенной АБК только в клетках Со1-0 биосинтез этилена поддерживался на уровне, который позволяет клеткам пролиферировать дольше (Таблица 7).

Теперь рассмотрим последствия описанных выше событий применительно к процессам, происходящим на клеточном уровне. Когда путь передачи сигнала этилена функционально активен (Со1-0), клетки активно пролиферируют, а экзогенная АБК выполняет свою функцию ингибитора синтеза ДНК и деления (Рис. 10 и 11). Если этиленовый путь конститутивно активен (ctrl-1). то клетки начинают выходить из цикла и переходить к эндоредупликации (Таблица 8). В этом случае экзогенная АБК. вероятно, способствует реактивации клеточных делений. При инактивированном этиленовом пути идет активная дифференцировка на фоне незначительной пролиферации. Если этилен не воспринимается (егг/-У), то, вероятно, кроме дифференцировки может происходить и массовая гибель клеток (Рис. 11 и Таблица 10), а экзогенная АБК "спасает" клетки, усиливая пролиферацию на фоне снижающейся дифференцировки (Рис. 11 и Таблица 10). Если сигнал этилена воспринимается, но не проводится (ет2-1), то идет активная дифференцировка, а экзогенная АБК усиливает дифференцировку и снижает пролиферацию (Рис. 11 и Таблица 10).

Таким образом, восприятие и передача этиленового сигнала определяет соотношение пролиферации и гибели клеток, которое может корректироваться АБК. Механизм гибели клеток в отсутствие восприятия этилена, по всей видимости, должен отличаться от запрограммированной клеточной смерти, сопровождающей, например, старение. Проведение сигнала этилена определяет баланс между пролиферацией и цитодифференцировкой, которая также может быть настроена в ту или иную сторону при помощи АБК. Оба эти обстоятельства требуют дальнейшего изучения, которое проводится нами в настоящее время.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степанченко, Наталья Сергеевна, Москва

1. Карягин В.В. (1998) Фитогормоны в плодах томата при индуцированной 4-хлорфеноксиуксусной кислотой партенокарпии. Дисс. канд. биол. наук, Москва, 102 с.

2. Мендельсон М. (1969) Абсорбционная цитофотометрия: сравнение различных методов исследования структурированных объектов двухволновой метод. В сб.: Введение в количественную цитохимию, под ред. Бродского В.Я. и др., М„ Мир, с. 167-177.

3. Патрушев Л.И., Зыкова Е.С., Каюшин А.Л., Коростелева М.Д., Мирошников А.И. (1998) Новая система ДНК-диагностики, позволяющая обнаружить и идентифицировать гомозиготные и гетерозиготные точковые мутации. Биоорганическая химия, 24. 194-200.

4. Перт С.Дж. (1978) Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., Мир, 331 с.

5. Ракитин В.Ю., Ракитин Л.Ю. (1986) Определение газообмена и содержания этилена, двуокиси углерода и кислорода в тканях растений. Физиология растений, 33, 403-413.

6. Смоленская И.Н., Носов А.В. (1988) Методы получения и культивирования протопластов. В сб.: Методы культивирования клеток, под ред. Пинаева Г.П., Л., Наука, с. 164-175.

7. Alonso J.M., Hirayama Т., Roman G., Nourizadeh S., Ecker J.R. (1999) EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science, 284,2148-2152.

8. Ansorge W. (1985) Fast and sensitive detection of protein and DNA bands by treatment with potassium permanganate. J. Biochem. Biophys. Methods, 11, 13-20.

9. Asai T., Tena G., Plotnikova J., Willmann M.R., Chiu W-L., Gomes-Gomes L., Boiler T., Ausubel F.M., Sheen J. (2002) MAP kinase signaling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature, 415, 977-983.

10. Barow M., Meister A. (2003) Endopolyploidy in seed plant is differently correlated to systematic, organ, life strategy and genome size. Plant Cell Environ., 26, 571-584.

11. Beaudoin N., Serizet C., Gosti F., Giraudat J. (2000) Interactions between abscisic acid and ethylene signaling cascades. Plant Cell, 12, 1103-1116.

12. Bentem S., Hirt H. (2007) Using phosphoproteomics to reveal signaling dynamics in plants. Trends Plant Sci, 12, 404-411.

13. Bergmann D.C., Lukowitz W., Somerville C.R. (2004) Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science, 304, 1494-1497.

14. Berkmans B., De Veylder L. (2009) Transcriptional control of the cell cycle. Curr. Opin. Plant Biol., 12, 599-605.

15. Binder B.M., O'Malley R.C., Wang W., Moore J.M., Park B.M., Spalding E.P., Bleecker A.B. (2004). Arabidopsis seedling growth response and recovery to ethylene. A kinetic analysis. Plant Physiol., 136, 2913-2920.

16. Bisson M.M., Bleckmann A., Allekotte S., Groth G. (2009) EIN2, the central regulator of ethylene signalling, is localized at the ER membrane where it interacts with the ethylene receptor ETR1. Biochem. J., 424, 1-6.

17. Bisson M.M., Groth G. (2010). New insight in ethylene signaling: Autokinase activity of ETR1 modulates the interaction of receptors and EIN2. Mo I Plant. 3. 882-889.

18. Bleecker A., Estelle M., Somerville C., Kende H. (1988) Insensitivity to ethylene conferred by a dominant mutation in Arabidopsis thaliana. Science, 241, 10861089.

19. Boruc J., Van den Daele H, Hollunder J., Rombauts S., Mylle E., Hilsoa1.ze D., De Veylder L., Russinova E. (2010) Functional modules in ttxe Arabidopsis core cell cycle binary protein-protein' interaction network. Plant Cell, 22, 1264-1280.

20. Boudsocq M., Barbier-Brygoo H., Lauriére C. (2004) Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana, J. Biol. Chem., 279, 41758-41766.

21. Burnett E., Desikan R., Moser R., Neill S. (2000) ABA activation of an 1VEBIP kinase in Pisum sativum epidermal peels correlates with stomatal responses "to ABA. J. Exp Bot, 51, 197-205.

22. Cardinale F., Meskiene I., Ouaked F., Hirt H. (2002) Convergence and divergence of stress-induced mitogen-activated protein kinase signaling pathways at the level of two distinct mitogen-activated protein kinase kinases. Plant Cell, 14, 703-711.

23. Castellano M.M., Boniotti M.B., Caro E., Schnittger A., Gutierrez C. (2004). DNA replication licensing affects cell proliferation or endoreplication in a cell type-specific manner. Plant Cell, 16, 2380-2393.

24. Castellano M.M., Pozo J.C., Ramirez-Parra E., Brown S., Gutierrez C. (200 1) Expression and stability of Arabidopsis CDC6 are associated with endoreplication. Plant Cell 13, 2671-2686.

25. Chaiwongsar S., Otegui M.S., Jester P.J., Monson S.S., Krysan P.J. (2006) The protein kinase genes MAP3K epsilon 1 and MAP3K epsilon 2 are required for pollen viability in Arabidopsis thaliana. Plant J, 48, 193-205

26. Chang C., Kwok S.F., Bleecker A.B., Meyerowitz E.M. (1993) Arabidopsis ethylene-response gene ETR1: similarity of product to two-component regulators. Science, 262. 539-544.

27. Chao Q., Rothenberg M., Solano R., Roman G., Terzaghi W., Ecker J. (1997) Activation of the ethylene gas response pathway in Arabidopsis by the nuclear protein ETHYLENE-INSENSITIVE3 and related proteins. Cell, 89, 1133-1144.

28. Chen Y.F., Randlett M.D., Findell J.L., Schaller G.E. (2002) Localization of the\ethylene receptor ETR1 to- the endoplasmic reticulum of Arabidopsis. J. Biol. Chem., 277, 19861-19866.

29. Cheng W.H., Chiang M.H., Hwang S.G., Lin P.C. (2009) Antagonism between abscisic acid and ethylene in Arabidopsis acts in parallel with the reciprocal regulation of their metabolism and signalling pathways. Plant Mol. Biol., 71, 61-80.

30. Cho H.-J., Kwon H.-K., Wang M.-H. (2010) Expression of Kip-related protein 4 gene (KRP4) in response to auxin and cytokinin during growth of Arabidopsis thaliana. BMB Rep. 43, 273-278.

31. Clark K.L., Larsen P.B., Wang X., Chang C. (1998) Association of the Arabidopsis CTR1 Raf-like kinase with the ETR1 and ERS ethylene receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 5401-5406.

32. Colcombet J., Hirt H. (2008) Arabidopsis MAPKs: a complex signalling network involved in multiple biological processes. Biochem. J., 413, 217-226.

33. Cutler S.R, Rodriguez P.L, Finkelstein R.R, Abrams S.R. (2010) Abscisie acid: emergence of a core signalling network. Annu. Rev Plant Biol., 61, 651-679.

34. Dai Y., Wang H., Li B., Huang J., Liu X., Zhou Y., Mou Z., Li J. (2006) Increased expression of MAP KINASE KINASE7 causes deficiency in polar auxin transport and leads to plant architectural abnormality in Arabidopsis. Plant Cell, 18, 308-320.

35. Dau H., Imaseki H., Wasteneys G.O., Kazama H. (2003) Ethylene stimulates endoreduplication but inhibits cytokinesis in cucumber hypocotyl epidermis. Plant Physiol., 133, 1726-1731.

36. De Veylder L., Beeckman T., Beemster G.T.S., Krols L., Terras F., Landrieu I., Van Der Schueren E., Maes S., Naudts M., Inze D. (2001) Functional analysis of cyclin dependent kinase inhibitors of Arabidopsis. Plant Cell, 13, 1653-1668.

37. De Veylder L., Joubes J., Inze D. (2003) Plant cell cycle transitions. Curr. Opin. Plant Biol., 6. 536-543.44. del Pozo J.C., Lopez-Matas M.A., Ramirez-Parra E., Gutierrez C. (2005) Hormonal control of plant cell cycle. Physiol. Plant., 123, 173-183.

38. Desikan R., Cheung M.K., Bright J., Henson D., Hancock J.T., Neill S.J. (2004) ABA, hydrogen peroxide and nitric oxide signalling in stomatal guard cells. J. Exp. Bot., 55, 205-212.

