Ферменты липоксигеназного каскада

Гоголев, Юрий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ферменты липоксигеназного каскада
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ферменты липоксигеназного каскада"

На правах рукописи

Гоголев Юрий Викторович

ФЕРМЕНТЫ ЛИПОКСИГЕНАЗНОГО КАСКАДА: СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ

03.01.05 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 6 СЕН 2013

Казань-2013

005533510

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН)

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Гречкнн Александр Николаевич

академик РАН, доктор химических наук, директор КИББ

КазНЦ РАН

Тишков Владимир Иванович

профессор, доктор химических наук, профессор кафедры химической энзим ологии химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Лось Дмитрий Анатольевич

профессор, доктор биологических наук, зав. лаб. молекулярных основ внутриклеточной регуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений имени К. А. Тимирязева Российской академии наук

Горшкова Татьяна Анатольевна

профессор, доктор биологических наук, зав. лаб. механизмов роста растительных клеток КИББ КазНЦ РАН

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук

Защита состоится 18 октября 2013 г. в И часов на заседании диссертационного совета Д002.005.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при КИББ КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я № 30, тел/факс (843)2927347, e-mail: na.ponomareva@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке КазНЦ РАН.

Автореферат разослан «09 » C'PiVPb(-¿juffl 13 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д002.005.01,

кандидат биологических наук ^ % Пономарева Анастасия Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Липоксигеназный каскад является источником физиологически активных соединений - оксилипинов. У высших растений ок-силипины отвечают за регуляцию роста, морфогенез, участвуют в формировании системной устойчивости к экстремальным факторам и патогенам [Тарчевский, 2002]. Кроме высших растений оксилипины и ферменты их биосинтеза обнаружены у бактерий, бурых и красных водорослей, кораллов, хордовых и пластинчатых [Lee et а!., 2008].

Ключевыми ферментами липоксигеназного каскада являются липоксигеназы и ци-тохромы семейства CYP74 суперсемейства Р450. В зависимости от региоспецифичности действия липоксигеназы растений в основном разделяют на 9- и 13-специфичные, а также обладающие дуалистичными свойствами. Продукты липоксигеназной реакции - гидроперекиси жирных кислот - преобразуются при участии ферментов CYP74: алленоксидсин-таз (АОС), гидропероксидлиаз (ГПЛ), дивинилэфирсинтаз (ДЭС). Алленоксидсинтазы и дивинилэфирсинтазы являются дегидразами, в то время как гидропероксидлиазы - изо-меразами. Разнообразие генов семейства CYP74 в геномах различных организмов предполагает и другие типы катализа. К настоящему времени охарактеризовано несколько десятков ГПЛ и АОС, а также несколько ДЭС разных видов растений. Существует мнение, что ферменты последнего класса не имеют широкого распространения в природе.

Интерес к оксилипинам обусловлен высокой практической значимостью веществ этого класса. Они являются сигнальными соединениями, обеспечивающими защитный ответ растений на клеточном, организменном, популяционном и межвидовом уровне, что может быть использовано в агропромышленном производстве и биотехнологии. Оксилипины ответственны за многие свойства растений, характеризующие их в качестве сырья и пищевых продуктов. В этой связи изучение первичных детерминантов катализа ферментов липоксигеназного каскада, исследование их молекулярной эволюции и систематики, разработка моделей катализа представляются актуальными.

Объем экспериментальных и теоретических данных, накопленный в разных лабораториях мира, существенно расширил представления о механизмах ферментативного катализа. Во многих случаях удалось создать термодинамические модели протекания ферментативных реакций. В то же время, ферментативный катализ липоксигеназ и ферментов CYP74 остается недостаточно охарактеризованным. Предложенные модели взаимодействия активного центра некоторых липоксигеназ с различными жирными кислотами объясняют каталитические свойства 13-липоксигеназ, однако не согласуются с экспериментальными данными, полученными при изучении 9-липоксигеназ. Несмотря на большое разнообразие оксилипинов, в значительной степени изученными можно считать биосинтез и функции жасмоновой кислоты и ее производных, являющихся продуктами превращения 13-гидроперекисей жирных кислот. В отношении других оксилипинов, в частности, производных 9-гидроперекисей жирных кислот, объем знаний остается недостаточным.

Особый интерес представляет молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада. Широкое распространение липоксигеназ позволяет предположить их возникновение до цитохромов. Однако отсутствие функциональной значимости гидроперекисей жирных кислот ставит вопрос о возможном включении липоксигеназ в уже существующий метаболический процесс, в котором поступление данного субстрата происходило в результате неферментативного окисления ненасыщенных жирных кислот.

Филогения и систематика ферментов CYP74 до сих пор остается на стадии разработки. Использование стандартных алгоритмов классификации приводит к объединению в систематические группы функционально не связанных ферментов. Некоторые типичные представители CYP74 по биохимическим характеристикам не удовлетворяют принятым критериям принадлежности к семейству, в связи с чем их предложено включить в одноименный «клан» [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. При этом данный клан рассматривается как продукт поздней эволюции растений, связанной с их выходом на сушу. Однако открытия липоксигеназного каскада у животных, бурых водорослей и прокариот, свидетельствуют о древнем происхождении этого ферментативного пути и его фундаментальном физиологическом значении на ранних этапах развития жизни.

Данные противоречия могут быть следствием малой изученности ферментов CYP74. Так, у классического объекта - льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), с которого началось изучение ферментов данного семейства, недавно были выявлены новые оксилипины - необычные изомеры дивиниловых эфиров и их производные - линолипины [Chechetkin et al., 2008]. Однако фермент, ответственный за синтез дивиниловых эфиров, до настоящего времени оставался неизученным.

Выяснение эволюционных процессов, обусловливающих возникновение сложных реакционных комплексов, является одним из фундаментальных вопросов эволюции живых систем. С точки зрения молекулярной филогении ферменты липоксигеназного каскада представляют удобную модель, которая позволяет проследить коэволюцию двух типов ферментов, осуществляющих цепь сопряженных реакций. Детерминированность липоксигеназного каскада в небольшом количестве направлений биосинтеза оксилипинов при одновременной пластичности ферментов, способных к конверсии при минорных модификациях первичной структуры, дает возможность экспериментальной реконструкции эволюционных процессов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является выяснение механизмов каталитического действия ферментов липоксигеназного каскада и построение филогенетической модели, описывающей эволюционное развитие этих механизмов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Структурно-функциональная характеристика рекомбинантной липоксигена-зы ZmLOX3 кукурузы (Zea mays).

2. Получение мутантных форм ZmLOX3; сравнение реакций превращения ли-нолевой кислоты и других субстратов при участии фермента дикого типа и его мутантных форм.

3. Построение моделей взаимодействия ZmLOX3 и липоксигеназы GmLOXl сои (Glycine mea) с субстратами на основании экспериментальных данных и компьютерного моделирования.

4. Выявление особенностей механизма катализа рекомбинантной алленоксид-синтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата (Lycopersicort escuJentum) в сравнении с алленок-сидсинтазами подсемейства CYP74A.

5. Выявление, характеристика и клонирование открытой рамки считывания гена, кодирующего фермент, ответственный за биосинтез (а)52)-этероленовой кислоты у льна-долгунца (Linum usitatissimum L.); получение рекомбинантного фермента, его структурно-функциональная характеристика.

6. Получение мутантных форм LeAOS3 и фермента, ответственного за биосинтез (ш52)-этероленовой кислоты у льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), с модификациями каталитически важных доменов. Сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

7. Получение мутантных форм гидропероксидлиазы MtHPL люцерны (Medicago truncatula)-, сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

8. Проведение эволюционного анализа генетической информации, накопленной в отношении ферментов липоксигеназного каскада.

9. Построение филогенетических моделей, отражающих молекулярную эволюцию ферментов липоксигеназного каскада высших растений и их таксономическое положение.

Научная новизна работы. На основании экспериментальных данных и результатов компьютерного моделирования определены факторы, влияющие на специфичность окисления субстратов при участии (95)- и (135)-липоксигеназ растений (ZmLOX3 и GmLOXl, соответственно). Показано, что позиционирование субстратов в активном центре GmLOXl и ZmLOX3 различается, однако в обоих случаях субстрат погружается в активный центр метальной концевой группой; инверсии субстрата под действием внешних факторов не происходит. Специфичность действия ZmLOX3 не определяется ориентацией субстрата в активном центре, а детерминируется объемом активного центра, его пространственной структурой, положением ключевых аминокислотных остатков и атома железа.

Выявлены консервативные участки полипептидной цепи ZmLOX3 и предложены варианты мутаций, с высокой вероятностью влияющие на каталитические свойства фермента. В результате единичной аминокислотной замены получена мутантная форма ZmLOX3 с измененной региоспецифичностью.

Впервые показано, что алленоксидсинтаза LeAOS3 подсемейства CYP74C цитохро-мов Р450 является многофункциональным ферментом и катализирует синтез, гидролиз и циклизацию окиси аллена. Показано, что продуктами LeAOS3 являются (95)-а-кетол и рацемическая смесь г/ис-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

Выявлен ген дивинилэфирсинтазы 1лШЕ8 льна-долгунца (Шит изШЬзтит Ь.), клонирована его открытая рамка считывания. ЬиОЕБ идентифицирована как первый фермент подсемейства СУР74В, гомологичный 13-гидропероксидлиазам, входящим в состав данного подсемейства, и, вместе с тем, являющийся дивинилэфирсинтазой. На сегодняшний день ШЗЕЗ является единственной известной 13-гидропероксид-специфичной дивинилэфирсинтазой.

Проведен сравнительный анализ первичных и третичных структур монооксигеназ Р450 и представителей семейства СУР74; выявлены гипотетические детерминанты катализа - сайты, находящиеся в каталитически важных доменах, имеющих консервативные последовательности у ферментов с разным типом катализа - алленоксидсинтаз, гидропе-роксидлиаз и дивинилэфирсинтаз. Смоделированы модификации первичной структуры алленоксидсинтазы ЬеАОБЗ томата, гидропероксидлиазы МШРЬ люцерны, дивинилэфирсинтазы ЬцБЕЗ льна; проведен сайт-направленный мутагенез соответствующих генов, изучены каталитические свойства мутантных форм ферментов. Впервые показано изменение механизмов каталитического действия ферментов семейства СУР74 в результате замены аминокислотных остатков, находящихся вблизи гема. Получены мутантные формы алленоксидсинтазы ЬеАОБЗ, обладающие гидропероксидлиазной активностью, что означает конверсию дегидразного типа реакции в изомеразный. Впервые дивинилэ-фирсинтаза ЬиЛЕБ превращена в алленоксидсинтазу, которая катализирует преобразование 13-гидроперекиси а-линоленовой кислоты в 12-оксо-10,15-фитодиеновую кислоту и а-кетол. Проведенные превращения ферментов СУР74 могут служить подтверждением дивергенции генов СУР74 в ходе их эволюции от единого гипотетического предка с гидропероксидлиазной активностью, существовавшего у примитивных аэробов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Липоксигеназа гтШХЗ кукурузы проявляет (^-специфичность при окислении линолевой кислоты в нейтральных и щелочных условиях в диапазоне рН 6,5-9,5. Анализ моделей взаимодействия липоксигеназ с субстратами показал, что для гтЬОХЗ характерен единственный способ позиционирования субстрата в активном центре, обусловленный проникновением жирной кислоты в субстрат-связывающий карман метальной концевой группой. Аминокислотный остаток А1а562, расположенный в активном центре гтШХЗ, важен для проявления региоспецифичности действия; замена аланина на меньший по размерам глицин приводит к частичному проявлению (13Д)-региоспецифичности.

2. Специфичность действия липоксигеназ высших растений не обнаруживает строгой взаимосвязи с общей первичной структурой, что характерно для липоксигеназ животных, грибов и прокариот.

3. 13-специфичные липоксигеназы являются анцесторной группой по отношению к 9-специфичным липоксигеназам, которые образовались монофилетически до дивергенции однодольных и двудольных растений.

4. В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства СУР74А, фермент ЬеАОБЗ, принадлежащий подсемейству СУР74С, является многофункциональным. ЬеАОБЗ катализирует

синтез, гидролиз и циклизацию окиси аллена. Первичный продукт ЬеАОЭЗ, окись аллена, после высвобождения из активного центра захватывается тем же ферментом, катализирующим ее вторичные превращения, а именно - стереоспецифический гидролиз с образованием (9Л)-а-кетола и циклизацию с образованием рацемической г/ыс-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

5. Фермент ЬиБЕЭ льна является единственной дивинилэфирсинтазой, классифицируемой по общей первичной структуре как член подсемейства СУР74В цитохромов Р450, до сих пор включавшего только 13-гидропероксид-специфичные гидропероксидлиазы. Дивинилэфирсинтаза ЬиОЕв льна обладает строгой 13-региоспецифичностью к субстрату; предпочтительным субстратом для нее является 13-гидроперекись а-линоленовой кислоты, основным продуктом является (ю52)-этероленовая кислота.

6. В формировании определенного типа катализа ферментов семейства СУР74 принципиальная роль принадлежит центральному домену 1-спирали и ЕИЯ-триаде.

7. Все ферменты семейства СУР74 относятся к одной близкородственной филогенетической группе, несмотря на широкий спектр каталитических функций. Семейство СУР74 сформировалось на ранних этапах эволюции цитохромов Р450 до дивергенции эу-кариот от последнего общего предка. Предковая форма ферментов СУР74 высших растений дала начало трем большим группам. Первая включала 13-ГПЛ, вторая - 13-АОС, третья - 9/13-АОС, 9-АОС и 9/13-ГПЛ. Дивинилэфирсинтазы являются эволюционно наиболее молодыми ферментами, имеющими полифилетическое происхождение, не завершившееся формированием таксономически обособленных единиц. Субстратная специфичность наряду с типом катализируемой реакции является существенным таксономическим признаком представителей семейства СУР74; дивинилэфирсинтазы связаны с родственными группами общей субстратной специфичностью.

Научно-практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным условиям. Изучены механизмы образования продуктов липоксигеназной сигнальной системы - оксилипинов, участвующих в процессах онтогенеза растений, а также в формировании ответа на стрессовые факторы. Многие оксилипины являются физиологически активными, бактерицидными соединениями.

В экономическом аспекте актуальными являются исследования липоксигеназного каскада масличных, зерновых и технических культур, а также лекарственных растений. Оксилипины во многом определяют ценные технологические, органолептические и лечебные свойства растений, которые могут быть востребованы в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности.

Разработаны системы получения и препаративной очистки липоксигеназ и цитохромов растений, способные найти применение в промышленности. Ферменты с измененными каталитическими свойствами могут быть использованы для создания генетически модифицированных растений, удовлетворяющих требованиям современного сельскохо-

зяйственного производства, и стать основой инновационных технологий переработки сырья с использованием биокатализаторов, в том числе иммобилизованных ферментов.

Качественное изменение ферментативного катализа при сайт-направленном мутагенезе представляет потенциальный интерес для практического использования в биоинженерии. Результаты работы могут способствовать разработке алгоритмов направленной модификации белков с целью получения ферментов с заданными свойствами.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных ферментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2004 по 2013 гг. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74: структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов - эндогенных биорегуляторов растений» (гос. per. №: 01200901959). Исследования поддержаны грантами РФФИ № 09-04-00915-а, 09-04-12222-офи_м, программой президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантом ведущей научной школы НШ № 6992.2010.4, Федеральной целевой программой «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров» (ГК № 14.740.11.0797 от 30.10.2010). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты работы доложены на конференции «Современные достижения в биохимии и клеточной биологии растительных липидов» (Солт-Лейк-Сити, США, 2007); на 2-ом Международном семинаре по липидным медиаторам (Вальядолид, Испания,2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксшшпины» (Лозанна, Швейцария, 2009); на 35-ом и 36-ом конгрессах FEBS (Прага, Чешская республика, 2009; Турин, Италия, 2011); на VII Съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011); на 3-ем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); на 4-ом Съезде ЕМВО (Ницца, Франция, 2012); на 18-ой Международной конференции «Цитохромы Р450: биохимия, биофизика и биотехнология» (Сиэтл, США, 2013); на итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (2006-2013 гг.).

Публикации. По результатам работы опубликовано семь статей в отечественных и семь в зарубежных рецензируемых изданиях. Все издания входят в перечень ВАК РФ. По докладам на научных мероприятиях опубликовано 50 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 345 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В работе представлено 13 таблиц и 92 рисунка. Список литературы включает 395 источников.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы биоинформатики. Поиск аминокислотных последовательностей липокси-геназ и цитохромов Р450 проводили с помощью программы PSI-BLAST в базе данных NCBI и банке данных д-ра Нельсона [http://drnelson.uthsc.edu/ CytochromeP450.html]. Множественные выравнивания проводили с применением программы Clustal Omega [Sievers et al., 2011]. Для филогенетического анализа использовали пакет программ MEGA 5 [Tamura et al., 2011]. Трехмерные модели белков строили с помощью пакета программ EsyPred3D [Lambert et al., 2002]. Позиционирование субстрата в активном центре исследовали с помощью программ Autodock 4.2 и AutodockTools 1.5.4 (The Scripps Research Institute). Модели лигандов получали с помощью программы ChemOffice (CambridgeSoft), визуализацию данных проводили с помощью программы PyMol APBS Tool (Carlson Group, University of Michigan). Праймеры конструировали с помощью программы Vector NTI9 (Invitrogen, США).

Подготовка материала. Рекомбинантные плазмиды, содержащие открытые рамки считывания (ОРС) генов LeAOS3 [Howe et al., 2000] и ZmLOXi [Wilson et al., 2001], были любезно предоставлены доктором Г. Хоу (Университет штата Мичиган, США) и Н. Кэл-лер (Университет штата Висконсин, США), соответственно. Для клонирования генов ферментов CYP74 льна-долгунца (Linum usitatissimum L., сорт Новоторжский) их экспрессию индуцировали инокуляцией клетками штамма Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 растений, выращенных в течение 35 дней в открытом грунте.

