Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кластогенез и антикластогенез в клетках больных периодической болезнью

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Кластогенез и антикластогенез в клетках больных периодической болезнью"

На правах рукописи

МКШШН АСМИК СУРЕНОВНА

УДК 575:591

КЛЛСТОГЕНЕЗ И АНТШШСТОГЕНЕЗ В КЛЕТКАХ БОЛЬНЫХ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ

03.00.15 - Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи МЕЖЛУМЯН АСМИК СУРЕНОВНА

УДК 575:591

К1АСТ0ГЕНЕЗ И АНТИКЛАСТОГЕНЕЗ В КЛЕТКАХ БОЛЬНЫХ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ

03.00.15 - Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена на кафедре генетики и цитологии биологического факультета Ереванского государственного университета

Научные руководители: доктор биологических наук,профессор

Р.М.АРУТЮШШ

кандидат биологических наук, доцент Т.Ф.САРКИСЯН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,профессор

Ю.А.МАГАКЯН

кандидат биологических наук.ст.н.с. И.В.СИМОНЯН

Ведущее учреждение - Институт медицинской радиологии МЗ

Республики Армения

Защита состоится " G " 1992 г. в "_" час.

на заседании специализированного ученого совета К 055.01.04

по генетике при Ереванском государственном университете по адресу: 375049, Армения, г.Ереван-49,' ул. Чаренца,8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЕГУ Автореферат разослан " 3 "СШ/С&ОЯ^ " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г.МУГНЕЦЯН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование антикластогеиного эффекта (снижение уровня патогенетических нарушений, индуцированных мутагенами) является одним из важнейших аспектов ангимутагенеза, включающего и вопросы защиты клеток от генных мутаций. Существует определенная система изучения антикластогенеза, которая основана на применении специальных тест-систем для оценки защитного действия в клетках человека и млекопитающих ( Get>hart , Aru-tyunyan , 1991). Количественная оценка антикластогенных эффектов в значительной степени зависит от действия эндогенных и экзогенных факторов, изменяющих чувствительность клеточных тест-систем.

Одним из наиболее перспективных подходов к пониманию механизмов антикластогенеза является изучение феномена протекторного эффекта в клетках лиц с различными заболеваниями, относящихся к группам генетического риска.

К группе генетического риска можно отнести периодическую болезнь (ПБ) или семейную средиземноморскую лихорадку - заболевание,чаще всего,аутосомно-рецессивное, которое может иметь также доминантные формы наследования. ПБ относится к группе заболеваний, для которых характерно нарушение цитогенетического гомеоста-за ( Emerit , 1990).

В настоящее время имеется достаточное количество данных о важной роли изменения процессов метаболизма арахидоновой кислоты в этиологии ПБ. Метаболиты арахидоновой кислоты играют важную роль в патогенезе не только ПБ, но и многих аутоиммунных заболеваний ( Emerit , Miohelson , 1982). В тоже время, ингибиторы циклооксигеназ и липоксигеназ, участвующих в процессах метаболизма арахидоновой кислоты в клеточных культурах, полученных от людей с подобными заболеваниями, обладают антикластогенным эффектом ( Emerit et al ., 1983). Поэтому новой моделью для исследования этого феномена может служить культура лимфоцитов периферической крови и плазма больных ПБ.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение механизмов антикластогенеза и кластогенеза при ПБ и проверка применимости этой модели к теории Emerit (1990) о кластогенном факторе, выделяемом из крови больных при многих аутоиммунных заболеваниях.

Для реализации сформированной цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Выявление потенциальных цитогенетических изменений в культурах лимфоцитов больных ПБ по сравнению со здоровыми донорами;

2. Сравнительное изучение действия кластогенов и антикласто-генов в клетках больных ПБ и здоровых доноров;

3. Исследование влияния модификаторов метаболизма арахидоновой кислоты и плазмы больных ПБ на уровни цитогенетических изменений в культуре лимфоцитов периферической 1фови здоровых доноров;

4. Анализ распределения разрывов хромосом в клетках культур лимфоцитов в обеих изученных группах по сравнению с теоретическими распределениями.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые изучены механизмы повышения уровней аберраций хромосом при ПБ. Выявлено действие кластогенного фактора плазмы крови больных ПБ на культуры лимфоцитов здоровых доноров, что приводит к повышению количества клеток с хромосомными аберрациями.

При обработке клеток больных ПБ кластогенами (алкилирующим агентом фотрином и антибактериальным препаратом диоксидином) и антикластогенами (противовирусным белком - интерфероном, лекарством с антирадикальным действием — биметилом и тиоловым радиопротектором гаммафосои ) выявлены различия в чувствительности хромосом больных ПБ к фотрину, чего не наблюдалось при обработке диоксидином. Показаны различия интенсивности антикластогенеза между культурами лимфоцитов доноров и больных ПБ. При этом два ангикластогена с антирадикальным механизмом действия в клетках больных ПБ не проявили защитного эффекта.

Выявлены различные закономерности эффектов действия ингибиторов окислительного метаболизма арахидоновой кислоты, к которым относятся аспирин и бедигин. Бедитин оказывал протекторный эффект только в присутствии арахидоновой кислоты, добавленной к плазме больных ПБ. Аспирин,в отличие от бедитина, обладал защитным эффектом только в тех случаях, когда к плазме больных арахидоновая кислота не добавлялась.

Получены данные, свидетельствующие о соответствии экспериментального распределения разрывов распределениям Пуассона и геометрическому. В то же время, в большинстве экспериментальных вариан-

тов, как в культурах здоровых доноров, так и у больных ПБ показано достоверное различие отрицательного биномиального распределения с параметром ® = 2.

