Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение липоксигеназного окисления биологически активных амидов арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение липоксигеназного окисления биологически активных амидов арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК . • ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ химии Ч мм. М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

"УДК 577.115.3 На правах рукописи

БОБРОВ Михаил Юрьевич

Изучение липоксигеназного окисления биологически активных амидов арахидоновой и зйкозапентаенозой

кислот

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1998

Робота выполнена в Институте биоорганической жим! ¿ш. ¡М.М.Шемякина и Ю.Л.ОкчпшшкСсь:* Российски Академии Наук Нау'чный руководитель: доктор химических наук В.В.Безуглов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Э.В. Дятловнцкш кандидат химических наук Н.В. Проказовп

Ведущая организация:

Институт физиологически активных вещее т {'А 1а

Защита состоится 24 июня 1998 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 прг Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, Москва ГСН-7, Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ Р> Автореферат разослан «&/» мая 1998 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор химических наук В.А.Несмеянс

Актуальность работы

В последнее зремя активно изучается новый класс липидных 6-орегуляторов - амидные производные жирных кислот (ЖК). Так, было показано, что некоторые амиды ЖК являются эффективными ингибиторами фосфолипазы А2 из различных источников. Из спинномозговой жидкости кошек был выделен амид олеиновой кислоты (названный олеамидом), обладающий способностью вызывать сон. Подобной активностью в различной степени обладали и некоторые синтетические аналоги олеамина. Этаноламид арахидоновой кислоты (анандамид), равно как и этаноламиды других ЖК, действуя как эндогенные лиганды каннабиноидных рецепторов, также могут быть отнесены к этому классу. Было также показано, что ткани ряда органов, прежде всего мозга, содержат системы синтеза и деградации этаноламидов и первичных амидов ЖК. Наличие механизмов амидирования ЖК в клетках предполагает возможность существования в биологических объектах амидов ЖК с биогенными аминами, например дофамином и серотонином, которые могут иметь биологическую активность, отличающуюся от активности исходных компонентов. Поэтому изучение биохимических свойств и биотрансформации амидированных производных ЖК является актуальной задачей современных исследований.

Известно, что жирные кислоты подвергаются в организме различным биохимическим преобразованиям. Превращение полиненасыщенных жирных кислот в оксигенированные производные - оксилипины под действием оксигеназ является наиболее распространенным путем их метаболических превращений в большинстве органов и тканей. Производные полиненасыщенных жирных кислот по карбоксильной группе также могут являться субстратами липоксигеназного окисления. Важно отметить, что к началу данной работы липоксигеназное окисление анандамида и других амидов жирных кислот практически не исследовалось и изучение такого окисления представляет актуальную задачу,

поскольку окисленные формы амидов, как и в случае с немодифици-рованными жирными кислотами, могут проявлять более высокую активность или иметь совершенно новые биологические свойства. Кроме того, в силу своей природы, амиды ЖК могут также взаимодействовать с ферментами биотрансформация ЖК в клетках, что может приводить к изменению их активности и соответственно модулировать клеточные функции. Таким образом, ашщные производные ЖК могут оказывать комплексное воздействие на процессы жизнедеятельности в клетке. Поэтому мы считали необходимым изучить липоксигеназное окисление биоактивных амидов жирных кислот в спленоцитах мышей, как примере клеток периферической каннаби-ноидной системы, а также изучить влияние этих соединений на липоксигеназное окисление эндогенной арахидоновой кислоты в указанных клетках.

Цель работы

Синтез этаноламидов арахидоновой и зйкозапентаенозой кислот, серотоминамида и дофаминамида арахидоноиой кислоты, изучение липоксигеназного окисления синтезированных соединений 15-липоксигеназой соевых бобоз и 12-липоксигеназой спленоцитов мышей, а также определение влияния этих соединений на липоксигеназное окисление эндогенной арахидоновой кислоты в спленоцитах.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые синтезированы серотонинамид и дофаминамид арахидоновой кислоты, разработаны удобные методы синтеза этаноламидов арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот, позволившие синтезировать меченные тритием в зтаноламидной и жирнокислотной части аналоги анандамида. Изучено липоксигеназное окисление синтезированных соединений. Впервые получены кинетические характеристики процесса окисления этаноламидов арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот, а также дофаминамида

арахидоновой кислоты. Выделены и охарактеризованы продукты окисления. Показано, что серотонинамид арахидоновой кислоты является необратимым ингибитором окисления арахидоновой кислоты 15-липоксигеназой соевых бобов.