Тотальную ДНК экстрагировали фенольным методом [Георгиев, 1959]; РНК выделяли с помощью коммерческого набора RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия). Для получения двуцепочечной кДНК использовали коммерческий набор MINT (Евроген, Россия). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в стандартном температурном режиме, от 14 до 40 циклов. Праймеры синтезировали в НПО «Синтол» (Россия). Качество нуклеиновых кислот оценивали после их электрофоретического разделения в агароз-ном геле; количество определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, США). Для выделения ДНК из агарозного геля использовали наборы MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия). Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК проводили с помощью вектора pGem-T Easy (Promega, США). Определение нуклеогидной последовательности ДНК проводили на автоматическом капиллярном ДНК-анализаторе ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Для анализа и сопоставления секвенирован-ных последовательностей применяли программы Sequencing Analysis 5.3.1. и SeqScape Software 2.6. (Applied Biosystems, США).

Для определения последовательностей полноразмерных кДНК использовали метод RACE (Rapid Amplification of cDNA End), основанный на гнездовой ПЦР. Мутации в клонированные гены вводили методом полноразмерной амплификации плазмид с модифицированными праймерами с помощью ПЦР с ДНК-полимеразой KOD (Novagen, США) или Pfu Turbo (Stratagen, США). Реакционную смесь обрабатывали рестриктазой Dpn\ (Fermentas, Литва), гидролизующей метилированную ДНК бактерий.

Получение рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки нарабатывали в клетках Е. coli BL21 (DE3)pLysS и Rosetta-gami(DE3)pLysS В с использованием векторов рЕТ-30, рЕТ-32 Ek/LIC, рЕТ-23а (Novagen, США). Протокол был составлен на основе общепринятых методик. Клетки продуцентного штамма Е. coli выращивали в среде Luria-Bertani (LB), разведенной равным объемом минеральной среды М9, до достижения культурой OD6oo = 0,8-1,0. Клеточную культуру охлаждали до 20 °С и добавляли в нее 0,1 мМ ИПТГ. Для синтеза цитохромов добавляли предшественник тема - 5-аминолевулиновую кислоту - из расчета 115 мг/л. Индуцированные клетки инкубировали 18-24 часа при умеренной аэрации и 16-20 °С, после чего собирали центрифугированием, суспендировали и разрушали в лизирующем буфере BugBuster (Invitrogene, США).

Очистку ферментов CYP74 проводили металлоаффинной хроматографией на колонке Bio-Scale Mini Profinity IMAC (Bio-Rad, США). Содержащую белок фракцию подвергали ультрафильтрации через фильтр AmiconUltra 50k (Millipore, США). Рекомбинантную липоксигеназу ZmLOX3 собирали высоливанием ((NH4)2S04, 20-50 % насыщения), диа-лизовали и последовательно подвергали анионообменной (Q-Sepharose) и гидрофобной (Octyl-Sepharose) хроматографии.

Биохимическая характеристика ферментов. (92, 11 Я, 135> 13-гидроперокси-(9,11 )-октадекадиеновую кислоту (13-гидроперекись линолевой кислоты, 13-ГПОД) и (135)-гидроперокси-(92,11£,152)-октадекатриеновую кислоту (13-гидроперекись а-линолено-вой кислоты, 13-ГПОТ) получали окислением линолевой и а-линоленовой кислот, соответственно, при участии соевой липоксигеназы (Sigma-Aldrich, США). (9S,10£,12Z)-9-гидроперокси-( 10,12)-октадекадиеновую кислоту (9-гидроперекись линолевой кислоты, 9-ГПОД) и (95,10Е, 12Z, 152)-гидроперокси-( 10,12,15)-октадекатриеновую кислоту получали в результате инкубации линолевой и а-линоленовой кислот, соответственно, с липоксиге-назой томата. Гидроперекиси очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на колонке Separon SIX (5 мкм, 3,2x150 мм, Tessek, Чехия).

Реакцию липоксигеназного окисления проводили в насыщенном кислородом 0,1 M Ыа-фосфатном буфере (pH 7,0 или 9,0), содержавшем 0,3 мМ субстрата. Активность ферментов CYP74 определяли по снижению характерного для гидроперекисей жирных кислот оптического поглощения при 234 нм. Анализ проводили в 0,05 M Na-ацетатном (pH 5,0), Ыа-фосфатном (pH 6,0-8,0), трис-HCl (pH 7,5-8,5) и глицин-NaOH (pH 9,0) буферах. Для расчета скорости реакций использовали начальные линейные участки кинетических кривых. Кинетические параметры рассчитывали по установке наборов данных для насыщающей модели с одним сайтом связывания простого лиганда с помощью программного обеспечения SigmaPlot 11 (Systat Software Inc., США).

Продукты реакций экстрагировали смесью этилацетата и гексана (1:1), высушивали, перерастворяли в метаноле и наносили на колонку Nucleosil 5 ODS (250x4,6 мм) (Ма-cherey-Nagel, Германия) с обращенной фазой. Растворитель нужных фракций высушивали. Остаток перерастворяли в ацетоне и наносили на две соединенные колонки Separon SIX с нормальной фазой. Для протонирования жирных кислот в систему растворителей

добавляли ледяную уксусную кислоту (1:1000). Фракции ВЭЖХ на нормальной фазе, соответствующие отдельным пикам продуктов, метилировали диазометаном. Метиловые эфиры анализировали хиралько-фазовой ВЭЖХ на колонке Chiralcel OD-H (Daicel Chemical Industries, Япония) в смеси растворителей гексан/изопропанол (97:3 по объему).

Образцы для ГХ-МС готовили по протоколу, разработанному ранее [Grechkin et al., 2007]. Реакционную смесь экстрагировали смесью гексана с этилацетатом (1:1). Продукты высушивали, растворяли в метаноле и восстанавливали в присутствии NaBHí. Восстановленные продукты метилировали диазометаном, диазометан выпаривали, продукты растворяли в метаноле и гидрировали водородом над РЮ2. Продукты силилировали смесью пиридин/гексаметилдисилазан/триметилхлорсилан (2:1:2). После упаривания сили-лирующей смеси продукты экстрагировали гексаном. Очистку продуктов проводили с помощью ВЭЖХ, после чего проводили их анализ методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) путем полного спектрального сканирования ионов в диапазоне отношений массы к заряду от 50 до 650 с помощью масс-спектрометра QP5050A, соединенного с газовым хроматографом GC-17A (Shimadzu, Япония).

Для определения пространственной структуры оксигенированных жирных кислот и подтверждения данных по геометрической изомерии применяли метод спектроскопии протонного ядерного магнитного резонанса. 'Н-ЯМР спектры исследуемых веществ, растворенных в CDCI3, и 2D-COSY регистрировали с помощью спектрометра Avance 600 (Bruker, Германия) при рабочей частоте 600 МГц. Эксперименты по гомоядерному 'Н двойному резонансу проводили с помощью того же инструмента.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Биохимическая характеристика рекомбинантной липоксигеназы ZmLOX3 кукурузы обыкновенной (Zea mays). Наработку рекомбинантного фермента ZmLOX3 проводили в клетках штамма E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS В. Оптимизация условий экспрессии гена ZmLOX3 позволила достичь высокой каталитической активности фермента. Его очистку проводили комбинацией методов ионообменной и гидрофобной хроматографии. В табл. 1 представлены результаты типичного эксперимента.

Табл. 1. Каталитическая активность препаратов рекомбинаитной ZmLOX3.

Стадия очистки Белок, мг Активность, ед./мг Выход, %

Клеточный лизат 1570 132 100

Фракция 20-50 % насыщения (КН4)2304 435 390 82

Фракция элюента после (З-БерЪагозе 22 4180 44

Фракция элюента после ОИу^ЗерЬагове 4,2 9970 20

Согласно теории обратной ориентации, предложенной Гарднером [Gardner, 1989], появление 9-гидропероксипроизводных жирных кислот связано с тем, что в кислых условиях карбоксильная концевая группа жирной кислоты находится в неионизированном со-

стоянии и способна погружаться в субстрат-связывающий карман. При захцелачивании реакционной среды ионизация карбоксильной группировки заставляет жирную кислоту переориентироваться; происходит погружение в активный центр метальной концевой группы, что ведет к образованию 13-гидропероксипроизводных жирных кислот.

Скорости и продукты окисления линолевой и а-линоленовой кислот при участии ZmLOX3 исследовали при разных значениях pH. Было установлено, что вне зависимости от pH среды преобладающим продуктами реакции являлись (95)-гидроперекиси жирных кислот (табл. 2). В отличие от опубликованных данных для (95)-липоксигеназ, регио- и стереоспецифичность ZmLOX3 не зависели от условий реакции.

Скорость окисления а-линоленовой кислоты была меньше, чем линолевой. Согласно модели, предложенной для ЛОГ млекопитающих [Kuhn et al., 1990], субстрат должен позиционироваться так, чтобы пентадиеновая группировка связалась с определенным ключевым аминокислотным остатком; взаимодействие акцептора с водородом прохирального центра субстрата должно быть энергетически выгодным. Вероятно, взаимодействие пен-тадиеновой группировки, центром которой является 11-ый атом углерода, с соответствующим аминокислотным остатком активного центра ZmLOX3 происходит как в случае а-линоленовой, и линолевой кислот. Это обеспечивает специфичность реакции. Однако для а-линоленовой кислоты энергетически выгодным является удаление атома водорода от прохирального центра другой пентадиеновой группировки (9-го атома); увеличение расстояния от акцептора водорода до пентадиеновой группировки с прохиральным центром на 11-ом атоме углерода снижает скорость реакции.

2.2. Направленная модификация первичной структуры ZmLOX3. Для выяснения особенностей первичной структуры и филогенетического положения ZmLOX3 проводили множественное выравнивание аминокислотных последовательностей липоксигеназ растений, для которых получены данные о специфичности действия. Кроме того, с помощью методов компьютерного моделирования нами была построена трехмерная модель ZmLOX3. Полученные данные свидетельствуют о том, что разделение липоксигеназ на группы по специфичности не обнаруживает строгого соответствия степени схожести первичных структур. В то же время, согласно сравнительному анализу первичной структуры липоксигеназ

GrnLoxl (527) VLXD (553) GmLox3 (546) VLXB(541) ZmLox3 (547)

растений, для большинства 13-специфичных липоксигеназ в области 537 - 570 аминокислотных остатков характерно при-

Consensus (574) LjL PHIRDTMNINALARQSLINA GI сутствие мотива INGLAR или

INALGR (рис. 1). Однако у

Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей липоксигеназ сои GmLOXl, VLXD, GmLOX3, VLXB и кукурузы ZmLOX3. а - А1а560, б - А1а562 в последовательности ZmLOX3.

GmLOXl и 9-специфичного фермента ZmLOX3 в этом сайте обнаруживается последовательность INALAR.

В полипептидной цепи рекомбинантного фермента 2шЬОХЗ были проведены замены аминокислотных остатков А56(Ю и А5620. Было обнаружено, что преобладающим продуктом окисления линолевой кислоты при участии 2шЬОХЗ А5600 была (95)-гидроперекись. Количество минорных продуктов (9Д)-, (135)-, (13Л)-гидроперекисей линолевой кислоты составляло не более 3 %, что соответствовало профилю продуктов окисления субстрата при участии гшЬОХЗ дикого типа (табл. 2). Полученный результат согласуется с компьютерной моделью, согласно которой боковая группировка А1а560 не участвует в формировании субстрат-связывающего кармана. Продуктами окисления линолевой кислоты при участии 2тЬОХЗ А562в являлись 9- и 13-гидроперекиси в соотношении 68,5:31,5. С помощью хирально-фазовой ВЭЖХ показано, что среди 9-гидроперекисей линолевой кислоты преобладали (5)-энантиомеры (97 %), тогда как среди 13-гидроперекисей преобладали (Д)-энантиомеры (96 %). Для 7тЬОХЗ дикого типа константа Михаэлиса для линолевой кислоты составила 20,2 мкМ, тогда как для ZmLOXЗ А5620 - 3,2 мкМ. Таким образом, в результате мутации А562в липоксигеназы гтЬОХЗ кукурузы бьша изменена региоспецифичность каталитического действия фермента.

Табл. 2. Процентное соотношение продуктов окисления линолевой кислоты при участии 7тЬОХЗ дикого типа и ее мутантных форм А56(Ю и А5620.

фермент гидроперекиси линолевой кислоты суммы продуктов

(95)- №)- (135)- (13Л)- (95)- + (13Д)- (9R)- + (135)-

ZmLOX3 97,5 % 1,0% 0,6 % 0,9 % 98,4 % 1,6 %

ZmLOX3 A560G 97,7 % 0,8 % 0,7 % 0,8 % 98,5 % 1,5%

ZmLOX3 A562G 66,4 % 2,1 % 1,3 % 30,2 % 96,6 % 3,4 %

Согласно гипотезе Коффа [Coffa, Brash, 2004] для каталитической активности (135)-специфичных липоксигеназ оптимальными являются щелочные условия, когда карбоксильная концевая группа жирной кислоты ионизирована и субстрат входит в активный центр фермента метальной концевой группой. Для образования (95)-гидроперекиси субстрат должен проникнуть в активный центр неионизированной карбоксильной группой при кислых рН. Альтернативная гипотеза заключается в том, что ориентация субстрата всегда соответствует его погружению в активный центр метильной концевой группой. Ключевую роль играет боковая группа аминокислотного остатка А1а542 GmLOXl (Ala562 ZmLOX3), расположенного у входа в субстрат-связывающий карман. У (135)-специфичных липоксигеназ она закрывает от молекулы кислорода 9-ый атом углеродной цепи субстрата. У (95)-специфичных липоксигеназ боковая группа остатка аланина блокирует 13-ый атом. При замене остатка аланина на менее объемный остаток глицина углерод в 13-ом положении открывается для присоединения кислорода. Поэтому мутантная форма ZmLOX3 A562G катализирует образование не только (95)-, но и (13/?)-гидроперекиси линолевой кислоты.

Ранее высказано предположение, что у некоторых липоксигеназ, в частности, (8R)-ЛОГ коралла Plexaura homomalla субстрат-связывающий центр представляет собой не карман, а U-образный канал [Neau et а!., 2009]. В этом случае специфичность действия липоксигеназы может зависеть от ориентации субстрата в канале. До настоящего времени мы не располагаем данными о трехмерной структуре (95)-специфичных липоксигеназ. Однако использование методов биоинформатики позволило построить пространственную модель фермента на основании сходства аминокислотных последовательностей с липок-сигеназами, для которых данные рентгеноструктурного анализа получены.

2.3. Моделирование механизма ферментативного действия ZmLOX3. Согласно филогенетическим данным специфичность действия липоксигеназ определяется не протяженными последовательностями, а компактными доменами. При этом для липоксигеназ характерны разные спектры специфично окисляемых субстратов. Так, (135)-липоксигеназа GmLOX3 сои, в отличие от ZmLOX3, специфично окисляет полиненасыщенные жирные кислоты длиной 20 и 22 углеродных атома, хотя и с меньшей эффективностью, чем линолевую и а-линоленовую кислоты. При этом как GmLOX3, так и ZmLOX3 способны использовать в качестве субстрата сложные липиды [Чечеткин и со-авт., 2009]. Данные о пространственной структуре 13-ЛОГ GmLOXl и GmLOX3, а также комплекса GmLOX3 с аналогом субстрата были получены методом рентгеноструктурного анализа [Dainese et al., 2005]. Эти данные были использованы нами при конструировании пространственной модели ZmLOX3 (рис. 2).

Полученная модель ZmLOX3 обладает значительным сходством с пространственной структурой соевых липоксигеназ. N-концевой PLAT-домен ZmLOX3 длиной 160 аминокислотных остатков участвует во взаимодействии с мембранами и свободными жирными кислотами. В состав PLAT-домена входят аминокислотные остатки Asp31 и Glul20, необходимые для связывания Са2+, и Lysll4. Благодаря Lysll4 обеспечивается ассоциация белка с мембраной, либо липопротеин-связанным субстратом. В состав С-концевого домена входит третий Са2+-связывающий аминокислотный остаток Glul94.

Для (8Д)-липоксигеназы коралла, GmLOXl и ZmLOX3 провели моделирование взаимодействия субстрата и активного центра (рис. 3) и определили следующее. Активный центр GmLOXl формируется тремя полостями, соединяющимися у атома железа. Жирная кислота в активном центре может располагаться одним из двух способов (рис. 4). В первом случае карбоксильная концевая группа субстрата фиксируется водородными связями с Thr257 (GmLOXl) в полости I (рис. 4В). Углерод, от которого отрывается водород, располагается в непосредственной близости (3 А) от атома железа. Алифатическая часть субстрата располагается в полости И. Во втором случае часть субстрата находится в полости I в непосредственной близости от аминокислотных остатков Leu255, Glu256, Thr259, Ile538, Ile753, Leu754 и Пе839; остальная часть субстрата располагается в полости III (рис. 4Г). Таким образом, специфичность действия GmLOXl при использовании в качестве субстратов жирных кислот с разной длиной углеродной цепи объясняется возможностью их разного позиционирования в активном центре.

Н1з519 н'з71°

Рис. 2. Модель трехмерной структуры 7лп1.0ХЗ кукурузы, а - общая структура фермента, б - расположение боковых групп аминокислотных остатков ли-гандов железа. Консервативными лигандами железа 2т[,ОХЗ являются аминокислотные остатки Н1з519, Н18524, №8710, А8П713 И 11е864. Для И-концевого домена характерно наличие Р-складчатых областей; большую часть С-концевого домена, составляют а-спирали.

а У^ б ^ В

\ у ' у ' V [оЛ

и > Т V г - . V/

-V. -у-*/Г

г X, уи д К-. с >

. »

Рис. 3. Положения субстратов в активных центрах гтЬОХЗ (а, б, в) и ОтЬОХ1 (г, д, е), рассчитанные с помощью программы АШос1оск 4.2. Субстраты: а, г - (17,, 1ОД1ЪТ)-гексадекатриеновая, б, д - а-линоленовая, в, е - (IЪ2,162)-докозадиеновая кислоты.

Сопоставление пространственных структур GmLOXl и (8 R)-липоксигеназы коралла (рис. 4А) [Neau et al., 2009] выявило, что аминокислотные остатки, образующие «и»-образный субстрат-связываю-щий канал (8Я)-липоксигеназы, в последовательности GmLOXl располагаются сходным образом, однако имеется ряд существенных различий. В последовательности GmLOXl в положении 539 находится лейцин вместо изолейцина в соответствующем положении у липоксигеназы коралла, А1а560 -вместо Gly, А1а503 - вместо Leu, Тгр498 - вместо Leu в соответствующих положениях. В случае кораллового фермента карбоксильная группа субстрата фиксируется на Argl83. У GmLOXl этой позиции соответствует Gly256. Алании в позиции 503 GmLOXl вместо лейцина в соответствующем положении фермента коралла дает увеличение объема субстрат-связывающей полости соевой липоксигеназы. В то же время, аминокислотный остаток Тгр498 перекрывает доступ к другой части U-образного канала (рис. 4Б-Г). Таким образом, предложенная для (8Л)-липоксигеназы коралла модель U-образного канала не соответствует структуре GmLOXl. Аналогичный вывод можно сделать для расчетной модели ZmLOX3, поскольку в соответствующих сайтах также находятся остатки аланина и триптофана.

В случае ZmLOX3 объем доступный для субстрата несколько меньше в сравнении с объемом субстрат-связывающей полости GmLOXl. Боковые группы аминокислотных остатков Ser272 и Ile273 ZmLOX3, соответствующих Gly256 и Thr257 у GmLOXl, перегораживают проход в полость I, ограниченную с другой стороны приподнятым по сравнению с GmLOXl атомом железа (рис. 4Б). Боковая группа Phe571 (11е551 у GmLOXl) не позволяет алифатической части субстрата проникнуть в полость П. Этот сайт обусловливает различия объема и положения субстрат-связывающей полости III у 9-ЛОГ и 13-ЛОГ. Сайт-направленный мутагенез соответствующего фенилаланина привел к изменению специфичности действия ЛОГ [Hornung et al., 1999]. Полость III частично пе-

Рис. 4. Модели позиционирования субстрата в активном центре липоксигеназ. А - «U»-образная модель (8Я)-ЛОГ коралла, Б - ZmLOX3, В - GmLOXl при взаимодействии с субстратами С<20, Г - GmLOXl при взаимодействии с субстратами С>20 и сложными липидами. Римскими цифрами обозначены полости I, II, и III.

рекрывается с полостью И. Боковые группы аминокислот дна полости III у ZmLOX3 смещены таким образом, что субстрат располагается ближе к атому железа. Меньший объем субстрат-связывающей полости ZmLOX3 накладывает ограничения на конформа-цию субстрата при его позиционировании возле атома железа. ZmLOX3 имеет единственный канал для проникновения субстрата через полость III, и для нее выявлен только один способ позиционирования субстратов, позволяющий специфично окислять жирные кислоты с длиной углеродной цепи 18 и 16 атомов.

Таким образом, 9- и 13-специфичность липоксигеназных реакций не определяется случайным позиционированием субстрата, зависящим от условий реакции, а детерминируется структурными особенностями соответствующих липоксигеназ.

Представленные результаты позволяют заключить, что 9-липоксигеназный путь не является второстепенным ответвлением липоксигеназного каскада, связанным с образованием побочных продуктов, а представляет собой самостоятельное направление адаптивной эволюции. Эволюционное закрепление 9-липоксигеназного пути у цветковых связанно с важной физиологической ролью образуемых оксилипинов для этих растений. Узкий диапазон субстратной специфичности 9-липоксигеназ, а также результаты сайт-направленного мутагенеза, приводящие к частичной конверсии (реверсии) специфичности, свидетельствуют об их происхождении от 13-липоксигеназ.

На следующем этапе липоксигеназного каскада, вслед за липоксигеназами, каталитическую эстафету принимают цитохромы Р450 семейства CYP74. Изучению уникальных свойств некоторых из них были посвящены наши дальнейшие исследования.

2.4. Участие (75)-гидроперекиси гексадекатриеновой кислоты (ГДК) в лнпоксн-геназном каскаде. В липоксигеназном каскаде гидроперекиси линолевой или а-линоленовой кислот преобразуются ферментами семейства CYP74 суперсемейства цито-хромов Р450. Ранее было показано, что гексадеканоиды также являются нативными субстратами 9- и 13-липоксигеназ [Чечеткин и др., 2009]. Исследование возможности дальнейшего превращения гидроперекисных производных гексадеканоидов в липоксигеназном каскаде представляет значительный интерес. В наших экспериментах мы инкубировали (75)-гидроперекись гексадекатриеновой кислоты с очищенными рекомбинантными ферментами CYP74: алленоксидсинтазой ZmAOSl кукурузы и диви-нилэфирсинтазой NtDES табака. Субстрат эффективно превращался при участии ZmAOSl в 7-гидрокси-8-оксо-( 10Z, 127)-гексадекатриеновую, при участии NtDES - ди-нор-колнеленовую кислоты.

Таким образом, (75)-гидроперекись ГДК может быть использована в качестве субстрата дивинилэфирсинтазами и алленоксидсинтазами. Эффективное и специфичное окисление ГДК при участии липоксигеназ in vitro и превращение образуемой гидроперекиси в последующих реакциях, катализируемых ферментами CYP74, указывают на возможность существования у растений наряду с октадеканоидным гексадеканоидного липоксигеназного каскада. Физиологическое значение данного каскада не выявлено.

2.5. Структурные особенности ферментов семейства CYP74. Все цитохромы Р450 имеют консервативные «субстрат-распознающие сайты» (СРС), например, 1-спираль. Входящий в ее состав «кислород-связывающий домен» участвует в катализе монооксиге-назной реакции [Denisov el al, 2005] и имеет консервативную последовательность A/G-G-X-D/E-T-T/S. Поскольку для функционирования ферментов CYP74 не требуется наличие молекулярного кислорода, аминокислотные остатки, участвующие в связывании и активации кислорода, в последовательности ферментов CYP74 отсутствуют. Проведенное сопоставление первичных структур I-спиралей классической монооксигеназы цитохрома Р450 2с8 человека (Homo sapiens) и алленоксидсинтазы AtAOS Arabidopsis thaliana выявило, что абсолютно консервативный и необходимый для катализа монооксигеназной реакции остаток треонина (Т) монооксигеназы Р450 2с8, входящий в состав «кислород-связывающего домена», соответствует консервативному для всех ферментов CYP74 остатку аспарагина (N) AtAOS:

AVSDLFGAGTE(Т)TSTTLRYSLLLLLK Р450 2с8

ATHNLLFATCF(N)TWGGMKILFPNMVK AtAOS

Согласно результатам сопоставления третичных структур каталитических центров AtAOS, расшифрованной в работе [Lee et al, 2008], и монооксигеназы Р450 2с8, расшифрованной в работе [Schoch et al., 2003], в структуре ферментов CYP74 «кислород-связывающему домену» соответствует последовательность, названная нами «центральный домен I-спирали» (IHCD) (рис. 5). Мы предполагаем, что функция этого домена заключается во взаимодействии с гидроперекисной группировкой субстрата и непосредственном участии в катализе ферментов.

Рис. 5. Результат сопоставления третичных структур каталитических центров монооксигеназы Р450 2с8 и AtAOS, проведенного с помощью программы VMD 1.8.6. Красным цветом отмечены гемы обоих ферментов, желтым - I-спираль Р450 2с8, синим - I-спираль AtAOS. Желтыми цилиндрами выделены а-спирали Р450 2с8, зелеными - а-спирали AtAOS.

2.6. Биохимическая характеристика рекомбинантной аллсиоксидсиптазы LeAOS3 (CYP74C3) томата (Lycopersicon esculentum). В качестве модельного объекта исследования каталитических свойств 9-гидропероксид-специфичных цитохромов CYP74 использовали рекомбинантную алленоксидсинтазу LeAOS3 томата. Для ее наработки был использован бактериальный продуцент на основе штамма Е. coli BL21(DE3)pLysS. Очистка фермента методом металлоаффинной хроматографии позволила получить активный препарат LeAOS3 не менее 90 % чистоты.

Все алленоксидсинтазы (подсемейств CYP74A и CYP74C) катализируют синтез ко-роткоживущих окисей аллена. Образуемые при участии АОС подсемейства CYP74A окиси аллена на следующем этапе циклизуются с образованием циклопентенонов, либо спонтанно гидролизуются с образованием а- или у-кетолов. Циклизация протекает спонтанно, либо при участии алленоксидциклаз (АОЦ), и зависит от наличия двойной связи в Р,у-положении по отношению к оксирану. Окиси аллена, продуцируемые из линолевой кислоты, спонтанно гидролизуются, но не циклизуются [Grechkin et al„ 2000]. В отличие от этого, среди продуктов инкубации 9-ГПОД с LeAOS3 (CYP74C3) наряду с (12Z)-9-гидрокси-10-оксо-12-октадеценовой кислотой (а-кетолом) присутствует циклопентенон -10-оксо-11-фитоеновая кислота (Ю-ОФЕК) (рис. 6) [Hamberg, 2000]. Это явление до настоящего времени не получило объяснения.

Для биохимической характеристики LeAOS3 продукты инкубации 9- и 13-гидроперекисей жирных кислот с LeAOS3 анализировали с помощью ГХ-МС в виде метиловых эфиров триметилсилил-производных (Ме/ТМС) (рис. 7). Для выявления зависимости профиля продуктов реакции от концентрации LeAOS3 9-ГПОД (100 мкг) инкубировали с различными количествами LeAOS3 при 0 "С в течение 10 секунд. Поскольку ожидаемым первичным продуктом каталитического действия LeAOS3 является нестабильная окись аллена (122)-9,10-эпоксиоктадека-10,12-диеновая кислота (9,Ю-ЭОД), продукты инкубации после быстрой экстракции подвергали метанолизу. Эта стадия позволяла регистрировать наличие окиси аллена, эффективно превращая 9,Ю-ЭОД в рацемический метоксикетон [Hamberg, Hughes, 1989].

В результате инкубации субстрата с 0,5 мкг LeAOS3 (рис. 7А) основным улавливаемым продуктом был метоксикетон За (рис. 6), соответствующий окиси аллена 9,Ю-ЭОД I. Среди продуктов реакции присутствовал а-кетол 4а - продукт гидролиза 9.Ю-ЭОД. Идентификацию соединения За и а-кетола 4 (Ме/ТМС) подтвердили данные масс-спектров (рис. 8). Кроме того, наблюдалось появление двух дополнительных продуктов, 1а и 2а (в виде метиловых эфиров 1 и 2). Соединения 1 и 2 идентифицировали как циклопентеноны - транс- и tfuc-10-OKCo-l 1-фитоеновая кислоты (Ю-ОФЕК).

При увеличении концентрациями LeAOS3 (2, 5 или 40 мкг/мл) профили продуктов менялись (рис. 7). Регистрируемое количество метоксикетона постепенно снижалось; уменьшение пика сопровождалось увеличением пиков 1 и 2, а также пика а-кетола. При этом скорость преобразования 9,Ю-ЭОД в присутствии LeAOS3 была значительно выше, чем ожидаемая скорость спонтанного превращения окиси аллена (время полужизни 30

секунд [Hamberg, 2000]). На основании масс-спектров соединения 1 и 2 идентифицировали как транс- и ¡/uc-изомеры Ю-ОФЕК. Присутствие циклопентенона в качестве продукта реакции подтвердили данные ЯМР-спектроскопии. 'Н-ЯМР-спектр был идентичен таковому для г/ыс-Ю-ОФЕК [Hamberg, 2000]. Z/ыс-циклопентенон (2) являлся первичным продуктом циклизации окиси аллена и основным изомером. Ранее отмечалось, что цик-лопентенон с цнс-конфигурацией боковых цепей является ожидаемым продуктом антара-поверхностной циклизации окиси аллена в соответствии с правилами сохранения орбитальной симметрии [Grechkin, 1994].

О о hf^---^--COOR

COOR

1. R»M<S 1а, R = H

—

3. R »Me, R'sMe * За, R = Me,R'«H

4. R»TMC,R' »Me

4a (122)-9-гидрокси-10-оксо-12-октадеценовая кислота (а-кетол) R » Н, R' =■ Н

COOR

7. R-Me 7a, R-H

^^ ^^ COOR

2, R-Me 2a, R» H

О 10. R = Me

10a, R = H

COOR'

б. R-Me.R'-Me »a, R = Me, R"» H

в, R-TMC.R'-Me

ва (92)-12-оксо-13-гндрокси-9-октадецеяовая кислота (а-кетол) R«H, R1 = Н

COOR

L 9,10-ЭрД (окись аллена) COOR

П. 12,13-ЭОД (окись аллена)

COOR

HL 12,13-ЭОТ (окись аллена)

COOR"

S. R = Me, R'= Me Ba, R « Me, R" = H 9. R - TMC. R' - Me ва 12-оксо-13-гидрокш-(9^,152)-октадекадиеиовая кислота (а-кетол) R»H,R' = H

11. R-11a. R -

TMC, R-Me H, R' -H

Рис. 6. Химические структуры соединений, полученных в качестве продуктов ин-кубаций гидроперекисей жирных кислот с рекомбинантной LeAOSЗ. Номера соединений по тексту выделены полужирным шрифтом.

•> i >3 а-к«тол

1 \,К м

т/г 1

152, J^ , , JM-A /т 201— — ■■ ■■ jm

25Ô— ............

15.0 16.0 17.0 /(мин) .....

259 ............г. . ■ ■ ..............................,

15.0 16.0 17.0

t (мин) ^

1 2ч I а-квтол

* ЧА i

%__L

201--.-■- -1 1 А.

25в —........................|М||||П.

15.0 16.0 17.0 /(мин)-

1М23

и*

277 308

100 150

т/г -

200 250

1JLLL

201 Б

ми±£3им**™—

777 309 340

50 1 00 150 200 250 300 390 т/г ■—"-'■'■

1259

»» il

О ОТШ

VK^^-^COOM. ------

2 9

Л J>.l I I I

200 m/i -

383

\ И*

277 И7'398

Рис. 7. Хроматограмма продуктов инкубации 9-ГПОД с LeAOS3 в концентрациях: А - 0,5, Б -5, В - 40 мкг/мл. 1 и 2 - транс- и i/ис-изомеры 10-оксо-11-фитоеновой кислоты, 3 - метоксикетон. Селективные ионные токи соответствуют: 152 -метиловому эфиру циклопенте-нона, 201 - продукту метанолиза окиси аллена, 259 - а-кетолу 4а в виде метилового эфира ТМС-производного (4).

Рис. 8. Электронные масс-спектры продуктов инкубации 9-ГПОД с разными концентрациями ЬсАОБЗ: А - метиловый эфир рацемического цис-циклопентенона;

Б - продукт метанолиза окиси аллена в виде метилового эфира 3; В - а-кетол 4а в виде метилового эфира ТМС-производного (4).

2.6. Анализ энантиомерного состава продуктов инкубации 9-ГПОД с рекомби-нантной ЬеАОвЗ. Очистку соединения 2 проводили с помощью ВЭЖХ на нормальной фазе, после чего его нанесли на колонку СЫга1се1 ОБ-Н и выяснили, что энантиомеры соединения 2 не разделяются на этой колонке. Повторный анализ проводили после щелочной изомеризации 1/ис-циклопентенона 2 в соответствующий транс-изомер 1. Результаты анализа указывают на то, что исследуемый продукт является рацемическим и состоит из равных частей (9Я,13Я)- и (95,135)-энаитиомеров.

Стерический анализ а-кетола, полученного в результате инкубации 9-ГПОД с ЬеАОБЗ (4а), выявил преимущественно (9Я)-энантиомер (92%). В то же время, а-кетол, образуемый при участии ХтА081, представлял собой смесь (9Д)- и (95)-энантиомеров. Избирательное образование (9Д)-а-кетола при участии ЬеАОБЗ означает, что окись аллена гидролизуется по механизму. При спонтанном гидролизе значительный вклад вно-

сит SN1 механизм, в результате чего образуется рацемический а-кетол, как в случае реакции, катализируемой ZmAOSl. Таким образом, гидролиз окиси аллена в присутствии LeAOS3 не является спонтанным.

2.7. Механизм реакции, катализируемой рекомбинантной LeAOS3. Результаты наших экспериментов согласуются с данными, указывающими на то, что короткоживу-щая окись аллена является первичным продуктом LeAOS3 [Itoh et al., 2002]. Это означает, что синтез окиси аллена является общей функцией алленоксидсинтаз подсемейств CYP74A и CYP74C. Однако характер дальнейших превращений окиси аллена при участии LeAOS3 отличается от такового при участии ферментов CYP74A. Время полужизни окиси аллена зависит от концентрации LeAOS3, тогда как в реакциях, катализируемых АОС подсемейства CYP74A, время полужизни окисей аллена постоянно (27-44 с) [Tijet, Brash, 2002]. Когда концентрация LeAOS3 достигает насыщения, происходит полное превращение 9-ГПОД через 9,Ю-ЭОД в Ю-ОФЕК и а-кетол за 20 секунд. Кроме того, в реакции стереоспецифично образуется (9Л)-изомер а-кетола.

Таким образом, LeAOS3 является мультифункциональным ферментом, который катализирует три превращения (рис. 9). Продуктом первой реакции является короткоживу-щее промежуточное соединение окись аллена - 9.Ю-ЭОД (рис. 9, реакция 1), -

синтезируемая и высвобождаемая из ка-О талитического центра LeAOS3. Затем

LeAOS3 вновь захватывает 9.Ю-ЭОД для катализа двух последующих конкурирующих превращений, а именно гидролиза и циклизации (рис. 9, реакции 2 и 3, соответственно). Гидролиз, но не циклизация, протекает стереоспецифично. Окончательными продуктами LeAOS3 являются (9Д)-а-кетол 4а и рацемическая I/1/C-10-OKCO-11-фитоеновая кислота 2а.

Полученные результаты позволяют дополнить существующую схему метаболизма оксилипинов (рис. 10).

Результаты работы свидетельствуют о том, что, LeAOS3 и аналогичные 9-АОС подсемейства CYP74C контролируют новый метаболический путь от линолевой кислоты до циклопентенонов. Физиологическое значение данного пути еще предстоит выяснить.

Циклопентеноны - производные 9-гидроперекисей линолевой и а-линоленовой кислот - обнаружены в корнях имбиря, ландыша и подсолнечника [Grechkin et al., 2007]. Тканеспецифичное образование этих соединений указывает на их участие в сигнальных цепях, альтернативных образованию жасмоновой кислоты в 13-ЛОГ/АОС пути.

ОН

(9R)-а-кетол

рацемическая смесь

цис-10-оксо-ФЕК

Рис. 9. Схема предполагаемых ферментативных реакций, катализируемых ЬеАОЗЗ. К=(СН2)7С02Ме; К'=(СН2)4Ме.

/ ^^^соон

_ „ л1ша!е{но)вая кислота 9-ЛОГ \ 13-ЛОГ

(9Д)-а-кетал

(2Л>ШО(Д/Т) АОс| /

" О

(ад),ю-эо(дгг) аск;

^^соон

«ис-Ю-ОФ(Е/Д)К

АОЦ (только с 12,(13S)-30T)

«ис(+)-12-ОФДК

S --

Рис. 10. Схема превращения линолевой и а-линоленовой кислот. Выделены реакции гидролиза и циклизации окисей аллена с образованием (9Л)-а-кетола и цис-циклопентенонов при участии LeAOS3.

2.8. Обнаружение новых генов ферментов CYP74 льна-долгунца (Linum usitatis-simum L.). Лен был первым растением, в котором удалось выявить и охарактеризовать цитохром Р450 семейства CYP74 - алленоксидсинтазу LuAOS [Song el al., 1993]. Долгое время считалось, что LuAOS является единственным представителем данного семейства у льна, и его активность необходима только в семенах. Обнаружение в листьях льна диви-нилового эфира - (ш52)-этероленовой кислоты и новых соединений — линолипинов [Che-chetkin et al., 2008] - поставило вопрос о ферментативных основах их метаболизма. Однако соотнесение предполагаемой ферментативной активности с каким-либо ферментом у малоизученных организмов представляет собой крайне сложную задачу. Одно из ее решений может быть связано с поиском и идентификацией соответствующих мРНК. Поиск мРНК предполагаемой дивинилэфирсинтазы льна провели благодаря наличию в первичной структуре цитохромов CYP74 консервативных участков, что позволяет с некоторой вероятностью предсказать варианты последовательностей генов, кодирующих данные области.

Для выявления молекул кДНК, полученных в результате обратной транскрипции целевых мРНК, использовали различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Ключевым моментом исследования являлся выбор участков кодирующих последовательностей генов ферментов CYP74, которые отличались бы от последовательностей генов других цитохромов Р450, но, вместе с тем, были достаточно консервативными для генов семейства CYP74. В дальнейшем эти последовательности использовали при конструировании вырожденных праймеров для амплификации фрагментов целевых генов в ПЦР. Для выбора праймируемых участков проводили сравнительный анализ аминокислотных последовательностей известных ферментов CYP74 разных видов растений. В зависимости от степени сходства аминокислотных последовательностей все ферменты разделили на три группы. В каждой группе выделяли и сравнивали каталитически важные домены, из которых наиболее консервативными оказались В'-спираль и ERR-триада. По их аминокислотным последовательностям с учетом частоты встречаемости кодонов у высших растений определили наиболее вероятные кодирующие нуклеотидные последовательности, на основе которых сконструировали три пары олигонуклеотидных праймеров.

Ферменты разделили на группы. В первую группу (ДЭС) включили охарактеризованные к настоящему времени дивинилэфирсинтазы растений семейства пасленовых (Solanaceae). Праймеры LDF и LDR оказались строго комплементарны выбранным участкам генов данной группы. Вторую группу (ГПЛ) составили гидропероксидлиазы, которые обладали наибольшим сходством первичной структуры и субстратной специфичности с известными дивинилэфирсинтазами. На основе последовательностей кодирующих их генов сконструировали вырожденные праймеры LHF и LHR. Третья группа (АОС) включала алленоксидсинтазу льна (Linum usitatissimum, GenBank Ш: U00428.1) и гидропероксидлиазу тополя (Populus trichocarpa, GenBank ГО: EF145878), который среди растений с расшифрованным геномом оказался таксономически наиболее близким видом для льна. На основе нуклеотидных последовательностей генов третьей группы сконструировали праймеры LAF и LAR. Сконструированные праймеры использовали для выявления последовательностей, гомологичных генам семейства CYP74, в библиотеке кДНК.

Содержание галактолипидов, включающих этерифицированные дивиниловые эфи-ры, увеличивается после инфицирования растений льна-долгунца клетками фитопатоген-ных бактерий Pectobacteríum atrosepticum [Chechetkin et al., 2009]. Исходя из этого, тотальную РНК выделяли из листьев 35-дневных растений через сутки после инокулиро-вания их суспензией клеток возбудителя мягких гнилей Pectobacteríum atrosepticum SCRI1043 (Erwinia carotovora ssp. atrosepticá). На основе выделенной РНК получали библиотеку двуцепочечной кДНК с помощью реакции обратной транскрипции. Смесь кДНК использовали в качестве источника матрицы для гнездовой ПЦР с тремя парами праймеров. Полученные фрагменты клонировали с помощью бактериального вектора pGem-T Easy (Promega, США), после чего определили их нуклеотидную последовательность. Последовательности фрагментов LHF-LHR имели высокую степень сходства с генами ферментов подсемейства CYP74B многих видов растений.

Следующим этапом определения структуры новых генов подсемейства CYP74B льна стала амплификация последовательностей 5'- и З'-концевых участков их кДНК мето-

дом RACE. Амплифицированные концевые участки клонировали; их последовательности определили. Поскольку клонированные нами 5'- и З'-фрагменты могли соответствовать генам разных изоформ, проводили дополнительный раунд амплификации полноразмерных кДНК, соответствующих транскриптам генов подсемейства CYP74B льна. Для этого использовали праймеры, комплементарные 5'- и З'-концевым участкам. Полученные ам-пликоны также клонировали с помощью вектора pGem-T Easy и секвенировали.

Дальнейшая работа была сосредоточена на изучении гена и белка изоформы 1 фермента подсемейства CYP74B льна. Открытая рамка считывания (ОРС) данного гена содержит 1419 нуклеотидов и соответствует полипептиду размером 473 аминокислотных остатка. Последовательность гена зарегистрирована в базе данных GenBank NCBI под идентификационным номером HQ286277.1 (GI:310687282). Предполагаемому белку было присвоено название CYP74B16 [Nelson, личное сообщение].

Проведенное нами сопоставление аминокислотной последовательности изоформы 1 с описанными ферментами CYP74 с помощью программы BLAST также показало, что новый фермент CYP74B16 льна относится к подсемейству CYP74B и проявляет высокую степень сходства первичной структуры с 13-ГПЛ. Однако его последовательность имеет несколько уникальных аминокислотных замен, затрагивающих каталитически важные домены и, в первую очередь, центральный домен I-спирали (IHCD) (рис. 11). Как у всех ферментов CYP74B, в начале домена IHCD в положении 286 фермента CYP74B16 находится лейцин (рис. 11, положение 1). В следующем положении у CYP74B16 находится остаток аланина, тогда как у всех известных ферментов CYP74B в этом месте располагается остаток глицина (рис. 11, положение 2). Из всех ферментов CYP74 в этом участке остаток аланина находится только у дивинилэфирсинтазы чеснока AsDES [Stumpe et al., 2008]. Непосредственно после домена IHCD в последовательности CYP74B16 находится остаток глутаминовой кислоты. У всех членов подсемейства CYP74B, также как у большинства ферментов CYP74, в этом положении находится консервативный остаток глицина. Исключение составляют ДЭС пасленовых растений, у которых в этом положении остаток глицина также замещен остатком другой аминокислоты (рис. 11). В связи с этими структурными особенностями, была проведена биохимическая характеристика рекомби-нантного фермента CYP74B16.

Рис. 11. Результаты множественного выравнивания последовательностей 1-спирали ферментов CYP74 (домен IHCD обозначен 1-6).

2.9. Характеристика рекомбинантного фермента CYP74B16 льна. Для получения рекомбинантного белка CYP74B16 ОРС соответствующего гена поместили в экспресси-рующий вектор рЕТ-32 Ek/LIC (Novagen.CLIIA) методом безлигазного клонирования. На-

работку и очистку рекомбинантного фермента проводили с использованием штамма Е. coli Tuner(DE3)pLysS по методике, разработанной ранее для LeAOS3.

Очищенный препарат CYP74B16 обладал ферментативной активностью в отношении гидроперекисей жирных кислот в широком диапазоне pH, с максимумом при значениях pH от 7.5 до 8.0. Снижение оптического поглощения реакционной смеси при длине волны 234 нм сопровождалось возрастанием поглощения в области 267 нм, что характерно для дивиниловых эфиров.

Для определения константы Михаэлиса и константы каталитической были измерены начальные скорости реакций с разными субстратами в концентрациях от минимальной до насыщающей. Из полученных данных сделали вывод, что сродство рекомбинантного фермента CYP74B16 к (135)-ГПОТ значительно выше, чем к (135)-ГПОД, (95)-ГПОД (табл. 3) и (95)-ГПОТ (данные не представлены). В то же время, максимальную каталитическую активность рекомбинантный фермент CYP74B16 проявлял по отношению к (135)-ГПОД. Соотношение kcJK„ свидетельствует, что 13-гидроперекиси о-линоленовой и ли-нолевой кислот являются предпочтительными субстратами (табл. 3). Такие субстратные предпочтения характерны для большинства ГПЛ подсемейства CYP74B.

Табл. 3. Константы каталитические и константы Михаэлиса рекомбинантного фермента CYP74B16, рассчитанные для каждого субстрата с помощью пакета программ SigmaPlot 11 software (Systat Software Inc., USA).

Субстрат Константа каталитическая, кса, (сек4) Константа Михаэлиса, Кт (мкмоль) kcJKm (сек_1мкмоль_|) Субстратная специфичность, %

13(S)-rnOT 545,8 ± 12,9 28,0 ± 1,9 19,5 100

13(5)-ГПОД 956,4 ±31,7 132,5 ±5,8 7,2 37

9(5)-ГПОД 33,7 ± 1,1 122,4 ±8,6 0,3 1,4

Анализ выявил наличие одного преобладающего продукта, в спектре которого имеется молекулярный ион [М]+ при m/z 306 (рис. 12А). Его масс-спектр (рис. 12Б) идентичен спектру, описанному ранее для метилового эфира (ш52)-этероленовой кислоты [Hamberg, 1998; Chechetkin et al„ 2008] и этероленовой кислоты [Grechkin et al„ 1995]. Время удерживания основного продукта соответствует таковому для (ш52)-этероленовой кислоты. Анализ продуктов реакции в виде Ме/ТМС после восстановления боргидридом натрия и каталитического гидрирования выявил полностью гидрированный дивиниловый эфир -13-оксанонадекановую кислоту (рис. 12В) - и продукт фрагментации цепи - 12-гидрокси-додеканоевую кислоту (Ме/ТМС).

Основное соединение очищали с помощью ВЭЖХ на обратной и нормальной фазах и исследовали методом ЯМР-спектрометрии. 'Н-ЯМР спектр оказался идентичен спектру (ю52)-этероленовой кислоты, полученному ранее [Chechetkin etal., 2008]. Значения

констант спин-спинового взаимодействия ./11,12 = о транс- и i/ыс-конфигурации двойных связей.

5.0

7.S К), а 12.5 lTö~ Время удерживания, мин

17.5

= 12,0 Гц и Jfx = 6,2 Гц свидетельствуют

Полученные данные позволили идентифицировать основной продукт преобразования (135)-ГПОТ как (co5Z)-этероленовую кислоту, а фермент CYP74B16 - как дивинилэфирсинтазу. В соответствии с принятой номенклатурой ферментов CYP74, новому ферменту присвоили тривиальное название LuDES (дивинилэфирсинтаза L. usitatis-simum L), также как и соответствующему гену - LuDES [Gogolev et al., 2012].

Как указывалось выше, структура LuDES имеет высокую степень сходства со структурами других членов подсемейства CYP74B. Кроме того, ген LuDES, также как и гены ГПЛ подсемейства CYP74B, экспрессируется в листьях; фермент утилизирует в качестве субстрата преимущественно (135)-ГПОТ. Превращение (135)-ГПОТ приводит к образованию дивинилового эфира, тогда как продуктами превращения (135)-ГПОД являются сопоставимые количества дивинилового эфира и (92)-12-оксо-9-додеценовой кислоты. Продукты фрагментации, вероятно, образуются благодаря дополнительной гидропероксидлиазной активности, проявляемой LuDES по отношению к (135)-ГПОД. В листьях льна преобладающей жирной кислотой является а-линоленовая. По всей вероятности, превращение (135)-ГПОТ в (со52!)-этероленовую кислоту является основной функцией LuDES.

Еще одной особенностью LuDES является геометрическая специфичность образуемого дивинилового эфира - (ш52)-этероленовой кислоты. Эта особенность объединяет LuDES с дивинилэфирсинтазами растений рода лютик {Ranunculus), которые также локализованы в листьях и предпочтительно утилизируют (135)-ГПОТ [Hamberg, 1998; 2002; 2004; 2005]. Синтез (ш52)-этероленовой кислоты и других подобных дивиниловых эфи-ров происходит у бурых водорослей рода ламинария (Laminaria) [Proteau, Gerwick, 1993].

JÖ0 m/i

Рис. 12. Результат анализа продуктов инкубации рекомбинантного фермента CYP74B16 с 13-гидроперекисью а-линоленовой кислоты методом ГХ-МС: (А) хроматограмма продуктов инкубации (Ме/ТМС) по полному ионному току (TIC), (Б) электронный масс-спектр метилового эфира основного продукта, (В) электронный масс-спектр метилового эфира основного продукта после каталитического гидрирования.

Дивинилэфирсинтазы бурых водорослей и растений рода и лютик, как и кодирующие их гены, до сих пор не изучены; систематическое положение ферментов не определено.

Полученные результаты указывают на то, что LuDES является уникальным ферментом, представляющим особый интерес для изучения механизма катализа и филогении как представителей семейства CYP74, так и цитохромов Р450 в целом. По сходству первичной структуры белок относится к подсемейству CYP74B. Однако в то время как все известные цитохромы подсемейства CYP74B являются гидропероксидлиазами, LuDES проявляет дивинилэфирсинтазную активность. Обнаружение данного фермента открывает новые возможности для выявления особенностей структуры активного центра цитохромов CYP74, определяющих тип катализа. Кроме того, полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярной эволюции семейства CYP74.

2.10. Выявление значения доменов IHCD и ERR для формирования типа катализа ферментов CYP74. Практически все цитохромы суперсемейства Р450 являются мо-нооксигеназами, и для них характерно использование двух субстратов: непосредственно окисляемого соединения и молекулярного кислорода. Уникальным свойством ферментов семейства CYP74 является отсутствие необходимости во втором субстрате, а именно -молекулярном кислороде. В реакции участвует кислород гидроперокси-группы окисленной жирной кислоты. В связи с этим, домен IHCD ферментов CYP74 отличается от соответствующего ему «кислород-связывающего домена» монооксигеназ отсутствием аминокислотных остатков, участвующих в связывании и активации кислорода и переносе электронов. С противоположной стороны к гему примыкает другой консервативный для всех цитохромов Р450 домен, названный ERR-триада. Исходя из сопоставления первичных и третичных структур представителей разных семейств цитохромов Р450, мы предположили, что функция некоторых аминокислотных остатков, входящих в состав этих доменов, заключается в непосредственном участии в каталитическом действии ферментов CYP74. Для проверки результатов анализа мы провели замены аминокислотных остатков, входящих в состав домена IHCD и ERR-триады алленоксидсинтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата, гидропероксидлиазы MtHPL (CYP74C3) люцерны и дивинилэфирсинтазы LuDES (CYP74B16) льна, получили и проанализировали следующие мутантные формы: LeAOS3 F295I, S297A, K302S, D359R и T366Y, MtHPL F284I и N285T и LuDES E292G. Кроме того, три мутантные формы MtHPL F287V, N285A и G288I были любезно предоставлены доктором Р. Хьюзом из Великобритании.

Выбор сайтов для замен в последовательностях АОС, ГПЛ и ДЭС основан на сопоставлении последовательностей изученных ферментов CYP74 и наличии в каталитически важных доменах несинонимических аминокислотных остатков, консервативных для ферментов с разным типом катализа. Например, фермент LuDES является единственной ди-винилэфирсинтазой, проявляющей сходство первичной структуры с 13-гидропероксидпиазами. Эта особенность предоставляет возможность выявления минорных различий в аминокислотных последовательностях, определяющих разницу в каталитических свойствах, что представляет интерес для энзимологии. В последовательностях

всех алленоксидсинтаз и гидропероксидлиаз после домена ШСР находится два остатка глицина подряд; у всех исследованных к настоящему времени дивинилэфирсинтаз первый остаток глицина заменен на остаток аланина (ДЭС пасленовых) или лейцина (ДЭС чеснока). В данном сайте ЬиОЕЗ содержит остаток глутаминовой кислоты. В клонированном гене ЬийЕЗ провели мутацию, обеспечивающую замену остатка глутаминовой кислоты в положении 292 на остаток глицина. С некоторой вероятностью можно было ожидать приобретение новым ферментом гидропероксидлиазной активности.

2.11. Анализ продуктов реакций, катализируемых ферментами дикого типа и их мутантнымн формами. В результате инкубации ЬеАОБЗ дикого типа с 9-ГПОД основным регистрируемым продуктом был а-кетол - (122)-9-гидрокси-10-оксо-12-октадеценовая кислота 4а в виде Ме/ТМС 4 (рис. 13А). Этот продукт образуется в результате гидролиза окиси аллена. В ничтожно малых количествах регистрировали также гид-ропероксидлиазный продукт - 9-оксононановая кислота 11а в виде метилового эфира 11 (рис. 13А). Дивиниловые эфиры обнаружены не были.

Все полученные нами мутантные формы ЬеАОЭЗ сохранили способность утилизировать 9-гидроперекись линолевой кислоты. Мутантные формы Р2951 (рис. 13Б), Б297А (рис. 13В), К302Э (рис. 13Г) и Т366У (рис. 13Д) проявляли 13, 52, 36 и 72 %, соответственно, тотальной активности ЬеАОБЗ дикого типа. Анализ продуктов превращений субстрата при участии этих мутантных форм, продемонстрировал кардинальные изменения в типе катализа. Все четыре мутанта проявляли активность гидропероксидлиазы (изомера-зы), продуцируя значительно большее количество 9-оксононановой кислоты 11а, чем фермент дикого типа. В то же время алленоксидсинтазная (дегидразная) активность мутантных форм ЬеАОЭЗ была сильно снижена (8297А, К3028 и Т366У) или отсутствовала (Р2951). С другой стороны, замена аспарагиновой кислоты на аргинин в ЕЫК-триаде (Р359Я) не привела к изменениям в характере катализа (данные не представлены).

В качестве субстрата для МШРЬ дикого типа и ее мутантных форм использовали 13-ГПОТ. Продукты анализировали в виде Ме/ТМС после восстановления ИаВЩ и гидрирования над РЮ2. Все мутантные формы сохранили способность утилизировать 13-ГПОТ. Однако помимо основного продукта реакции 12-оксо-(92)-додеценовой кислоты (12-ОДДК, Ме/ТМС), характерной для МШРЬ дикого типа, выявлялись дополнительные продукты, а именно - (92,11£)-13-оксотридекадиеновая (13-ОТДК) и (92)-11-оксоундеценовая (11-ОУДК) кислоты (Ме/ТМС). Относительное количество этих продуктов в некоторых случаях превышало количество специфического продукта (рис. 14).

Появление 13-оксотридекадиеновой и 11-оксоундеценовой кислот свидетельствует о нарушениях в ферментативном катализе. Эти соединения являются результатом спонтанного а- или р-разрезания. В обоих вариантах происходит задержка катализа после перегруппировки эпоксиаллильного радикала. В случае образования 13-ОТДК происходит разрыв Си-Си связи. В случае образования 11-ОУДК, как мы предполагаем, происходит окисление эпоксиаллильного радикала с последующим разрывом Сц-С|2 связи.

Рис. 13. Хроматограмма продуктов инкубации 9-ГПОД с ЬсАОЗЗ (А) и ее мутантных форм: Р2951 (Б), в297А (В), КЗ02Б (Г), Т366У (Д).

Рис. 14. Хроматограмма продуктов инкубации 13-ГПОТ с МдаРЬ дикого типа (А) и ее мутантными формами: Р2841 (Б), С2881 (В), К285А (Г), N2851 (Д) и Б287У (Е).

Полученные данные демонстрируют возможность конверсии ферментов СУР74 в результате точечных мутаций. Четыре мутации ЬеАОЗЗ - Р2951, К3028, Т366У и 8297А превратили АОС в ГПЛ. Это свидетельствует об определяющей роли данных аминокислотных остатков в специфичной функции фермента. Гидропероксидлиазная активность обнаруживается у мутантов ЬеАОЭЗ Р2951 и Ц359К, не смотря на то, что у этих форм можно было ожидать появления дивинилэфирсинтазной активности. С другой стороны, ни одна мутация МШРЬ не привела к приобретению нового типа катализа. Таким образом, можно предположить, что гидропероксидлиазная реакция является базовой по механизму, а алленоксидсинтазная и дивинилэфирсинтазная реакции формируются в процессе ее видоизменения под влиянием боковых групп ключевых аминокислот.

Для проверки выдвинутого предположения мы получили мутантную форму LuDES E292G и проанализировали ее свойства. Модифицированный фермент сохранил способность утилизировать (135)-ГПОТ. В то же время, анализ продуктов превращения гидроперекиси продемонстрировал кардинальные изменения в типе катализа (рис. 15Б). Основным продуктом реакции, катализируемой LuDES E292G, было соединение, идентифицированное как а-кетол. В качестве контроля (135)-ГПОТ инкубировали с рекомбинантной алленоксидсинтазой ZmAOSl (CYP74 Al 9) кукурузы {Zea mays) (рис. 15В). Сравнение продуктов подтвердило правильность идентификации. Масс-спектр минорного продукта превращения (13S)-rnOT модифицированным бации (135)-ГПОТ с LuDES дикого типа (А), ферментом соответствует г/ис-12-оксо-мутантной формой LuDES E292G (Б) и 10,15-фитодиеновой кислоте. Дивини-ZmAOSl (В). лэфирсинтазный продукт LuDES -

(<в52)-этероленовая кислота — обнаружен не был (рис. 15Б). Таким образом, в результате мутации E292G LuDES полностью утратила активность дивинилэфирсинтазы и приобрела активность алленоксидсинтазы.

При выборе сайта модификации LuDES отсутствие глицина в позиции 292 представлялось наиболее существенной особенностью, отличающей LuDES (CYP74B) от гидропе-роксидлиаз подсемейства CYP74B. Результат мутации - превращение ДЭС в АОС, а не ГПЛ - может представляться неожиданным. Вместе с тем, результат подтверждает ключевое значение сайта в каталитическом действии ферментов CYP74. В целом, структуры домена IHCD и ERR-триады во многом определяют тип катализа ферментов CYP74. Последовательности этих доменов можно использовать в качестве «отпечатков пальцев» ферментов CYP74, предсказывая, как правило, тип катализа по первичной структуре.

Результаты работы показывают, что все ферменты CYP74 обладают сходными механизмами катализа. Ранее гидропероксидлиазы были идентифицированы как изомеразы, катализирующие гемолитическую перегруппировку с промежуточными продуктами - ал-коксирадикалом и эпоксиаллильным радикалом [Grechkin et al., 2006]. Результаты сайт направленного мутагенеза указывают на то, что эпоксиаллильный радикал является ключевой точкой катализа всех ферментов CYP74 (рис. 16).

A LuDES дикого типа

((1)52)-этераленовая кислота

16 17 18

Время удерживания, мин

Б E292G мутантная форма

13-ГОТ (МеГГМС) транс_ и чис,12.ОФДК

Время удерживания, мин

В ZmAOSl дикого типа

Время удерживания, мин

Рис. 15. Хроматограммы продуктов инку-

R, ITlOfflU)

■^FF-oh

эпоксиадпильныи радикал щ

AOC (LeAOS3, LuDESE292G)

•к,

алкоксильныи радикал

ДЭС (LuDES), ПОП (MtHPL, LeAOS3F2951, -K302S, -T366Y, -S297A)

й н

окись аллена

/ \

\sR>

циклопентенон

альдегид со-оксожирная кислота

Рис. 16. Общая схема реакций, катализируемых ферментами CYP74 и их мутантными формами. Выделены стадии реакций, в которых происходит переключение типа катализа в результате единичных аминокислотных замен. LeAOS3 и ее мутантные формы инкубировали с (95)-ГПОД; R, = -(СН2)6СООН, R2 = -(СН2)4СН3. LuDES и MtHPL и их мутантные формы инкубировали с (135)-ГПОТ; R, = -СН=СНСН2СН3, R2 = -(СН2)7СООН.

Алленоксидсинтазы, как и дивинилэфирсинтазы, являются гидропероксид-дегидратазами. Несмотря на это, механизм каталитического действия ДЭС имеет больше общего с механизмом каталитического действия ГПЛ, которые являются изомеразами.

Первой стадией катализа у всех ферментов СУР74 является гомолиз гидроперокси-группы (рис. 16) с образованием эпоксиаллильного радикала и соединения II (Ис^-ОН комплекс). В зависимости от структуры домена ПКЮ и ЕЯК-триады эпоксиаллильный радикал претерпевает различные превращения. Второй стадией у АОС является отщепление атома водорода с образованием экзо-двойной связи при оксиране, что приводит к образованию окиси аллена. У гидропероксидлиаз и дивинилэфирсинтаз вторая стадия иная - гомолиз углерод-углеродной связи в оксиране с образованием винилоксикарбинильного радикала. Заключительным этапом катализа ДЭС является отщепление атома водорода от радикала с образованием второй двойной связи дивинилового эфира. Заключительным этапом катализа ГПЛ является рекомбинация винилоксикарбинильного радикала с гидро-ксильным радикалом с образованием полуацеталя.

Насколько нам известно, до нашей работы [Торогкоуа е/ а!., 2008] и независимо выполненной работы группы проф. Рамана [Ьее е! а!., 2008], в литературе не было примеров направленного изменения первичной структуры ферментов, приводивших к превращению фермента с одним типом катализа в фермент с другим типом в результате единичной замены аминокислотного остатка.

Экспериментальные данные согласуются с результатами компьютерного анализа структуры цитохромов СУР74, выявившими домены и аминокислотные остатки, определяющие тип катализа СУР74, в частности, домен 1НСП. Полученные результаты вносят вклад в представление об эволюции ферментов СУР74 и цитохромов Р450 в целом.

2.19. Филогенетический анализ и классификация ферментов липоксигеназного каскада. Непротиворечивая модель молекулярной эволюции ферментов липоксигеназного каскада до сих пор не построена. Долгое время липоксигеназный каскад считался эволюционным приобретением высших растений. Последние данные о присутствии цитохромов семейства СУР74 и оксилипинов у прокариот, водорослей и животных заставляют разрабатывать альтернативные гипотезы. На рис. 17 представлено филогенетическое дерево липоксигеназ, построенное с помощью алгоритма «присоединения ближайших соседей» [Ба^ои, Ке1, 1987]. Для построения было отобрано 438 последовательностей липоксигеназ организмов разного таксономического положения.

Молекулярно-филогенетический анализ аминокислотных последовательностей липоксигеназ позволил выявить относительную взаимосвязь между первичной структурой и функциональными характеристиками ферментов, в частности субстратной и каталитической специфичностью. Так, липоксигеназы млекопитающих разделяются на 5 групп. В группу А входят липоксигеназы, проявляющие 12Я-специфичность действия. Группа В объединяет в себе эпителиальные липоксигеназы с дуалистичной 12/15-активностью. Ферменты, имеющие ^^-специфичность действия (п+2 тип катализа), включены в группу С. Липоксигеназы, обладающие 12-специфичной активностью, составляют большую часть группы Е. Обособленная группа Б включает исключительно 5-липоксигеназы (п-2 тип катализа). Липоксигеназы высших растений разделились на четыре группы. Две из них принадлежат, споровым и голосеменным. Группа I представляет ферменты мхов

(Phvscomitrella patens) и печеночников (Marchantía polymorpha), у которых обнаружены 15- и 13-специфичные ЛОГ. Единственный охарактеризованный 13-специфичный фермент плауновидных (Selaginella moellendorffli, сектор L) имеет менее 45 % идентичности с известными последовательностями ЛОГ. В секторе К находятся ферменты однодольных и двудольных, проявляющие 13-специфичную активность. Хотя 9-липоксигеназы составляют монофилетическую группу, значимых различий первичной структуры этих ферментов с последовательностями 13-ЛОГ выявить не удается (сектор М).

Рис. 17. Филогенетическое дерево липоксигеназ. Группа Н включает ферменты Polysphondylium pallidum и Cyanothece sp.; J - Physcomitrella patens и Marchantía polymorpha-, L - Selaginella moellendorjfíi. Дерево построено методом «присоединения соседей».

По всей видимости, эволюционное развитие липоксигеназ происходило в соответствии с эволюцией основных таксонов. Вероятно, 13-специфичные ЛОГ возникли монофи-летически у растений одновременно с группой ЛОГ грибов, образующих широкий спектр продуктов (5-, 8-, 15-гидроперекиси, рис. 17, группа I); эти группы, также как липоксиге-

назы животных, протеобактерий, цианобакгерий имели общего предка. Первые этапы эволюции группы липоксигеназ, вероятно, совпали с появлением эукариотических организмов или непосредственно предшествовали этому событию.

Возникновение 9-специфичных липоксигеназ в результате минорных модификаций 13-липоксигеназ произошло, вероятно, незадолго до расхождения однодольных и двудольных растений. Это предположение подтверждается экспериментами по сайт-направленному мутагенезу. В результате мутации A562G проведено частичное изменение специфичности ZmLOX3, по-видимому, представляющее собой реверсию к 13-специфичной активности у 9-специфичного фермента Для уточнения времени возникновения 9-липоксигеназного пути необходимо получить данные о липоксигеназах споровых и разработать непротиворечивую филогенетическую модель цитохромов CYP74.

Разработку филогении и таксономии семейства CYP74 нельзя считать завершенной. В работе Д. Нельсона посвященной филогении цитохромов суперсемейства Р450 растений [Nelson, Werck-Reichhart, 2011] описание семейства CYP74 содержит серьезные противоречия. В связи с низкой степенью сходства последовательностей внутри семейства CYP74 было сочтено целесообразным ввести новую таксономическую единицу - клан, состоящий из одного семейства. При этом сделано заключение, что в эволюционной истории данные ферменты впервые появляются у печеночников (Marchantiophyta) в связи с выходом растений на сушу. Предполагается, что возникновение клана CYP74 было связано с развитием жасмонатной сигнальной системы, присутствующей у всех наземных растений. Ферменты CYP74 прокариот, морских кишечнополостных и хордовых распространились в результате горизонтального переноса генов от наземных растений посредством метилотрофных бактерий [Nelson, Werck-Reichhart, 2011].

Противоречивость приведенного представления об эволюции семейства CYP74 может быть дополнена тем фактом, что дивиниловые эфиры обнаружены не только у наземных растений, но также у бурых водорослей. Кроме того, алленоксидсинтазная активность обнаружена в клетках цианобактерий Acaryochloris marina [Gao et al., 2009]. Согласно альтернативной точке зрения клан CYP74 не имеет общих предков с другими группами цитохромов Р450; он возник на ранних этапах эволюции суперсемейства до дивергенции животных и растений от их последнего общего предка [Lee et al., 2008].

Для выяснения причин возникшего противоречия мы провели филогенетический анализ 493 аминокислотных последовательностей цитохромов Р450 не только высших растений, но и представителей следующих таксонов: Archaea, Bacteria, Amoebozoa, Alveo-lata, Euglenozoa, Fungi, Metazoa (рис. 18).

Полученные данные позволяют сделать вывод, что клан CYP74 не является производным других семейств Р450 высших растений, а представляет собой монофилетиче-скую группу ферментов, гомологичных представителям других групп цитохромов Р450 широкого спектра организмов, включающего цианобактерии (Nostoc punctiforme), грам-положительные бактерии (Bacillus subtilis) и нитчатые грибы (Neurospora crassä). Ферменты CYP74 проявляют сходство с представителями семейств CYP7 и CYP51 (рис. 18).

Рис. 18. Филогенетическое дерево суперсемейства Р450. Цифрами обозначены семейства и кланы цитохромов Р450 согласно [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. Построение выполнено методом «максимального правдоподобия».

Еще одно построение было выполнено с использованием в качестве оперативных таксономических единиц (OTE) последовательностей всех цитохромов трех организмов -A. thaliana, Ph. patens, Branchiostoma floridae. Обе модели подтверждают предположение о древнем эволюционном происхождении семейства CYP74. Воспроизводимое объединение эпоксиалкогольсинтазы CYP74B2 хордового животного, гидропероксидлиазы CYP74Y мха и алленоксидсинтазы CYP74A1 двудольного растения в монофилетичную группу указывает на высокую консервативность первичной структуры ферментов CYP74.

Принятые алгоритмы молекулярно-филогенетического анализа учитывают только аминокислотные замещения (нуклеотидные замены). В то же время, характерной особенностью ферментов CYP74, отличающей их от других цитохромов Р450, является наличие дополнительной консервативной последовательности из 9 аминокислотных остатков в гем-связывающей петле. Ранее высказывалось предположение, что эта последовательность возникла у семейства CYP74 после инсерции в соответствующую часть гена [Brash, 2009]. Однако в этом случае следует признать, что в одни и те же локусы генов CYP74

животных, растений и бактерий независимо были встроены фрагменты одинаковой последовательности. Данное событие в эволюции цитохромов Р450 является менее вероятным, чем деления 9 кодонов у одного из анцесторных генов суперсемейства.

В отличие от ферментов CYP74, остальные цитохромы Р450 являются монооксиге-назами или оксигеназами и используют молекулярный кислород в качестве субстрата. Отсутствие цитохромов Р450 у облигатных анаэробов указывает на то, что начало эволюции этих ферментов связано с возникновением фотосинтеза и последующей сменой восстанавливающей атмосферы на окислительную. Накопление кислорода в атмосфере началось 850 млн. лет назад [Konhauser et al., 2009] и совпало с появлением последнего эукариотического общего предка [Cavalier-Smith, 2010]. При последующем изменении условий существования основным направлением эволюции являлась адаптация клеточного метаболизма, связанная с выработкой механизмов защиты от повреждения биополимеров активными формами кислорода (АФК) и способов ликвидации последствий этих повреждений. Использование молекулярного кислорода эукариотами началось позднее благодаря приобретению митохондрий [Di Giulio, 2007]. Переход эукариот к аэробному образу жизни произошел за 150 млн. лет до дивергенции животных и растений, связанной с приобретением последними хлоропластов. Сопоставление событий с геологической шкалой выявляет резкое ускорение эволюции в этот период. Длительное (более 1 млрд. лет) существование древних организмов в условиях низких концентраций кислорода после появления первых цианобактерий 2,1 млрд. лет назад [Javaux et al., 2004] создавало предпосылки для первичной адаптации к образованию перекисных продуктов.

Одним из последствий повреждения мембран АФК является образование гидроперекисей жирных кислот. Вероятно, эти соединения, как субстрат для образования оксили-пинов, существовали до появления липоксигеназ. В то же время, нельзя исключать, что эволюция многих железосодержащих белков, в том числе липоксигеназ, десатураз и цитохромов CYP74, обеспечивающих липоксигеназный каскад, протекала параллельно. В результате перехватываемый ими кислород передавался различным субстратам, которые затем претерпевали превращения во все более сложных и разветвленных цепях реакций. При этом некоторые компоненты могли включаться в существующие цепи на определенных этапах. Так, например, ненасыщенные жирные кислоты могли синтезироваться первоначально в анаэробных условиях без участия десатураз, как в настоящее время происходит у некоторых бактерий, у которых синтазы жирных кислот способны образовывать двойную связь в процессе синтеза ацильной цепи [Heath, Rock, 1996; Лось, 2001].

Еще до радикального изменения состава атмосферы локальные концентрации кислорода в фотосинтезирующих клетках и непосредственном их окружении (матах и биопленках) могли быть выше средних значений. Это означает, что для фотосинтетиков и организмов, входящих в сообщества с ними, развитие защиты от перекисных продуктов было актуально уже около двух млрд. лет назад. Это создавало предпосылки для длительной эволюции антиоксидантных ферментов и цитохромов до формирования кислородной атмосферы. При этом предковые формы цитохромов Р450 могли обходиться

одним субстратом - продуктом спонтанного окисления биополимеров. Возможно, ферменты CYP74, осуществляющие подобную реакцию в отношении гидроперекисей жирных кислот, являются рудиментарными представителями этой древней группы цитохромов. Удаление поврежденных молекул могло происходить в результате превращения их в диффундирующие и летучие соединения, в том числе, оксилипины. Когда в результате эволюции развились более эффективные способы антиоксидантной защиты, данная группа могла быть элиминирована Сохранению семейства CYP74 способствовало переключение с репаративных функций на сигнальные. Кроме того, ферменты CYP74 непосредственно участвовали в эволюции антиоксидантной системы. Показано, что АОС кораллов [Koljak et al., 1997] и цианобактерий [Schneider et al., 1997] имеют сходство с каталазами. Например, белок Mycobacterium avium, проявляющий сходство структуры с каталазами и ферментами CYP74, с высокой эффективностью метаболизирует перекись водорода в присутствии как (135)- так и (95)-гидроперекисей линолевой, либо (155)-, (8Я)-гидроперекисей арахидоновой кислот, необходимых в качестве косубстрата в перок-сидазной реакции [Pakhomova et al., 2009].

Гипотезу о древнем происхождении CYP74 подтверждают следующие факты. Во-первых, локализация современных ферментов семейства в значительной степени связана с хлоропластами, являющимися потомками первых фотосинтезирующих организмов. Во-вторых, регрессивная эволюция белков путем утраты фрагментов аминокислотных цепей и связанных с ними функций требует меньше времени по сравнению с усложнением структуры путем приобретения новых функциональных последовательностей; в этом смысле делеция фрагмента из 9 аминокислотных остатков более вероятна, чем их случайная вставка с появлением новой функции. В-третьих, отсутствие кислорода предшествовало его появлению в атмосфере в качестве доступного субстрата В-четвертых, на независимо построенных филогенетических деревьях представители семейства (клана) CYP74 собраны в отдельную монофилетическую ветвь. В-пятых, данная модель не требует привлечения дополнительных эволюционных механизмов, эффективность которых не может быть подтверждена; так, для объяснения присутствия представителей CYP74 у таксономически отдаленных организмов было выдвинуто предположение о горизонтальном переносе соответствующих генов между растениями, протеобактериями и животными [Nelson, Werck-Reichhart, 2011; Nelson et al., 2013]. В качестве еще одного аргумента можно привести тот факт, что по сравнению с монооксигеназной реакцией реакция превращения гидроперекиси с участием ферментов CYP74 является простой, не требующей переносчиков электронов; предположение о поступательном развитии от двухкомпонент-ной системы к сложному реакционному комплексу представляется оправданным.

Современное распространение ферментов CYP74, в основном, связано с сосудистыми растениями. Это обстоятельство послужило основой концепции позднего происхождения семейства. Новые данные о присутствии АОС, ГПЛ и ЭАС у бактерий и животных дают основания для пересмотра этих представлений. Тем не менее, предположение о том, что ферменты CYP74 могли передаться и растениям и животным от общего предка отвер-

гается на том основании, что эти ферменты не обнаружены у одноклеточных простейших и зеленых водорослей [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. Однако отсутствие той или иной группы ферментов на том или ином отрезке филогенетической линии может быть следствием редуктивной эволюции, часто встречающейся в природе.

Существующая классификация ферментов CYP74 была заложена с использованием ограниченного объема данных, и в настоящее время нуждается в реорганизации. Согласно ранней классификации семейство было разделено на четыре подсемейства: CYP74A, CYP74B, CYP74C и CYP74D [Itoh, Howe 2001]. Однако появляется все больше ферментов CYP74, которые, согласно критерию сходства первичной структуры, не могут быть отнесены к этим подсемействам. Примерами служат ферменты CYP74 споровых и голосеменных, протеобактерий, хордовых и кишечнополостных. По обновленной классификации [Nelson, 2013] ферменты протеобактерий и животных не входят в новообразованный таксон клан CYP74, а относятся к новым семействам. С такой классификацией не согласны некоторые исследователи, по мнению которых функциональное сходство не менее важно для классификации, чем сходство последовательностей [Lee et al., 2008].

Результаты нашей работы показывают, что среди изученных подсемейств CYP74 могут появляться новые члены, гомологичные по степени сходства первичной структуры и при этом отличающиеся по типу катализа от ферментов, образующих подсемейство. Так, LuDES, гомологичная ферментам CYP74B, является ДЭС, в отличие от изученных членов подсемейства, обладающих активностью 13-ГПЛ.

Нами было предпринято построение филогенетического дерева клана CYP74, включающего новые ферменты, в том числе, охарактеризованные в данной работе (рис. 19). Кроме ферментов высших растений дерево позволяет включить в семейство (клан) CYP74 последовательности АОС коралла A. palmata (ApAOS) и плаунка Selaginella moellendorffii (SemAOS), эпоксиалкогольсинтазы (ЭАС) ланцетника В. floridae (BfEAS). Хотя экстраполяция на дальние эволюционные дистанции связана со значительной ошибкой, полученный результат воспроизводился с применением разных алгоритмов построения эволюционных моделей и при использовании разных критериев выборки OTE.

Согласно полученной модели ферменты CYP74 плауновидных (SemAOS) и мхов (CYP74G, рис. 19) наиболее близки к ферментам CYP74 животных, что согласуется с общими представлениями об эволюции живых существ.

Общепризнанного критерия отнесения последовательности фермента к тому или иному подсемейству CYP74 не выработано. По нашим оценкам, степень идентичности между представителями признанных подсемейств не выходит за пределы 50 %. При обозначении подсемейств мы руководствовались этим пороговым значением.

Разделение на филогенетическом дереве двух основных типов ферментов CYP74 -ГПЛ и АОС — указывает на то, что эта дивергенция произошла на ранних этапах эволюции семейства. В пользу такого вывода также свидетельствует тот факт, что оба типа ферментов представлены у филогенетически отдаленных организмов. Разделение на 9- и 13-гидропероксид-специфичные ферменты также закономерно отражает эволюцию се-

мейства. Две удаленные терминальные монофилетические группы - ГПЛ (подсемейства СУР74В, СУР74Р) и АОС (подсемейство СУР74А) включают ферменты, обладающие исключительно 13-гидропероксид-специфичностью. В то же время, ферменты эволюционно более молодой группы СУР74С/СУР740/СУР74А* обладают 9-гидропероксид-специфичной или смешанной активностью. До настоящего времени 9-гидропероксид-специфичные ферменты СУР74 обнаружены только у растений отдела покрытосеменных.

Рис. 19. Филогенетическое дерево цитохромов СУР74, построенное методом «присоединения соседей». Предполагаемые подсемейства обозначены символами, предложенными Д. Нельсоном для соответствующих групп [http://drnelson.uthsc.edu]. Стрелками указаны ферменты, в отношении которых проведена конверсия ферментативной активности, в том числе в данной работе (выделено шрифтом).

Проведенный анализ не позволил определить филогенетические отношения ГПЛ и АОС. Результаты работ по сайт-направленному мутагенезу [Toporkova et al., 2008; Lee et al., 2008] показали, что единичные аминокислотные замены могут привести к превращению АОС в ГПЛ. Дивинилэфирсинтаза LuDES была превращена в алленоксидсинтазу. Учитывая то, что реверсии более вероятны, чем приобретение функций de novo, можно предположить, что эволюция семейства CYP74 состояла в последовательном превращении ферментов ГПЛ —> АОС —► ДЭС. В то же время, нельзя исключать, что у разных групп CYP74 был единый предковый фермент с собственной каталитической функцией. Исходя из механизма реакций, катализируемых ферментами CYP74, наиболее вероятным кандидатом на предковую форму является эпоксиалкогольсинтаза (ЭАС). Этот фермент был обнаружен у В. Jloridae [Lee et al., 2008]. Выявление ЭАС у высших растений могло бы дать ценную информацию для уточнения эволюционной модели семейства CYP74.

Дивинилэфирсинтаза LuDES не единственное функциональное исключение из своей филогенетической группы. Дивинилэфирсинтаза чеснока (AsDES) также не соответствует группе 9/13-АОС и помещена в отдельное подсемейство. Таким образом, одним из результатов нашей работы является заключение о полифилетическом эволюционном происхождении дивинилэфирсинтаз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Благодаря прогрессу геномных технологий, база данных первичной структуры белков увеличивается лавинообразно. В то же время, работы по характеристике ферментов часто завершаются поверхностным описанием белка. Так, субстратные предпочтения ли-поксигеназ растений, регио- и стереоспецифичность их действия не достаточно изучены, что препятствует выяснению общих закономерностей 9- и 13-липоксигеназных путей. Экспериментальные данные подтверждают построенную нами модель позиционирования субстрата в активном центре липоксигеназ, согласно которой расположение пентадиено-вой группировки определяется объемом субстрат-связывающей полости фермента. Показано [Чечеткин и др., 2009], что для ZmLOX3 определяющим фактором соответствия субстрата является расстояние от карбоксильного конца до центра пентадиеновой группировки. Скорость и специфичность реакции сохраняются, если это расстояние такое же, как у линолевой кислоты, что наблюдается в случае гексадекадиеновой кислоты. Стери-ческие препятствия для позиционирования 20:2 и 22:2 в активном центре фермента могут быть причиной потери регио- и стереоспецифичности диоксигенирования.

Ранее сообщалось, что замена аминокислотного остатка приводила к смене регио- и стереоспецифичности действия 13-ЛОГ [Coffa, Brash, 2004]. Нами показано, что мутация A562G 9-специфичной липоксигеназы ZmLOX3 изменяет лишь региоспецифичность фермента. Таким образом, результаты нашего исследования указывают на ограниченность теории, объясняющей специфичность липоксигеназ ориентацией субстрата в активном центре, и необходимость разработки новой модели, основанной на признании того, что субстрат погружается в активный центр только метальной концевой группой.

Согласно полученным нами результатам, 7-гидроперекись гексадекатриеновой кислоты может вовлекаться в последующие реакции липоксигеназного каскада. Дивинилэ-фирсинтаза табака in vitro преобразует данный субстрат в динор-колнеленовую кислоту, алленоксидсинтаза кукурузы в а-кетол - 7-гидрокси-8-оксо-( 10Z, 12£)-гексадекадиеновую кислоту. Это открывает новые возможности исследования гексадеканоидного липоксигеназного пути и механизмов регуляции специфичности действия липоксигеназ.

В липоксигеназном каскаде липоксигеназы и цитохромы Р450 семейства CYP74 действуют координировано. Продолжением исследования, посвященного 9-специфич-ному направлению каскада, явилось изучение алленоксидсинтазы LeAOS3 томата, обладающей необычными свойствами. Известно, что большинство АОС катализируют образование из гидроперекисей жирных кислот окисей аллена, которые претерпевают спонтанный гидролиз и, в гораздо меньшей степени, спонтанную циклизацию [Tijet, Brash, 2002]. В то же время, характер дальнейших превращений окиси аллена в присутствии LeAOS3 необычен. Во-первых, время полужизни окиси аллена зависит от концентрации фермента. Во-вторых, LeAOS3 в насыщающей концентрации полностью превращает субстрат через окись аллена в циклопентенон и а-кетол за 20 секунд при 0 °С. В-третьих, а-кетол образуется стереоспецифично. Конечными продуктами являются (9Я)-а-кетол и рацемическая смесь г/ис-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

Приведенный путь метаболизма жирных кислот характерен не только для томата. Ранее показано, что аналогичные пути превращения жирных кислот в циклопентеноны и кетолы характерны для имбиря, ландыша и подсолнечника [Ogorodnikova et al., 2008].

Практически все ферменты суперсемейства Р450 являются монооксигеназами, и для них характерно использование двух субстратов: окисляемого соединения и молекулярного кислорода. В реакции, катализируемой ферментами CYP74, участвует кислород гидро-перокси-группы окисленной жирной кислоты. Соответственно, аминокислотные остатки, участвующие в связывании и активации кислорода и переносе электронов у монооксиге-наз, в последовательностях CYP74 отсутствуют. Было высказано предположение, что функция центрального домена I-спирали CYP74 (IHCD), соответствующего «кислород-связывающему домену» монооксигеназ, заключается во взаимодействии с гидроперекис-ной группировкой субстрата. Сделанные заключения были проверены с помощью сайт-направленного мутагенеза. Результатом этих экспериментов послужили конверсии ферментов CYP74. Четыре единичные мутации LeAOS3 F295I, K302S, T366Y и S297A превратили АОС (дегидразу) в ГПЛ (изомеразу). Это свидетельствует о роли данных аминокислотных остатков домена IHCD в специфичной функции фермента.

Учитывая, что реверсии к исходному фенотипу встречаются чаще, чем образование нового, можно предположить, что предковый фермент CYP74 обладал гидропероксидли-азной каталитической активностью, в то время как алленоксидсинтазная и дивинилэфир-синтазная активности являются ее производными.

Дивинилэфирсинтазы наименее изучены из ферментов липоксигеназного каскада (за исключением эпоксиалкогольсинтаз, включение которых в клан CYP74 еще окончательно

не признано). В настоящей работе впервые описана рекомбинантная 13-гидропероксид-специфичная ДЭС - LuDES (CYP74B16), - которая обладает высокой степенью сходства по отношению к 13-ГПЛ (CYP74B) и отличается от всех ранее описанных ДЭС по субстратной специфичности, продуктам реакции и органоспецифичности экспрессии гена [Гоголев и др., 2011]. В то же время, LuDES, вероятно, не единственная ДЭС, катализирующая образование (ш52)-этероленовой кислоты или родственных соединений. Такие дивиниловые эфиры были обнаружены в растениях рода лютик (Ranunculus) и у бурых водорослей рода ламинария (Laminaria) [Proteau, Gerwick, 1993]. Сходный дивиниловый эфир с (Л,2)-бутадиеновым фрагментом был обнаружен ранее в красной водоросли поли-нейра (Polyneura latissima) [Grechkin, 2002]. Соответствующие ДЭС остаются совершенно неизученными. Они могут оказаться либо ортологами LuDES, либо представителями других, в том числе, новых подсемейств CYP74.

В молекулярной филогении, связанной с систематикой ферментов, тип каталитической реакции принято ассоциировать с определенным подсемейством. В случае семейства CYP74 это соответствие не соблюдается. Так, подсемейство CYP74C содержит АОС и ГПЛ, подсемейство CYP74B - ГПЛ и ДЭС, CYP74A - АОС и ДЭС (рис. 19). В то же время, подсемейства CYP74D и CYP74H выделены лишь по функциональному признаку.

Исходя из анализа первичной структуры LuDES, можно было бы предположить, что этот фермент является природным мутантом 13-ГПЛ. В связи с этим, нами была предпринята попытка направленной модификации LuDES путем замены E292G, моделирующей реверсию данной мутации. Однако фермент полностью утратил активность дивинилэфирсинтазы и приобрел активность алленоксидсинтазы. Полученный результат кажется неожиданным, хотя он подтверждает важную роль домена IHCD в определении типа катализа CYP74. Кроме того, не отрицая базовой роли гидропероксидлиазной реакции для ферментов CYP74, он вписывается в модель эволюции семейства CYP74, предполагающей последовательное превращение ферментов ГПЛ —»АОС —> ДЭС.

Насколько нам известно, до настоящей работы [Toporkova et al., 2008] и одновременно выполненного исследования [Lee et al., 2008], в литературе не было примеров принципиального изменения катализа ферментов в результате единичных замен аминокислотных остатков. Полученная серия превращений ферментов CYP74 позволяет заключить, что разработан алгоритм направленных модификаций первичной структуры белков данного семейства, с высокой вероятностью изменяющих их каталитические свойства. Алгоритм включает построение филогенетических моделей, анализ третичной структуры белков, изучение механизма катализа. Промежуточным результатом служит определение консервативных, каталитически важных доменов, положения субстрата относительно активного центра, выявление роли отдельных аминокислотных остатков в зависимости от их свойств и пространственного расположения. На завершающем этапе должно быть осуществлено моделирование предполагаемых каталитических свойств белка с измененной структурой. Результаты проведенных экспериментов подтверждают эффективность

используемого алгоритма и открывают возможности для целенаправленного изменения каталитического действия ферментов СУР74.

Полученные данные подтверждают эволюционное происхождение семейства СУР74 от единого предкового гена. Обнаружение представителей семейства у прокариот и животных дают основание отнести время образование такого предкового гена ко времени существования последнего общего предка эукариот. Результаты расчета эволюционных дистанций также свидетельствуют о древнем происхождении семейства и соответствии его филогенетической модели общей эволюции организмов, у которых обнаружены ферменты СУР74. Таким образом, предположение о существенной роли горизонтального переноса генов в эволюционной истории семейства СУР74 не является обоснованным.

Несмотря на то, что в настоящее время липоксигеназы представлены широко, их эволюционная история связана, в основном, с эукариотическими организмами (рис. 17). Вероятно, распространение липоксигеназ не являлось обязательным условием возникновения ферментов СУР74. Не нуждаясь в молекулярном кислороде, эти ферменты могли появиться в период восстанавливающей атмосферы, выполняя репаративные функции, связанные с элиминацией гидроперекисей. Протекторная функция могла принадлежать и первыми липоксигеназам, способным перехватывать кислород и передавать его цитохро-мам в виде гидроперекисей. В этом случае, два железосодержащих белка могли пройти путь коэволюции, на протяжении которого их протекторная функция трансформировалась в метаболическую и сигнальную; в итоге был сформирован липоксигеназный каскад. Другое направление эволюции цитохромов Р450 определилось кооперацией с переносчиками электронов и усложнением реакции за счет формирования серии промежуточных комплексов в процессах поэтапного восстановления и окисления железа.

Проверить высказанные предположения экспериментально не представляется возможным. Однако можно отметить, что у современных растений липоксигеназный сигнальный каскад является частью фитоиммунитета и активизируется при повреждениях клеток, связанных с последующими окислительными событиями, в том числе такими драматичными, как окислительный взрыв [Тарчевский, 2002].

С точки зрения общей молекулярной филогении на примере липоксигеназ и цитохромов СУР74 можно сделать заключение, что высокий потенциал структурной и функциональной (фенотипической) изменчивости не всегда определяет темпы молекулярной эволюции. Поворотным пунктом в эволюции ферментов следует считать события, обеспечивающие выбор партнеров по коэволюции. Это обуславливает дивергенцию ферментов в связи с их принадлежностью к новым биохимическим процессам и одновременно расширяет спектр каскадов реакций, свойственных клеткам данного вида, увеличивая его физиологические возможности. При этих событиях возрастает вероятность скачкообразных изменений скорости эволюции, вызывающих сбои молекулярных часов, что часто обнаруживается при филогенетических построениях.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что ферменты ZmLOXЗ кукурузы и ОтЬОХ1 сои являются специфичными (95)- и (135)-липоксигеназами; условия реакции не оказывают влияния на специфичность действия данных ферментов.

2. Показано, что мутантная форма гтЬОХЗ А5620 при окислении линолевой кислоты проявляет измененную региоспецифичность действия, образуя (13Д)-гидроперекиси наряду с (95)-гидроперекисями, что связано с изменением объема полости активного центра.

3. Созданы трехмерные модели взаимодействия субстратов (жирных кислот и сложных липидов) с активными центрами липоксигеназ 2тЬОХЗ и ОтЮХ1, согласно которым 9- и 13-специфичность липоксигеназных реакций определяется не позиционированием субстрата, а архитектурой ферментов.

4. Выявлено, что первичная структура большинства липоксигеназ определяет специфичность ферментативной активности; исключение составляют липоксигеназы высших растений, у которых взаимосвязь между аминокислотной последовательностью и регио-специфичностью действия не выявляется. Липоксигеназы, обладающие 9-специфичностью, являются монофилетической группой, произошедшей от 13-специфичных липоксигеназ у цветковых растений перед дивергенцией однодольных и двудольных.

5. Показано участие (75)-гидроперекиси гексадекатриеновой кислоты в липоксиге-назном каскаде растений: при участии дивинилэфирсинтазы ИШЕБ табака и алленоксид-синтазы 7тА0Б1 кукурузы (75)-гидроперекись превращается в дивиниловый эфир (динор-колнеленовую кислоту) и а-кетол, соответственно.

6. Установлено, что алленоксидсинтаза ЬеАОЯЗ томата, принадлежащая подсемейству СУР74С, является мультифункциональным ферментом и, в отличие от алленоксидсин-таз подсемейства СУР74А, катализирует не только синтез, но также гидролиз и циклизацию окиси аллена. Гидролиз протекает стереоспецифично с образованием (9Л)-а-кетола; циклизация приводит к образованию рацемической смеси !/кс-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

7. Клонированы нуклеотидные последовательности, соответствующие трем полноразмерным мРНК генов подсемейства СУР74В, обнаруженным в транскриптоме листьев льна (Ыпит изНШттит Ь.), инокулированных клетками фитопатогенного штамма Рес1оЬас1егшт а^оьерйсит 80111043. Получен очищенный препарат функционально активного рекомбинантного фермента СУР74В16 (СепВапк Ш: 110286277.1).

8. Определены кинетические параметры фермента СУР74В16, в соответствии с которыми новый фермент является строго 13-гидропероксид-специфичным; предпочтительным субстратом является 13-гидроперекись а-линоленовой кислоты, основным продуктом катализируемой реакции - (<о52)-этероленовая кислота. Фермент СУР74В16 идентифицирован как 13-специфичная дивинилэфирсинтаза, которой присвоено тривиальное название ЬиОЕБ. По критериям молекулярной филогении ЬиОЕБ относится к под-

семейству CYP74B, включавшему до настоящего времени исключительно 13-гидропероксид-специфичные гидропероксидлиазы.

9. Выявлены сайты, определяющие механизм каталитического действия ферментов CYP74. На основе анализа первичной и третичной структуры белков впервые проведены конверсии ферментов разных функциональных групп. В результате аминокислотной замены E292G в центральном домене I-спирали LuDES проведена конверсия дивинилэфир-синтазы в алленоксидсинтазу. Замены аминокислотных остатков F295I, K302S, S297A и T366Y в полипептидной цепи LeAOS3 привели к превращению алленоксидсинтазы (де-гидразы) в гидропероксидлиазу (изомеразу). Мутации MtHPL F284I и N285T привели к появлению продуктов гомолитической фрагментации углеродного остова — (9Z,11£)-13-оксотридекадиеновой и (9Z)-11-оксоундеценовой кислот.

10. В результате объединения ферментов CYP74 животных, споровых и цветковых растений в отдельную монофилетическую группу, гомологичную цитохромам Р450 прокариот и нитчатых грибов, показано древнее происхождение семейства CYP74, имевшее место до дивергенции последнего общего предка эукариот. Данное семейство могло участвовать в начальных этапах эволюции цитохромов Р450.

11. Показано, что в эволюции ферментов CYP74 высших растений появление монофи-летической группы 13-ГПЛ (подсемейства CYP74B, CYP74F) происходило одновременно с появлением 13-АОС споровых (подсемейство CYP74G). Следующим этапом явилось образование группы, включающей 13-АОС цветковых (CYP74A), 9/13-АОС (подсемейство CYP74A*), 9-АОС и 9/13-ГПЛ (подсемейство CYP74C).

12. Дивинилэфирсинтазы имеют полифилетическое происхождение на поздних этапах эволюции семейства CYP74 и не образуют таксономически обособленной единицы; выделение данных ферментов в отдельные подсемейства (CYP74D, CYP74H) является условным.

13. Субстратная специфичность и тип катализа являются существенными таксономическими признаками представителей семейства CYP74, отражающими распределение по филогенетическим группам; дивинилэфирсинтазы связаны с близкородственными группами общей субстратной специфичностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Grechkin, A.N. Hydroperoxide lyases (CYP74C and CYP74B) catalyze the homolytic isomerization of fatty acid hydroperoxides into hemiacetals / A.N. Grechkin, F. Bruhlmann, L.S. Mukhtarova, Y.V. Gogolev, M. Hamberg // Biochimica et Biophysica Acta. - 2006. - V. 1761. -P. 1419-1428.

2. Чечеткин, И.Р. Регио- и стереоспецифичность рекомбинантной липоксигеназы-2 сои / И.Р. Чечеткин, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Доклады Академии наук. - 2007. - Т. 415, № 6. - С. 829-831.

3. Grechkin, A.N. Tomato CYP74C3 is a multifunctional enzyme not only synthesizing aliene oxide but also catalyzing its hydrolysis and cyclization /A.N. Grechkin, L.S. Mukhtarova,

L.R. Latypova, Y.V. Gogolev, Y.Y..Toporkova, M. HambergH Chembiochem-2008. - V. 9-P. 2498-2505.

4. Toporkova, Y.Y. Determinants governing the CYP74 catalysis: Conversion of allene oxide synthase into hydroperoxide lyase by site-directed mutagenesis / Y.Y. Toporkova, Y.V. Gogolev, L.S. Mukhtarova, A.N. Grechkin // FEBS Letters. - 2008. - V. 582. - P. 3423-3428.

5. Чечеткин, И.Р. Специфичность окисления гомологов линолевой кислоты липокси-геназами растений / И.Р. Чечеткин, Е.В. Осипова, Н.Б. Тарасова, Ф.К. Мухитова, М. Хам-берг, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Биохимия. - 2009. - Т. 74. - С. 1052-1059.

6. Осипова, Е.В. Рекомбинантная 9-липоксигеназа кукурузы: экспрессия, очистка и свойства / Е.В. Осипова, Р.И. Чечеткин, Ю.В. Гоголев, Н.Б. Тарасова // Биохимия. - 2010. -Т. 75.-С. 968-983.

7. Топоркова, Я.Ю. Изменение катализа ферментов подсемейства CYP74C в результате сайт-направленного мутагенеза / Я.Ю. Топоркова, Е.В. Осипова, Л.Ш. Мухтарова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Доклады Академии наук. - 2010а. - Т. 435. - С. 117-120.

8. Топоркова, Я.Ю. Происхождение разнообразия семейства CYP74 цитохромов Р450 по результатам сайт-направленного мутагенеза / Я. Ю. Топоркова, Л.Ш. Мухтарова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Вестник Московского университета. Сер. 16, Биология. - 20106. -N4.-C. 29-32

9. Chechetkin, I.R. Oxidation of glycerolipids by maize 9-lipoxygenase and its A562G mutant / I.R. Chechetkin, E.V. Osipova, L.L. Antsygina, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Chem. Phys. Lipids - 2011. - V. 164. - P. 216-220.

10. Mukhtarova, L.S. Hydroperoxide lyase cascade in pea seedlings: Non-volatile oxylipins and their age and stress dependent alterations / L.S. Mukhtarova, F.K. Mukhitova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Phytochemistry. - 2011. - V. 72. - P. 356-364.

11. Гоголев, Ю.В. Выявление и первичная характеристика нового цитохрома CYP74B1 льна (Linum usitatissimum) / Ю.В. Гоголев, С.С. Горина, Н.Е. Гоголева, Я.Ю. Топоркова, Л.Ш. Мухтарова, И.Р. Чечеткин, А.Н. Гречкин // Доклады Академии наук. -

2011,-Т. 440.-С. 540-543.

12. Gogolev, Y.V. Green leaf divinyl ether synthase: Gene detection, molecular cloning and identification of a unique CYP74B subfamily member / Y.V. Gogolev, S.S. Gorina, N.E. Gogoleva, Y.Y. Toporkova, I.R. Chechetkin, A.N. Grechkin // Biochimica et Biophysica Acta. -

2012.-V. 1821.-P. 287-294.

13. Ермилова, B.C. Изменение каталитических свойств дивинилэфирсинтаз в результате единичных аминокислотных замен / Ермилова B.C., Горина С.С., Топоркова Я.Ю., Мухтарова Л.Ш., Гоголев Ю.В., Гречкин А.Н. // ДАН. - 2013. - С. 1-4. - В печати.

14. Toporkova Y.Y. Structure-function relationship in CYP74 family: conversion of divinyl ether synthases into allene oxide synthases by site-directed mutagenesis / Y.Y. Toporkova, V.S. Ermilova, S.S. Gorina, L.S. Mukhtarova, E.V. Osipova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // FEBS Letters. - 2013. - P. 1-7. - Published online June 30, 2013. DOI 10.1016/j.febslet.2013.06.030.

ТЕЗИСЫ МАТЕРИАЛОВ НАУЧНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ

1. Осипова Е.В. Получение и свойства рекомбинантного белка 9-липоксигеназы кукурузы и его мутантной формы / Е.В. Осипова, И.Р. Чечеткин, А.Ю. Ярин, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Сб. тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - 2008. - Новосибирск: «Арта». - С. 42.

2. Toporkova Y.Y. Characterization of tomato allene oxide synthase LeAOS3 catalysis and its alteration by site-directed mutagenesis / Y.Y. Toporkova, Y.V. Gogolev, L.S. Mukhtarova, A.N. Grechkin // FEBS Journal. - 2009. - V. 276, Supp. 1 "34-th FEBS congress "life's Molecular Interactions". - Prague: Wiley-Blackwell. - P. 14.

3. Toporkova Ya.Yu. Origin of the CYP74 family of cytochromes P450 diversity based on results of site-directed mutagenesis / Ya.Yu. Toporkova, L.Sh. Mukhtarova, Yu.V. Gogolev, A.N.Grechkin // Abstracts of the 2nd Moscow International Conference "Molecular Phylogenet-ics". - 2010. - Moscow: Torus press. - P. 169.

4. Toporkova Ya.Yu. Alteration of catalytic mechanism of tomato allene oxide synthase LeAOS3 and alfalfa hydroperoxide lyase MtHPL by site-directed mutagenesis / Ya.Yu. Toporkova, L.Sh. Mukhtarova, Yu.V. Gogolev, A.N. Grechkin // 35th FEBS Congress Abstracts Book. - 2010. - Gothenburg: Wiley-Blackwell. - P. 260.

5. Горина C.C. Дивинилэфирсинтаза LuDES льна - новый фермент подсемейства CYP74B / C.C. Горина, Я.Ю. Топоркова, Н.Е. Гоголева, JI.IH. Мухтарова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. Гоголев // Сб. тезисов VII Съезда общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий». -2011. Н. Новгород: Изд. НГУ. - С. 196-197.

6. Gorina S.S. The unique enzyme of the CYP74B subfamily from flax (Linum usitatis-simum L.) / S.S. Gorina, Y.Y. Toporkova, N.E. Gogoleva, L.S. Mukhtarova, I.R. Chechetkin, Y.V. Gogolev and A.N. Grechkin // 36th FEBS Congress Abstracts Book. - 2011. - Torino: Wiley-Blackwell.-P. 211.

7. Топоркова Я.Ю. Исследование структуры комплекса мини- фермента, моделирующего каталитический центр цитохрома Р450 (CYP74), с субстратом / Я.Ю. Топоркова, С.С. Горина, Л.Ш. Мухтарова, Е.А. Ермакова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Сб. тезисов 4 съезда биофизиков России. - 2012. - Н. Новгород: Изд. НГУ. - стр. 219.

8. Toporkova Y.Y. Mini-enzyme modeling catalytic center of cytochrome P450 (CYP74) as a model for enzyme-substrate complex study / Y.Y. Toporkova, S.S. Gorina, E.A. Ermakova, L.S. Mukhtarova, Y.V. Gogolev, Y.F. Zuev, A.N.Grechkin // 4ht EMBO meeting Abstracts Book. - 2012. - Nice: Wiley-Blackwell. - P. 88.

9. Gorina S.S. Structural and functional characteristics of new divinyl ether synthase (CYP74B16) from flax (Linum usitatissimum L.) / S.S. Gorina, Y.Y. Toporkova, L.S. Mukhtarova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Plant Biology Congress. Book of abstracts. - 2012. -Freiburg. - P. 14.

10. Toporkova Y.Y. Interconversions of the enzymes within the CYP74 family by site-directed mutagenesis / Y.Y. Toporkova, S.S. Gorina, V.S. Ermilova, L.S. Mukhtarova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // 18th International conference on cytochrome P450: biochemistry, biophysics, biotechnology. Book of abstracts. - 2013. - Seattle. - P. 106.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую признательность моему научному консультанту академику А.Н. Гречкину за неоценимую помощь в работе. Выражаю искреннюю благодарность профессору Н. Келлер (Университет Висконсин) и доктору А. Фаммартино (Университет Турина) за предоставленные препараты рекомбинантных плазмид. Благодарю сотрудников лаборатории оксилипинов Казанского института биохимии и биофизики Л.Ш. Мухта-рову, Ф.К. Мухитову, Н.В. Ланцову, И.Р. Чечеткина, А.Ю. Ярина за помощь в подготовке растительного материала и проведение биохимических исследований. Выражаю признательность профессору Ю.Ф. Зуеву и Б.И. Хайрутдинову за проведение ЯМР-исследований. Выражаю особую благодарность Н.Е. Гоголевой, Я.Ю. Топорковой, С.С. Гориной, Е.В. Осиповой и всем аспирантам и сотрудникам лаборатории молекулярной биологии, без чьих знаний, таланта и увлеченности данная работа не могла бы состояться.

Выражаю глубокую благодарность Российскому фонду фундаментальных исследований, Президиуму РАН и Министерству образования РФ за финансовую поддержку исследований.

Подписано в печать 25.08.2013 г.

Печать электрографическая Бумага офсетная 80 гр/м2 Усл.п.л. - 1,5 Заказ № 372 Тираж: 150 экз. Типография «Ctrl-Р» 115230, Казань, Сары Садыковой, 59 тел.: 214-45-17

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Гоголев, Юрий Викторович, Казань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И БИОФИЗИКИ КАЗАНСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

5201351891

На правах рукописи

Гоголев Юрий Викторович

ФЕРМЕНТЫ ЛИПОКСИГЕНАЗНОГО КАСКАДА: СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА,

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ академик РАН А.Н. Гречкин

Казань 2013

ЧАСТЬ I

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ..................................................7

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................10

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................22

1.1. Оксилипины как биологически активные соединения..........................22

1.2. Метаболизм оксилипинов.............................................................27

1.3. Общая характеристика липоксигеназ..............................................30

1.4. Специфичность действия липоксигеназ...........................................32

1.5. Модели специфичности действия липоксигеназ................................39

1.6. Третичная структура липоксигеназ.................................................43

1.7. Липоксигеназа-3 кукурузы (ZmLOX3).............................................48

1.8. Общая характеристика ферментов Р450............................................49

1.9. Общая характеристика ферментов семейства CYP74..........................54

1.10. Структурная организация ферментов семейства CYP74.....................55

1.11. Алленоксидсинтазы..................................................................59

1.12. Гидропероксидлиазы.................................................................63

1.13. Дивинилэфирсинтазы................................................................66

1.14. Эпоксиалкогольсинтазы.............................................................68

1.15. Сравнение механизмов катализа цитохромов CYP74

и монооксигеназ Р450................................................................69

1.16. Локализация ферментов CYP74.....................................................79

1.17. Регуляция экспрессии генов ферментов липоксигеназного

каскада.........................................................................................81

1.18. Молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада..........85

1.18.1. Общие представления о молекулярной эволюции.....................85

1.18.2. Классификация и молекулярная филогения липоксигеназ..........91

1.18.3. Классификация цитохромов семейства CYP74........................95

1.18.4. Ферменты семейства CYP74 вне царства растений...................97

1.18.5. Молекулярная филогения ферментов CYP74.............................98

1.19. Постановка цели

исследования..................................................................................107

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................115

2.1. Методы биоинформатики..............................................................115

2.2. Подготовка растительного материала..............................................117

2.3. Выделение тотальной РНК из листьев растений................................ 118

2.4. Реакция обратной транскрипции и получение

двуцепочечной кДНК...................................................................118

2.5. Полимеразная цепная реакция.......................................................119

2.6. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот

в агарозном геле........................................................................119

2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК........................ 120

2.8. Молекулярное клонирование ДНК................................................ 121

2.8.1. Характеристика бактериальных штаммов.....................................121

2.8.2. Среды для культивирования бактерий.......................................... 123

2.8.3. Приготовление компетентных клеток Е. coli...................................123

2.8.4. Перенос плазмид в компетентные клетки Е. coli..............................124

2.8.5. Клонирование ПЦР-фрагментов.................................................. 125

2.8.6. Клонирование полноразмерных кДНК..........................................125

2.8.7. Клонирование целевых генов в экспрессирующие векторы................. 127

2.9. Сайт-направленный мутагенез клонированных генов......................... 130

2.10. Наработка и очистка рекомбинантных белков................................. 132

2.10.1. Выращивание культур продуцентов и индукция синтеза рекомбинантных белков....................................................132

2.10.2. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном

геле...............................................................................133

2.10.3. Выделение и очистка рекомбинантных белков..........................134

2.11. Реактивы и материалы для исследований катализа рекомбинантных ферментов....................................................... 136

2.12. Получение препаратов из растительного материала и подготовка субстратов..............................................................................137

2.12.1. Получение препаратов ацетонового порошка семян.................137

2.12.2. Получение препаратов свободных жирных кислот...................137

2.12.3. Получение препаратов гидроперекисей жирных кислот............138

2.13. Кинетические исследования реакций липоксигеназного

каскада..................................................................................139

2.14. Анализ продуктов реакций липоксигеназного каскада методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)..................140

2.14.1. Хроматография на обращенной фазе.....................................140

2.14.2. Хроматография на нормальной фазе......................................140

2.15. Спектральные исследования........................................................141

2.15.1. Подготовка образцов для ГХ-МС.........................................141

2.15.2. Проведение экспериментов по ГХ-МС...................................141

2.15.3. Получение спектров оптического поглощения.........................142

2.15.4. Получение ЯМР-спектров...................................................142

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ....................................143

3.1. Получение рекомбинантного фермента 2тЬОХЗ...............................143

3.1.1. Экспрессия 2тЬОХЗ в бактериальном продуценте....................143

3.1.2. Очистка рекомбинантного фермента 2тЬОХЗ...........................144

3.2. Окисление линолевой и линоленовой кислот при участии

гтЬОХЗ и ОтЬОХ1..................................................................148

3.3. Участие (78)-гидроперекиси 16:3 в липоксигеназном пути..................151

3.4. Направленная модификация первичной структуры 2тЬОХЗ.................154

3.4.1. Создание мутантных форм ZmLOXЗ......................................154

3.4.2. Окисление линолевой кислоты мутантными формами

гтЬОХЗ..........................................................................156

3.4.3. Окисление сложных липидов 2т1Х)ХЗ и ZmLOXЗAla562Gly.......159

3.5. Моделирование механизма ферментативного действия 2тЬОХЗ...........162

3.5.1. Трехмерная модель 2тЬОХЗ................................................162

3.5.2. Модели позиционирования субстратов в активном центре

липоксигеназ......................................................................164

3.6. Клонирование гена алленоксидсинтазы томата LeAOS3...........................171

3.7. Получение очищенного рекомбинантного фермента LeAOS3...............173

3.8. Продукты превращения 9-гидроперекиси линолевой кислоты при участии LeAOS3........................................................................174

3.9. Анализ энантиомерного состава цис-10-оксо-11-фитоеновой

кислоты...................................................................................181

3.10. Анализ энантиомерного состава а-кетола и метоксикетона.................182

3.11. Превращение 13-гидроперекиси линолевой кислоты при участии

Le АО S3.................................................................................184

3.12. Характеристика специфичности действия LeAOS3 (CYP74C)

и алленоксидсинтазы кукурузы ZmAOS (CYP74A)...........................186

3.13. Превращение окиси аллена LeAOS3 in situ......................................188

3.14. Предполагаемый механизм реакции, катализируемой LeAOS3.............190

3.15. Исследование доменов LeAOS3 и гидроперксидлиазы

люцерны MtHPL методом сайт-направленного мутагенеза..................194

3.15.1. Определение домена IHCD в первичной структуре

ферментов CYP74............................................................194

3.15.2. Выбор позиций и аминокислотных замен в полипептидной

цепи LeAOS3...................................................................199

3.15.3. Анализ продуктов катализа мутантных форм LeAOS3...............201

3.15.4. Выбор сайтов и аминокислотных замен в полипептидной

цепи MtHPL...................................................................207

3.15.5. Сравнительный анализ результатов сайт-направленного

мутагенеза LeAOS3 и MtHPL....................................................208

3.16. Обнаружение новых генов ферментов CYP74 льна-долгунца..............214

3.17. Выявление и клонирование кДНК CYP74B16..................................218

3.18. Получение препарата рекомбинантного белка CYP74B16...................224

3.19. Идентификация фермента CYP74B16............................................225

3.20. Исследование кинетических параметров реакций,

катализируемых ЬиБЕБ.............................................................231

3.21. Сравнение 1дЮЕ8 с другими членами подсемейства СУР74В.............235

3.22. Направленная модификация первичной структуры ЬиОЕБ.................238

3.23. Каталитические свойства ЬиБЕ8 Е292С.........................................240

3.24. Филогенетический анализ и классификация ферментов липоксигеназного каскада...........................................................249

3.24.1. Филогенетический анализ липоксигеназ......................................250

3.24.2. Филогенетический анализ цитохромов СУР74..............................254

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................276

ВЫВОДЫ.....................................................................................288

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................291

ПРИЛОЖЕНИЕ..............................................................................334

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Ю-ОФДК- 10-оксо-11,15-фитодиеновая кислота;

Ю-ОФЕК- 10-оксо-11-фитоеновая кислота;

12,13-ЭОД - (92)-12,13-эпоксиоктадека-9,11-диеновая кислота;

12,13-ЭОТ - (92,11£,13£,152)-12,13-эпоксиоктадека-9,11,15-триеновая кислота;

12-ОФДК - (152)-12-оксофито-10,15-диеновая кислота;

12-ОФЕК - 12-оксо-10-фитоеновая кислота;

13-ГПОД - (92,11Д 13£)-13-гидропероксиоктадека-9,11-диеновая кислота; 13-ГПОТ - (135)-гидроперокси-(92,11£,152)-октадекатриеновая кислота; 13-ЛОГ - липоксигеназа, окисляющая углерод полиненасыщенной жирной кислоты в положении 13;

16:2 - (92,122)-гексадекадиеновая кислота, 16:3 - (72,102,132)-гексадекатриеновая кислота, 18:2 - (92,122)-октадекадиеновая (линолевая) кислота, 18:2 - линолевая кислота;

18:3 - (92,122,152)-октадекатриеновая (а-линоленовая) кислота, 20:2 - (112,142)-эйкозадиеновая кислота,

20:4 - (52,82,112,142)-эйкозатетраеновая (арахидоновая) кислота, 22:2 - (132,162)-докозадиеновая кислота,

9,Ю-ЭОД - (122)-9,10-эпоксиоктадека-10,12-диеновая кислота; 9,10-ЭОТ - (10Е, 122)-9,10-эпокси-10,12-октадекадиеновая кислота; 9-ГПОД - (9£,10£,122)-9-гидропероксиоктадека-10,12-диеновая кислота; 9-ГПОТ - (95)-гидроперокси-(10£,122,152)-октадекатриеновая кислота; 9-ЛОГ - липоксигеназа, окисляющая углерод полиненасыщенной жирной кислоты в положении 9;

А1А08 - алленоксидсинтаза АгаЫс1орз1$ МаИапа; ёЫТР - смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов; ОтЬОХ1 - липоксигеназа-1 сои, ОтЬОХ2 - липоксигеназа-2 сои,

ОтЬОХЗ - липоксигеназа-3 сои,

ЬеА08 - алленоксидсинтаза томата {Ьусорег$1соп еясиЬШит); ЬеНРЬ - гидропероксидлиаза томата (Ьусорегягсоп езси1епШт)\ ЬиАОБ - алленоксидсинтаза льна-долгунца (Ыпит шНаНяятит Ь.); 1дЮЕ8 - дивинилэфирсинтаза льна-долгунца {Ыпит шиаИяБтит Ь.); МШРЬ - гидропероксидлиаза люцерны (МесИса%о ЬгипсаЫ1а)\ 2тА08 - алленоксидсинтаза кукурузы; 7шЬОХЗ - липоксигеназа-3 кукурузы,

а-кетол- 12-оксо-13-гидрокси-(92),(15г)-октадекадиеновая кислота;

АОС - алленоксидсинтаза;

АОЦ - алленоксидциклаза;

АФК - активные формы кислорода;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,

ГП - гидроперекись;

ГПЛ - гидропероксидлиаза;

ГХ/МС - газовая хромато-масс-спектрометрия;

Диазометан - К[-нитрозотолуол-4-сульфометиламид;

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДСН - додецилсульфат натрия,

ДЭС - дивинилэфирсинтаза,

ИПТГ - изопропил-Р-О-1 -тиогалактопиранозид;

КОЕ - колониеобразующие единицы;

лизоФХ - 2-линолеол-5и-глицеро-3-фосфохолин

ЛОГ - липоксигеназа,

Ме/ТМС - ТМС-производное метилового эфира;

МЛГ- 1-линоленоил-гас-глицерол (монолинолеоилглицерол)

НАД(Ф)Н - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный;

ОРС - открытая рамка считывания;

п.н. - нуклеотидное основание;

ПААГ — полиакриламидный гель;

ПНЖК - полиненасыщенная жирная кислота;

ПОГ - пероксигеназа;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

СК - салициловая кислота;

СРС - субстрат-распознающий сайт;

ТМС - триметилсилил;

Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан;

ФАД - флавинадениндинуклеотид;

ФЛ - фосфолипаза;

ФМН - флавинмононуклеотид;

ФМСФ - фенилметансульфонилфторид;

ЭАС - эпоксиалкогольсинтаза;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс.

ВВЕДЕНИЕ

Постановка проблемы и ее актуальность.

Липоксигеназный каскад является источником физиологически активных соединений - оксилипинов. У высших растений оксилипины отвечают за регуляцию роста, дифференциацию клеток, морфогенез, а также участвуют в индукции органогенеза и формировании системной устойчивости к различным экстремальным факторам и патогенам [Тарчевский, 2001, ПоЬ е? а1., 2002; БШшре, РешБпег, 2006]. Кроме высших растений оксилипины и ферменты их биосинтеза обнаружены у некоторых бактерий, бурых водорослей, красных водорослей, а также у представителей кораллов, хордовых и пластинчатых (ТпсИор1ах асИгаегет) [Ьее е/ а1, 2008].

Ключевыми ферментами липоксигеназного каскада, обеспечивающими разнообразие продуктов, являются липоксигеназы и ферменты уникального семейства СУР74 суперсемейства Р450. Липоксигеназы животных, водорослей, грибов и микроорганизмов используют в качестве субстратов Сго-жирные кислоты (например, арахидоновую кислоту), в то время как липоксигеназы растений в основном катализируют превращение С^-жирных кислот (линолевой и а-линоленовой кислоты). У многих видов растений, животных и микроорганизмов определены нуклеотидные последовательности генов липоксигеназ. Однако лишь некоторые из них клонированы с целью исследования функциональных белковых продуктов. Продукты первичной липоксигеназной реакции - гидроперекиси жирных кислот - преобразуются ферментами СУР74: алленоксидсинтазами (АОС), гидропероксидлиазами (ГПЛ), дивинилэфирсинтазами (ДЭС). Исследования последних лет показали, что большинство ферментов СУР74 являются дегидразами (АОС и ДЭС) и изомеразами (ГПЛ). В то же время, большое разнообразие неизученных генов СУР74 в геномах различных организмов свидетельствует о вероятности существования других типов катализа. К настоящему времени

охарактеризовано несколько десятков ГПЛ и АОС, в то время как клонировано лишь 5 генов ДЭС разных видов растений, принадлежащих двум родам. Существует мнение, что ферменты этого класса не имеют широкого распространения в природе. Тем не менее, круг организмов, обладающих дивиниловыми эфирами, неуклонно расширяется.

Интерес к оксилипинам обусловлен высокой практической значимостью веществ этого класса. Они являются сигнальными соединениями, обеспечивающими защитный ответ растений на клеточном, организменном, популяционном и межвидовом уровне, что может быть использовано в современном агропромышленном производстве. Оксилипины ответственны за многие свойства растений, характеризующие их в качестве сырья и пищевых продуктов. В настоящее время некоторые рекомбинантные ферменты липоксигеназного каскада нашли свое применение в биотехнологии для производства компонентов в парфимерной и пищевой промышленности. В этой связи изучение первичных детерминантов катализа ферментов липоксигеназного каскада, исследование молекулярной эволюции и систематики, разработка моделей катализа представляются актуальными.

Объем экспериментальных и теоретических данных, накопленный в разных лабораториях мира, позволил во многом выяснить критические параметры первичной и третичной структур активных центров ферментов. Существенно расширено представление о механизмах ферментативного катализа. Опираясь на данные рентгеноструктурного анализа, изучения молекулярной структуры и динамики белковых молекул и фермент-субстратных комплексов, во многих случаях удалось создать термодинамические модели протекания ферментативных реакций. В то же время, ферментативный катализ липоксигеназ и ферментов СУР74 остается недостаточно охарактеризованным.

В зависимости от региоизомеров продуктов реакции липоксигеназы растений разделяются на (95)- и (13£)-специфичные. Предложенные модели взаимодействия активного центра некоторых липоксигеназ с различными

жирными кислотами объясняют каталитические свойства 13-липоксигеназ, однако не согласуются с экспериментальными данными, полученными при изучении 9-липоксигеназ. Несмотря на большое разнообразие оксилипинов, в значительной степени изученными можно считать биосинтез и функции жасмоновой кислоты и ее производных, являющихся продуктами превращения 13-гидроперекисей жирных кислот. В отношении других оксилипинов, в частности, производных 9-гидроперекисей жирных кислот, объем знаний остается недостаточным. Неисследованным остается вопрос об участии в липоксигеназном каскаде растений других ненасыщенных жирных кислот, кроме линолевой и а-линоленовой, в том числе жирных кислот гексадеканового ряда, составляющих до 20 % от общего количества липидов в 16:3 растениях [Тагшевоп, Яе1(1 1971; Моп§гапё е? а1., 2005].

Особый интерес представляет молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада. Широкое распространение липоксигеназ предусматривает их первичное возникновение по отношению к цитохромам. Однако отсутствие какой-либо функциональной значимости гидроперекисей жирных кислот ставит вопрос о возможном включении липоксигеназ в существовавший ранее метаболический процесс с другим источником данного субстрата, в том числе неферментативного окисления ненасыщенных жирных кислот.

Филогения и систематика ферментов СУР74 остается на стадии разработки. Использование стандартных �

Информация о работе

Гоголев, Юрий Викторович
доктора биологических наук
Казань, 2013
ВАК 03.01.05

Диссертация

Ферменты липоксигеназного каскада - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Ферменты липоксигеназного каскада ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ферменты липоксигеназного каскада"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Гоголев, Юрий Викторович, Казань

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ферменты липоксигеназного каскада
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений