Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сигнальные функции жирных кислот и их производных в формировании защитных ответов растений на стрессы

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Сигнальные функции жирных кислот и их производных в формировании защитных ответов растений на стрессы"

На правах рукописи

САВЧЕНКО ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

СИГНАЛЬНЫЕ ФУНКЦИИ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ В ФОРМИРОВАНИИ ЗАЩИТНЫХ ОТВЕТОВ РАСТЕНИЙ НА

СТРЕССЫ

03.01.05 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 8 АВГ 2014

Пущино-2014

005551997

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

Научный консультант:

Климов Вячеслав Васильевич, доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты:

Юрина Надежда Петровна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, заведующая лабораторией биоэнергетики

Лось Дмитрий Анатольевич, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. КА. Тимирязева Российской академии наук, заведующий лабораторией молекулярных основ внутриклеточной регуляции

Бровко Федор Александрович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, заведующий лабораторией иммунохимии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Защита состоится «12» ноября 2014 г. в 11:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01, созданного на базе ИФПБ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (http://www.ibbp.psn.ru).

Автореферат разослан « » августа 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Назарова Галина Николаевна

Актуальность темы

Регуляция развитая растительного организма и его взаимодействие с

окружающей средой осуществляется благодаря скоординированному действию

нескольких сигнальных и регуляторных систем, образующих сложную

многокомпонентную сигнально-регуляторную сеть. Важным компонентом этой

регуляторной сети является система, включающая производные окисленных

жирных кислот - оксилипины, которые образуются ферментативно или

спонтанно во всех аэробных организмах от бактерий до человека (Howe and

Schilmiller, 2002; Тарчевский, 2002). Системы оксилипинов схожи у

эволюционно далеких видов, несмотря на то, что в качестве субстратов для их

образования используются разные жирные кислоты, отличающиеся по длине

углеродной цепи и числу ненасыщенных связей. Схожи многие этапы

биосинтеза, сходство обнаруживается в биохимической природе ферментов

биосинтеза оксилипинов и в химической структуре некоторых конечных

продуктов. Более того, оксилипины у разных организмов сохранили

функциональное сходство, и у растений и у животных эти вещества вовлечены

в регуляцию стрессовых ответов. В животных клетках двадцатиуглеродная

арахидоновая кислота дает начало биологически активным веществам -

эйкозаноидам, таким как простагландины, простациклины, тромбоксаны,

лейкотриены, липоксины и другие. Эти вещества, выполняющие важные

регуляторные функции во всех тканях и системах животного организма,

вовлечены в различные иммунопатологические ответы, включая

воспалительные процессы, астму, раковые заболевания, ревматоидный артрит

(Harizi et al., 2008). В вегетативных тканях покрытосеменных растений

арахидоновая кислота не образуется, и субстратами для синтеза оксилипинов

выступают шестнадцати- и восемнадцатиуглеродные ненасыщенные жирные

кислоты (Andreou et al., 2009). Путь биосинтеза оксилипинов у растений

включает несколько параллельных ветвей. Алленоксидсинтазная и

гидропероксидлиазная - две доминирующие ветви этого биосинтетического

пути (Feussner and Wasternack, 2002). Метаболиты алленоксидсинтазной ветви,

3

жасмонаты, характеризуются широким спектром регуляторных функций и отвечают за рост, развитие, фертильность, старение и защитные реакции растений (Pauwels et al., 2009; Wasternack and Hause, 2013). Наиболее изученные метаболиты гидропероксидлиазной ветви - это, так называемые, Летучие Соединения Зеленых Листьев, которые, в основном, представлены шестиуглеродными альдегидами и их производными (Matsui et al., 2006). В литературе имеются многочисленные подтверждения того, что метаболиты гидропероксидлиазы играют важную роль в защите растений от насекомых и патогенов. Работы последних лет показали, что летучие оксилипины являются активными участниками сложной сигнальной системы, обеспечивающей экологические взаимодействия с другими растениями и насекомыми (Engelberth et al., 2004; Kessler and Baldwin, 2001; van Poecke and Dicke, 2004).

В течение длительного времени изучение сигнальных функций жирных кислот и оксилипинов остается важнейшей областью исследований в медицине и биологии по причине разнообразия и важности функций, выполняемых этими соединениями. Несмотря на наблюдаемый в последние годы прогресс, многие регуляторные механизмы растений, связанные с жирными кислотами и оксилипинами, остаются малоизученными. До сих пор не известны некоторые этапы биосинтеза оксилипинов у растений и биологические функции многих метаболитов, не идентифицированы компоненты сигнальных систем, связанных с метаболизмом и действием оксилипинов. Исследование вопросов, связанных с функциями жирных кислот и оксилипинов в адаптации растений к условиям биотических и абиотических стрессов, является актуальной задачей современной биологии и имеет как теоретическое, так и практическое значение.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - изучение сигнальных функций жирных кислот и

оксилипинов в индукции защитных ответов растений на биотические и

абиотические стрессы окружающей среды и в обеспечении взаимодействий

растений с другими организмами - патогенными микроорганизмами,

4

насекомыми и соседними растениями. В работе решались следующие задачи:

1. изучить влияние сверхдлинноцепочечных полиненасыщеных жирных кислот на активацию защитных ответов в условиях биотических стрессов у покрытосеменных растений;

2. изучить влияние биотических (патогены и насекомые-фитофаги) и абиотических (механическое повреждение и засуха) факторов внешней среды на содержание оксилипинов алленоксидсинтазной и гидропероксидлиазной ветвей пути биосинтеза оксилипинов;

3. изучить влияние биотических и абиотических факторов внешней среды на экспрессию генов, связанных с метаболизмом и сигналингом оксилипинов;

4. исследовать роль отдельных оксилипинов в процессе адаптации растений к неблагоприятным условиям среды, используя генетически-модифицированные растения с измененным содержанием оксилипинов.

Научная новизна и значимость результатов работы

В результате проведенной работы были обнаружены новые аспекты

сигнальных функций жирных кислот и оксилипинов.

Впервые получены убедительные доказательства того, что арахидоновая

кислота, которая не образуется у покрытосеменных растений и попадает в

растительные ткани только в процессе инфицирования патогенными

микроорганизмами, активирует стрессовые ответы и индуцирует

оксилипинную сигнальную сеть у покрытосеменных растений. В ходе

экспериментов с использованием трансгенных растений, в которых

реконструирован биосинтез нетипичных для покрытосеменных растений

сверхдлинноцепочечных полиненасыщеных жирных кислот, было показано,

что, как и в животных клетках, в растениях арахидоновая кислота осуществляет

транскрипционную регуляцию группы стрессовых генов, в конечном

результате приводящую к изменению устойчивости к стрессовым факторам.

Совокупность данных позволяет рассматривать эту жирную кислоту как

патоген-ассоциированную молекулярную структуру (от англ. «райк^еп-

5

associated molecular pattern»), которая воспринимается растительным организмом как сигнал распознавания «свое/чужое». Результаты работы послужили основой для новых исследований, целью которых является идентификация растительных генов, регулируемых арахидоновой кислотой, с помощью технологии микрочипов. Полученные данные и биологические материалы могут быть использованы в дальнейших работах по выяснению молекулярных основ устойчивости растений к патогенам, выделяющим арахидоновую кислоту в процессе инфицирования растений, таким как патогены рода Phytophthora.

Нами получены новые данные о роли летучих оксилипинов во взаимодействии растений с насекомыми. В работе обнаружено активное подавление синтеза и эмиссии метаболитов гидропероксидлиазной ветви грызущими насекомыми-фитофагами. Показано, что такая супрессия вызывается активными компонентами, содержащимися в ротовых секретах насекомых. Получены экспериментальные данные, подтверждающие, что растения, подвергнутые воздействию летучих соединений, выделяемых соседними поврежденными растениями, более устойчивы к насекомым. В совокупности полученные результаты приводят к выводу о том, что активная супрессия гидропероксидлиазной ветви, исключающая передачу летучих сигналов между соседними растениями, направлена на предотвращение инициирования защитных процессов в растениях экологического сообщества, что может обеспечить насекомым преимущества в естественной среде. Конечный результат исследований направлен на поиск альтернативных путей защиты растений от насекомых, способных заменить применение вредных для здоровья людей и экологии пестицидов.

В работе получены новые доказательства участия оксилипинов в

адаптации растений к абиотическим стрессам. Показано, что механическое

повреждение и засуха по-разному изменяют профиль оксилипинов

алленоксидсинтазной и гидропероксидлиазной ветвей. Анализ генетически

модифицированных растений арабидопсиса с измененным профилем

6

оксилипинов позволил идентифицировать 12-оксофитодиеновую кислоту как метаболит, регулирующий апертуру устьиц и повышающий засухоустойчивость растений.

Таким образом, представляемая работа охватывает широкий круг вопросов, связанных с функциями жирных кислот и оксилипинов в регуляции защитных ответов растений в условиях биотических и абиотических стрессов, имеющих как теоретическое, так и практическое значение.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Присутствие нетипичных для покрытосеменных растений сверхдлинноцепочечных полиненасыщеных жирных кислот в тканях растений приводит к существенным изменениям устойчивости к патогенам и насекомым.

2. Изменение устойчивости трансгенных растений, синтезирующих сверхдлинноцепочечные полиненасыщеные жирные кислоты, к патогенам и насекомым связано с изменением уровней гормонов, регулирующих ответы на биотические стрессы, жасмоновой кислоты и салициловой кислоты.

3. Арахидоновая кислота, образованная в тканях высших растений в результате генетической модификации или нанесенная на поверхность листьев, изменяет защитные реакции растений и модулирует устойчивость к патогенам.

4. Разные типы повреждений растительных тканей дифференциально изменяют профили оксилипинов. Повреждения, вызванные механическим поранением или насекомыми с колюще-сосущим ротовым аппаратом, стимулируют образование и выделение метаболитов гидропероксидлиазной ветви, а повреждения, вызванные грызущими насекомыми, сопровождаются подавлением этих процессов. В основе наблюдаемой супрессии лежит регуляция экспрессии генов пути биосинтеза оксилипинов.

5. Подавление эмиссии летучих метаболитов гидропероксидлиазной ветви

вызывается активными компонентами, присутствующими в ротовых секретах

грызущих насекомых, и направлено на предотвращение инициирования

защитных ответов у соседних растений.

7

6. Адаптация растений к условиям дефицита воды сопровождается изменением содержания оксилипинов алленоксидсинтазной и гидропероксидлиазной ветвей. Уровень 12-оксофитодиеновой кислоты в листьях коррелирует с засухоустойчивостью растений.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены в виде устных докладов на ретритах Департамента биологии растений Калифорнийского университета в Дэвисе (Асиломар, США, 2008 г., 2009 г.), на встречах Американской ассоциации биологов растений (Гонолулу, США, 2009 г.; Миннеаполис, США, 2011 г.), на семинаре ИФПБ РАН (Пущино, Россия, 2013 г.), на семинаре в Массачусетском институте технологий (Массачусетс, США, 2013 г.), на 18-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, Россия, 2014 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 22 печатные работы, 21 статья в ведущих рецензируемых научных журналах и глава в книге. По результатам работы получен международный патент на новый подход к улучшению засухоустойчивости растений. Список публикаций по теме диссертационной работы приведен в конце автореферата.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, пяти глав (включая «Обзор литературы», «Объекты и методы исследования», три главы, посвященные результатам исследования и их обсуждению), заключения, выводов и списка литературы, включающего 355 источников. В работе представлены 46 рисунков и 3 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

Обзор литературы представляет собой анализ современных данных о регуляторных функциях жирных кислот и их производных. В работе описываются пути биосинтеза оксилипинов в растениях, обсуждается разнообразие функций этих соединений, собраны и проанализированы данные об участии оксилипинов в адаптационных процессах растений в условиях абиотических и биотических стрессов. В обзоре рассматриваются современные работы, посвященные изучению молекулярных основ действия оксилипинов, выполненные с использованием биохимических, молекулярно-биологических и генетических подходов. Приводятся данные об участии оксилипинов в переносе стрессовых сигналов, регуляции экспрессии стресс-индуцируемых генов, а также о взаимодействии оксилипинов с многочисленными сигнальными путями в клетках, включая сигнальные пути растительных гормонов. В обзоре также затрагиваются вопросы разработки новых подходов к повышению устойчивости растений к стрессовым условиям, основанные на стимулировании естественных защитных механизмов растений оксилипинами.

Объекты и методы исследования

Объектами исследований служили растения Arabidopsis thaliana. Были использованы дикие типы Columbia-0 (Col-0), Wassilewskija (Ws), Landsberg erecta (Ler), трансгенные линии, экспрессирующие гены С18-Д9-элонгазы Isochrysis galbana, С20-Д8-десатуразы Euglena gracilis и С20-Д5-десатуразы Mortierella alpina для синтеза сверхдлинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, трансгенные линии, экспрессирующие гены HPL риса, растения, мутантные по генам AOS, JAR!, EDS6 и OPR3, растения, экспрессирующие люциферазу светлячка под контролем промотора, содержащего Элементы Быстрого Ответа на Стрессы (RSRE), растения томатов (Solanum lycopersicum).

Анализ жирных кислот, растительных гормонов и оксилипинов, выделенных из растительных тканей, а также летучих органических соединений, выделяемых растениями в окружающую среду, осуществляли с помощью метода газовой хроматографии и масс-спектрометрии на газовом хроматографе Hewlett and Packard 6890, соединенным с масс-спектрометром Agilent Technologies 5973. Для оценки устойчивости растений к биотическим стрессам применяли методы биоанализа с использованием грибкового патогена Botrytis cinerea, оомицетного патогена Phytophthora capsici, бактериального патогена Pseudomonas syringae pv tomato DC3000, зеленой персиковой тли Myzus persicae, гусениц Pieris гарае и Spodoptera exigua. Анализ экспрессии генов проводили с помощью метода количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). Для исследования индукции неспецифических стрессовых ответов в тканях растений проводили анализ экспрессии репортерного гена люциферазы светлячка, регулируемого промотором, содержащим RSRE элементы (Элементы Быстрого Ответа на Стрессы - Rapid Stress Response Element), с помощью видеокамеры Andor DU434-BV CCD camera. Для создания генетических конструкций использовали стандартные методы молекулярной биологии и генной инженерии. Трансформацию арабидопсиса осуществляли методом погружения соцветий в суспензию агробактерий. Скрининг трансгенных растений проводили на основе устойчивости к гербициду и с помощью ПЦР. Для оценки засухоустойчивости растений проводили тест на выживание в условиях нехватки воды. Для статистического анализа данных было использовано программное обеспечение Sigma-Stat.

Результаты исследований и их обсуждение

Исследование сигнальных функций арахидоновой кислоты у

покрытосеменных растений

Жирные кислоты и их производные не только являются важными

структурными и метаболическими составляющими клетки, но также выступают

участниками и регуляторами многих сигнальных путей. Структурные

10

особенности жирных кислот, такие как длина цепи и степень ненасыщенности,

определяют их участие в различных биологических процессах. Было показано,

что экспрессия многих генов регулируется жирными кислотами на

транскрипционном и посттранскрипционном уровнях в одноклеточных

организмах, в животных и растительных клетках (В1аск й а1., 2000; Оир1иэ е1

а!., 2000; Ьоб й а!., 2013; Ре§опег й а1., 2004). У растений влияние жирных

кислот и их метаболитов на протекание внутриклеточных процессов

проявляется особенно ярко в стрессовых условиях (ирсЬигсЬ, 2008; СЬаЫга-

ЗЬекага е! а1., 2007; КасЬгоо е1 а1., 2003а). Незначительные изменения

жирнокислотного состава мембранных липидов приводят к изменениям

метаболизма и активности сигнальных путей, что влияет на протекание

физиологических процессов, в первую очередь, на формирование ответных

реакций на стрессовые факторы внешней среды. Не только изменение

внутритканевого жирнокислотного состава, но и экзогенная обработка

растений жирными кислотами влияет на активность сигнальных путей

стрессовых ответов (ВоэШск е1 а1., 1981; ОгегйзкоУБкауа й а1., 2004; ЯогЬпоуа

е1 а1., 2003). Жирные кислоты с очень длинной углеродной цепью (более 18

углеродных атомов) обычно не обнаруживаются в покрытосеменных

растениях, особенно в вегетативных тканях, однако присутствуют в больших

количествах в клетках некоторых патогенов растений - оомицетах, включая

представителей рода РИу1орЫога. Также известно, что двадцатиуглеродная

арахидоновая кислота секретируется этими патогенами на ранних стадиях

инфицирования. Некоторые исследования указывают на потенциальные

сигнальные функции, выполняемые этой жирной кислотой в растениях

(Воз1оск й а1. 1981), однако убедительных данных, подтверждающих

способность арахидоновой кислоты выполнять роль регулятора защитных

реакций у цветковых растений, не было получено. В представляемой работе

были использованы трансгенные растения АгаЫс1ор$1$ /каНапа, способные

синтезировать нетипичные для цветковых растений сверхдлинноцепочечные

полиненасыщенные жирные кислоты, в том числе арахидоновую кислоту, для

11

изучения влияния этих жирных кислот на защитные ответы растений в условиях биотических стрессов. Эти растения были получены в лаборатории профессора Лазарус в Школе биологических наук Бристольского университета (Бристоль, Великобритания) с целью исследования возможности биосинтеза жирных кислот с очень длинной углеродной цепью в растениях для биотехнологического производства (Qi et al., 2004). В нашей работе были использованы два типа трансгенных растений: ПЭК1 (Продуценты Эйкозаполиеновых Кислот 1), полученные последовательной трансформацией дикого типа Со1-0 (ДТ) генами С18-Д9-элонгазы Isochrysis galbana, С20-Д8-десатуразы Euglena gracilis и С20-Д5-десатуразы Moríierella alpina, и ПЭК2, полученные трансформацией ДТ

Таблица 1. Жирнокислотный состав

одной генной конструкцией,

липидов, выделенных из листьев содержащей все три гена. В отличие дикого типа и ПЭК1 растений

от растений дикого типа ПЭК арабидопсиса

продуцируют незначительные Жирные

количества необычных для покрыто- кислоты

семенных растений эйкозаполиено- 16:0

16:1А'

вых жирных кислот, включая

16:2А7*10

арахидоновую кислоту (таблица 1). 16 зд710 При нормальных условиях растения lg:0 ПЭК фенотипически не отличаются is:ia»

ОТ ДТ. ДЛЯ ТОГО ЧТОбЫ ПОНЯТЬ как 18:2л'-11

18:3 Д'".и

присутствие необычных для

20:0

растений эйкозаполиеновых жирных ^ м кислот изменяет стрессовые ответы 2о:зд»-"." растения, ПЭК растения были 20:за«»" подвергнуты действию разнооб- 20:4А "■"•14-17

20:4А!-».»,14

разных биотических стрессовых

20:5Д5-».".".'7

факторов.