Продемонстрировано модулирующее действие этаноламида арахидоновой кислоты, его 15-гидроксипроизводного и серотонинамида арахидоновой кислоты на липоксигеназное окисление арахидоновой кислоты в спленоцитах мышей. Показана амидазная активность спленоцитов по отношению к этаноламиду арахидоновой кислоты и серотонинамиду арахидоновой кислоты в спленоцитах мышей.

Этаноламид 15-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты и серотонинамид арахидоновой кислоты могут быть использованы в качестве регуляторов ферментов каскада арахидоновой кислоты, что делает их важным инструментом биохимических и биомедицинских исследований.

Апробация работы

Основные результаты диссертации были представлены на Симпозиуме "Полиненасыщенные жирные кислоты N-6 и N-3 семейств: медико-биологические, биохимические и биотехнологические аспекты" (Владивосток, 1995), и на IV Международном конгрессе по ненасыщенным жирным кислотам и эйкозаноидам (Эдинбург, 1997).

Публикации

По материалам диссертации имеется 7 публикаций.

Объём работы

Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста, включает 2 таблицы, 13 рисунков и состоит из обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части и выводов. Список литературы содержит 138 ссылок.

1. Синтез амидов жирных кислот

Синтезированы этаноламиды арахидоновой (анандамид, АА-ЕА) и ойкозапентаеновой (ЕРА-ЕА) кислот, а также серотонинамид (АА-5НТ) и дофаминамид (АА-ОА) арахидоновой кислоты (характеристики соединений представлены в Таблице 1). Структуры полученных соединений были подтверждены методами масс-спектрометрии и ЯМР- спектроскопии (структуры соединений изображены на Рис.1). Было применено два метода синтеза: метод смешанных ангидридов с изобутилхлорформиатом и метод с использованием 1,1 '-карбонилди-имидазола. Оба метода были одинаково эффективны. Этаноламиды арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот были получены с выходом 85% и 80%, серотонинамид и дофаминамид арахидоновой кислоты с выходом 45% и 40%, соответственно.

Таблица 1.

Соединение R, 2-тах (этанол) m/z [стр-ра иона] 'Н-ЯМР: 8, м.д. (мультиплетность, протоны, J, Гц)я

AA-5HT 0.30а 277 463 [М+Нр 0.90 (ЗН, т, Н20), 5.36 (8Н, м, Н5, Н6, Н8, Н9, H11, Н12, Н14, Н15), 5.55 (с, NH), 7.94 (с, NH ар.)

AA-DA 0.16* 282 440 [/W+H]*" 0.90 (ЗН, т, Н20), 5.37 (8Н, м, Н5, Н6, H8, H9, Н11, Н12, H14, Н15), 5.56 (с, NH)

АА-ЕА 0.566 - 347 [/Vf]г 0.91 (т, ЗН, H20), 5.35 (8Н, м, Н5, Н6, H8, Н9, Н11, Н12, H14, H15), 6.06 (с, NH)

ЕРА-ЕА 0.566 - 345 [М*]' 0.97 (т, ЗН, Н20), 5.37 (ЮН, м, H5, Н6, Н8, H9, Н11, H12, Н14, Н15, Н17, H18), 6.25 (1с, NH

15-НЕТЕ-ЕА 0.496 237 363 [Af]г 0.89 (ЗН, т, H20), 5.41 (5Н, м, H5, Н6, Н8, H9, Н11), 6.02 (1Н, с, NH), 5.73 дд, H14, J 15.4, J 6.6), 4.19 м, H15)

15-НЕРЕ-ЕА 0.496 240 361 [Л/f]г 0.93 (ЗН, т, Н20),5.40 (7Н, м, Н5, Н6, Н8, Н9, H11, H17, Н18), 6.00 (1H, с, NH), 5.7 (дд, H14J15.J7), 4.19 (м, Н15)

а) TCX: Kieselgel G60 (Merck, Германия), бензол-ацетон, 5:1.

б) TCX: Kieselgel G60 (Merck, Германия), хлороформ-метанол, 10:1.

в) ионизация быстрыми атомами (MS50TC, Kratos), матрица -нитробензиловый спирт.

г) плазменная десорбция, индуцированная 252 Cf (МСБХ, Украина).

д) BrukerWM-500.

---

АА-ЕА

ОН

15-НЕТЕ-ЕА

ынг^он

ЕРА-ЕА

АА-5НТ

он

АД-О А

Рис. 1. АА-ЕА - этаноламид арахидоновой кислоты (анандамид), ЕРА-ЕА -этаноламид эйкозапентаеновой кислоты, 15-НЕТЕ-ЕА - этаноламид 15-гид-роксиэйкозатетраеновой кислоты, 15-НЕРЕ-ЕА - этаноламид 15-гидрокси-эйкозапентаеновой кислоты, АА-5НТ - серотонинамид арахидоновой кислоты, АА-РА - дофаминамид арахидоновой кислоты

2. Ферментативное окисление аглидов жирных кислот

2.1. Ферментативное окисление АА-ЕА, ЕРА-ЕА и AÁ-DA 15-липоксигеназой соевых бобов

Ферментативное окисление амидов ЖК было изучено с использованием 15-липоксигеназы соевых бобов. При инкубации ананда-мида, этаноламида эйкозапентаеновой кислоты и дофаминамида арахидоновой кислоты с 15-липоксигеназой, выяснилось, что данные соединения являются субстратами для этого фермента. В результате окисления образовывались

1.4

1.2

продукты, которые после восстановления №ВН4 были идентифицированы, какэтаноламид 15-гидроксиэйкозатетраеновой

(15-НЕТЕ-ЕА), этаноламид 15- <4

о

гидроксиэйкозапентаеновой кислот (15-НЕРЕ-ЕА) и дофа- I 0-8 минамид 15-гидроксиэйкозатет- =Г пе

О 0.0

раеновой кислоты (15-НЕТЕ- ЕЕ ОА). Структура продуктов (Рис. С 04 1) была подтверждена методами ЯМР-спектроскопии и масс- о.2 спектрометрии.

При ферментативном окислении полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) образу-

214 234 254 274 294

Длина волны, нм

зи

ЮТСЯ гидроксипроизводные С Рис- 2- СпектРь| поглощения (1) 15-НЕТЕ-ЕА,

(2) 15-НЕРЕ-ЕА и (3)15-НЕТЕ-0А

сопряженными двойными связями, что приводит к появлению в УФ-спектре характерных полос поглощения с максимумом в интервале 234-240 нм. Продукты окисления анандамида и ЕРА-ЕА также имеют характерное для гидроксипроизводных поглощение при

длине волны около 234 нм, что использовалось для определения скорости их окисления. При этом для расчетов брали измеренные в биратном буфере (рН=9, Т=25°С) при 234 нм коэффициенты молярной экстинкции гидроксиэтаноламидов жирных кислот, поскольку в литературе для этаноламидов используются коэффициенты экстинкции соответствующих производных в органических растворителях. Значения коэффициентов составили 14000 для 15-НЕТЕ-ЕА, 20400 для 15-НЕРЕ-ЕА и 20800 для 15-НЕТЕ-ОА. УФ-спектры соединений показаны на Рис. 2.

Аппроксимацией экспериментальных точек по уравнению Михаэлиса-Ментен, получены кинетические параметры окисления арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот, анандамида, этаноламида эйкозапентаеновой кислоты и дофаминамида арахидоновой кислоты (значения параметров приведены в Таблице 2).

Таблица 2.

Исходное вещество Продукт Км мчМ V.», миМ/кин Упж/Ки мин'1

АА-ЕА 15-НЕТЕ-ЕА 3.2 66 2 1

ЕРА-ЕА 15-НЕРЕ-ЕА 49 9.0 1.8

АА-ОА 15-НЕТЕ-ОА 10.4 28.2 2.7

АА 15-НЕТЕ 15.5 35.4 :з

ЕРА 15-НЕРЕ 21.0 42.0 2.0

Зависимость начальных скоростей реакции от концентрации А ЕА, ЕРА-ЕА и АА-ОА представлена на Рис. 3. Все эксперимен-проводились при одинаковой концентрации фермента, котор составляла 1 мкг/мл.

Известно, что арахидоновая кислота является одним предпочтительных субстратов для 15-липоксигеназы. Как следует таблицы 2, при переходе от свободныхЖК к их амидным производнь наблюдается повышение сродства субстрата к ферменту: значен констант Михаэлиса изменяются в интервале от 21 мкМ для ЕРА, 3.2 мкМ для АА-ЕА, при этом наблюдается практичес пропорциональное падение значений Утах. В результат эффективность всех исследованных субстратов оказывает приблизительно одинаковой: Утал/Кт изменяется в интервале 1.8 2.7 мин1. Это свидетельствует о том, что амидирование свободы ПНЖК не приводит к ухудшению кинетических характерист образующихся соединений. Так как величина \/шах/Кт являет константой скорости при низких концентрациях субстрата, мож предположить, что незначительное количество анандамид образуемого тканями, не должно быть препятствием для е липоксигеназного окисления.

В процессе изучения ферментативного окисления этаноламид ЖК было отмечено, что при уменьшении молярного соотношен фермент-субстрат, в УФ-спектре реакционной среды появляют полосы поглощения, имеющие приблизительно 240 и 270 нм (Р| 4). Подобная картина наблюдается в аналогичных условиях и д арахидоновой кислоты, из которой образуются 5,15- и 8,1 дигидроксиэйкозатетраеновые кислоты. Это дает основан предположить, что в результате ферментативного окисления М01 образовываться дигидроксипроизводные этаноламидов ПНЖК. вышеизложенного следует, что 15-липоксигеназа соевых боб способна окислять некоторые амиды ЖК, с образованием моновозможно, дигидроксипроизводных.

[Этаноламид жирной кислоты], мкМ

-1-1-1-1-1-'.-1-г

О 10 20 30 40

[АА-ОА],мкМ

Рис. 3. Зависимость начальной скорости липоксигеназного окисления анандамида (0), этаноламида эйкозапентаеновой кислоты (♦) (А) и дофаминамида арахидоновой кислоты (В) от концентрации; кривые представляют собой аппроксимацию экспериментальных данных по уравнению Михаэлиса-Ментен.

0.5

о

О 0.4

0 5

1 0.3

3 о

§ 0.2 О

с

0.1

0.0

он

А)

^ ш

ЫН

он

он 5,15-сННЕТЕ-ЕА ОН О

8,15-снНЕТЕ-ЕА

220 2 40 260 280 300 320 340

Длина волны, нм

220 240 260 280 300 320 340

Длина волны, нм

4. УФ-спекгры реакционных смесей окисления 28 мкМ анандамида (А) и атаноламида апентаеновой кислоты (В) 15-липоксигеназой. Спектры сняты при различном молярном ношении субстрат - фермент (25 °С, 1ч.): 1)490, 2)245,3) 163, 4) 122,5) 93,6)81,7)61 ко для анандамида).

Эти обстоятельства имеют большое значение, поскольку рпзнообразнь-о продукты окисления амидов ЖК могут обладать специфической биологической активностью.

2.2. Ингибированио 15-липоксигоназы

серотонинамидом арахидоновой кислоты

Амид арахидоновой кислоты с серотонииом (5-гидрокси-триптаминамид арахидоновой кислоты) тоже первоначально рассматривался как субстрат для 15-липоксигеназы, но попытка обнаружить продукты его окисления не дала результатов. Чтобы определить характер взаимодействия зтого соединения с ферментом, исследовалось влияние серото-нинамида арахидоновой кислоты на липоксигеназное окисление арахидоновой кислоты - классического субстра-; та для 15-липоксигеназы.

Заходом реакции следи-. ли по УФ-поглощению на длине волны 234 нм. Добавление АА-5НТ к ферменту одновре-монносарахидоновой кисло-

0 СО 1Й 150 200

той не оказывало заметного

, 1Г.ТГ Время,(мин)

влияния на выход 15-НсТЕ, _ . ел/

" Рис. 5. Зависимость скорости липоксигенэз-

ТОГДЭ как предварительная ИН- ного окисления арахидоновой кислоты от вре-субвЦИЧ 15-липоксигеназы с мени инкубации форманта с АА-5НТ.

АА-5НТ приводит к снижению

выхода продуктов. Скорость реакции существенно зависит от времени прединкубгции 15-липоксигеназы (5 мкг/мп) с АА-5НТ (10 мкг/мл) (Рис. 5). Кривая зависимости имеет вид гиперболы. Из графика видно, что в течение 2.5 часов фермент практически полностью инакти-

1.25

1.С0

175

0.5

0.25

вируется. Важно отметить, что инкубация фермента со свободным серотонином в течение 50 минут не приводила к снижению выхода продуктов окисления. Удаление АА-5НТ диализом смеси против бо-ратного буфера в течение 20 часов при 6°С, не приводит к восстановлению активности 15-липоксигеназы в отношении арахидоновой кислоты. В контрольных экспе-

риментах, проводившихся в отсутствие ингибитора, активность фермента изменилась незначительно, что свидетельствует о необратимом характере ингибирования 15-ли-поксигеназы соевых бобов се-ротонинамидом арахидоновой э кислоты.

Ингибирующий эффект АА-5НТ также изучали на примере изменения концентрации кислорода в реакционной смеси * (Рис 6). Из графика видно, что при добавлении АА-5НТ к 15-липоксигеназе

0.25

0,2

0,15

0.1

1

10

15

20

25

Время(мин.)

происходит незначительное Рис. 6. Влияние серотонинамида арахидоно-

снижение концентрации Кие-

вом кислоты на концентрацию кислорода в

реакционном смеси с липоксигеназои соевых порода (позиция 1 на графи- бобов (объяснения см. в тексте).

ке). По-видимому, это вызвано стимуляцией активного центра фермента ацильной частью мо лекулы АА-5НТ, однако, в дальнейшем происходит ингибирова ние фермента, о чем свидетельствует отсутствие снижения кон центрации кислорода после добавления избытка линолевой кис лоты (позиция 2). Добавление порции свежей 15-липоксигеназь

'Совместно с профессором Пенсильванского университета США Е. Маневичем.

2

т

\

5

О

приводит к резкому падению концентрации кислорода в реакционной смеси (позиция 3). Результаты этого эксперимента являются еще одним аргументом в пользу необратимого характера инги-бирования. Можно предположить, что при взаимодействии АА-5НТ с липоксигеназой происходит образование активных форм кислорода, в результате чего может происходить ковалентное взаимодействие остатка серотонина с ферментом, с последующей его инактивацией.

Таким образом, в зависимости от структуры амидной части производных ПНЖК, эти соединения могут являться как субстратами, так и ингибиторами 15-липоксигеназы, что позволяет использовать их как инструмент для изучения механизма специфической ферментативной активности, а также в качестве регуляторов процессов ли-поксигеназного превращения ПНЖК в клетке.

3. Влияние амидов жирных кислот на липоксигеназное окисление эндогенной арахидоновой кислоты в спленоцитах мышей

3.1. Влияние анандамида на синтез 12-НЕТЕ

Известно, что спленоциты мышей синтезируют из эндогенной и экзогенной арахидоновой кислоты два липоксигеназных продукта: 12-гидроксиэйкозатетраеновую (12-НЕТЕ) и 12,20-дигидроксиэйкоза-тетраеновую (12,20-сКНЕТЕ) кислоты. Влияние анандамида на окисление эндогенной арахидоновой кислоты нами оценивалось по продукции 12-НЕТЕ, так как спленоциты постоянно синтезируют эту гид-роксикислоту, играющую, по-видимому, важную роль в функционировании клеток.

При инкубации со спленоцитами анандамид увеличивал количество 12-НЕТЕ, секретируемой в инкубационную среду (Рис. 7). Гидроксипроизводные самого анандамида не были обнаруже-

§

&

ш н-

ш £

305

260

220 -

180

140

100

60

4 б

АА-ЕА (мкг/мл)

10

Рис. 7. Влияние анандамида на синтез 12-НЕТЕ спленоцитами мышей в присутствии (1 и о отсутствие (2) ФМСФ.

ны в этих экспериментах.

Добавление к клеткам фенилметилсульфонилфторидг (ФМСФ), являющегося специфическим ингибитором амид гид ри лаз, практически полностью блокировало эффект аиандамид* (Рис. 7), который и в этих условиях не давал окисленных прог} водных. Таким образом, можно сделать вывод, что уайличони« синтеза 12-НЕТЕ под действием анандамида происходи г за счё его гидролиза до арахидоновой кислоты с образоьйнием допол нительного количества субстрата для 12-липоксигеназы, которая однако, не окисляет сам анандаммд. Длг, уточнения вышдоги'.сэд! ных эффектов нами были использованы меченные тртием а.ч« логи анандамида.

0.16-г

3! 30 п. 25

га

А)

Л л Б>

без ФМСФ

о

20

10 5 О

35 30 Ч- 25

1 2 3 4 5 6 7 8 зоны

0-

с ФМСФ

10 5 0

10 20 30 45 60

Время (мин.)

1 2 3 4 5 6 7 8 зоны

Рис. 8. Влияние ФМСФ на гидролиз анандамида спленоцитами мышей (А) и распределение радиоактивности при РТСХ продуктов метаболизма АА* - ЕА (Б) и АА -ЕА* (В).

Гидоолиз анандамида в спленоцитах. Для выяснения деталей действия анандамида на синтез 12-НЕТЕ спленоцитами мышей были синтезированы [3Н]-анандамиды, меченные по жирно-кислотной (АА*-ЕА, молярная радиоактивность 120 Ки/ммоль) и этаноламидной (АА-ЕА*, молярная радиоактивность 4.9 Ки/ммоль) частям*. Анализируя экстракты клеточной суспензии после инкубации с мечеными анандамидами, мы показали, что АА-ЕА* гид-ролизуется изолированными спленоцитами мышей с образованием [3Н]-этаноламина. Кроме того, было показано, что добавление в клеточную среду ингибитора амидгидролаз (ФМСФ) в значительной мере подавляет образование [3Н]-этаноламина спленоцитами (Рис. 8 А). Экстракцию клеточной суспензии проводили смесью хлороформ - метанол - уксусная кислота (6:5:1). В предварительных экспериментах было установлено, что при экстракции в данных условиях из среды, не содержащей клеток, коэффициент рас-

"Синтез меченных тритием аналогов анандамида осуществлен совместно с д.х.н. В.П.Шевченко (ИМГРЛН).

пределения анандамида между водным и хлороформным слоями составляет 0.156 ± 0.038. Степень гидролиза анандамида оценивалась как отношение значений радиоактивности в водном слое к сумме значений радиоактивности в водном слое и хлороформе, с учетом распределения анандамида между слоями.

Продукты метаболизма анандамида обнаруживали методом РТСХ. На рисунке 8 справа показаны значения радиоактивности (в процентах от общей радиоактивности, % о.р.) в зонах на хро-матографической пластинке; кривая отображает распределение вещества на РТСХ. На радиохроматограмме продуктов инкубации АА*-ЕА со спленоцитами (Рис. 8 Б), обнаружены пики, соответствующие анандамиду (31.52% общей радиоактивности, пик I) и 12-НЕТЕ (29.85% общей радиоактивности, пик II). После инкубации АА-ЕА* со спленоцитами, на радиохроматограмме кроме пика анандамида (Рис. 8 В, пик I), был обнаружен пик неизвестного соединения (15.69% общей радиоактивности, пик II), который, возможно, соответствует М-ацилфосфатидилэтаноламину, биосинтез которого описан в литературе.

Приведенные данные позволяют с уверенностью утверждать, что в спленоцитах мышей существует система метаболизма анандамида, под действием которой происходит образование свободной арахидоновой кислоты и этаноламина. Эти факты согласуются с данными литературы, где уже была продемонстрирована амидгидролазная активность клеток нервной ткани, а также гомо-генатов печени, семенников, почек, легких и селезенки по отношению к анандамиду. Таким образом, можно рассматривать анан-дамид и как своеобразную скрытую форму арахидоновой кислоты, которая может высвобождаться в результате гидролиза и превращаться в биологически активные оксилипины, например, 12-НЕТЕ. Важно отметить, что 12-НЕТЕ, помимо спленоцитов, синтезируется эндотелиальными, гладкомышечными клетками сосудов, островковыми клетками поджелудочной железы, клетка-

ми крови, желудочно-кишечного тракта, нервной ткани и клетками зародышевых оболочек человека. Эта кислота и ее метаболит 5,12-НЕТЕ (6-транс-лейкотриен В4), образованный 5-липоксигеназой, являются хемоаттрактантами для нейтрофилов и эозинофилов и присутствуют в высоких концентрациях при различных воспалительных и аллергических процессах.

Поскольку спленоциты относятся к клеткам, постоянно сек-ретирующим в среду 12-НЕТЕ и другие эйкозаноиды, изменение количества этих продуктов под действием этаноламидов ЖК, возможно, модулирует функции лимфоцитов и других клеток иммунной системы, находящиеся под контролем эйкозаноидов.

3.2. Влияние АА-5НТ на синтез 12-НЕТЕ

Ингибирующее действие АА-5НТ на соевую липоксигеназу позволило предположить наличие сходного эффекта АА-5НТ в отношении 12-липоксигеназы спленоцитов мышей. Влияние АА-5НТ на спленоциты оценивалось по продукции 12-НЕТЕ из эндогенной арахидоновой кислоты.

Инкубация клеток с АА-5НТ в течение 30 мин приводила к концентрационно зависимому росту синтеза 12-НЕТЕ. Исследования амидгидролазной активности показали, что прединкубация клеток с ФМСФ вызывает уменьшение продукции 12-НЕТЕ спле-ноцитами. Важно подчеркнуть, что при анализе экстрактов инкубационных сред методом ВЭЖХбыли обнаружены пики, соответствующие по времени удерживания АА-5НТ. Количество АА-5НТ (при всех концентрациях) в средах после прединкубации клеток с ФМСФ было приблизительно в 2.5 раза больше, чем после инкубации без ингибитора. Таким образом, можно предположить, что увеличение синтеза 12-НЕТЕ в этих экспериментах происходило, в основном, за счет гидролиза АА-5НТ и высвобождения свободной арахидоновой кислоты. Однако вид кривых, представленных

340 -1

60 н-.-1-1---.-'

0 2.5 5 7.5 10 12.5

АА-5НТ, мкг/мл

Рис. 9. Влияние М-5НТ на синтез 12-НЕТЕ спленоцитами мышей в отсутствие (1) и в присутствии (2) ФМСФ.

на рисунке 9, может свидетельствовать и в пользу комплексного взаимодействия АА-5НТ с клетками.

Так возможны взаимодействия АА-5НТ или 5-НТ, образовавшегося в результате гидролиза, с серотониновыми рецепторами на плазматической мембране и с внутриклеточными местами связывания с последующим выделением эндогенной арахидоновой кислоты. В наших экспериментах наблюдалось небольшое увеличение синтеза 12-НЕТЕ (на 13 %) клетками прединкубирован-ными со свободным серотонином, что говорит о возможности двойной стимуляции продукции 12-НЕТЕ за счёт гидролиза АА-5НТ. Этим можно объяснить тот факт, что после прединкубации с ФМСФ наблюдается повышение синтеза 12-НЕТЕ малыми концентрациями АА-5НТ. Также, учитывая описанные особенности ингибиро-вания 15-липоксигеназы соевых бобов, можно предположить, что

АА-5НТ конкурирует с эндогенной арахидоновой кислотой за связывание с 12-липоксигеназой. Таким образом, проявление ожидаемых эффектов ингибирования липоксигеназы становится заметным только при достаточно высоких концентрациях АА-5НТ, которые необходимы для взаимодействия с липоксигеназами, а также для насыщения, а возможно, и ингибирования амидгидролазы.

3.3. Влияние этаноламида 15-гидроксиэйкозатетра-еновой кислоты на синтез 12-НЕТЕ

Способность анандамида и других этаноламидов полиненасыщенных жирных кислот окисляться 12- и 15-липоксигеназами млекопитающих (данные литературы) позволяет предположить специфическую биологическую активность их гидроксипроизводных. Нами было исследовано влияние окисленного 15-липоксигеназой соевых бобов производного анандамида - 15-

15-НЕТЕ-ЕА (мкг/мл) 15-НЕТЕ (мкг/мл)

Рис. 10. Ингибирование синтеза 12-НЕТЕ 15-гидроксианандамидом (слева); на правом графике показана стимуляция синтеза 12-НЕТЕ 15-гидрокси-эйкозатетраеновой кислотой.

НЕТЕ-ЕА на синтез 12-НЕТЕ в спленоцитах мышей. В отличие от анандамида, его 15-гидроксипроизводное оказывало на спленоциты противоположное действие: снижало продукцию 12-НЕТЕ (Рис. 10), при этом 15-НЕТЕ-ЕА не подвергался действию амидгидролазы, что было показано ВЭЖХ-анализом продуктов инкубации. Поскольку 15-НЕТЕ не является продуктом окисления арахидоновой кислоты в спленоцитах, то при гидролизе 15-НЕТЕ-ЕА до 15-НЕТЕ и этаноламина можно было бы ожидать концентрационно зависимый рост уровня 15-НЕТЕ, однако этого на хроматограммах не наблюдалось. Устойчивость 15-НЕТЕ-ЕА к амидгидролазе косвенно подтверждается и тем, что 15-НЕТЕ в противоположность 15-НЕТЕ-ЕА стимулировала синтез 12-НЕТЕ из эндогенной арахидоновой кислоты (Рис. 10). Поэтому при гидролизе 15-НЕТЕ-ЕА спленоцитами можно было бы также ожидать увеличения синтеза 12-НЕТЕ.

Из приведенных результатов следует, что 15-НЕТЕ-ЕА, в сравнении с анандамидом и 15-НЕТЕ, имеет индивидуальный спектр активности в отношении липоксигеназы и амидазы спленоцитов. Известные примеры межклеточного биосинтеза оксилипинов позволяет предположить существование подобных путей образования гидроксипроизводных этаноламидов ЖК, способных оказывать модулирующее действие на функции различных клеток. Наши данные могут свидетельствовать в пользу этого предположения, поскольку 15-НЕТЕ-ЕА устойчив к действию амидгидролаз и оказывает супрессорное влияние на липоксигеназное окисление эндогенной арахидоновой кислоты спленоцитами мышей.

Таким образом, можно заключить, что анандамид и АА-5НТ самостоятельно не стимулируют синтез 12-НЕТЕ и не являются субстратами для 12-липоксигеназы. По-видимому, модификация арахидоновой кислоты соответствующими аминами является критическим обстоятельством для проявления активности 12-

липоксигеназы спленоцитов мышей. Данные обстоятельства согласуются с результатами работ, где была показана избирательность окисления анандамида 12-липоксигеназами лейкоцитов свиньи и эритроцитов человека. Так, для 12-липоксигеназы лейкоцитов свиньи анандамид являлся хорошим субстратом, однако 12-липоксигеназа эритроцитов человека проявляла незначительный уровень окисления.

Из наших результатов также видно, как изменения в различных частях молекулы амида жирной кислоты влияют на активность другого фермента - гидролазы амидов ЖК. Гидроксилирование пятнадцатого атома углерода арахидоновой кислоты приводит к возникновению устойчивости 15-НЕТЕ-ЕА к действию амидгидролазы. Эта особенность открывает возможность моделировать молекулы, устойчивые по отношению к системам метаболизма организма и обладающие более длительным действием.

4. Выводы

1. Разработаны удобные методы синтеза этаноламидов арахидоновой и эйкозалентаеновой кислот, позволившие синтезировать меченные тритием в этаноламидной и жирнокислотной части аналоги анандамида. Впервые синтезированы серотонинамид и дофаминамид арахидоновой кислоты.

2. Впервые изучены кинетические параметры липоксигеназного окисления этаноламидов арахидоновой, эйкозалентаеновой кислот и дофаминамида арахидоновой кислоты 15-липоксигеназой соевых бобов. Показано, что амидирование полиненасыщенных жирных кислот не приводит к ухудшению кинетических характеристик образующихся соединений.

3. Показано, что в результате окисления этаноламидов арахидоновой, эйкозалентаеновой кислот и дофаминамида арахидоновой кислоты 15-липоксигеназой соевых бобов образуются 15-гидроксипроизводные соответствующих соединений, а в определенных условиях - продукты двойного липоксигеназного окисления этих амидов. Установлено, что серотонинамид арахидоновой кислоты является необратимым ингибитором 15-липоксигеназы соевых бобов.

4. Изучена биотрансформация анандамида и серотонинамида арахидоновой кислоты в спленоцитах мышей. Установлено, что эти соединения подвергаются гидролизу с высвобождением арахидоновой кислоты. Показано модулирующее влияние серотонинамида арахидоновой кислоты, анандамида и его 15-гидроксипроизводного на липоксигеназное окисление арахидоновой кислоты в спленоцитах мышей.

Основные результаты диссертации изложены в следующих

публикациях:

1. М.Ю. Бобров, Е.В. Фомина-Агеева, Д.В. Куклез, Г.Н. Зинченко, Г.С. Когтева, В.В. Безуглов. Липоксигеназное окисление этаноламида арахидоновой кислоты. - Тезисы докл., -Симпозиум "Полиненасыщенные жирные кислоты N-3 и N-6 семейств: медико-биологические, биохимические и биотехнологические аспекты", Владивосток, 1995.

2. М.Ю. Бобров, Г.С. Когтева, Е.В. Фомина-Агеева, Г.Н. Зинченко, Н.М. Грецкая, Д.В. Куклев, В.В. Безуглов. Кинетика окисления зтаноламидов арахидоновой (анандамида) и эйкозапентаеновой кислот соевой 15-липоксигеназой. - Биоорганическая химия.

1996, Т. 22, № 10-11, с. 875-877.

3. В.В. Безуглов, М.Ю. Бобров, Г.С. Когтева, Е.М. Маневич. Серотонинамид арахидоновой кислоты - необратимый ингибитор соевой 15-липоксигеназы. - Биоорганическая химия. 1996, Т. 22, №10- 11, с. 878-880.

4. С.И. Рогов, В.П. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Н.Ф. Мясоедов, В.В. Безуглов, М.Ю. Бобров, В.М. Федосеев. Использование метода твердофазного гетерогенного каталитического гидрирования для получения меченного тритием этаноламина и селективно меченных тритием зтаноламидов арахидоновой, эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот. - Радиохимия.

1997, Т. 39, №5, с. 458-463.

5. V.V. Bezuglov, Y.M. Manevich, A.V. Archakov, M.Yu. Bobrov. Artificially fimctionolized polyenoic fatty acids as modulators of soybean lipoxygenase. - Prostaglandins, leukotrienes and essential fatty acids. 1997, V. 57, № 2, p. 261.

6. B.B. Безуглов, E.M. Маневич, М.Ю. Бобров, Д.В. Куклев, Г.Н. Петрухина, В.А. Макаров, Г.А. Бузников. Искусственно функциснализированные полиеновые жирные кислоты - новые липидные биорегуляторы. - Биоорганическая химия. 1997, Т. 23, №3, с. 211-220.

7. В.В. Безуглов, М.Ю. Бобров, A.B. Арчаков. Биоактивные амиды жирных кислот. - Биохимия. 1998, Т. 63, № 1, с. 27-37.

Соискатель