Данные, полученные на модели клеток больных ПБ, позволяют предложить новый подход к изучению эффекта антикластогенов при различных наследственных заболеваниях с нарушениями иммунитета. Разработана тест-система, представляющая синтез теории Етег1Л (1990), биохимического анализа кластогенного фактора и количественных аспектов антикластогенеза. Предложенный методический подход, с учетом антикластогенных эффектов при действии специфических для данного заболевания метаболитов и антиметаболитов, имеет прямой практический выход. На основе сравнения эффективности ан-тикластогенного действия ряда антиметаболитов становится возможным дифференцировать различные блоки метаболизма арахидоновой кислоты для каждого конкретного случая заболевания. Подобный практический выход из исследований в области антикластогенеза рекомендуется впервые.

Положения, выносимые на защиту:

Обнаружение повышенных спонтанных уровней цитогенетических повреждений, хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов (СХО), в клеточных культурах больных ПБ.

Выявление более высокой чувствительности культур лимфоцитов периферической крови больных ПБ к изученным экзогенным веществам по сравнению с культурами доноров.

Проявление различий в эффективности антикластогенов в культурах лимфоцитов больных ПБ и доноров.

Наличие кластогенного эффекта плазмы больных ПБ при ее добавлении к культурам лимфоцитов здоровых доноров.

Доказательство цитогенетической активности веществ, участвующих в процессах метаболизма арахидоновой кислоты, измененной при ПБ, а также ингибиторов этих процессов.

Использование анализа распределения хромосомных повреждений по клеткам при действии изучаемых факторов кластогенеза и антикластогенеза для выявления возможного смещения популяций лимфоцитов по клеточному циклу.

Апробация работы.Основные материалы диссертации доложены на совместном'заседании Научного Совета по проблемам генетики и се-

лекции АН СССР (Вильнюс, 1990) и на конференциях профессорско-преподавательского состава ЕГУ (1989, 1990).

Структура и объем работы.Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения, общего заключения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на страницах машинописи, содержит рисунков и таблиц. Список литературы включает наименований.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для получения культур лимфоцитов служила цельная периферическая кровь больных ПБ и .здоровых доноров. Исследованы клеточные культуры от 16 больных ПБ и 16 здоровых доноров.

Культивирование лимфоцитов. Лимфоциты периферической щ)ови культивировали по методике Hungerford (1955). Для каждой культуры использовали по 6 мл питательной среды Игла, 1.5 мл сыворотки крупного рогатого скота и 100 ед/мл пенициллина. Клетки стимулировали к бласттрансформации при добавлении 0.02 мл фитогемаг-глюгиняна р ( Difco lab, , usa ) на 10 мл культуры. Культуры инкубировали при температуре 37°С в течение 741 часов; за 2 часа до фиксации для задержки митоза на стадии метафазы добавляли колцемид (в конечной концентрации 0.3 /*г/мл). Перед фиксацией культуры обрабатывали гипотоническим раствором 0.075 M КС! в течение IQ минут при 37°С. Процесс фиксации осуществлялся раствором метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1.

В части экспериментов плазму крови трех больных ПБ добавляли в культуры лимфоцитов трех здоровых доноров. В качестве контроля использована плазма крови трех здоровых доноров, добавленная к культурам лимфоцитов доноров. Для получения плазмы крови культуры лимфоцитов центрифугировали при 2000 об./мин. в течение 15 мин. Плазму отсасывали по 0.5 мл и добавляли в культуры клеток здоровых доноров до начала их культивирования.

Окрашивание препаратов. Для анализа уровней хромосомных аберраций препараты окрашивали азур-эозином в течение 5-10 мин.

Для оценки уровней СХО на 24 часу культивирования добавляли 5-бромдезоксиуридин (БДУ; в конечной концентрации 10 /д г/мл. Препараты окрашивали по методу Perry , Wolff (1974).

Методы онтогенетического анализа

Препараты анализировали с помощью светового микроскопа Zeiss Тазз Plus при увеличении ой. ЮОх, ок. Юх, при масляной иммерсии.

Для учета хромосомных аберраций анализировали по 100-300 метафаз первого деления от каждой культуры. При этом учитывали следующие цитогзнетические показатели: частота аберрантных клеток (в %), общее число разрывов, число одиночных и парных разрывов хромосом, число хроматидных и хромосомных обменов, общее число структурных аберраций хромосом на 100 меток. Для подсчета числа СХО на одну клетку анализировали из каждой культуры по 25-50 метафаз второго митоза. Всего в данной работе проанализировано около 15000 метафаз.

Описание использованных веществ. В качестве кластогенов были использованы следующие вещества:

1. Фотрин (2,2,4,6-пентаэтиленимино-6-морфолиноциклотрифос-фатазтриен) - пентафункциональный алкилирующий агент, цитоста-тик (в концентрация 0.5*10~^М);

2. Диоксидин (1,4-диокси-2,3-бис(оксиметил) оксалин) - антибактериальное средство, индуктор свободных радикалов кислорода (в концентрации 13.5*10""%).

В качестве антикластогенов были использованы:

1. Интерферон - человеческий лейкоцитарный рекомбинантный <Х2-ИФ-противовирусный белок (в концентрации 37 МЕ/мл);

2. Бемитил - (2-этилтиобензамидазол гидробромид) - психостимулятор и иммуностимулятор, ингибитор образования свободных радикалов'кислорода (в концентрации 0.7*10 М);

3. АПАЭТФ-2,3 или гаммафос ( s -2-3-аминопропиламиноэтил-тиофосфат), эффективный тиоловый радиопротектор (в концентрации 0.7x10^).

Изучены цитогенетические эффекты следующих метаболитов и ингибиторов цикла арахдцоновой кислоты:

1. Арахидоновая кислота - ненасыщенная жирная кислота (в концентрации 3*10~%);

2. Аспирин (ацетилсалициловая кислота) - ингибитор биосинтеза производных' арахидоновой кислоты (в концентрации КР%);

3. Бедитин ( сС2-адреноблокатор), производное бензодиоксана-

селективный ингибитор 5-липоксигеназного пути метаболизма ара-хидоновой кислоты (в концентрации 10~®М).

Исследованные вещества были любезно предоставлены Г.Д.Засу-хиной (Институт общей генетики Российской АН), С.Б.Середениным и А.Д.Дурневым (НИИ фармакологии Российской АМН), Э.С.Габриеля-ном (кафедра фармакологии Ереванского медицинского института)и А.Г.Паносяном (Институт медицинской радиологии МЗ Республики Армения).

Схемы введения веществ

Исследуемые кластогены и антикластогены вводили в культуры на стадиях 0- -р э клеточного цикла, за 26 часов до фиксации (рис. I).

+ФГА +ктту +кластогены

+антикласто- ФйксацйЯ

_ -I_I_I_»_

О ч. 24 ч. 48 ч. 74 ч.

Рис. I. Схема введения мутагенов и протекторов

Для изучения класгогенного эффекта плазмы больных ПБ эксперименты выполнены по следующей схеме (рис. 2).

+вещесгва

+плазма +ФГА +БДУ Фиксация

больных

-Л----------1______I_и

О ч. ,1ч. 24 ч. 74 ч.

Рис. 2. Схема введения плазмы крови, арахидоновой кислоты и ингибиторов ее метаболизма

Статистический анализ. При статистической обработке использовали программу statgraph на компьютере IBM, а также оригинальную компьютерную программу ожидаемых теоретических распределений.

Для анализа распределения хромосомных повреждений по клеткам использованы методические приемы, разработанныеН.П.Бочковым и соавт. (1972). С этой целью экспериментальные распределения сравнивали со следующими теоретическими распределениями:

I. Пуассоновское распределение: х _т

Р (х) - -2 ' 6

зс1

2. Отрицательное биномиальное: р (х) = с * -i • gmCi-e)1

в двух вариантах:

отрицательное биномиальное распределение с m =1, т.е. геометрическое распределение и отрицательное биномиальное с

m =2.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ В КЛЕТКАХ БОЛЬНЫХ ПБ В СРАВНЕНИИ СО ЗДОРОВЫМИ ДОНОРАМИ

Проведен онтогенетический анализ уровней хромосомных аберраций и СХО в культурах лимфоцитов периферической 1фови десяти больных периодической болезнью. Выявлено повышение количества хромосомных аберраций, в среднем равное 5.84+0.20$, что значительно выше контрольного уровня в группе 10 здоровых доноров, который равен 1.70+0.28$ (р< 0.001). Данные по типам и распределению хромосомных аберраций в клетках больных ПБ и здоровых доноров представлены в таблицах I и 2. У больных ПБ число СХО на клетку составило 6.79+0.31, то есть достоверно не отличается от уровня СХО у здоровых доноров, равного.7.71+0.66 Ср> 0.05). Таким образом,в клетках больных ПБ выявлено определенное повышение спонтанного уровня хромосомных аберраций, но не СХО.

2. ИЗУЧЕНИЕ АНТИКЛАСТОГЕННОГО ЭФФЕКТА У БОЛЬНЫХ ПБ

Культуры лимфоцитов периферической крови трех больных ПБ и трех здоровых доноров обрабатывали кластогенами и антикласто-генами на 48-м часу от начала культивирования, за 26-28 часов до фиксации.

Полученные результаты представлены в таблице 3 и на рис. 3, 4. Показаны достоверные различия в чувствительности хромосом к изученным соединениям между больными ПБ и здоровыми донорами.

В клетках больных ПБ, обработанных бемитилом, уровни аберрантных метафаз были равны 5.58$, что более, чем в 2 раза превышает уровень аберрантных метафаз в клетках доноров, равный 3.10$ (р < 0.05). В присутствии интерферона уровень аберрантных клеток повышался у больных до 10.32$, а у доноров до 7.00$ (р<0,05). Гаммафос повышал уровень аберрантных клеток у больных до 16.56^, а у доноров до 8.33% (р<0,01). Обработка клеток мутагеном диоксидином оказала практически одинаковый кластогенный эффект в обеих группах. Уровни аберрантных

Таблица I

Частота хромосомных аберраций и СХО в культурах лимфоцитов больных ПБ

Вариант Проем. Клеток Аберрации на < оо клеток Число

клеток с Одиноч• Парных Обменов Структ- СХО

аберр,к разрыв, разрыв. аберр. на кл

I. 198 II .41 3-80 7-61 0-00 II .41 14.04

2- 140 4.29 0.71 5-00 0-00 5.71 -

3- 250 5.20 1.20 4.00 0-00 5-20 10.00

4- 300 5.00 1.67 3-66 0-00 5.33 10.95

5- по 7-2? 1-82 5-45 0-91 8.18 -

6- 100 4-00 2-00 2.00 0-00 4-00 6.83

7. 300 4.33 3-33 1.00 0-00 4-33 5.26

8- 300 8.67 4-67 4-66 о.оо 9-33 5.33

9- 300 3.67 0-67 3-33 0.00 4-00 3.76

Ю- 240 9-58 4-58 5.00 о.оо 9.58 -

Таблица 2

Частота хромосомных аберраций и СХО в культурах лимфоцитов доноров

Вариант Проем. Клеток Аберрации Еа 1 оо клеток Число

клеток с Одиноч■ Парных Обменов Структ. СХО

аберр,'/. разрыв, разрыв. аберр. на кл

I. 100 2.00 1-00 1.00 0.00 2-00 -

2- 100 1.00 0-00 1.00 о.оо 1.00 1.80

3- ТОО 1.00 0-00 I -00 . 0.00 1.00 7.90

4- ТОО 1.00 1-00 0-00 0.00 1.00 12.00

5- ТОО 2.00 0-00 2-00 о.оо 2-00 5.30

6- ТОО 4-00 2-00 2.00 0.00 4.00 7.33

7- 100 2.00 1.00 1.00 0.00 2-00 7.13

8- по 1.00 1.00 0.00 0.00 1.00 8.47

9- 300 1-67 0-67 1-33 0.00 1-67 7.34

Ю- 300 1-33 0-67 0-66 0.00 1-33 6.23

Таблица 3

Частота хромосомных аберраций и СХО в культурах лимфоцитов доноров и больных ПБ после обработки кластогенами и антикластогенами

Вариант Проем - Клеток Аберрации на 1 оо клеток Число

клеток с Одиноч - Парных Обменов Структ. СХО

аберр,'/. разрыв, разрыв. аберр. на кл

Культуры лимфоцитов здоровых доноров

К 70 4.29 0.00 5.70 0. 00 5.70 4. .00

БМ 260 3. 1 0 2.21 1 .77 0.00 3.98 3. 75

ИФ 100 7.00 1 .00 8.00 0.00 9.00

ГФ 300 8. 33 2.00 6.67 0.00 8.67 2 . 47

да 160 17. 50 3. 1 3 1 3.75 0.63 17.51

ДК-*БМ 183 3.82 1 .09 2.73 0.00 3.82 6. 89

ДК-^Ф 1 28 4. 69 3. 1 2 1 .56 0.00 4.68

ДК+ГФ 237 5.07 0.34 4.65 0.00 5.49 6. 78

ФТ 200 20.50 6.00 14.50 0.50 21 .00 4. 61

ФТ-*БМ 205 8.78 2.93 6.35 0.00 9. 28 1 . 66

ФТ-® 21 2 8.96 4.22 5.68 о.оо 9.90

ФТ+ГФ 120 1 1 .67 5.00 9. 1 7 о.оо 14. 17 1 2. 26

Культуры лимфоцитов больных ПБ

к 270 2 .96 0.74 2.59 0.00 3. 33 6. 25

БМ 21 3 6.58 2.82 3.76 0.00 6.58 6 • 68

ИФ 339 10.32 3.24 8.55 0.00 1 1 .79 6. 58

ГФ 320 16.56 3.75 1 4.06 0. 31 18.13 6. 64

ДК 400 1 4.75 4.50 1 3. 25 0.50 1 8. 25 1 1 . 83

ДК-'БМ 343 1 1 .63 3.21 10.76 0.00 1 3.97 1 1 . 10

ДК-ИФ 300 1 5.00 3.67 1 3. 33 0.67 1 7.67 1 1 . 25

ДК+ГФ 280 1 4.29 3.93 1 2.29 0. 00 16.22 9. 75

ФТ 1 00 33.00 1 5. 00 30.00 1 .00 46.00 16. 80

ФТ+БМ 103 33.00 1 1 .65 39.80 1 .95 53.40 8. 27

ФХчйФ 395 17.22 11.14 1 4.43 0.76 26. 33 17. 79

ФТ+ГФ 280 37.85 26.43 52. 1 3 5.72 84.28 18. 43

Обозначения: К-контроль ,БМ-0.7*10 4М,ИФ-37 МЕ/МЛ ,ГФ-0.7x1 о 4М , ДК- 13.5х10_4М, ФТ- 0.5хЮ-5М

ФТ+ГФ КШ ФТ+Ш Ш2 ФТ+БМ

Ш дк+го

КШ ДК+ИФ Ш ДК+БМ

ЕЯ ШЛ БМ

К

Рис.3.Уровни аберрантных метафаз, индуцированных в клетках больных ПБ.

401

ФТ+ГФ

В ФТ+®

Ш ФТ+БМ

ш ФТ

ДК+ГФ

в ДК+ИФ

ША ДК+БМ

шя дк

^ ГФ

в №

УТЛ БМ

гп К

Рис. 4.Уровни аберрантных метафаз,индуцированных в клетках доноров.

метафаз повышались до 17.50$ у доноров и до 14.75$ у больных (р>0,05). Защитный эффект антикластогенов был выявлен в клетках доноров, обработанных диоксидином, в отличие от клеток больных ПБ. В клетках доноров бемигил снижал уровни аберрантных метафаз индуцированные диоксидином до 3.82$ (р< 0.001), интерферон - до 4.69$ (р< 0.001), гаммафос - до 5.07$ (р<0.001).

В культурах лимфоцитов больных уровни аберрантных метафаз в вариантах, обработанных диоксидином в присутствии бемитила, составили 11.63$, в присутствии интерферона - 15.00$, и в присутствии гаммафоса - 14.29$ (р> 0.05). Аналогичные данные были получены при оценке средней частоты структурных аберраций и отдельных типов хромосомных аберраций. Таким образом, протекторный эффект исследованных антикластогенов в клетках больных ПБ, обработанных диоксидином, не наблюдался.

Фотрин обладал сильным кластогенным эффектом в культурах клеток доноров и больных ПБ, вызывая повышение количества аберрантных клеток в среднем до 20.50$ у доноров и 33.00$ у больных. Уровни структурных аберраций у доноров повышались в среднем до 21, а у больных - до 46 из расчета на 100 клеток (р< 0.001). В основном, подобные различия между уровнями цитогенетических нарушений у больных и здоровых лиц вызваны образованием большого количества парных разрывов, в среднем, составляющих у доноров 14.5, а у больных 30 на 100 клеток (р<0,01).

В культурах клеток здоровых доноров, обработанных,фотрином, защитный эффект исследованных антикластогенов был/Достоверен. Бемитил снижал уровни аберрантных метафаз до 8.78$ (рс0.001), интерферон - до 8.96$ (р< 0,001), гаммафос - до 11.67°$ (р<0.05). Частота структурных аберраций на 100 клеток, индуцированных фот-рином, составляла в вариантах с бемитилом 9.28 (р< 0,001), интерфероном - 9.90 (р*0.01), гаммафосом - 14.17 (р-с 0.05).

Однако, подобная закономерность не наблюдалась при проведении онтогенетического анализа в культурах клеток больных ПБ. Интерферон оказался единственным антикластогеном, который оказал достоверный защитный эффект при обработке клеток фотрином, снижая уровни аберрантных метафаз с 33.00$ до 17.22$ (р< 0.001). Два других антикластогена, бемитил и гаммафос не проявили защитного эффекта в клетках больных.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о четких различиях в чувствительности хромосом к кластогенам в культурах лимфоцитов больных ПБ и здоровых доноров. Исследованные антикластогены, в основном, не оказывали защитного эффекта в клеточных культурах больных ПБ.

3. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДЕЙСТВИЯ МОДИФИКАТОРОВ МЕТАБОЛИЗМА АРАХВДОНОВСЙ КИСЛОТЫ ПРИ ПБ

Изучено комбинированное влияние плазмы больных ПБ с метаболитами арахидоновой кислоты и ингибиторами их биосинтеза, аспирином и бедитином.

Согласно данным цитогенетического анализа, плазма больных ПБ обладала мутагенным эффектом в культурах лимфоцитов здоровых доноров (табл. 4, рис. 5). Количество клеток с.аберрациями хромосом достоверно повышалось до 11.4352 (р< 0,001), Для сравнения, в качестве контроля использовалась плазма доноров, добавленная к культурам лимфоцитов донора. Плазма здоровых доноров не обладала мутагенным эффектом, и количество клеток с аберрациями составляло в среднем 2.32%. Эти данные свидетельствуют о мутагенном эффекте плазмы больных ПБ, приводящем к достоверному повышению количества хромосомных аберраций более чем в три раза (р<0,001).

Анализ уровней структурных аберраций хромосом (из расчета на 100 клеток) также показал достоверные различия между вариантами. При добавлении плазмы больных в культуры доноров, выявлено в среднем 12.65 структурных аберраций,по сравнению с контрольными данными, равными 4.02 (р< 0.001).

Как видно из таблицы 4, одной из причин подобного повышения частоты хромосомных аберраций является достоверное увеличение количества парных разрывов до 7.35 на 100 клеток при введении плазмы больного, по сравнению с контролем, составляющим 1.82 на 100 клеток (р< 0.01).

Мутагенный эффект плазмы больных ПБ на хромосомы способны снижать некоторые ингибиторы процессов метаболизма арахидоновой кислоты. Поэтому нами был исследован цитогенетический эффект этих соединений в клеточных культурах в следующих концентрациях: аспирин (ингибитор циклооксигеназного пути) - 10""%; бедитин (ингибитор 5-липоксигеназного пути) - Ю~°М.

Арахидоновая кислота, при ее добавлении к культурам крови

Таблица 4

Частота хромосомных аберраций и СХО в культурах лимфоцитов доноров при добавлении плазмы крови больных ПБ и исследованных веществ

Вариант Проем. Клеток Аберрации на 1 оо клеток Число

клеток с Одиноч - Парных Обменов Структ. СХО

аберр.к разрыв- разрыв. аберр- на кл

Пд/Д 274 2. 92 2. .19

Пб/Д 245 11 .43 4. .90

Пб/Д+АК 280 8. 93 2 .86

Пб/Д+АС 300 6. 67 1 . .67

Пб/Д+АА+АС 30 0 7. 67 1 . .67

Пб/Д-»БД 212 е. 49 2. .36

Пб/Д+АК-БД 1 37 3. 65 0. .73

1 .83 0. 00 4.02 3. 13

7.35 0.40 12.65 4 - Об

8.93 0. 35 12.14 3.82

6.00 0.00 7.67 3. 34

6. 67 0.33 8.67 3. 68

6. 60 О.ОО 8. 96 1 .53

3.65 0.00 4. 38 3.00

Обозначения: Д-культура крови доноров; Дц/Д-шгазма донора, добавленная в культуру крови донора; Пб/Д-плазма больного ПБ, добавленная в культуру крови донора; АК-арахидоновая кислота; АС-асшрш; БД-бедогин.

доноров, не .повышала частоты аберрантных метафаз в присутствии плазмы больных. Так, среднее число структурных аберраций хромосом составило 12.14 на 100 клеток и не наблюдалось различий по сравнению с вариантами без арахидоковой кислоты, составлявшими 12.65 на 100 клеток.

В культурах здоровых доноров, в присутствии плазмы больных ПБ, аспирин способствовал снижению уровней аберрантных клеток до 6.67$, по сравнению с вариантом без аспирина, где эти уровни были равны 11.43$ (р 0.01).

Выявленный антикластогенный эффект аспирина подтверждается при анализе среднего количества структурных аберраций хромосом, составляющего без аспирина 12.65, а в его присутствии, снижаю-

12 10

8

6

4

2

О

Рис. 5. Цитогенетические эффекты плазмы больных ЛБ и исследованных веществ при их добавлении к культурам здоровых доноров.

щегося до 7.67 (р<0.05). Различия в частотах типов аберрации хромосом в вариантах с аспирином и без него не обнаружено.

Количество аберрантных метафаз, в присутствии плазмы больных ЛБ с арахидоновой кислотой и аспирином, составляло 7,67$, а в вариантах без аспирина - 8.93% (р> 0.05). Недостоверны различия и между уровнями структурных хромосомных аберраций на 100 клеток (р> 0.05).

Бедитин не оказывал антикластогенного эффекта в присутствии плазмы больных ПБ. Его протекторный эффект был отмечен только в присутствии арахидоновой кислоты, когда частота клеток с аберрациями снижалась до 3.65$, в отличие от вариантов без добавления бедитина, где частота аберрантных метафаз составляла 8.49;? (р < 0,05). Бедитин достоверно снижал уровни парных разрывов с 8.93 до 3.65 на 100 клеток (р<0.05) и средние уровни структур-

ой Пб/Д+АК+БД ш Пб/Д+БД

Ш Пб/Д+АК+АС 1=1 Лб/Д+АС

Ш Пб/Д+АК ШПб/Д

ных аберраций с12.14|до 4.38 на 100 клеток (р<0.05).

Согласно данным анализа среднего числа СХО на клетку, ни одно из изученных соединений, как и плазма крови больных ПБ, не приводили к изменению этого параметра.

4. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК ПО ЧИСЛУ РАЗРЫВОВ ХРОМОСОМ В КУЛЬТУРАХ ОТ БОЛЬНЫХ ПБ И ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ ШСТОГЕНОВ И АНТИКЛАСТОГЕНОВ

4.1. Распределение клеток по числу разрывов при действии мутагенов диоксидяна и фотрина, и антимутагенов бемитила, интерферона, гаммафоса. Анализ распределения клеток по числу разрывов может дать важную дополнительную информацию о процессах повреждения хромосом и их модификации.

Во второй серии опытов в группе здоровых доноров показано полное соответствие эмпирического распределения числа повреждений хромосом по отношению к распределению Пуассона и геометрическому (табл. 5). Но в большинстве экспериментов было выявлено достоверное различие распределений от отрицательного биномиального (с т=2).

В группе больных ПБ было, в основном, показано совпадение распределения числа разрывов с геометрическим распределением и распределением Пуассона (табл. б). Но были и исключения, когда в отдельных вариантах выявлено достоверное отклонение от этих моделей. Однако, следует отметить основные различия, а именно -отклонение всех эмпирических распределений от отрицательного биномиального (с т=2).

Наши данные свидетельствуют о соответствии экспериментального распределения разрывов распределениям Пуассона и геометрическому. Но в большинстве экспериментальных вариантов, как в культурах здоровых доноров, так и у больных ПБ, показано достоверное различие экспериментального от отрицательного биномиального распределения.

В большинстве вариантов, обработанных антикластогенами, были показаны те же закономерности. Поэтому мы можем предположить, что антикластогены не влияют на соотношение клеток, находящихся на различных стадиях клеточного цикла.

4.2. Распределение клеток по числу разрывов при действии модификаторов метаболизма арахидоновой кислоты. В третьей серии

Таблица 5

Анализ распределения разрывов по клеткам в культурах лимфоцитов доноров

Разрывов К БМ ИФ ГФ ДК ДК+БМ ДК+ИФ ДК+ГФ ФТ ФТ+БМ ФТ+ИФ ФТ+ГФ

0 66 219 93 274 132 176 1 22 225 159 1 87 1 93 106

1 3 6 5 23 27 7 Ь 1 1 39 17 18 1 1

2 И > 1 12 2 1 0 0 1 2 1 1 3

0.071 0.090 0.181 0.047 0.215 0.099

0.040 0.090 0.033 0.055 0.093 0. 142

N1 X ' О.15 0.39 0.33 0.03 0.10 0.00 0.00 0.04 0.17 0.00 0.05 0.25

п 1 1111 1 1 1 1 1 1 1

Р >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05

>0.05 >0.05 >0.05 - >0.05 >0.05 1 >0.05

N2 х £ 0.10 0.33 0.21 0.01 0.57 0.01 0.01 0.01 6.44 0.02 0.00 0.06

п 1 12 11 1 1 1 2 1 1 1

Р >0.05 <0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0. 05

>0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05

N3 О X 3.21 6.33 5.86 12.73 12.77 3.18 2.65 в. 68 18.54 8.49 10.12 : 9.07

п 1 112 2 1 1 1 2 1 1 1

>0.05 <0.05 <0.01 >0. 05 <0.001 <0.01

Р <0.05 <0.01 >0.05 <0.01 <0.01 <0.01

Обозначения --К-контроль ,БМ-бемитал(0.7 * Ю_4М) ,ИФ-интерферон (37МЕ/мл), ГФ-гаммафос(0.7 * 10~4М), ДК-диоксвдин (13-5 * Ю"4М) ,ФТ- фотрин (0-5 * Ю_5М). Модели распределений: N1-Пуассона, иг-геометрическое, Nз-стрицат.бионом.с т=2.

Табжца 6

Анализ распределения разрывов по клеткам в культурах лимфоцитов больных ПБ

Разрывов К БМ ИФ ГФ ДК ДК+БМ ДК+ИФ ДК+ГФ ФТ ФТ+БМ ФТ+ИФ ФТ+ГФ

0 262 199 304 267 341 303 255 240 67 69 327 1 74

1 7 14 30 47 47 34 37 36 23 23 40 45

2 И > 1 0 5 6 12 6 8 4 10 1 1 28 61

О.ОЗЗ О.118 О.188 0.18 О. 47 0.273

иредыке 0.066 0.184 0.134 О.157 0.524 0.886

N1 0.09 0.02 О.22 0.02 9.28 0.25 0.47 0.02 2.15 3.66 61 .41 92.25

п 1 1112 1 1 1 2 2 2 3

>0.05 >0.05 <0.01 >0. 05 >0.05 <0.001

Р >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 <0.001

N2 х2 0.06 0.06 0.02 1.00 1.19 0.00 0.23 0.57 0.09 0.15 16.80 22.41

п 1 11 2 2 1 2 2 2 2 2 5

>0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 <0.001

Р >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 <0.001

N3 х2 5.19 5.83 19.83 25.36 39.40 22.27 19.23 19.42 25.99 26.0 2 76. 1 4 161.26

п 1 1 2 2 2 2 3 2 2 3 3 4

<0.05 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

Р <0,05 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

Обозначения те же ,что и в таблице 5 -

опытов выявлено совпадение эмпирического распределения числа поврежденных хромосом с распределениями Пуассона и геометрическим, независимо от варианта обработки.

Показано, что распределение разрывов в вариантах экспериментов с довольно низким значением числа разрывов на клетку совпадает с геометрическим распределением и распределением Пуассона. И, аналогично данным для аберраций, индуцированных фотрином и диоксидином, наблюдаются достоверные различия от отрицательного биномиального, за исключением варианта, когда к плазме добавляли арахидоновую кислоту и бедитин. Согласно данным Н.А.Чернышевой и А.Н.Чеботарева (1989), это'можно объяснить тем, что изучаемые популяции находятся в первом клеточном делении. Мы можем только предположить, что в варианте, когда к плазме добавляли арахидоновую кислоту и бедитин, могли произойти изменения в теше прохождения клеточного цикла популяцией анализируемых клеток. Так, применение анализа распределения в клетках может помочь в понимании изучаемых цитогенетических механизмов.

ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Периодическая болезнь (ПБ), как известно, наследственное заболевание с невыясненной этиологией. Ее патогенез, вероятнее всего, связан с изменениями клеточного метаболизма и иммунной системы.

Работ в области цитогенетики ПБ практически не имеется. В связи с этим, нами проведен хромосомный анализ в группе больных ПБ, в результате которого было выявлено четкое повышение уровней хромосомных аберраций в лимфоцитах, достигающее 5.84+0.20$, по сравнению со здоровыми индивидуумами, при отсутствии различий в уровнях СХО.

Использование подобных клеточных систем от больных с.хромосомной нестабильностью, характеризующихся различными функциональными состояниями клеток, может быть удобной клеточной моделью для изучения механизмов антикластогенеза в клетках человека.

Нами исследовано действие неспецифических соединений, обладающих кластогенным и антикласгогенным эффектом в клеточных культурах больных ПБ и доноров. Показаны различия в чувствитель-

ности хромосом у (Зольных ПБ и доноров при изучении одновременного действия на культуру клеток кластогенов (фотрина и диоксиди-на) и антикластогенов (интерферона, бемитила и гаммафоса ).

Выявлена различная чувствительность хромосом в клетках больных ПБ и доноров. В большинстве культур лимфоцитов больных ПБ антикластогены не оказывали защитного действия, в отличие от культур доноров. Различная чувствительность хромосом культур лимфоцитов больных ПБ и здоровых доноров (высокий уровень хромосомных аберраций, отсутствие антикластогенного действия изученных протекторов) может быть связана с нарушением метаболизма арахидоно-вой кислоты у больных ПБ. Ранее было показано, что эйкозаноиды -высокоактивные метаболиты арахидоновой кислоты, играют важную роль в этиологии ПБ (А.Г.Паносян и соавт., I98S).

Подобное объяснение может быть дано и выявленному кластоген-ному эффекту плазмы больных ПБ. Плазма крови больных ПБ, введенная в культуру лимфоцитов здоровых доноров, приводит к достоверному повышению количества клеток с хромосомными аберрациями. Ингибиторы цикла арахидоновой кислоты, к которым относятся аспирин и бедатин, в основном способствуют снижению уровней цитоге-нетических повреждений. Однако закономерности их действия различны.

Бедитин оказывал протекторный эффект только в присутствии арахидоновой кислоты, добавленной к плазме больных ПБ. Аспирин, в отличие от бедитина, обладал защитным эффектом только в тех случаях, когда в плазму больных арахидоновая кислота не добавлялась.

Весьма интересно изучение связи метаболизма арахидоновой кислоты в крови больных ПБ с уровнями обнаруженных цитогенетических различий между больными ПБ и донорами. Для обсуждения биохимических механизмов выявленной кластогенной активности целесообразно использовать данные по изучению некоторых аутоиммунных заболеваний. При этом для исследования действия ингибиторов арахидоновой кислоты на хромосомы используется модель мембранно-опосре-дованных хромосомных изменений. Эта модель предполагала действие мембранно-активных агентов, стимулирующее окисление мембранных липидов и ведущее к образованию кластогенных свободно-радикальных, липид-гидропероксидазных и альдегидных компонентов ( Eme rit et al., 1983).

Существуют три типа ферментативного окисления арахидоновой кислоты (липоксигеназный, циклооксигеназный и монооксигеназный).

Бедитин, который был использован в наших опытах, является селективным ингибитором липоксигеназного пути, и в настоящее время рассматривается в качестве нового терапевтического средства при ЛБ.

Второй путь метаболизма арахидоновой кислоты - циклооксигеназный, менее специфический в патогенезе ПБ.В качестве ингибитора этого пути нами использован аспирин. Известно, что активность циклооксигеназы проявляется при значительно более низких концентрациях арахидоновой кислоты, чем активность липоксигеназ. Сравнительно низкие концентрации арахидоновой кислоты в плазме крови больных ПБ, по-видимому, достаточны для проявления активности циклооксигеназы и эффектов аспирина, который снижал уровни хромосомных аберраций даже без добавления экзогенной арахидоновой кислоты.

Добавление арахидоновой кислоты существенно влияет на липо-ксигеназное окисление и уровень ее метаболитов. Максимальный ан-тикластогенный эффект мы наблюдали при действии ингибитора липо-ксигеназы, бедитина, что свидетельствует об участии метаболитов липоксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты в клас-тогенезе при ПБ.

Важную дополнительную информацию о процессах повреждения хромосом и их модификации может дать анализ распределения клеток по числу разрывов. Нами проанализировано распределение разрывов хромосом по клеткам в культурах лимфоцитов больных ПБ и доноров. Показано соответствие экспериментальных распределений разрывов по клеткам распределениям Пуассона и геометрическому.

Обнаруженное преобладание аберраций хроматидного типа в клетках больных ПБ может объясняться, как было предложено Аио1а1г ег а1 • (1990), на основе механизма индукции разрывов ДНК.

Таким образом, специфический подход к изучению механизмов " антикластогенеза при исследовании клеток больных ПБ, не менее эффективен, чем осуществленное наш ранее применение неспецифических кластогенов и антикластогенов.

Можно полагать, что для объяснения наблюдаемых цитогенетичес-ких эффектов, необходимо провести аналогичный анализ на большей

группе больных ПБ, обладающих различной чувствительностью к действию ингибиторов арахидоновой кислоты.

Ранее вопросы антикластогенеза рассматривались, в основном, вне связи со спецификой модельных систем, на которых они исследовались. Работы Emerit et al . (1983, 1984, 1990) были первой попыткой связать вопросы антикластогенеза при действии химических мутагенов со спецификой метаболизма ряда аутоиммунных заболеваний. Интересные исследования в области связи кластогенных и антикластогенных эффектов с функциональным состоянием организма проводятся с 80-х годов Г.Д.Засухиной, Н.Н.Ильинских и Ю.Лазут-кой с соавторами.

При этом показано существенное влияние на наблюдаемые эффекты типов клеток или специфики болезни. Чаще всего при этом использовались одномерные системы со снижением определенных типов функциональных зависимостей. В случае ПБ , появилась возможность оценить специфическое действие ряда антиметаболитов арахидоновой кислоты (Э.С.Габриелян с соавт., 1990).

Используемые нами (а также в работах А.Д.Дурнева) стандартные тест-системы с учетом количественных параметров действия протекторов, которые исключают их прямое взаимодействие с мутагенами, позволили изучить феномен защиты хромосом от специфических для данной болезни мутагенов. Более того, возникает вполне реальная возможность, в дальнейшем, на основе получения оптимального эффекта ряда антикластогенов,определять конкретный блок цикла арахидоновой кислоты у каждого обследуемого больного. Так, по нашему мнению, и должна происходить эволюция концепции антикластогенеза.

ВЫВОДЫ

1. В культурах лимфоцитов больных ПБ наблюдался достоверно повышенный, по сравнению с донорами, уровень хромосомных аберраций (5.84$ при 1.70$ у доноров), наряду с отсутствием различий в уровнях GX0. Это позволяет рекомендовать изучение процессов антикластогенеза в культурах клеток больных ПБ.

2. Диоксидин индуцировал одинаковый уровень лимфоцитов с хромосомными аберрациями в клетках больных ПБ и у доноров, а фотрин вызывал достоверно более высокий уровень цитогенетичес-

ких изменений в клетках больных ПБ по сравнению с донорами. Интерферон и гаммафос оказывали достоверный мутагенный эффект в культурах лимфоцитов больных ПБ по сравнению с донорами, а бе-митил не вызывал подобного эффекта. Это свидетельствует о большей чувствительности хромосом больных ПБ к введению ряда экзогенных веществ.

3. Антикластогены не проявляли протекторного эффекта в клетках больных ПБ, в отличие от клеток доноров, при их одновременном введении с кластогенами. Только интерферон достоверно снижал мутагенное действие фотрина. Из этого следует, что существует специфический механизм действия разных антикластогенов на хромосомы больных ПБ.

4. Плазма крови больных ПБ, добавленная в культуры лимфоцитов доноров, оказывала достоверный мутагенный эффект. Этого не наблюдалось при введении плазмы крови здоровых доноров и арахи-доновой кислоты.

5. В присутствии плазмы больных ПБ ингибиторы метаболизма арахидоновой кислоты (аспирин и бедитин) не повышали уровней хромосомных аберраций при добавлении арахидоновой кислоты в культуры доноров. Ингибиторы, в основном, снижали частоту хромосомных аберраций. Протекторный эффект бедитина был достоверным при добавлении арахидоновой кислоты в плазму больных, а аспирина - без добавления. Следовательно, арахидоновая кислота и ингибиторы ее метаболизма играют важную роль в процессах класто-генеза и антикластогенеза.

6. Выявлено соответствие экспериментального распределения разрывов хромосом по клеткам распределениям Пуассона и геометрическому, и его отклонение от отрицательного биномиального распределения с т =2. Это свидетельствует об отсутствии смещения клеток по циклу под влиянием исследованных веществ.

7. Представленная тест-система, с использованием культур клеток больных ПБ, позволяет рекомендовать новый методический подход для исследования эффекта антикластогенов при ряде заболеваний. На основании полученных результатов, мы предлагаем при дифференциальном применении антиметаболитов арахидоновой кислоты,проводить оценку их защитного эффекта для идентификации ингибиторов метаболизма, связанных с этиологией ПБ.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

1. Арутюнян P.M., Саркисян Т.Ф., Межлумян A.C., Паши-

нян С.А. Изучение антикластогеиного эффекта у больных периодической болезнью. I, Сравнительное изучение действия кластоге-нов и антикластогенов// Биологический журнал Армении,-1992.-Т.45.- J» I.

2. Межлумян A.C., Саркисян Т.Ф., Арутюнян P.M., Пано -сян А.Г., Григорян C.B. Изучение антикластогеиного эффекта у больных периодической болезнью. 2. Исследование модификаторов метаболизма арахидоновой кислоты// Биологический журнал Армении.- 1992.- Т.45. - № I.

3. Межлумян A.C., Саркисян Т.Ф., Арутюнян P.M. Распределение клеток по числу разрывов хромосом у больных периодической болезнью// Ученые записки ЕГУ.-1992,- № I.