39. Desikan R., Last K., Harrett-Williams R., Tagliavia C., Harter K., Hooley R., Hancock J.T., Neill S.J. (2006) Ethylene-induced stomatal closure in Arabidopsis occurs via AtrbohF-mediated hydrogen peroxide synthesis. Plant J.47, 907-916.

40. Dewitte W., Murray J.A. (2003) The plant cell cycle. Annu. J^ev. Plant Biol., 54 235-264.

41. Doonan J.H., Kitsios G. (2009) Functional evolution of eye 1 in-dependent kinases Mol. Bioltechnol., 42, 14-29.

42. Feilner T., Hultschig C., Lee J., Meyer S., Immink R.G., iCoenig A., Possling

43. A., Seitz H., Beveridge A., Scheel D., Cahill D.J., Lehrach H., Kreutzber<*er Jto "'

44. Kersten B. (2005) High throughput identification of potential Arabidopsis mitogen-activated protein kinases substrates. Mol. Cell. Proteomics, 4, 101558-68.

45. Filkuka J., Kleinwachter V. (1981) Basic staining of cell nuclei. Medical Faculty ofPurkyne University, Brno, 158 p.

46. Francis D. (2007) The plant cell cycle 15 years on. New Phytol., 174, 261-278.

47. Fu X., Harberd N. (2003) Auxin promotes Arabidopsis root growth by modulatins gibberellin response. Nature, 421, 740-743.

48. Fujii H., Chinnusamy V., Rodrigues A., Rubio S., Antoni R., Park S.Y., Cutler S.R., Sheen J., Rodriguez P.L., Zhu J.K. (2009) In vitro reconstitution of an ABA signaling pathway. Nature, 462, 660-664.

49. Fujii H., Verslues P.E., Zhu J.-K. (2007) Identification of two ^ protein kinases required for abscisic acid regulation of seed germination, root growth, and gene expression in Arabidopsis. Plant Cell, 19, 485-494.

50. Fujii H., Zhu J.K. (2009) Arabidopsis mutant deficient in 3 abscisic acid-activated protein kinases reveals critical roles in growth, reproduction^ and stress. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 8380-8385.

51. Fujita Y., Nakashima K., Yoshida T., Katagiri T., Kidokoro S., Kanamori N. (2009) Three SnRK2 protein kinases are the main positive regulators of abscisic acid signaling in response to water stress in Arabidopsis. Plant Cell Physiol., 50, 2123-2132.

52. Gao Z., Wen C.K., Binder B.M., Chen Y.F., Chang J., Chiang Y.H., Kerris R.J. 3rd, Chang C., Schaller G.E. (2008) Heteromeric interactions among•ethylene receptors mediate signaling in Arabidopsis. J. Biol. Chem., 283, 2380123810.

53. Gazzarrini S, McCourt P. (2003) Cross-talk in plant hormone signalling: what Arabidopsis mutants are telling us. Ann. Bot. 91. 605-612.

54. Gendreau E., Orbovic V., Hofte H., Traas J. (1999). Gibberellin and ethylene control endoreduplication levels in the Arabidopsis thaliana hypocotyl. Planta, 209, 513-516.

55. Ghassemian M., Nambara E., Cutler S., Kawaide H., Kamiya Y., McCourt P.2000) Regulation of abscisic acid signaling by the ethylene response pathway in Arabidopsis. Plant Cell. 12. 1117-1126.

56. Granier C., Inze D., Tardieu F. (2000) Spatial distribution of cell division rate can be deduced from that of p34 (cdc2) kinase activity in maize leaves grown at contrasting temperatures and soil water conditions. Plant Physiol., 124, 1393-1402.

57. Greilhuber J. (2005) Intraspecific variation in genome size in Angiosperms: Identifying its existence. Ann. Bot., 95, 91-98.

58. Gudesblat G.E., Iusem N.D., Morris P.C. (2007) Guard cell-specific inhibition of Arabidopsis MPK3 expression causes abnormal stomatal responses to abscisic acid and hydrogen peroxide. New PhytoL, 173, 713-721.

59. Guzman P., Ecker J.R. (1990) Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell, 12, 513-523.

60. Hall B., Shakeel S., Schaller G.E. (2007) Ethylene receptors: ethyleneperception and signal transduction. J. Plant Growth Regid., 26, 118-130.

61. Hartig K., Beck E. (2006) Crosstalk between auxin, cytokinins, and sugars in the plant cell cycle. Plant Biol., 8, 389-396.

62. Heidstra R., Welch D., Scheres B. (2004). Mosaic analysis using marked activation and deletion clones dissect Arabidopsis SCARECROW action .in asymmetric cell division. Genes Dev., 18, 1964-1969.

63. Himmelbach A., Hoffmann T., Leube M., Hohener B., Grill E. (2002) Homeodomain protein ATHB6 is a target of the protein phosphatase ABI1 and regulates hormone responses in Arabidopsis. EMBO J., 21, 3029-3038.

64. Hirayama T., Shinozaki K. (2007) Perception and transduction of abscisic acidsignals: keys to the function of the versatile plant hormone ABA. Trends Plant Sci., 12, 343-351.

65. Hirayama T., Shinozaki K. (2010) Research on plant abiotic stress responses in the post-genome era: past, present and future. Plant J., 61, 1041-1052.

66. Hrabak E.M., Chan C.W.M., Gribskov M., Harper J.F., Choi J.H., Halford N., Kudla J., Luan S., Nimmo H.G., Sussman M.R., Thomas M., Walker-Simmons

67. K., Zhu J.-K., Harmon A.C. (2003) The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases. Plant Physiol, 132. 666-680.

68. Hua J., Chang C., Sun Q., Meyerowitz E.M. (1995) Ethylene insensitivity conferred by the Arabidopsis ERS gene. Science, 269, 1712-1714.

69. Hua J., Meyerowitz E.M. (1998) Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana. Cell, 94, 261-271.

70. Hua J., Sakai H., Nourizadeh S., Chen Q.H.G., Bleecker A.B., Ecker J.R., Meyerowitz E.M. (1998) EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptors gene family in Arabidopsis. Plant Cell, 10, 1321-1332.

71. Huang M.-M., Arnheim N., Goodman M.F. (1992) Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res., 20. 4567-4573.

72. Hunter T. (1995) Protein kinases and phosphatases: the yin and yang of protein phosphorylation and signaling. Cell, 80, 225-236.

73. Ichimura K., Casais C., Peck S.C., Shinozaki K., Shirasu K. (2006) MEKK1 is required for MPK4 activation and regulates tissue-specific and temperature-dependent cell death in Arabidopsis. J. Biol Chem., 281, 36969-36976.

74. Inze D., De Veylder L. (2006) Cell cycle regulation in plant development. Annn. Rev. Genetics, 40. 77-105.

75. Jonak C., Okresz L., Bogre L., Hirt H. (2002) Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signaling. Curr. Opin. Plant Biol., 5. 415-24.

76. Joubes J., Chevalier C. (2000) Endoreduplication in higher plants. Plant Mo I Biol. 43. 735-745.

77. Jurado S., Trivino S.D., Abraham Z., Manzano C., Gutierrez C., del Pozo C.2008) SKP2A protein, an F-box that regulates cell division, is degraded via the ubiquitin pathway. Plant Signal. Behav., 10, 810-812.

78. Kang J., Hwang J., Lee M., Kim Y, Assmann S.M., Martinoia E., Lee Y. (2010) PDR-type ABC transporter mediates cellular uptake of the phytohormone abscisic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 2355-2360.

79. Kazahara K., Nakayama Y., Nakazato Y., Ikeda K., Kuga T., Yamaguchi N. (2007) Src signaling regulates completion of abscission in cytokinesis through- ERK/MAPK activation at the midbody. J. Biol. Chem., 282, 5327-5339.

80. Kazama H., Dan H., Imaseki H., Wasteneys G.O. (2004) Transient exposure to ethylene stimulates cell division and alters the fate and polarity of hypocotyl epidermal cells. Plant Physiol., 134, 1614-1623.

81. Kieber J.J., Rothenberg M., Roman G., Feldman K.A., Ecker J.R. (1993) CTR1, a negative regulator of the ethylene response pathway in Arabidopsis, encodes a member of the Raf family of protein kinases. Cell, 72, 427-441.

82. Kobayashi Y., Yamamoto S., Minami H., Kagaya Y., Hattori T. (2004) Differential activation of the rice sucrose nonfermenting 1- related protein kinase 2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid. Plant Cell, 16, 1163-1177.

83. Kosetsu K., Matsunaga S., Nakagami H., Colcombet J., Sasabe M., Soyano T., Takahashi Y., Hirt H., Machida Y. (2010) The MAP kinase MPK4 is required for cytokinesis in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 22. 3778-3790.

84. Krysan P.J., Jester P.J., Gottwald J.R., Sussman M.R. (2002) An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis. Plant Cell, 14, 1109-1120.

85. Kuhn J.M., Boisson-Dernier A., Dizon M.B., Maktabi M.H., Schroeder J.I.2006) The protein phosphatase AtPP2CA negatively regulates abscisic acid signal transduction in Arabidopsis, and effects of abhl on AtPP2CA mRNA. Plant Physiol., 140, 127-139.

86. Kuromori T., Miyaji T., Yabuuchi H., Shimizu H., Sugimoto E., Kamiya A., Moriyama Y., Shinozaki K. (2010) ABC transporter AtBCG25 is involved in abscisic acid transport and responses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 2361-2366.

87. Kuromori T., Yamamoto M. (1994) Cloning of cDNAs from Arabidopsis thaliana that encode putative protein phosphatase 2C and a human Drl-like protein by transformation of a fission yeast mutant. Nucleic Acids Res., 22, 5296-5301.

88. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

89. Leung J., Bouvier-Durand M., Morris P.C., Guerrier D., Chefdor F., Giraudat J. (1994) Arabidopsis ABA response gene ABI1: features of a calcium-modulated protein phosphatase. Science, 264, 1448-1452.

90. Leung J., Merlot S., Giraudat J. (1997) The Arabidopsis ABSCISIC ACID-INSENSITIVE2 (ABO) and ABI1 genes encode homologous protein phosphatases 2C involved in abscisic acid signal transduction. Plant Cell, 9, 759-771.

91. Li J., Wang X., Watson M.B., Assmann S.M. (2000) Regulation of abscisic acid-induced stomatal closure and anion channels by guard cell AAPK kinase. Science, 287, 300-303.

92. Liu X., Yue Y., Li B., Nie Y., Li W., Wu W.H., Ma L. (2007) A G proteincoupled receptor is a plasma membrane receptor for the plant hormone abscisic acid. Science, 315, 1712-1716.

93. Lu C., Han M.H., Guevara-Garcia A., Fedoroff N.V. (2002) Mitogen-activated protein kinase signaling in postgermination arrest of development by abscisic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 15812-15817.

94. Lui J., Wang H., Delong C., Fowke L.C., Crosby W.L., Fobert P.R. (2000) The Arabidopsis Cdc2a-interacting protein ICK2 is structurally related to ICK1 and is a potent inhibitor of cyclin-dependent kinase activity in vitro. Plant J., 21, 379-385.

95. Lukowitz W., Roeder A., Parmenter D., Somerville C. (2004) A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell, 16, 109-119.

96. Ma Y., Szostkiewicz I., Korte A., Moes D., Yang Y., Christmann A., Grill E. (2009) Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science, 324, 1064-1068.

97. Manke I.A., Nguyen A., Lim D., Stewart M.Q., Elia A.E.H., Yaffe M.B. (2005) MAPKAP kinase-2 is a cell cycle checkpoint kinase that regulates the G2/M transition and S phase progression in response to UV irradiation. Mol. Cell, 17, 3748.

98. Manning G., Whyte D.B., Martinez R., Hunter T., Sudarsanam S. (2002) The protein kinase complement of the human genome. Science, 298, 1912-1934.

99. MAPK Group (2002) Mitogen-activated protein kinase cascades in plants: a new nomenclature. Trends Plant Sci, 7. 301-308.

100. McCourt P., Creelman R. (2008) The ABA receptors we report you decide. Curr. Opin. Plant Biol., 11, 474-478.

101. Menges M., Hennig L., Gruissem W., Murray J.A.H. (2002) Cell cycle-regulated gene expression in Arabidopsis. J. Biol. Chem., 277, 41987-42002.

102. Meskiene I., Beaudouin E., Schweighofer A., Liwosz A., Jonak C., Rodriguez P.L., Jelinek H., Hirt H. (2003) Stress-induced protein phosphatase 2C, is a negative regulator of a mitogen-activated protein kinase. J. Biol. Chem., 278, 18945-18952.

103. Meyer K., Leube M.P., Grill E. (1994) A protein phosphatase 2C involved in ABA signal transduction in Arabidopsis thaliana. Science, 264, 1452-1455.

104. Miao Y., Lv D., Wang P., Wang X.C., Chen J., Miao C., Song C.P. (2006) An Arabidopsis glutathione peroxidase functions as both a redox transducer and a scavenger in abscisic acid and drought stress responses. Plant Cell, 18, 2749-2766.

105. Morrison D.K., Davis R.J. (2003) Regulation of MAP Kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev Cell Dev. Biol., 19, 91-118.

106. Moshkov I.E., Novikova G.V., Mur L.A.J., Smith A.R., Hall M.A. (2003) Ethylene rapidly up-regulates the activities of both monomeric GTP-binding proteins and protein kinase(s) in epicotyls of pea. Plant Physiol., 131; 1718-1726.

107. Mundy J., Nielsen H.B., Brodersen P. (2006) Crosstalk. Trends Plant Sci., 11, 6364.

108. Murashige T., Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15, 473-97.

109. Mustilli A.C., Merlot S., Vavasseurb A., Fenzia F., Giraudat J. (2002) Arabidopsis OST1 protein kinase mediates the regulation of stomatal aperture by abscisic acid and acts upstream of reactive oxygen species production. Plant Cell, 14, 3089-3099.

110. Nakagami H., Pitzchke A., Hirt H. (2005) Emerging MAP kinase pathways in» plant stress signaling. Trends Plant Sci., 10, 339-346.

111. Nakagami H., Soukupova H., Schikora A., Zarsky V., Hirt H. (2006) A mitogen-activated protein kinase kinase kinase mediates reactive oxygen species homeostasis in Arabidopsis. J Biol. Chem , 281, 38697-38704.

112. Nakai T., Kato K., Shinmyo A., Sekine M. (2006) Arabidopsis KRPs have distinct inhibitory activity toward cyclin D2-associated kinases, including plant-specific B-type cyclin-dependent kinase. FEBS Lett, 580, 336-340.

113. Nambara E., Marion-Poll A. (2005) Abscisic acid biosynthesis and catabolism. Annu. Rev. Plant Biol., 56, 165-185.

114. Nemhauser J.L., Mockler T.C., Chory J. (2004) Interdependency ofbrassinosteroid and auxin signaling in Arabidopsis. PLoS Biol., 2, E258.j 1

115. Neuhoff V., Stamm R., Eibl H. (1985) Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: a systematic analysis. Electrophoresis, 6, 427-448.

116. Nieuwland J., Maughan S., Dewitte W., Scofield S., Sanz L., Murray J.A.H. (2009) The D-type cyclin CYCD4;1 modulates lateral root density in Arabidopsis by affecting the basal meristem region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 2252822533.

117. Nishimura C., Ohashi Y., Sato S., Kato T., Tabata S., Uegucho C. (2004) Histidine kinase homologs that act as cytokinin receptors possess overlapping functions in the regulation of shoot and root growth in Arabidopsis. Plant Cell. 16, 1365-1377.

118. Nishimura N., Yoshida T., Kitahata N., Asami T., Shinozaki K., Hirayama T. (2007) ABA-Hypersensitive Germination 1 encodes a protein phosphatase 2C. anessential component of abscisic acid signaling in Arabidopsis seeds. Plant J., 50, 935-949.

119. Nosov A.V., Smolenskaya I.N., Nosova A.N., (1983) Cytophotometric study of DNA-fuchsin complex in cultured mesophyjl protoplasts of Nicotiniana tabacum and Viciafaba. Biol. Plant., 25, 173-179.

120. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R., Hall M.A. (2000) The effect of ethylene on MAPKinase-like activity in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett., 474, 2932.

121. O'Farrell P.Z. (1975) High resolution two-dimentional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 250, 4007-4021.

122. Oda Y., Miinura T., Hasezawa S. (2005) Regulation of secondary cell walldevelopment by cortical microtubules during tracheary element differentiation in

123. Arabidopsis cell suspensions. Plant Physiol., 137, 1027-1036.

124. Ormenese S., de Almeida Engler J., De Groodt R., De Veylder L., Inze D., Jacqmard A. (2004) Analysis of the spatial expression pattern of seven Kip related proteins (KRPs) in the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Ann. Bot. 93, 575-580.

125. Ortega-Martinez O., Pernas M., Carol R.J., Dolan L. (2007) Ethylene modulates stem cell division in the Arabidopsis thaliana root. Science, 317, 507-510.

126. Ortiz-Masia D., Perez-Amador M.A., Carbonell J., Marcote M.J. (2007) Diverse stress signals activate the CI subgroup MAP kinases of Arabidopsis. FEBS Lett., 581, 1834-1840.

127. Ouaked F., Rozhon W., Lecourieux D., Hirt H. (2003) A MAPK pathway mediates ethylene signaling in plants. EMBO J., 22, 1282-1288.

128. Pandey S., Nelson D.C., Assmann S.M. (2009) Two novel GPCR type G proteins are abscisic acid receptors in Arabidopsis. Cell, 136, 136-148.

129. Park H.C., Song E.H., Nguyen X.C., Lee K., Kim K.E., Kim H.S., Lee S.M., Bae D.W., Yun D.-J., Chung W.S. (2011) Arabidopsis MAP kinase phosphatase 1 is phosphorylated and activated by its substrate AtMPK6. Plant Cell Rep., 30, 15231531.

130. Parkinson J.S., Kofoid E.C. (1992) Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet., 26, 71-112.

131. Pasternak T.P, Otvos K., Domoki M., Feher A. (2007) Linked activation of cell division and oxidative stress defense in alfalfa leaf protoplast-derived cells is dependent on exogenous auxin. Plant Growth Regul., 51, 109-117.

132. Peret B., De Rybel B., Casimiro I., Benkova E., Swarup R., Laplaze L., Beeckman T., Bennett M.J. (2009) Arabidopsis lateral root development: an emerging story. Trends Plant Sci., 14, 399-408.

133. Perrot-Rechenmann C. (2010) Cellular responses to auxin: division versus expansion. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2, aOO 1446.doi: 10.110 l/cshperspect.a001446.

134. Popescu S.C., Popescu G.V., Bachan S., Zhang Z., Gerstein M., Snyder M., Dinesh-Kumar S.P. (2009) MAPK target networks in Arabidopsis thaliana revealed using functional protein microarrays. Genes Dev., 23, 23-80.

135. Qiao H., Chang K.N., Yazaki J., Ecker J.R. (2009). Interplay between ethylene, ETP1/ETP2 F-box proteins, and degradation of EIN2 triggers ethylene responses in Arabidopsis. Genes Dev., 23, 512-521.

136. Qu X., Schaller G.E. (2004) Requirement of the histidine kinase domain for signal transduction by the ethylene receptor ETR1. Plant Physiol., 136, 2961-2970.

137. Rodriguez P.L., Benning G., Grill E. (1998) ABI2, a second protein phosphatase 2C involved in abscisic acid signal transduction in Arabidopsis. FEBS Lett., 421, 185-190.

138. Ruzicka K., Ljung K., Vanneste S., Podhorska R., Beeckman T., Friml J., Benkova E. (2007) Ethylene regulates root growth through effects on auxin biosynthesis and transport-dependent auxin distribution. Plant Cell, 19, 2197-2212.

139. Saavedra X., Modrego A., Rodriguez D., Gonzalez-Garcia M.P., Sanz L., Nicolas G. (2010) The nuclear interactor PYL8/RCAR3 of Fagus sylvatica FsPP2Cl is a positive regulator of abscisic acid signaling in seeds and stress. Plant Physiol., 152, 133-150.

140. Sakai H., Hua J., Chen Q.G., Chang C., Medrano L.J., Bleecker A.B., Meyerowitz E.M. (1998) ETR2 is an £77?/-like gene involved in ethylene signaling in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 410-418.

141. Schaller G.E., Bleecker A.B. (1995) Ethylene binding sites generated in yeast expressing the Arabidopsis ETR1 gene. Science, 270, 1809-1811.

142. Schmelzle K., White F.M. (2006) Phosphoproteomic approaches to elucidate cellular signaling networks. Curr. Opin. Biotechnol., 17, 406-414.

143. Schwartz M., Madhani H. (2004) Principles of MAPK kinase signaling specificity in Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Genet., 38, 725-748.

144. Schweighofer A., Hirt H., Meskiene I. (2004) Plant PP2C phosphatases: emerging functions in stress signaling. Trends Plant Sci. 9. 236-243.

145. Sharp R.E., LeNoble M.E. (2002) ABA, Ethylene and the control of shoot and root growth under water stress. J. Exp. Bot., 53, 33-37.

146. Sharp R.E., LeNoble M.E., Else M.A., Thorne E.T., Gherardi F. (2000) Endogenous ABA maintains shoot growth in tomato independently of effects on plant water balance: evidence for an interaction with ethylene. J. Exp. Bot., 51, 1575-1584.

147. Shen Y., Wang X., Wu F„ Du S., Cao Z., Shang Y., Wang X.L., Peng C.C., Yu

148. X.C., Zhu S.Y. (2006) The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature, 443, 823-826.

149. Shenk R.U., Hildebrandt A. (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledons and dicotyledons plant sell cultures. Can. J. Bot., 50, 199-204.

150. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem., 68, 850-858.

151. Shimotohno A., Ohno R., Bisova K., Sakaguchi N., Huang J., Koncz C., Uchimiya H., Umeda M. (2006) Diverse phosphoregulatory mechanisms controlling cyclin-dependent kinase activating kinases in Arabidopsis. Plant J., 47, 701-710.

152. Solano R., Stepanova A., Chao Q., Ecker J.R. (1998) Nuclear events in ethylene signaling: a transcriptional cascade mediated by ETHYLENE-INSENSITIVE3 and ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1. Genes Dev., 12. 3703-3714.

153. Sontag E., Fedorov S., Kamibayashi C., Robbins D., Cobb M., Mumby M. (1993) The interaction of SV40 small tumor antigen with protein phosphatase 2Astimulates the MAP kinase pathway and induces cell proliferation. Cell, 75, 887897.

154. Sorrell D.A, Chrimes D., Dickinson J.R, Rogers H.J, Francis D. (2005) The Arabidopsis CDC25 induces a short cell length when overexpressed in fission yeast: evidence for cell cycle function. New PhytoL, 165, 425-428.

155. Soyano T., Nidshihama R., Morikiyo K., Ishikawa M., Machida Y. (2003) NQKl/NtMEKl is a MAPKK that acts in the NPK1 MAPKKK-mediated MAPK cascade and is required for plant cytokinesis. Genes Dev., 17, 1055-1067.

156. Sozzani R., Cui H., Moreno-Risueno M.A., Bush W., Van Norman J.M., Vernoux T., Brady S.M., Dewitte W., Murray J.A.H., Benfey P.N. (2010) Spatiotemporal regulation of cell-cycle genes by SHORTROOT links patterning and growth. Nature, 466, 128-132.

157. Spollen W.G., LeNoble M.E., Samuels T.D., Bernstein N., Sharp R.E. (2000) Abscisic acid accumulation maintains maize primary root elongation at low water potentials by restricting ethylene production. Plant Physiol., 122, 967-976.

158. Stepanova A.N., Hoyt J.M., Hamilton A.A., Alonso J.M. (2005) A link between ethylene and auxin uncovered by the characterization of two root-specific ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Plant Cell, 17, 2230-2242.

159. Stepanova A.N., Robertson-Hoyt J., Yun J., Benavente L.M., Xie D., Dolezal K., Schlereth A., Jurgens G., Alonso J.M. (2008) TAA1-mediated auxin biosynthesis is essential for hormone crosstalk and plant development. Cell, 133, 177-191.

160. Stepanova A.N., Yun J., Likhacheva A.V., Alonso J.M. (2007) Multilevel interactions between ethylene and auxin in Arabidopsis roots. Plant Cell, 19, 21692185.

161. Suarez-Rodriguez M.C., Adams-Phillips L., Liu Y.,Wang H., Su S.H., Jester P.J., Zhang S., Bent A.F., Krysan P.J. (2007) MEKK1 is required for flg22-induced MPK4 activation in Arabidopsis plants. Plant Physiol, 143. 661-669.

162. Suzuki T., Miwa K., Ishikawa H., Aiba H., Mizuno T. (2001) The Arabidopsis sensor His-kinase, AHK4, can respond to cytokinin. Plant Cell Physiol42, 107113.

163. Swiatek A., Lenjou M., Van Bockstaele D., Inze D., Van Onckelen H. (2002) Differential effect of jasmonic acid and abscisic acid on cell cycle progression in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol, 128, 201-211.

164. Szostkiewicz I., Richter K., Kepka M., Demrael S. , Ma Y., Korte A. Assaad F.F., Christmann A., Grill E. (2010) Closely related receptor complexes differ in their ABA selectivity and sensitivity. Plant J., 61, 25-35.

165. Taj G., Agarwal P., Kumar A. (2011) In-silico approaches for studying cross-talk of different kinases associated in diverse biological processes with their interacting substrates partners. J Proteomics Bioinform., 4, 091-097. '

166. Takatsuka H., Ohno R., Umeda M. (2009) The Arabidopsis cyclin-dependent kinase-activating kinase CDKF;1 is a major regulator of cell proliferation and cell expansion but is dispensable for CDKA activation. Plant J. 59. 475-187

167. Tanaka Y., Sano T., Tamaoki M., Nakajima N., Kondo N., Hasezawa S. (2005) Ethylene inhibits abscisic acid-induced stomatal closure in Arabidopsis Plant Physiol., 138. 2337-2343.

168. Tanaka Y., Sano T., Tamaoki M., Nakajima N., Kondo N., Hasezawa S. (2006) Cytokinin and auxin inhibit abscisic acid-induced stomatal closure by enhancing ethylene production in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 57. 2259-2266.

169. The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature, 408, 796-815.

170. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354.

171. Tyson J.J., Novak B. (2008) Temporal organization of the cell cycle. Curr. Biol., 18, 759-768.

172. Ueda J, Saito H, Watanabe H, Evers BM. (2005) Novel and quantitative DNA dot-blotting methods for assessment of in vivo proliferation. Am J Physiol., 288, 842-847.

173. Vandepoele K., Raes, J., De Veylder L., Rouze P., Rombauts S., Inze D. (2002). Genome-wide analysis of core cell cycle genes in Arabidopsis. Plant Cell, 14, 903916

174. Vanneste S., De Rybel B., Beemster G.T., Ljung K., De Smet I., Van Isterdael G., Naudts M., Iida R., Gruissem W., Tasaka M., Inze D., Fukaki H., Beeckman T. (2005) Cell cycle progression in the pericycle is not sufficient for

175. SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell, 17, 3035-3050.

176. Wang G., Kong H., Sun Y., Zhang X., Zhang, W., Altman N., de Pamphilis C.W., Ma H. (2004) Genome-wide analysis of the cyclin family in Arabidopsis and comparative phylogenetic analysis of plant cyclin-like proteins. Plant Physiol., 135, 1084-1099.

177. Wang H., Ngwenyama N., Liu Y., Walker J.C., Zhang S. (2007). Stomatal development and patterning are regulated, by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell, 19, 63-73.

178. Wang H., Zhou Y., Bird D.A, Fowke L.C. (2008) Functions, regulation and cellular localization of plant cyclin-dependent kinase inhibitors. J. Microscopy, 231, 234-246.

179. Wang P.-C., Du Y.-Y., An G.-Y., Zhou Y., Miao C„ Song C.-P. (2006) Analysis of global expression profiles of Arabidopsis genes under abscisic acid and H2O2 applications. J. Integr. Plant Biol. 48. 62-74.

180. West G., Inze D., Beemster G.T. (2004) Cell cycle modulation in the response of the primary root of Arabidopsis to salt stress. Plant Physiol., 135, 1050-1058.

181. Wrzaczek M., Hirt (2001) Plant MAP kinase pathways: how many and what for? Biol. Cell, 93, 81-87.

182. Wysocka-Diller J., Helariutta Y., Hukaki H., Malamy J., Benfey P.N. (2000) Molecular analysis of SCARECROW functions reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development, 127, 595-603.

183. Xu B.E., Lee B.H., Min X., Lenertz L., Heise C.J., Stippec S., Goldsmith E.J., Cobb M.H. (2005) WNK1: analysis of protein kinase structure, downstream targets, and potential roles in hypertension. Cell Res., 15, 6-10.

184. Xu J., Li Y.,Wang Y., Liu H., Lei L., Yang H., Liu G., Ren D. (2008) Activation of MAPKkinase 9 induces ethylene and camalexin biosynthesis and enhances sensitivity to salt stress in Arabidopsis. J. Biol. Chem., 283, 26996-27006.

185. Yoo S.-D., Cho Y.-H., Tena G., Xiong Y., Sheen J. (2008) Dual control of nuclear EIN3 by bifurcate MAPK cascades in C2H4 signalling. Nature, 451, 789-797.

186. Yoshida R., Hobo T., Ichimura K., Mizoguchi T., Takahashi F., Aronso J., Ecker J.R., Shinozaki K. (2002) ABA-Activated SnRK2 protein kinase is required for dehydration stress signaling in Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 1473-1483.

187. Zhang X., Dai Y., Xiong Y., DeFraia C., Li J., Dong X., Mou Z. (2007) Overexpression of Arabidopsis MAP kinase kinase 7 leads to activation of plant basal and systemic acquired resistance. Plant J., 52, 1066-1079.

188. Zhou Y„ Fowke L.C., Wang H. (2002) Plant CDK inhibitors: studies of interaction with cell cycle regulators in the yeast two-hybrid system and functional comparison in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell Rep., 20, 967-975.

189. Особая благодарность (Виктору Юрьевичу (ракитину, (Валерию (Владимировичу Харягину, Марине (Васильевне Серебряковой, Олегу Игоревичу %лычникову и Льву Ивановичу ОТатрушеву за помощь в проведении исследования.

190. Отдельно хочу поблагодарить моих родителей, Ольгу (Владимировну и Сергея Ивановича, за безграничное терпение и всестороннюю поддержку.