% от общего содержания

Дикий тип ПЭК1

14,50 ± 0,403 13,99 ± 0,285

2,02 ± 0,169 2,28 ± 0,156

0,61 ±0,063 0,63 ± 0,168

15,11 ±0,186 15,82 ± 0,545

1,41 ± 0,243 1,15 ± 0,136

1,33 ± 0,192 1,04 ±0,017

14,18 ±0,139 12,89 ± 0,476

50,72 ± 0,705 49,79 ± 0,232

0,12 ± 0,015 0,09 ± 0,012

0,77 ± 0,057

0,95 ± 0,055

0,02 ±0,01

0,16 ±0,039

0,42 ± 0,067

0,01 ±0,006

Для анализа защитных реакций растений дикого типа и трансгенных растений в условиях биотических стрессов были проведены эксперименты с использованием патогенов и вредителей, включая зеленую персиковую тлю М persicae, два изолята грибкового патогена В. ceneria, оомицет Р. capsici и бактериальный патоген Р. syringae (люминесцентный штамм DC3000). Трансгенные растения оказались более устойчивы ко всем стрессовым факторам за исключением бактериальной инфекции, проявляя повышенную чувствительность к Р. syringae (рис. 1). В эксперименте "выбора", в котором самки тли, помещенные в небольшие замкнутые камеры с ДТ и ПЭК1, выбирали растение для откладки яиц, в большинстве случаев предпочтение отдавалось растениям дикого типа (рис. 1 А). Размеры некротических повреждений, вызванных грибком В. ceneria, оказались значительно меньше на листьях трансгенных растений по сравнению с ДТ (рис. 1 Б). ПЭК1 оказались более устойчивыми к оомицету Р. capsici. На корнях ПЭК1 растений было обнаружено меньшее число спорангиев (рис. 1 В), а анализ количественной ПЦР выявил меньшее число копий ДНК патогена (рис. 1 Г). Бактериальный патоген, напротив, поражал трансгенные растения в большей степени, чем ДТ (рис. 1 Д). Результаты биоанализов свидетельствуют о существенных изменениях устойчивости трансгенных растений к биотическим стрессам.

Растения используют разные защитные механизмы в ответ на различные биотические стрессы. В ответ на повреждение биотрофными патогенами в растениях активируются сигнальные пути, связанные с биосинтезом салициловой кислоты (САК), образованием активных форм кислорода и активацией ответа программируемой гибели клеток, в то время как ответы на повреждения, вызванные насекомыми и некротрофными микроорганизмами, опосредуются главным образом жасмоновой кислотой (ЖАК). Обнаруженная устойчивость трансгенных растений к насекомым и некротрофным патогенам -грибкам и оомицетам, сопровождающаяся повышенной чувствительностью к бактериальной инфекции, предполагает активацию процессов, опосредованных

ЖАК, и подавление процессов, связанных с САК.

13

А

Б

о Р= 0,0012 g 100 _

н

В

О Q U-

§ ДТ ПЭК1

г

ч 0 ДТ ПЭК1

д | 600 Р=0,0001

—™ 5 0U-ю 0U-™

ДТ ПЭК1 ДТ ПЭК1 и ДТ ПЭК1

Рис. 1. Анализ устойчивости дикого типа (ДТ) и ПЭК1 растений к биотическим стрессам. (А) Результат выбора растения для откладывания яиц тлями М. persicae. Столбцы показывают общий результат четырех независимых экспериментов. (Б) Симптомы инфекции В. cinerea на листьях ДТ и ПЭК1 и диаметр повреждений на третий день после инокуляции патогена. Данные - среднее значение 40-48 измерений ± стандартная ошибка. (В) - число спорангиев Р. capsici (в 10 полях при увеличении 200Х), (Г) - количество ДНК Р. capsici в 1 г корней, определенное с помощью кПЦР, через 48 часов после инокуляции гидропонической среды зооспорами патогена. Данные - среднее значение результатов 40 измерений для (В) и 6 для (Г) ± стандартная ошибка. (Д) Рост бактерий Р. syringae в листьях ДТ и ПЭК1. Биолюминесценцию бактерий измеряли через 2 дня после инокуляции. Данные — среднее значение результатов анализа 30 растений, полученных в 4 независимых экспериментах, ± стандартная ошибка. Звездочки над столбцами обозначают статистически значимую разницу между разными генотипами.

Мы измерили содержание ЖАК и САК и провели анализ уровня экспрессии

генов путей биосинтеза этих гормонов и некоторых генов, экспрессия которых

регулируется этими гормонами, в интактных и механически поврежденных

14

растениях через 90 минут после повреждения листьев пинцетом, когда уровень жасмонатов в тканях достигает максимума (рис. 2). Для анализа были выбраны гены, кодирующие следующие ферменты: фосфолипазу AI DONGL (DGL), шесть липоксигеназ (LOX1-LOX6), алленоксидсинтазу (AOS). Фосфолипаза DGL вовлечена в формирование базового и стресс-индуцируемого уровней жасмонатов. DGL отщепляет жирные кислоты от молекул липидов. Свободные жирные кислоты используются в качестве субстрата липоксигеназами, которые превращают жирные кислоты в соответствующие гидропероксиды. Образовавшиеся гидропероксиды жирных кислот могут быть использованы несколькими ферментами разных ветвей биосинтеза оксилипинов. AOS является первым ферментом ветви, в которой образуются жасмонаты. В качестве маркерного ЖАК-индуцируемого гена был выбран ген VSP2 (Vegetative Storage Protein 2 - Вегетативный Запасающий Белок 2). Уровень ЖАК был выше в ПЭК1 растениях. За исключением генов LOX1 и LOX4 экспрессия всех остальных генов также была выше в ПЭК1 по сравнению с ДТ. Особенно заметна разница при сравнении поврежденных растении. Уровень салициловой кислоты и экспрессия генов, связанных с синтезом и переносом сигнала САК, напротив, подавлены в ПЭК1 по сравнению с ДТ. Для анализа экспрессии были выбраны следующие гены, связанные с САК: PAD4 (Phytoalexin Deficient 4 - Лишенный Фитоалексина 4), кодирующий белок, подобный липазе/эстеразе, позитивный регулятор уровня САК, ICSI (Isochorismate Synthase 1 - Изохоризмат-Синтаза 1), кодирующий фермент биосинтеза САК. Из САК-индуцируемых генов были выбраны NPR1 (Nonexpressor of Pathogenesis Related Proteins 1 - Неэкспрессирующий Белки Связанные с Патогенезом 1), ген транскрипционного фактора WRKY70, играющего ключевую роль во взаимодействии сигнальных путей ЖАК и САК, и PR1 (Pathogenesis-Related 1 - Связанный с Патогенезом 1), являющийся маркерным геном - индикатором интактности путей синтеза и передачи сигнала САК.

гюь

юх т

А08

т т

ЖАК *

т

I

К5Р2

□ ДТ В 1,2

1ПЭК1

0,8 0,4

БЫ т 250 £0X3 3 10X5

ииил

о

0 Си

§ 20 Ь0Х1 80 ЬОХ4 25 ЛО?

: I бо г№ л

аюгъ т 40 ¡5 Д

1 О I 5 I 8 Л —■-Ш- П--■ --™

«2000. £

| ЖАК Т 141 10X2 1,6 10X5 б ™Р2

М иУш

к МП

к МП

К МП

К МП

Рис. 2. Уровень жасмоновой кислоты и относительная экспрессия генов, связанных с биосинтезом жасмонатов в диком типе и ПЭК1 растениях. (А) Упрощенная схема биосинтеза и передачи сигнала жасмоната. (Б) Уровень ЖАК и (В) относительный уровень транскриптов в диком типе и ПЭК1 растениях, контрольных (К) и механически поврежденных (МП). Данные - среднее значение результатов шести измерений для (Б) и трех экспериментов дляО (В) ± стандартная ошибка.

Уровень экспрессии всех генов ниже в ПЭК1. Полученные данные объясняют повышенную чувствительность растений ПЭК к бактериальной инфекции. Для ПЭК1 и ПЭК2 были получены схожие результаты.

ПЭК растения содержат несколько двадцатиуглеродных жирных кислот. Эти растения обнаруживают существенные отличия от дикого типа в устойчивости к биотическим стрессам, обусловленные, по крайней мере отчасти, изменением содержания гормонов, вовлеченных в адаптацию к

стрессовым факторам. Для идентификации жирной кислоты, ответственной за наблюдаемый фенотип, растения арабидопсиса дикого типа обрабатывали разными жирными кислотами, затем измеряли уровень ЖАК в листьях обработанных растений. Результаты показали, что только арахидоновая кислота (АК) вызывала повышение уровня этого гормона. Обработка другими жирными кислотами не приводила к изменению уровня ЖАК. Также как и в случае эндогенного образования жирной кислоты, экзогенная обработка растений АК приводит к повышению уровня ЖАК и усилению экспресии гена УБР2 (рис. 3 А и Б). Аналогично ПЭК растениям, накапливающим АК, в обработанных АК растениях дикого типа понижены уровень САК и экспрессия генов РАВ4,1С51, \VRKY70 и РШ (рис. 3 В и Г).

а 801 £60 I"40

<5 20| 1 0

Ч™ Б 2*2,51 № ПК

и! 1ЩШ Ялк

В 2160, г 5| РЛП4 1С31

А ик щи

1:11 4Ж

о

1 2,0| ^'ИКПО

I 1,6 В и

Э 0,8 <§0,4| 0

|| №НКУ7С

12

Рис. 3. Уровень гормонов, ЖАК (А) и САК (В), и транскриптов генов, связанных с биосинтезом и сигналингом ЖАК (Б) и САК (Г), в контрольных (К) и обработанных арахидоновой кислотой (АК) растениях арабидопсиса. Представлены результаты трех экспериментов ± стандартная ошибка.

Известно, что ЖАК и САК в растении часто выступают антагонистами, обуславливая адекватность стрессовых ответов при различных условиях среды (Kunkel and Brooks 2002). Чтобы понять, является ли воздействие АК на САК прямым или опосредуется действием ЖАК, было изучено влияние АК на растения, мутантные по генам биосинтеза ЖАК - aos (Park et al. 2002). Этот мутант не содержит эндогенных жасмонатов из-за отсутствия функционального гена AOS, который кодирует первый фермент жасмонатной ветви. Анализ показал, что в таких растениях содержание САК и уровень экспрессии САК-зависимых генов не меняется после обработки АК (рис. 4). Данные свидетельствуют о том, что наблюдаемая супрессия ответов, связанных с САК, не является результатом прямого действия АК, а является следствием индукции ЖАК-опосредованных ответов.

I I К

А ' ,,п| Б 15 PR1 2,5 WRKY70 8 PAD4 _

S250 т Я т I ВАК

НМЛ

Рис. 4. Уровень САК (А) и экспрессия САК-зависимых генов (Б) в растениях aos, лишенных ЖАК, контрольных (К) и обработанных арахидоновой кислотой (АК). Представлены результаты трех анализов ± стандартная ошибка.

Относительно недавно идентифицированные г/ис-регуляторные элементы, названные Элементами Быстрого Ответа на Стрессы - RSRE (Rapid Stress Response Elements), ответственны за очень быструю и кратковременную индукцию генов в ответ на многие стрессы. Трансгенные растения, в которых экспрессия люциферазы контролируется промоторами, содержащими элементы RSRE, являются очень удобным инструментом для наблюдения индукции и распространения стрессовых ответов в растении (Walley et al. 2007). Эти

18

растения были использованы в представляемой работе для того, чтобы выявить способность жирных кислот активировать транскрипционную сеть неспецифических стрессовых ответов. При обработке этих растений различными жирными кислотами было обнаружено, что только АК обладала способностью индуцировать люциферазную активность (рис. 5). Для подтверждения индукции арахидоновой кислотой RSRE элементов в нативных промоторах арабидопсиса нами был проведен анализ экспрессии некоторых генов, содержащих RSRE элементы в промоторных участках, с помощью количественной ПЦР. Экспрессия генов CAFIa (CCR4-Associated Factor 1 -Ассоциированный с CCR4 Фактор 1), ERF#018 (Ethylene Response Factor #018 -Фактор Ответа на Этилен 18) и ВАР1 (BON Association Protein I - Белок, Ассоциированный с BON 1) индуцировалась обработкой растений арахидоновой кислотой. Таким образом, АК не только индуцирует синтетический ген RSRE.LUC, но и регулирует экспрессию генов с мотивом RSRE в нативных промоторах.

А Б

Контроль Н,0 18:2 20:2 20:4

0 20 40 60 80 100

Рис. 5. Изучение влияния различных жирных кислот на индукцию RSRE. (А) Изображение К8Е£:ЬиС растений до (верхняя панель) и после (нижняя панель) нанесения различных жирных кислот (18:2Д912, 18:ЗД9'12'15, 20:2ДИ'14, 20:ЗД|1Д4'17, 20:4Д5'81114) на поверхность листьев. (Б) Относительная люциферазная активность в растениях RSRE:LL)C, обработанных жирными кислотами, выраженная как площадь под графиком кинетики люциферазной активности измеренной в течение четырех часов после обработки растений.

Нами также обнаружено, что обработка растений арахидоновой кислотой повышает устойчивость растений к грибковому патогену В. ceneria. Для исследования роли гормонов в защитных процессах, индуцируемых арахидоновой кислотой, мы обрабатывали арахидоновой кислотой растения, мутантные по генам биосинтеза или путям передачи сигналов гормонов ЖАК и САК, затем заражали их спорами В. ceneria (рис. 6). В эксперименте использовали растения дикого типа и генетически модифицированные (растения, мутантные по гену AOS (aos), не способные синтезировать жасмонаты, растения, мутантные по гену JAR1 (jarl), в которых нарушена передача сигнала жасмоновой кислоты из-за отсутствия функционального

К АК

Рис. 6. Влияние арахидоновой кислоты на устойчивость растений арабидопсиса, дикого типа и мутантных, к В. сепепа. Растения обрабатывали 0,02% раствором этанола (К) или арахидоновой кислотой (АК), через 30 минут после обработки растения заражали спорами В. сепег'ш. (А) Видимые симптомы поражений листьев В. сепег'ш и (Б) результаты измерений диаметра поражений через три дня после заражения патогеном. Представлены результаты 40 измерений ± стандартная ошибка. Звездочка указывает на статистически значимую разницу между контрольными и обработанными арахидоновой кислотой растениями.

фермента, осуществляющего конъюгацию жасмоновой кислоты с аминокислотой изолейцином и растения, мутантные по гену ЕИБб (есЬб), в которых нарушен биосинтез САК). Защитного эффекта не наблюдалось если в растении нарушен биосинтез или передача сигнала ЖАК. Результаты экспериментов говорят о том, что в растениях арабидопсиса в основе защитного действия АК от грибковой инфекции лежит индукция процессов, опосредованных ЖАК. В работе также было обнаружено, что способность АК индуцировать защитные реакции не ограничивается арабидопсисом. Нами был проведен ряд экспериментов с растениями томатов, которые показали, что, как и в случае арабидопсиса, обработка листьев томатов АК индуцирует защитные ответы, опосредованные ЖАК, и приводит к уменьшению площади некротических повреждений.

Полученные данные представляют собой новое доказательство того, что жирные кислоты, также как и белковые молекулы, могут регулировать внутриклеточные процессы у покрытосеменных растений. Суммируя результаты анализа трансгенных растений, содержащих

сверхдлинноцепочечные полиненасыщеные жирные кислоты, и данные, полученные в экспериментах по экзогенной обработке растений различными жирными кислотами, можно сказать, что АК выполняет сигнальные функции у высших растений и выступает модулятором сигнальных путей, связанных с формированием стрессовых ответов. Также как и в животной клетке в растениях АК индуцирует не только специфические защитные ответы, но и активирует сигнальную сеть неспецифических стрессовых ответов. Полученные результаты позволяют предположить, что высшие растения, в ходе эволюции утратившие способность синтезировать АК, способны воспринимать эту молекулу как сигнал присутствия патогенов.

Дифференциальная регуляция алленоксидсинтазной и гидропероксидлиазной ветвей пути биосинтеза оксилипинов при взаимодействии растений с насекомыми

Растения часто подвергаются атакам насекомых-фитофагов. Поедание насекомыми неизбежно ведет к механическому повреждению растений и попаданию ротовых секретов в растительные ткани. Ротовые секреты насекомых содержат специфические для данного фитофага элиситоры, которые, попадая в поврежденную ткань растений, запускают защитные ответы посредством регуляции транскрипционных, трансляционных и посттрансляционных процессов (Halitschke et al., 2001; Hilker and Meiners, 2010; Howe and Jander, 2008). Ротовые секреты, выделяемые насекомыми, могут подавлять защитные ответы у растений, аналогично тому, как слюна кровососущих насекомых подавляет защитные ответы у животных (Musser, 2005; Will et al., 2007). Защитные ответы растений на атаки насекомых могут быть прямыми и непрямыми (опосредованными). К первому типу защитных реакций можно отнести синтез веществ, способных отталкивать насекомых или понижать усвоение ими питательных веществ. Непрямые защитные ответы основываются на синтезе и высвобождении так называемых Летучих Органических Соединений, которые привлекают естественных врагов насекомых или служат сигналом тревоги для соседних растений (Chehab et al., 2008; Kessler and Baldwin, 2001; Pare and Tumlinson, 1999; van Poecke and Dicke, 2004; Engelberth et al., 2004; Farag et al., 2005). Многие защитные ответы растений, вызываемые насекомыми, регулируются оксилипинами (Blee, 2002; Reymond et al., 2004).

В данной работе мы исследовали изменения профиля оксилипинов,

которые происходят в тканях растений в результате повреждений насекомыми-

фитофагами. В работе были использованы дикие типы и трансгенные растения

арабидопсиса: дикий тип Columbia-0 (Col-0), который является естественным

мутантом по гену HPL из-за делеции 10 пар оснований в первом экзоне гена,

дикий тип Wassilewskija (Ws), который содержит функциональный ген HPL и

22

трансгенные линии, полученные на основе Со1-0, экспрессирующие ген HPL риса под контролем конститутивного промотора (OsHPL3). Нами был проведен анализ летучих соединений, выделяемых интактными растениями и растениями, поврежденными с помощью пинцета или насекомыми. В экспериментах были использованы зеленые персиковые тли, обладающие колюще-сосущим ротовым аппаратом, и два вида гусениц, характеризующихся грызущим типом питания, «специалисты» (стенофаги) Pieres гарае и «генералисты» (эврифаги) Spodoptera exigua. В результате проведенных анализов цис-3-гексенол и г/мс-3-гексенил ацетат были идентифицированы как основные летучие соединения, выделяемые механически поврежденными растениями Ws и OsHPL3. Контрольные и поврежденные гусеницами растения не выделяли этих соединений (рис. 7). Даже длительное пребывание гусениц на растении, сопровождающееся значительными повреждениями растительных тканей, не приводит к выделению упомянутых метаболитов. Растения Со1-0 не выделяли гуис-3-гексенол и г/мс-З-гексенил ацетат, что подтверждает ферментативное HPL-зависимое происхождение данных метаболитов.

§_=■ 6001 5 'а

0 ¡ 400|

1 У 200|

II

L

S S я 20"

gas

5 т

I* ■

! 10 Я

~ К МП й

Ws

К МП Рт СоЮ

3 24 72 (ч) К МП Рт OsHPU

Рис. 7. Изучение влияния разных типов повреждений на выделение метаболитов гидропероксидлиазной ветви. (А) Уровень метаболитов, выделяемых интактными (К), механически поврежденными (МП) и поврежденными Р. гарае (Рг) (через 3, 24 и 72 часа после первых повреждений) растениями ^Л^, Со1-0 и ОэНРЬЗ.

Интересно, что повреждения растений тлями сопровождаются накоплением в тканях растений и выделением в окружающую среду метаболитов HPL ветви, несмотря на то, что эти насекомые не оставляют видимых повреждений на поверхности растений Ws (рис. 8).

Наблюдаемая в случае Р. гарае и S. exigua супрессия выделения летучих соединений может быть объяснена либо присутствием в ротовых секретах активностью, подавляющей выделение летучих соединений, либо результатом особой техники повреждения растений. Для выяснения причины, ответственной за подавление эмиссии метаболитов HPL, был проведен ряд экспериментов с растениями Ws. Ротовые секреты гусениц наносили на поверхность механически поврежденных листьев и проводили анализ испускаемых растением летучих соединений. Механически поврежденные растения, на раневую поверхность которых были нанесены ротовые секреты, выделяли на ~50% меньше гуис-З-гексенола и на -70% меньше гукс-З-гексенил ацетата по сравнению с растениями, на раневую поверхность которых наносили воду. Ротовые секреты Р. гарае и S. exigua вызывали похожие эффекты. Супрессия, вызванная насекомыми, не снималась повторным повреждением пинцетом, что свидетельствует о том, что отсутствие эмиссии метаболитов HPL не является результатом особой техники повреждения растительных тканей грызущими насекомыми, а связано с более глубокими изменениями в самом растении.

Анализ внутритканевого содержания метаболитов HPL ветви и параллельной AOS ветви в листьях интактных и поврежденных с помощью

24

ч 8 10'

8-

«2 Sg. 6 ? I 4

Ц 2

3-Й о-

сЯ

I S.4

§ >>

я « 3 я 2

IV I £

п я

к м п Мр

ш

cr-1-

к мпа/р

Рис. 8. (А) Уровень г/мс-3-гексенола, накапливаемого в тканях, и (Б) цис-3-гексенил ацета, выделяемого в окружающую среду, интактными (К), механически поврежденными (МП) и поврежденными Му:из регБкае (Мр) растениями АУв.

насекомых веществ, обладающих

пинцета или насекомыми растений позволил обнаружить высокий базовый уровень первого продукта НРЬ ветви, г/мс-3-гексеналя, в листьях 'Мб и ОзНРЬЗ, не зависимо от типа воздействия на растения, включая контрольные неповрежденные растения. Уровень цис-3-гексенола, продукта восстановления цис-3-гексеналя, заметно возрастает после повреждения растений пинцетом, однако такого изменения не наблюдается в растениях, поврежденных гусеницами (рис. 9). Даже на поздней стадии инфестации внутритканевый уровень г/ис-З-гексенола оказывается не выше, чем у контрольных растений, в то время как уровень жасмоновой кислоты, метаболита параллельной ветви биосинтеза оксилипинов, постепенно повышается в растениях поврежденных насекомыми (рис. 10). Эти данные свидетельствуют о дифференциальной регуляции двух ветвей биосинтеза оксилипинов при повреждении растений насекомыми. Уровень салициловой кислоты остается неизменным при всех описанных экспериментальных условиях. Результаты анализов указывают на селективность и специфичность ответов, связанных с повреждением растительных тканей насекомыми.

и с

Ч ¡5 4

41 —

^ 3 .

о и 2

3- £ 0-

*

. -.

К МП Рг

К МПРг

ГШ)

К МП Рг апгп

Рис. 9. Содержание г^с-З-гексеналя (А) и г/ие-З-гексенола (Б) в контрольных (К), механически поврежденных (МП) и поврежденных гусеницами (Рг) растениях Шэ, Со1-0 и ОбНРЬЗ. Представлены результаты 6 измерений ± стандартная ошибка. Звездочки над столбцами обозначают статистически значимую разницу (Р < 0,05).

К б 12 24 72 (ч) Рг

6 12 24 72 (ч) Рг

Рис. 10. Эндогенное содержание цис-3-гексенола и ЖАК в контрольных (К, белые столбцы) и поврежденных гусеницами Р. гарае (Рг, серые столбцы) растениях через указанные промежутки времени после первых повреждений. Представлены результаты 6 измерений ± стандартная ошибка.

Для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе изменения уровней оксилипинов, был проведен анализ экспрессии генов биосинтеза оксилипинов с помощью метода кПЦР в контрольных и поврежденных гусеницами растениях на ранних (90 минут) и поздних (3 дня) стадиях повреждения гусеницами Р. гарае (рис. 11). Был проведен анализ экспрессии генов AOS и HPL ветвей, включая гены фосфолипазы (DGL), липоксигеназы (LOX2),

алленоксидсинтазы (AOS), ОФДК-редуктазы 3 (OPR3), гидропероксидлиазы (HPL) и г^г/с-3-гексенолацетилтрансферазы (CHAT). Экспрессия гена DGL значительно не изменялась, уровень экспрессии гена LOX2 повышался на ранних стадиях повреждения растений насекомыми и возвращался к

LOX21

6 72 (h)

Рис. 11. Уровень транскриптов в контрольных (К) и поврежденных гусеницами (Рг) растениях через 6 и 72 часа после появления первых повреждений. Данные - среднее значение результатов 3 экспериментов ± стандартная ошибка.

базовому уровню к третьему дню. Гены жасмонатной ветви AOS и OPR3 экспрессировались значительно активнее в растениях, поврежденных гусеницами, как на ранней, так и на поздней стадиях повреждений. Экспрессия генов гидропероксидлиазной ветви, HPL и CHAT, не менялась после повреждения растений насекомыми. Факт отсутствия индукции экспрессии генов HPL и CHAT на. ранней и поздней стадиях инфестации свидетельствует о том, что в основе наблюдаемой супрессии HPL ветви лежит регуляция экспрессии генов ферментов пути биосинтеза.

Для того чтобы понять биологическое значение наблюдаемой супрессии, был проведен эксперимент, позволяющий оценить влияние выделяемых летучих соединений на устойчивость соседних растений к насекомым. Эксперименты показали, что растения Со1-0, которые находились вблизи механически поврежденных растений OsHPL3, выделяющих летучие соединения HPL ветви, были меньше повреждены гусеницами, чем растения, которые не были подвергнуты действию летучих соединений. Полученные данные позволяют предположить, что активная супрессия эмиссии метаболитов HPL ветви насекомыми-фитофагами, исключающая передачу сигналов между соседними растениями, направлена на предотвращение инициирования защитных процессов в растениях экологического сообщества.

Чтобы защититься от насекомых-фитофагов, растения выработали

множество разнообразных стратегий, включая биосинтез вторичных

метаболитов, образующихся в AOS и HPL ветвях. Метаболиты AOS ветви —

жасмонаты - способствуют развитию устойчивости к широкому спектру

биотических факторов, включая насекомых (McConn et al. 1997; Baldwin 1998).

Летучие соединения HPL ветви вовлечены в интра- и интерорганизменные

сигнальные каскады и являются сигналом тритрофных взаимодействий (Bate

and Rothstein 1998; Pare et al. 1998; Stotz et al. 1999; Arimura et al. 2001). Нами

показано, что образование метаболитов AOS и HPL ветвей дифференциально

регулируется при разных типах повреждений растительных тканей. В работе

обнаружено подавление эмиссии летучих соединений HPL ветви насекомыми-

27

фитофагами с грызущим типом питания, которое, возможно, направлено на блокирование взаимодействий между соседними растениями.

Изучение роли оксилипинов алленоксидсинтазной и

гидропероксидлиазной ветвей в устойчивости растений к засухе

Несмотря на существенный прогресс в изучении многих аспектов участия

оксилипинов в формировании ответных реакций растений на биотические

факторы внешней среды, роль оксилипинов в адаптации растений к

абиотическим стрессам остается малоизученной. В представляемой работе

изучали воздействие абиотических стрессов (механического повреждения и

засухи) на содержание метаболитов алленоксидсинтазной и

гидропероксидлиазной ветвей. Мы исследовали изменения содержания

оксилипинов в трех экотипах арабидопсиса, Col-0, Ws и Ler, в ответ на

поранение и засуху. Экотип Со1-0, как было упомянуто ранее, является

естественным мутантом, лишенным функционального гена HPL, но содержит

функциональный ген AOS. Экотипы Ws и Ler содержат функциональные гены

AOS и HPL. Анализ позволил обнаружить специфические особенности

оксилипинного профиля в условиях каждого из исследуемых абиотических

стрессов (рис. 12). Как и ожидалось, HPL метаболиты не были обнаружены в

Со1-0, за исключением небольшого количества неферментативно образованного

«уис-З-гексенола, присутствующего в механически поврежденных листьях.

Первый шестиуглеродный продукт HPL ветви i/ис-З-гексеналь присутствует в

экотипах Ler и Ws в очень высоких концентрациях, причем уровень этого

альдегида не изменяется в результате механического повреждения, а засуха

приводит к его повышению. Повышение уровня г/мс-З-гексеналя согласуется с

ранее полученными данными о повышении уровня транскрипции гена HPL в

условиях засухи (De Domenico et al., 2012; Reymond et al., 2000). Отсутствие

заметного изменения уровня г/ис-3-гексеналя после механического

повреждения может объясняться тем, что в этих условиях значительная его

часть превращается в более летучее соединение г/мс-3-гексенол, который

28

выделяется растением в окружающую среду после повреждения, как это было показано нами ранее (рис. 7). Уровень г/ис-3-гексенола, наоборот, повышается при механическом повреждении ткани и уменьшается в условиях засухи. Содержание метаболитов AOS ветви также по-разному изменяется в ответ на упомянутые абиотические стрессы во всех трех экотипах. В Ler и Ws уровень 12-оксофитодиеновой кислоты (12-ОФДК) возрастает существенно в ответ на засуху и мало изменяется после механического повреждения. В Со1-0 уровень 12-ОФДК увеличивается в обоих случаях, после механического повреждения и после действия засухи. Разница между экотипами, возможно, объясняется отсутствием конкуренции за субстрат в случае Со1-0 из-за отсутствия функциональной HPL. Интересно, что уровень ЖАК во всех трех экотипах увеличивается только в ответ на поранение и остается низким в течение 5 дней засухи, не смотря на то, что уровень биосинтетического предшественника 12-ОФДК повышен. Во всех экспериментах также измеряли уровень абсцизовой кислоты (АБК), так как именно этот гормон регулирует большую часть адаптивных процессов в условиях дефицита воды (Kim et al., 2010; Wasilewska et al., 2008). Уровень гормона АБК, как и ожидалось, сильно возрастает в условиях дефицита воды и незначительно увеличивается в ответ на механическое повреждение тканей. Таким образом, два абиотических стресса, механическое повреждение и засуха, по-разному изменяют состав оксилипинов. Засуха вызывает накопление начальных продуктов биосинтеза AOS и HPL ветвей и подавляет формирование последующих продуктов, а механическое повреждение приводит к накоплению продуктов конечных стадий биосинтеза.

Для того, чтобы изучить роль отдельных оксилипинов в адаптации растений к условиям засухи мы создали ряд трансгенных линий арабидопсиса с различным содержанием метаболитов HPL и AOS ветвей. Растения Со1-0 были трансформированы конструкциями, в которых экспрессия генов HPL риса контролируется конститутивным промотором.

«2000 -feи 1600

n g 1200

иис-3-гсксеналь

4 P 4

■4 p

30 20 10

12-ОФДК

II

1,6-1 ЖАК

1,2-

0,8 g

0,4-0J ■ |

К МП 3 К МПЗ

К МПЗ

Ьег Со1-0

Рис. 12. Содержание метаболитов (цис-Ъ-гексеналя, г/нс-3-гексенола, 12-ОФДК, ЖАК и АБК) в трех экотипах арабидопсиса (АУз, Ьег и Со1-0) в контрольных растениях (К, белые столбцы), механически поврежденных, через 90 минут после повреждения (МП, черные столбцы) и в растениях, подвергнутых засухе в течение пяти дней (3, серые столбцы). Данные

представляют собой результаты трех экспериментов ± стандартная ошибка.

Были созданы конструкции для экспрессии генов HPL2 и HPL3, а также конструкция, в которой ген HPL3 лишен последовательности, кодирующей транзитный пептид (HPL3-TP), для того чтобы изменить внутриклеточную

локализацию белка HPL3. Во всех случаях кодирующая

последовательность генов была соединена с последовательностью гена Зеленого Флуоресцирующего Белка для возможности изучения локализации рекомбинантных белков в клетке и детекции с помощью антител против Зеленого Флуоресцирующего Белка. В работе использовали трансгенные

растения, которые содержали рекомбинантный белок HPL и накапливали значительное количество метаболитов HPL. Высокоразрешающая конфокальная микроскопия показала, что белки HPL2, HPL3 и HPL3-TP по-разному локализуются внутри клетки: HPL3 -в хлоропластах, а HPL2 и HPL3-TP -вне пластид (рис. 13).

Антн-ЗФБ Рубиско 4

ЗФБ

Наложение двух

хлоропласт изображений

1 щ ш

щ в 1

Н н я

НРЬ2

НРЬЗ

НРЬЗ-ГП

Рис. 13. Экспрессия генов ЯР/. риса в арабидопсисе. (А) Вестерн-блот анализ белков трансгенных растений, экспрессирующих рекомбинантные белки НРЬ (НРЬ2, НРЬЗ и НРЬЗ-ТР), с помощью антител против Зеленого Флуоресцирующего Белка. Ниже показан фрагмент геля, окрашенного с помощью кумасси синего, демонстрирующий содержание большой субъединицы Рубиско в образцах. (Б) Уровень цис-3-гексеналя в трансгенных растениях. (В) Конфокальные изображения клеток эпидермиса и мезофилла арабидопсиса, демонстрирующие субклеточную локализацию белков НРЬ в трансгенных растениях и автофлуоресцирующего хлорофилла. Большая часть НРЬЗ находится внутри хлоропластов, НРЬ2 обнаруживается вне пластид (обозначено стрелками). НРЬЗ, лишенный пептида, направляющего белок в хлоропласты (НРЬЗ-ТР), обнаруживается также вне хлоропластов в составе больших структур, возможно, белковых агрегатов (также отмечено стрелками). Размер серой полосы - 10 мкм.

Мы также использовали в работе мутантные растения с измененным

содержанием метаболитов AOS ветви. Мутант aos не содержит

функционального гена AOS и, вследствие этого, не образует жасмонатов. Этот

мутант был первоначально создан на основе безтрихомного мутанта gl-1 (Park

et al., 2002), но с помощью нескольких скрещиваний этого мутанта с диким

типом Со1-0 нам удалось избавиться от мутации в гене Gl-1 (Glabrous-1).

Мутант оргЗ, созданный на основе дикого типа Ws, не содержит

функционального гена ОФДК-редуктазы 3, в результате чего в этих растениях

образуется 12-ОФДК, но ЖАК не образуется (Stintzi and Browse, 2000).

Измерения уровней ЖАК и 12-ОФДК в контрольных и подвергнутых стрессу

растениях показали, что субклеточная локализация HPL влияет на стресс-

индуцируемые уровни жасмонатов. В частности, линии,

сверхэкспрессирующие HPL3 в пластидах, характеризуются наименьшим

содержанием ЖАК и 12-ОФДК. Такой результат не является неожиданным и

объясняется использованием значительной части пула гидропероксидов

жирных кислот ферментом HPL, что подтверждает ранние предположения о

конкуренции HPL и AOS за общий субстрат (Halitschke et al., 2004; Tong et al.,

2012). Неожиданностью оказалось повышенное содержание жасмонатов в

растениях, сверхэкспрессирующих внепластидные HPL. Уровень свободной 12-

ОФДК повышается в результате механического повреждения и засухи во всех

анализируемых линиях, но самый высокий уровень обнаруживается в

растениях, экспрессирующих внепластидные HPL, после воздействия засухи.

Уровень ЖАК, напротив, индуцируется только при механическом повреждении

и остается неизменным после воздействия засухи, несмотря на наличие в

клетках больших количеств метаболического предшественника 12-ОФДК.

Высокий уровень 12-ОФДК в линиях с экстрапластидными ферментами HPL

может быть объяснен активацией ветви AOS метаболитами

гидропероксидлиазной ветви на фоне отсутствия конкуренции за субстрат.

Отсутствие накопления ЖАК в условиях, когда количество биосинтетического

предшественника не ограничено, позволяет предположить блокирование

32

превращения 12-ОФДК в ЖАК сигналом, специфично индуцируемым в условиях засухи. Для контроля был измерен уровень гормона АБК во всех растениях. Результаты показали, что засуха вызывала повышение уровня этого гормона во всех растениях, при этом уровень АБК во всех трансгенных растениях был одинаковым. Для того, чтобы изучить корреляцию между уровнем оксилипинов и физиологическими ответами растений, мы провели тесты на выживаемость в условиях засухи всех генетически модифицированных растений арабидопсиса. Результаты анализа установили положительную корреляцию между засухоустойчивостью растений и уровнем 12-ОФДК (рис. 14 А). Так, растения HPL3-TP и оргЗ, которые характеризуются самым высоким содержанием 12-ОФДК, показали самый высокий процент выживания в условиях засухи, в то время как растения aos, которые не способны образовывать 12-ОФДК, и линии HPL3, в которых общий субстрат используется и для образования метаболитов гидропероксидлиазной ветви, и для образования жасмонатов, обнаружили наименьший процент выживания в ответ на засуху. Затем мы измерили апертуру устьиц в растениях и обнаружили, что диаметр устьичной щели меньше у растений с более высоким содержанием 12-ОФДК (рис. 14 Б). Итак, нами обнаружено, что процесс адаптации растений к условиям засухи приводит к торможению процесса превращения 12-ОФДК в ЖАК. Совокупность полученных данных свидетельствует о роли 12-ОФДК в устойчивости растений к условиям дефицита воды. Аналогичные выводы о регуляторных функциях 12-ОФДК в условиях дефицита воды были высказаны ранее (Seki et al. 2007). Возможно, что способность этого метаболита усиливать устойчивость растений к условиям дефицита воды связана с регулированием апертуры устьичной щели.

Чтобы исследовать влияние разных оксилипинов на апертуру устьиц мы проанализировали действие метаболитов HPL и AOS ветвей на устьица эпидермальных препаратов арабидопсиса Со1-0. Результаты показали, что из метаболитов HPL только высокие концентрации 1у«с-3-гексеналя (50-100 мкМ)

и 100

i «80

s I 60

1 »40

pa cu

ч= 20 с4

о

J100l 100-, *

SO' 80- ЯШ

60' Г^I * 60- _Н

40- УЬ 40Т Я » Я

3 Е ДТ "OS ДТ оргЗ

12,

ДТ оргЗ

Рис. 14. (А) Результаты тестов на выживание растений с разным содержанием оксилипинов. Приведены средние значения четырех независимых экспериментов, проведенных с использованием 10-12 растений каждого генотипа ± стандартная ошибка. (Б) Изображения устьиц и результаты измерений ширины устьичной щели растений с измененным содержанием оксилипинов. Данные представляют собой среднее значение не менее 90 измерений ± стандартная ошибка. Звездочки над столбцами указывают на статистически значимую разницу между трансгенным растением/мутантом и соответствующим диким типом (Р<0,05).

вызывают уменьшение апертуры устьиц (рис. 15). Метилжасмонат уменьшает

апертуру устьиц нелинейно, вызывая умеренное уменьшение даже при

концентрации 200 мкМ. В литературе имеются противоречивые данные о

воздействии жасмоновой кислоты и ее производных на апертуру устьиц

(Raghavendra and Reddy, 1987; Suhita et al., 2004). В наших экспериментах 12-

ОФДК оказалась наиболее активным оксилипином, регулирующим ширину

устьичной щели арабидопсиса. Интересно, что такое действие 12-ОФДК не

34

Ют

в-

6-

4-

2-

0-1

3

У. 10-1

Я 8-

К (г

л

н 4-

о 2-

03 0-1

О,

10-,

н о. 8-

и С 6-

< 4-

2-

о-

10-

8-

б"

4-

2-

о-

цис-3 -гексеналь цис-З -гексенол

5 50 100 - 5 50 100 ЧмкМ) транс-2-гексеналь ¡/кс-3-гексенил ацетат

5 50 100 - 5 50 100 (мкМ) 12-ОФДК ЖАК

п

2 5 10 20 50 - 5 10 25 50 100 200 (мкМ) АБК

[Ийз

2 4 8 10 15 20 (мкМ)

Рис. 15. Измерение ширины устьичной щели эпидермальных препаратов арабидопсиса до и после добавления разных концентраций оксилипинов (цис-3-гексеналя, цис-3-гексенола, /ирамс-2-гексеналя, гумс-3-гексенил ацетата, 12-ОФДК и ЖАК), а также АБК. Данные -результаты 90 измерений ± стандартная ошибка.

ограничивается арабидопсисом, но также наблюдается при добавлении этого метаболита к препаратам эпидермиса томатов и рапса.

Таким образом, засуха приводит к изменению баланса некоторых растительных гормонов и метаболитов, что в результате отражается на состоянии устьиц (АсЬагуа апс! Азвтапп, 2009). Среди всех фитогормонов АБК является главным регулятором апертуры устьиц в условиях дефицита воды

(Kim et al., 2010). В некоторых работах было показано, что другой

растительный гормон - ЖАК, также накапливается в тканях в результате засухи

и участвует в регуляции апертуры устьиц (Creelman and Mullet, 1995; Munemasa

et al., 2007). Однако, уровень ЖАК повышается на очень короткий промежуток

времени на ранних этапах адаптации к условиям засухи. Так, например, в

растениях сои в условиях недостатка воды уровень ЖАК временно

повышается, а затем, через 4 часа после начала действия стресса понижается

ниже уровня, наблюдаемого в контрольных растениях (Creelman and Mullet,

1995). Наши данные показывают, что уровень ЖАК в условиях засухи не

изменяется, однако, уровень биосинтетического предшественника ЖАК, 12-

ОФДК, заметно увеличивается. Это может свидетельствовать о том, что в

данных стрессовых условиях блокируется перенос 12-ОФДК из хлоропластов в

пероксисомы, либо ингибируются стадии биосинтеза ЖАК, происходящие в

пероксисомах. Полученные нами данные о роли 12-ОФДК в обеспечении

устойчивости растений в условиях засухи согласуются с недавно

опубликованными данными, подтверждающими роль LOX6, фермента,

ответственного за формирование базового уровня 12-ОФДК в листьях и корнях,

в обеспечении устойчивости растений к засухе (Grebner et al., 2013). Мы также

предполагаем, что функции этого метаболита в условиях засухи могут быть

связаны с контролем апертуры устьиц, аналогично тому, как жасмонаты

контролируют апертуру устьиц в условиях биотических стрессов, защищая

растения от проникновения патогенов (Montillet et al., 2013). Различие функций

ЖАК и 12-ОФДК в регуляции экспрессии генов в ответ на различные стрессы

подтверждается на примере экспрессии гена AtPH01;H10, члена

малоизученного семейства генов PHOl (Ribot et al., 2008). Индукция

экспрессии этого гена при механическом повреждении регулируется

независимо от АБК 12-оксофитодиеновой кислотой, но не жасмоновой

кислотой. Антагонистические и синергические взаимодействия АБК и

жасмоната были описаны в нескольких работах (Adie et al., 2007; Anderson et

al., 2004; Mauch-Mani and Mauch, 2005). Кооперативное действие 12-ОФДК и

36

АБК не ограничивается ответами на сигналы окружающей среды, но также обнаруживается в регуляции процессов роста и развития, как в случае описанного взаимодействия этих гормонов при прорастании семян арабидопсиса. 12-ОФДК, взаимодействуя с АБК, вызывает накопление белка ABI5 (ABA Insensitive 5 - Не Чувствительный к АБК 5), что, в свою очередь, приводит к возрастанию уровня полигалактуроназы и ингибированию прорастания семян (Dave and Graham, 2012; Dave et al., 2011). В нашей работе показано, что засуха приводит к блокированию превращения 12-ОФДК в ЖАК. Такое блокирование, по-видимому, связано с функциями, выполняемыми этим оксилипином в стрессовых условиях.

Заключение

Растения постоянно испытывают на себе влияние множества факторов

живой и неживой природы. Оксилипины являются важным компонентом

сигнально-регуляторной системы, которая обеспечивает адекватную

регуляцию многих адаптивных процессов в ответ на изменяющиеся условия

окружающей среды. Регуляторные функции оксилипинов в растениях

характеризуются большим разнообразием и высокой специфичностью, что

подтверждается новыми данными, представляемыми в данной работе. Нами

получены новые доказательства участия жирных кислот и оксилипинов в

процессе адаптации растений к биотическим и абиотическим стрессам,

исследованы молекулярные механизмы, лежащие в основе адаптационных

процессов, регулируемых оксилипинами. К важнейшим результатам работы

можно отнести обнаружение дифференциальной регуляции разных этапов пути

биосинтеза оксилипинов различными стрессовыми факторами внешней среды.

В работе показано, что профиль метаболитов двух доминирующих ветвей пути

биосинтеза оксилипинов, алленоксидсинтазной и гидропероксидлиазной, по-

разному изменяется под влиянием биотических (патогены и насекомые-

фитофаги) и абиотических (механическое повреждение и засуха) факторов. В

основе наблюдаемых адаптивных процессов лежит регуляция экспрессии

37

генов, связанных с метаболизмом и сигналингом оксилипинов. Использование в работе генетически модифицированных растений с измененным содержанием жирных кислот и оксилипинов в сочетании с экзогенной обработкой растений синтетическими метаболитами позволило выявить роль отдельных жирных кислот и оксилипинов в процессе адаптации растений к неблагоприятным условиям среды. Полученные результаты могут послужить основой для дальнейших исследований, направленных на поиск новых способов повышения устойчивости растений к стрессовым условиям, основанных на стимулировании внутренних защитных механизмов растений.

Выводы:

1. Показано, что эндогенное продуцирование сверхдлинноцепочечных полиненасыщеных жирных кислот в арабидопсисе приводит к изменению устойчивости растений к биотическим стрессам. Трансгенные растения, в которых реконструирован биосинтез сверхдлинноцепочечных полиненасыщеных жирных кислот, более устойчивы к действию грибковых патогенов, оомицетных патогенов и насекомых, но более подвержены действию бактериальной инфекции.

2. Обнаружено, что арахидоновая кислота индуцирует защитные ответы, связанные с оксилипинами алленоксидсинтазной ветви у арабидопсиса и томатов. Полученные данные подтверждают уникальные консервативные сигнальные функции арахидоновой кислоты - способность модулировать стрессовые ответы у эволюционно удаленных эукариотических организмов.

3. Выявлены молекулярные механизмы, лежащие в основе изменений устойчивости растений к биотическим стрессам, индуцируемых арахидоновой кислотой. Показано, что арахидоновая кислота осуществляет транскрипционную регуляцию стрессовых генов, вызывает усиление экспрессии генов биосинтеза и передачи сигналов жасмоновой кислоты, а также генов неспецифических стрессовых ответов.

4. С помощью высокочувствительного метода газохромато-масс-спектрометрического анализа изучена динамика образования и выделения во внешнюю среду летучих оксилипинов в ответ на разные типы повреждений растительных тканей. Показано, что повреждения растений насекомыми с различными типами питания дифференциально изменяют содержание оксилипинов алленоксидсинтазной и гидропероксидлиазной ветвей. Обнаружено специфическое подавление образования и эмиссии соединений гидропероксидлиазной ветви при повреждении растений грызущими насекомыми-фитофагами.

5. Доказано, что подавление эмиссии летучих соединений гидропероксидлиазной ветви вызывается активными компонентами, содержащимися в ротовых секретах насекомых. Обнаружено, что в основе вызываемых грызущими насекомыми изменений содержания оксилипинов лежит транскрипционное перепрограммирование генов пути биосинтеза оксилипинов.

6. Получены новые доказательства участия оксилипинов в адаптации растений к абиотическим стрессам. Показано, что механическое повреждение и засуха по-разному изменяют содержание оксилипинов алленоксидсинтазной и гидропероксидлиазной ветвей. Обнаружено, что 12-оксофитодиеновая кислота индуцирует уменьшение апертуры устьиц и повышает засухоустойчивость растений.

Список основных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Savchenko Т. and Dehesh К. Drought stress modulates oxylipin signature by eliciting 12-OPDA as a potent regulator of stomatal aperture. Plant Signaling and Behavior, 2014, 9(2):e28304

2. Savchenko T.. Kolla V., Wang C.Q., Nasafi Z., Hicks D., Phadungchob В., Chehab W., Brandizzi F., Froehlich J., Dehesh K. Functional convergence of oxylipin and ABA pathways controls stomatal closure in response to drought. Plant Physiology, 2014, 164(3):1151-1160

3. Савченко T.B.. Застрижная O.M., Климов B.B. Оксилипины и устойчивость растений к абиотическим стрессам. Биохимия, 2014,79(4):460-477

4. Savchenko Т. and Dehesh К. Insect herbivores selectively mute GLV production in plants. Plant Signaling and Behavior, 2013, 8(5):e24136

5. Buerstenbinder K., Savchenko T.. Mueller J., Adamson A., Stamm G., Kwong R., Zipp В., Chandrasekaran D., and Abel S. Arabidopsis calmodulin-binding IQD1 localizes to microtubules and interacts with kinesin light chain-related protein-1. The Journal of Biological Chemistry, 2013,288(3):1871-1882

6. Savchenko T.. Pearse I., Ignatia L., Karban R., Dehesh K. Insect herbivores selectively suppress the HPL branch of the oxylipin pathway in host plants. The Plant Journal, 2013, 73(4):653-662

7. Laluk K., Prasad К. V., Savchenko T.. Celesnik H., Dehesh K., Levy M., Mitchell-Olds T., Reddy A. The calmodulin-binding transcription factor SIGNAL RESPONSIVE1 is a novel regulator of glucosinolate metabolism and herbivory tolerance in Arabidopsis. Plant and Cell Physiology, 2012, 53 (12):2008-2015

8. Xiao Y., Savchenko T.. Baidoo E., Chehab W., Hayden D., Tolstikov V., Corwin J., Kliebenstein D., Keasling J., Dehesh K. Retrograde signaling by the plastidial metabolite MEcPP induces selected stress responses. Cell, 2012, 149:1525-1535

9. Chehab W., Kim S., Savchenko T.. Kliebenstein D., Dehesh K., Braam J. Intronic T-DNA insertion renders Arabidopsis opr3 a conditional JA producing mutant. Plant Physiology, 2011, 156:770-778

10. Bostock R., Savchenko T.. Lazarus C., Dehesh K. Eicosapolyenoic acids: novel MAMPs with reciprocal effect on oomycete-plant defense signaling networks. Plant Signaling & Behavior, 2011, 6 (4):531-533

11. Savchenko T.. Walley J., Chehab W., Xiao Y., Kaspi R., Pye M., Mohamed M., Lazarus C., Bostock R., Dehesh K. Arachidonic acid: an evolutionarily conserved signaling molecule modulates plant stress signaling networks. The Plant Cell, 2010, 22:3193-3205

12. Walley J., Kelley D., Savchenko T.. Dehesh K. Investigating the function of CAF1 deadenylases during plant stress responses. Plant Signaling & Behavior, 2010, 5(7):802-805

13. Chehab E. W., Kaspi R., Savchenko T.. Rowe H., Negre-Zakharov F., Kliebenstein D., Dehesh K. Distinct roles of jasmonates and aldehydes in plant defense responses. PLoS One, 2008,3(4):el904

14. Fabro G., Di Rienzo J. A., Voigt C.A., Savchenko T., Dehesh K., Somerville S., Alvarez M. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiology, 2008, 146:1421-1439

15. Abel S., Savchenko T.. Levy M. Genome-wide comparative analysis of the IQD gene families in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa. BMC Evolutionary Biology, 2005, 5:72

16. Yokthongwattana K., Savchenko T.. Polle J.E., Melis A. Isolation and characterization of a xanthophyll-rich fraction from the thylakoid membrane of Dunaliella salina (green algae). Photochemical & Photobiological Sciences, 2005, 4(12):1028-1034

17. Premkumar L., Greenblatt H. M., Bageshwar U. K., Savchenko T.. Gokhman I., Sussman J. L., and Zamir A. Three-dimensional structure of a halotolerant algal carbonic anhydrase predicts halotolerance of a mammalian homolog. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2005, 102(21):7493-7498

18. Bageshwar U., Premkumar L., Gokhman I., Savchenko T.. Sussman J., Zamir A.

Natural protein engineering: a uniquely salt-tolerant, but not halophilic, atype

41

carbonic anhydrase from algae proliferating in low- to hyper-saline enviroments. Protein Engineering, Design and Selection, 2004, 17:191-200

19. Zamir A., Azachi M., Bageshwar U., Fisher M., Gokhman I., Premkumar L., Sadka.A., Savchenko T. Molecular and functional adaptations underlying the exceptional salt-tolerance of the alga Dunalielia salina. In Halophilic microorganisms, Ed: Antonio Ventosa, Publisher: Springer Verlag Berlin Heidelberg, 2003:165-176

20. Premkumar L., Greenblatt H., Bageshwar U., Savchenko Т.. Gokhman I., Zamir A. and Sussman J. Identification, cDNA cloning, expression, crystallization and preliminary X-ray analysis of an exceptionally halotolerant carbonic anhydrase from Dunalielia salina. Acta Crystalographica, Section D, 2003, 599(6): 1084-1086

21. Premkumar L., Greenblatt H., Sussman J., Bageshwar U., Savchenko Т.. Gokhman I. and Zamir A. The first ciystal structure of a halotolerant protein: carbonic anhydrase from D. salina at 1.86 A resolution. Acta Crystalographica, 2002, A58 (Supplement), C307

22. Savchenko Т.. Changes of Dunalielia salina cells protein composition induced by salt stress. Proceeding of Azerbaijan Academy of Sciences, 1998, l(6):26-31

Патент

Dehesh K., Savchenko T. Hydroperoxide lyase genes and tolerance to abiotic stress in plants Patent W0/2010/101885

Подписано в печать:

08.08.2014

Заказ № 10151 Тираж - 110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru