Проблемы модификации химического мутагенеза под влиянием антимутагенов в системах высших эукариот

Кужир, Татьяна Дановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Проблемы модификации химического мутагенеза под влиянием антимутагенов в системах высших эукариот
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Проблемы модификации химического мутагенеза под влиянием антимутагенов в системах высших эукариот"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

УДК 575.224.4/575.224.6

:гз с л

КУЖИР Татьяна Дановна

ПРОБЛЕМЫ МОДИФИКАЦИИ ХИМИЧЕСКОГО МУТАГЕНЕЗА ПОД ВЛИЯНИЕМ АНТИМУТАГЕНОВ В СИСТЕМАХ ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ

03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Минск - 1999

Работа выполнена в Институте генетики и цитологии HAH Беларуси.

Научный консультант: доктор биологических наук Гончарова Р.И.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, чл.-кор. РАМН и НАН БеларусиЛазюк Г.И., доктор биологических наук, профессор Ревазова Ю.А., доктор биологических наук, профессор Моссэ И.Б.

Оппонирующая организация: Институт биохимической физики РАН

Защита состоится « 22. » ¿jb&Opa/) su 2000 года в часов на

заседании Совета по защите диссертаций Д 01.31.01 в Институте генетики и цитологии HAH Беларуси по адресу: 220072, Минск, ул. Академическая, 27. тел. 284-19-11.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа HAH Беларуси.

Автореферат разослан « // » \Xfcß>CLfiJL- 2000 года

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций,

кандидат биологических наук

Л. А. Тарутина

ЕоМ.Ш -9,0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Работа актуальна в связи с острой необходимостью ограничить генетические последствия загрязнения биосферы химическими мутагенами. Генетическую безопасность могут обеспечить антимутагены, устраняющие или смягчающие мутагенные и канцерогенные эффекты средовых факторов. Их поиск и изучение проводятся во всем мире, однако, как правило, в тест-системах in vitro [Novick, Szilard, 1952; Clarke, Shankel, 1975; De Flora, Ramel, 1988]. Тема предусматривает организменный уровень исследований, что позволяет более точно прогнозировать действие антимутагенов в естественных условиях.

На современном этапе выделяются две крупные проблемы, изучение которых у высших эукариот, безусловно, способствует дальнейшему развитию теоретических и практических аспектов антимутагенеза: варьирование эффектов антимутагенов и механизмы их действия при химическом мутагенезе. Сейчас уже можно считать установленным фактом специфичность действия антимутагенов по отношению к различным мутагенам и тест-системам [Stich, 1991; Ferguson, 1994; Waters et al., 1996]. Однако недостаточно данных, позволяющих оценить вклад внутриклеточной среды в модификацию химического мутагенеза и охарактеризовать закономерности этого процесса в половых клетках.

Известно, что антимутагены могут снижать частоту мутаций, взаимодействуя с мутагенами и их генотоксичными метаболитами, либо действуют опосредованным путем [Kada, 1985; De Flora, Ramel, 1988; Гончарова, 1990, 1993]. Среди опосредованных механизмов широко изучаются эффекты антимутагенов на биотранс-формацшо промутагенов / проканцерогенов [De Flora, Ramel, 1988; Stich, 1991; Журков, Сычева, 1993]. Не менее важным является подавление мутагенеза за счет повышения точности репликации и репарации ДНК. Значение последнего механизма особенно велико по отношению к мутагенам прямого действия, в том числе "супермутагенам", мизерного количества которых достаточно, чтобы вызвать заметный рост мутабильности. Модуляция репарационных процессов под влиянием антимутагенов исследуется не более 20 лет [Рапопорт и др., 1979; Засухина, 1979; Kuroda, Inoue, 1988], эта проблема практически не изучена в половых клетках.

Интенсивная хозяйственная деятельность, развитая химическая промышленность, последствия Чернобыльской катастрофы усиливают актуальность для Беларуси научных изысканий, направленных на контролирование мутационного процесса в окружающей среде, сохранение генофондов и уменьшение генетического риска для населения. Тема диссертации тесно связана с решением этих проблем.

Связь работы с крупными научными программами и темами. Работа выполнена в лаборатории антимутагенеза Института генетики и цитологии HAH Беларуси в рамках следующих тем: "Изучение закономерностей модифицирующего действия антимутагенов при различных мутагенных воздействиях на дрозофиле и

мышах" (№ гос. регистрации 01860021735); "Изучение закономерностей и механизмов подавления антимутагенами химического мутагенеза в половых и соматических клетках высших организмов" (№ гос. регистрации 0109010213); "Изучение антимутагенной активности некоторых антиоксидантов при химическом мутагенезе у дрозофилы и мышей" (№ гос. регистрации 1998161); "Изучение влияния биологически активных веществ - новых производных 1,4-дигидроизоникотиновой кислоты на функционирование репарационных систем животных организмов".

Перечисленные темы координировались государственными программами "Флора и Фауна", "Биологическое разнообразие", "Функционирование биосистем", а также входили в международную программу ЮНЕСКО "Человек и биосфера".

Цель и задачи исследования. Цель работы - выявление закономерностей модификации химического мутагенеза под влиянием антимутагенов и механизмов их действия у высших эукариот. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг антимутагенов среди некоторых антиоксидантов и проанализировать проблемы тестирования веществ на антимутагенную активность в системах высших эукариот.

2. Изучить закономерности химического мутагенеза у высших эукариот на примере действия алкилирующего агента этилметансульфоната (ЭМС); оценить вклад определенных аддуктов и путей репарации ДНК в формирование ЭМС-индуцированных генных мутаций и разрывов хромосом.

3. Изучить влияние ряда антиоксидантов на ЭМС-индуцированный мутагенез в половых клетках дрозофилы и соматических клетках млекопитающих. Оценить эффективность антимутагенов, принадлежащих к различным химическим группам; выявить условия, способствующие проявлению их защитного действия.

4. Изучить влияние ряда антиоксидантов на репарацию ДНК при химическом мутагенезе у дрозофилы, для чего проанализировать: а) их влияние на материнскую репарацию первичных повреждений ДНК, индуцированных в зрелых сперматозоидах; б) зависимость эффектов от стадий сперматогенеза; в) чувствительность к антимутагенам половых клеток с полноценными и дефектными системами репарации.

5. На основании экспериментальных данных проанализировать механизмы действия изученных антиоксидантов у высших эукариот, их связь с защитными системами и репарацией ДНК.

Объект и предмет исследования. Основной объект исследований -Ого$орМа melanogasíer. Использованы различные линии дрозофилы, в том числе мутанты с дефектами эксцизионной (те'1-9) и пострепликативной (те1-4!) репарации. Часть экспериментов выполнена на гибридных мышах СБА *С57В1/6].

Предмет исследования - антимутагены как средства снижающие частоту спонтанных и индуцированных мутаций; мутационный процесс и репарация ДНК.

Гипотеза. Модификация химического мутагенеза с помощью антимутагенов рассматривается как сложный многокомпонентный процесс, важнейшей составляющей которого является обусловленная генотипом внутриклеточная и организ-менная среда. Благодаря множественным механизмам действия антимутагены вмешиваются в мутационный процесс на разных этапах. В условиях целостного организма приоритетными являются опосредованные механизмы, в том числе влияние на репарацию ДНК.

Методология и методы проведенного исследования. Методология исследования основана на таких общебиологических явлениях, как материнский эффект, эффект хранения, зависимость метаболической и репарационной активности клеток от стадий сперматогенеза или развития организма. Оценивался мутационный ответ половых и соматических клеток целостного организма, который подвергался мутагенному и/или антимутагенному воздействию.

В половых клетках дрозофилы учитывали рецессивные сцепленные с полом летальные мутации (РСПЛМ); разрывы хромосом, вызывающие эмбриональную (ЭЛ), в том числе позднюю (ПЛ), постэмбриональную (ПЭЛ) и суммарную (СЛ) летальность потомков в онтогенезе, а также потери половых хромосом (ППХ). Как правило, различные типы мутаций анализировали в потомстве одних и тех же родителей, т.е. при строго идентичных условиях эксперимента. Индивидуальный анализ потомства каждого обработанного самца давал возможность оценить частоту мутаций в пуле половых клеток как всех, так и отдельных особей.

Кластогенные эффекты дополнительно оценивали по частоте микроядерных (МЯ) полихроматофильных эритроцитов в костном мозге взрослых мышей (самцов и самок) и печени эмбрионов.

Научная новизна и значимость полученных результатов:

1. Выявлен новый класс антимутагенов - производные 1,4-дигидропиридина (1,4-ДГП). Антимутагенная активность этих соединений определяется отсутствием радикала или наличием карбоксилат-аниона в 4-м положении циклической структуры. Впервые установлена тесная корреляция между эффективностью антимутагенного действия производных 1,4-ДГП и их электронодонорной способностью.

2. Впервые продемонстрирован существенный вклад пострепликативной репарации в формирование ЭМС-индуцированных разрывов хромосом. Показана зависимость частоты ЭМС-индуцированных генных мутаций не только от стадии сперматогенеза, но и от генотипа самцов: сперматогонии самцов yellow более чувствительны к действию алкилирующего агента по сравнению с клетками дикого типа.

3. Впервые охарактеризовано действие антимутагенов в зависимости от многих факторов, включая изменения внутриклеточной среды на разных стадиях развития организма и сперматогенеза. Установлено, что обработка личинок способствует реализации защитного потенциала, тогда как обработка имаго вызывает разнона-

правленные эффекты антимутагенов. Эти закономерности свидетельствуют о том, что в условиях целостного организма защитное действие антиоксидантов против этилметансульфоната реализуется преимущественно опосредованным путем.

4. Впервые установлено, что производные 1,4-дигидроизоникотиновой кислоты (1,4-ДГИНК) наряду с некоторыми другими антиоксидантами модулируют репарационные процессы при химическом мутагенезе в половых клетках.

Полученные результаты представляют интерес для дальнейшей разработки нового структурно-функционального подхода к поиску антимутагенов. Они вносят существенный вклад в развитие фундаментальных представлений о модификации химического мутагенеза под влиянием антимутагенов, выявляя сложность и много-компонентность этого процесса у высших эукариот. Получили дальнейшее развитие представления о специфичности и механизмах действия антимутагенов. Высокой степенью новизны обладает экспериментальное доказательство влияния антимутагенов на репарацию ДНК в половых клетках, что дает возможность вмешиваться в химический мутагенез на завершающем этапе (после формирования адцук-тов ДНК), ожидая положительного эффекта не только у данного индивидуума, но и у его потомства.

Практическая значимость полученных результатов состоит в следующем:

1. Среди производных 1,4-ДГП обнаружены антимутагены, существенно подавляющие спонтанный и химический мутагенез у высших эукариот. При оптимальных условиях их защитное действие проявляется в широком диапазоне доз, а по эффективности они значительно превосходят другие изученные антиоксиданты (аминотиоловые соединения, производные фенола, облепиховое масло). Особенно ценно то, что антимутагенная активность обнаружена у лекарственных препаратов (дилудина, глутапирона), что расширяет спектр их практического применения.

2. Предложен критерий поиска антимутагенов среди антиоксидантов и некоторые рекомендации по тестированию антимутагенов. На фоне спонтанного мутационного процесса необходимо использовать тест-системы с достаточной разрешающей способностью, к которым можно отнести учет рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ) у дрозофилы. Характерно, что этот тест чувствителен не только к антимутагенным, но и комутагенным эффектам.

3. Установлены особенности действия антимутагенов, имеющие принципиальное значение для разработки стратегии практического применения антимутагенов.

4. Показано, что некоторые изученные антиоксиданты могут быть использованы в качестве репарогенов, способствующих восстановлению поврежденной ДНК.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Антимутагенное действие изученных производных 1,4-ДГП обусловлено химической структурой, обеспечивающей высокую антиоксидантную и электроно-донорную активность этих соединений. Антимутагены этой группы in vivo сущест-

венио подавляют уровень спонтанного и химического мутагенеза в половых клетках дрозофилы, а также снижают кластогенный эффект алкилирующего агента в соматических клетках мыши. При оптимальных условиях их защитное действие проявляется в широком диапазоне доз (10-250 мМ), а эффективность выше, чем у других изученных антиоксидантов.

2. В половых клетках дрозофилы генетическая активность антиоксидантов варьирует от антимутагенной до комутагенной, отражая специфичность действия антимутагенов. Защитный эффект антиоксидантов преимущественно проявляется в условиях, исключающих их химическое или физическое взаимодействие с мутагеном, предопределяя приоритетность опосредованных механизмов антимутагенного действия в условиях целостного организма.

3. Закономерности становления генных мутаций и разрывов хромосом под влиянием этилметансульфоната обусловлены аддуктами ДНК. Динамика накопления разрывов хромосом соответствует скорости депуринизации ДНК в результате спонтанного гидролиза 7-этилгуанина. Пострепликативная репарация может вносить вклад в ЭМС-кластогенез. Частота ЭМС-индуцированных генных мутаций зависит от стадии сперматогенеза и генотипа самцов.

4. Антимутагены влияют на материнскую репарацию первичных повреждений ДНК, индуцированных ЭМС в сперматозоидах дрозофилы. Защитный эффект глу-тапирона проявляется также на премейотических стадиях сперматогенеза. Дефекты репарации снижают чувствительность половых клеток к антимутагенам. Антиокси-данты способны модулировать репарацию ДНК при химическом мутагенезе в половых клетках.

5. У высших эукариот модификация мутационного процесса антимутагенами представляет результат взаимодействия трех составляющих: химического мутагенеза, антимутагенеза и обусловленной генотипом внутриклеточной среды, которая существенно влияет на реализацию защитного потенциала антимутагенов.

Личный вклад соискателя. Постановка задач, выбор подходов к изучению интересующих проблем, анализ данных и все теоретические разработки выполнены лично соискателем. Экспериментальный материал получен совместно с сотрудниками лаборатории антимутагенеза Института генетики и цитологии HAH Беларуси А.Б. Левиной, О.В. Даливеля, С.П. Забрейко, Н.В. Савиной. Для статистического анализа результатов использован пакет прикладных программ AB-STAT, а также специальные программы для персонального компьютера, созданные к.б.н. Б.Ю. Аношенко.

Автор выражает искреннюю благодарность зав. лабораторией антимутагенеза д.б.н. Р.И. Гончаровой, идеи которой нашли отражение и дальнейшее развитие в этом исследовании. Автор глубоко признателен всем участникам работы за творческое сотрудничество, помощь и дружескую поддержку.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации представлялись на VI Всесоюзном совещании по проблемам биологии и генетики дрозофилы (Одесса, 1989), на II и IV конференциях "Биоантиоксидант" (Москва, 1986, 1992), на заседаниях Секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" (Орджоникидзе, 1986; Ереван, 1987; Самарканд, 1990), научно-практической конференции стран Балтии и СНГ по проблемам антимутагенеза (Минск, 1993), на международном симпозиуме "Мутагены и канцерогены окружающей среды и наследственность человека" (Москва, 1994), съездах ВОГИС и БОГИС (Минск, 1992, Горки, 1992; 1997), республиканской конференции "Современные проблемы генетики и селекции" (Минск, 1995 г.), IV международной конференции по механизмам антимутагенеза и антиканцерогенеза (Канада, 1994 г.) и совещании Ирландской секции биохимического общества (Со1егате, 1996).

Опубликоваиность результатов.

Результаты исследований опубликованы в 30 статьях, а также материалах международных и республиканских конференций (всего 70 публикаций). В 1999 г. издана монография "Антимутагены и химический мутагенез в системах высших эука-риот" (267 е.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 7 глав и заключения. Полный объем диссертации 240 стр, рисунков 27, таблиц 54, список использованных источников насчитывает 661 наименование.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОПИСАНИЕ МАТЕРИАЛОВ И МЕТОДОВ РАБОТЫ

Изучена генетическая активность 13 препаратов дигидропиридинового ряда, синтезированных в Латвийском институте органического синтеза под руководством академика Г.Я. Дубура. Среди них следует выделить 2,6-диметил-3,5-диэтокси-карбонил-1,4-ДГП (дилудин, Д), 2,6-диметил-3,5-диэтоксикарбонил-4-(натрий кар-боксилато)-1,4-ДГП (ДГП) и динатриевую соль 2-(2,6-диметил-3,5-диэтоксикарбо-нил-1,4-дигидропиридин-4-карбоксамидо)-глутаровой кислоты (глутапирон, ГП), которые использованы для модификации химического мутагенеза. Показатели ан-тиоксидантной, электронодонорной и водорододонорной способности этих соединений определены сотрудниками Латвийского института органического синтеза [Тирзит, Дубур, 1972; Страдынь и др., 1972,1975; Велена, 1975].

В качестве антимутагенов изучены также аминотиоловые соединения (цистеин и цистеамин), фенольные производные (ионол и феноксан, последний синтезирован в Институте химической физики РАН), облепиховое масло (получено из Научного центра по облепихе НИИ садоводства Сибири). В качестве модельного мутагена

использован этилметансульфонат (ЭМС) - монофункциональный алкилирующий агент производства Sigma (CAS № 62-50-0).

Обработку дрозофилы модификаторами проводили путем кормления. Самцов обрабатывали на стадиях личинок и имаго; самок только на стадии имаго. Мутаген скармливали взрослым самцам в соответствии с методикой Lewis, Bacher (1967). Экспозиционная доза зависела от концентрации мутагена (6-25 мМ) и продолжительности кормления (10-36 ч). В опытах на мышах модификаторы (ДГП и ГП) вводили животным внутрибрюшинно за 12 ч до инъекции мутагена.

В опытах на дрозофиле использовали методы хранения спермы в семяприемниках самок и фракционирования половых клеток, обработанных мутагеном на разных стадиях сперматогенеза [Würgler et al., 1986]. Анализировали частоту рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ), уровень эмбриональной (ЭЛ), поздней эмбриональной (ПЛ), постэмбриональной (ПЭЛ) и суммарной (СЛ) летальности потомков в онтогенезе, частоту потерь половых хромосом (ППХ). Основной пул спонтанных и ЭМС-индуцированных РСПЛМ составляют внутрило-кусные изменения [Slizynsky, 1938; Sega, 1984; Lacy et al., 1986]. Летальность потомков в онтогенезе является интегральным показателем различного рода хромосомных повреждений, возникающих в половых клетках [Анисимов и др., 1974; Ау-эрбах, 1978]; при этом ПЛ и ПЭЛ наиболее строго соответствуют генетической компоненте [Munoz, Barnett, 1978; Würgler et al., 1984]. ППХ возникают в результате разрывов хромосом или их нерасхождения в мейозе. Эти повреждения нелеталь-ны, но приводят к появлению в Fi потомков исключительного фенотипа. В костном мозге мышей (самцов и самок), а также печени плодов учитывали частоту клеток с микроядрами (МЯ). Регистрация ППХ и микроядерный тест широко используются в генетической токсикологии для оценки кластогенности средовых факторов.

Для вычленения "чистого" мутагенного эффекта ЭМС применяли поправку Abbott [Mendelson, 1974; Munoz, Barnett, 1978]; эффективность антимутагенного действия определяли по редукционному фактору (РФ), отражающему частоту мутаций, подавляемых антимутагеном.

РФ = X100%; РФ = х 100%,

К M

где К — спонтанный уровень мутаций (контроль); AM — частота мутаций под влиянием антимутагена; M - частота мутаций, индуцированных мутагеном; AM + M - частота мутаций при комбинированном воздействии.

АНТИМУТАГЕНЫ И СПОНТАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ. НЕКОТОРЫЕ ПРОБЛЕМЫ ПОИСКА АНТИМУТАГЕНОВ

В опытах на дрозофиле изучено 12 производных 1,4-ДГП (9 одноядерных и 3 триядерных соединения). Воздействию подвергалась наиболее чувствительная к обработке ксенобиотиками личиночная стадия. Генетическую активность препара-

тов оценивали по частоте РСПЛМ в половых клетках самцов дикого типа (Berlin wild). Среди изученных одноядерных препаратов б снижали уровень спонтанной мутабильности половых клеток, тогда как триядерные производные оказались неэффективными по этому тесту [Кужир, 1982а, б].

Производные 1,4-ДГП окисляются в соответствующие производные пиридина. С этой реакцией связаны их водорододонорпые, элекгронодонорпые и ангиокси-дантные свойства. Заместитель в 4-м положении имеет решающее значение для химической реактивности этих препаратов [Дубур, 1979]. Нами проанализирована зависимость эффективности антимутагенного действия (по показателю РФ) от химической структуры этих соединений (рис. 1). Видно, что выраженную антимутагенную активность проявляют только вещества, незамещенные или с карбоксилат-аиионом в положении 4 (препараты I-VI). Мутабильность половых клеток под влиянием препаратов VII—IX или Х1-ХШ не отличается от спонтанного уровня. Характерно, что те и другие, одноядерные и триядерные соединения, содержат более сложные (гетероциклические) заместители в 4-м (9-м) положении 1,4-дигидро-пиридина, которые экранируют связь С(4)-Н и резко уменьшают доступность атома водорода дня реакции [Дубур, 1979]. Таким образом, как химическая, так и антимутагенная активность обусловлена замещением в 4-положении 1,4-ДГП и, по-видимому, не зависит от радикалов в других положениях [Гончарова и др., 1980; Кужир, 19826]._

□ COONA(NH4) ПН ■ С6Н5(для VII 3-пиридил)

Рис. 1. Эффективность антимутагенного действия соединений дигидропиридинового ряда

_(1-1Х - одноядерные, Х1-ХШ - триядерные производные)_

Как показывает табл. 1, РФ больше у одноядерных производных с наименьшими потенциалами элекгроокисления. Достоверность и высокая степень этой связи доказана с помощью корреляционного анализа (г = - 0.7 при Р < 0.05). Обнаружена также симбатная зависимость антимутагенных эффектов одноядерных производных 1,4-ДГП от их антиоксидшггной способности [Гончарова и др., 1980; Кужир, 19826]. Для производных 1,4-дигидропиридина можно прогнозировать анти-мугагенные свойства при условии, что показатель У/У превышает 1.3, а потенциалы электроокисления меньше 1 [Кужир, 19826]. Следовательно, величины антиок-

сидантной и электронодонорной способности антиоксидантов являются критерием их антимутагенной активности.

Таблица 1

Антимутагенная активность по сравнению с антиоксидантной и электронодонорной способностью одноядерных производных 1,4-дигидропиридина

№ соединения R-C(4) Антиокси- дантная способность v0/v Потенциалы электроокисления Антимутагенная активность*

Е„,В Е,д,В РФтах,% + /-

VI COONa 2,0 0,63 0,60 55,26 +

V COONH4 1,4 0,63 0,60 73,68 +

IV COONa 1,5 0,72 0,65 82,35 +

II Н 2,7 0,90 0,86 48,15 +

I Н 2,9 0,93 0,90 59,26 +

III Н 3,6 - 0,91 68,42 +

VIII С6Н5 1,1 1,07 1,02 -16,00 -

VII c5h4n 1.0 1,68 1,22 32,00 -

IX c6Hs 1,3 1,13 1,06 34,21 -

* Наличие антимутагенной активности (+) или ее отсутствие (-) в соответствии с z-критерием (анализ сопряженных выборок с помощью теста Cochran). РФтах - максимальные значения показателя

Известно, что одной из основополагающих проблем тестирования ксенобиотиков является выбор и обоснованность применяемых тест-систем [Natarajan, Obe, 1986; Sobéis, 1987; Shelby, 1988]. Это в одинаковой степени касается и мутагенов, и антимутагенов. Поэтому некоторые антиоксиданты были проверены в тест-системах, регистрирующих хромосомные нарушения. Оказалось, что соединение IV (при концентрации 4 мМ) существенно снижает частоту полных потерь половых хромосом у самцов R(!)2, у v / Bs • Y • se", не затрагивая однако частичные потери (определяемые по утрате маркеров Y-хромосомы). Этот же препарат (в дозе 1/10 LD5o) не влиял на спонтанное возникновение микроядер в соматических клетках млекопитающих [Кужир, 1999]. Триядерное производное (препарат XII) практически не изменял уровень аберраций хромосом в культуре эмбриональных фибробла-стов человека [Кужир, 1975, 19826]. Таким образом, производные 1,4-ДГП проявляли сходные эффекты по отношению к генным мутациям и разрывам хромосом. Антимутагенный эффект, выявленный по частоте РСПЛМ, подтверждался хотя бы в одной из тест-систем, регистрирующих нарушения хромосомной структуры.

Тест РСПЛМ позволяет регистрировать мутационный ответ около 800 локу-сов, что делает его одним из наиболее чувствительных к мутагенным воздействиям [Lee et al., 1983; Würgler et al., 1984]. Вполне вероятно, что он столь же чувствите-

лен и к действию антимутагенов. Можно ожидать, что вещества, зарекомендовавшие себя как эффективные антимутагены по тесту РСПЛМ, при определенных условиях смогут реализовать свой антимутагенный потенциал и в других тест-системах, а также по отношению не только к спонтанным, но и индуцированным мутациям.

АНТИМУТАГЕНЫ И ХИМИЧЕСКИЙ МУТАГЕНЕЗ.

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОЦЕССА МОДИФИКАЦИИ В ИССЛЕДОВАНИЯХ НА ДРОЗОФИЛЕ И МЫШАХ

Для изучения закономерностей модификации химического мутагенеза с помощью антимутагенов на организменном уровне использованы различные способы обработки объектов модификаторами. При добавлении препаратов в питательную среду, что обеспечивало продолжительную обработку личинок дрозофилы (табл. 2, опыты 1-5), производные 1,4-ДГИНК в целом оказывали защитное действие против ЭМС по тесту РСПЛМ. Ингибирующий эффект соединения IV (ДТП) проявлялся, начиная с дозы 30 мМ. Глутапирон (ГП) при концентрации 10-30 мМ проявлял стойкую тенденцию к снижению частоты ЭМС-индуцированных мутаций, достоверность которой доказана с помощью теста Cochran. При двухчасовой обработке отмытых личинок растворами ДГП (опыты 6-10) ингибирующий эффект зарегистрирован в диапазоне доз 30-250 мМ. Параллельно проверено влияние на ЭМС-мутагенез аминотиоловых радиопротекторов цистеина (Ц), цистеамина (ЦА) и фе-нольного антиоксиданта ионола. Следует отметить, что при добавлении в питательную среду только цистеин при максимальной концентрации (0.5 М) проявлял положительный эффект, снижая уровень ЭМС-мутагенеза на 1/3. Более эффективной оказалась кратковременная обработка отмытых личинок. Ионол в дозах, сравнимых с концентрациями ДГП, не изменял уровень ЭМС-индуцированной мутабильности половых клеток дрозофилы [Кужир, 19826; Goncharova, Kuzhir, 1989].

Анализ влияния модификаторов на кластогенность ЭМС при тех же условиях подтвердил защитный эффект ДГП, который при добавлении в питательную среду подавлял ЭМС-индуцированную эмбриональную летальность в диапазоне доз 0.030.25 М, а при воздействии на отмытые личинки, начиная с дозы 0.01 М [Кужир, 19826; Goncharova, Kuzhir, 1989]. Глутапирон при концентрации 20 мМ проявлял защитное действие по показателям ПЭЛ и СЛ, а в дозе 10 мМ достоверно снижал частоту химически индуцированных потерь половых хромосом у самцов, Y-хромосома которых маркирована геном В? [Кужир, 1999]. Таким образом, при кратковременном и продолжительном воздействии на личинки изученные производные 1,4-ДГИНК существенно снижали уровень ЭМС-индуцированных генных мутаций и хромосомных разрывов в половых клетках взрослых самцов.

Таблица 2

Влияние производных 1,4-ДГИНК на частоту ЭМС-индуцированных генных мутаций при обработке личинок дрозофилы

№ Доза ингибитора, М Обработка имаго ЭМС Проанализировано Частота

опыта Доза, М Экспозиция, ч самцов хромосом РСПЛМ, %

Обработка личинок путем добавления препаратов в корм

Контроль 0,025 10 111 1083 14,22

ДГП 0.01 0,025 10 142 1579 13,62

Контроль 0,010 10 142 1442 8,88

ДГП 0.01 0,010 10 131 1826 8,93

Контроль 0,010 36 45 574 45,30

3 ДГП 0.03 0,010 36 53 1061 30,54**

ДГП 0.10 0,010 36 44 1064 24,81**

л Контроль 0,025 10 40 876 17,69

ГП 0.01 0,025 10 46 835 14,85

Контроль 0,010 24 78 785 21,91

5 ГП 0.01 0,010 24 88 880 19,43

ГП 0.03 0,010 24 78 448 19,20

СосЬгап-тест для ГП: г = 2.29*

Обработка отмытых личинок 2 ч

Сахароза 1% 0,010 30 89 652 34,05

ДГП 0.25 0,010 30 95 1440 24,10**

Сахароза 1% 0,025 12 54 584 17,47

7 ДГП 0.01 0,025 12 52 450 15,11

ДГП 0.06 0,025 12 46 333 9,91**

Сахароза 1% 0,010 18 196 17,35

ДГП 0.15 0,010 18 165 9,09*

Сахароза 1% 0,010 24 62 394 24,62

9 ДГП 0.01 0,010 24 36 260 20,77

ДГП 0.05 0,010 24 54 382 19,11

10 Сахароза 1 % 0.010 36 40 406 50,98

ДГП 0.03 0,010 36 64 917 24,97**

Сос11гап-тест для ДГП 10 мМ: г = = 1.08

*Р <0.05; **Р<0.01

Как показывает табл. 3, при воздействии на имаго дрозофилы в течение 2-х сут до мутагенной обработки оба антиоксиданта (ДГП и феноксан) либо не изменяли частоту ЭМС-индуцированных РСПЛМ, либо проявляли потенцирующий эффект. По тестам, регистрирующим разрывы хромосом, их эффекты были неустойчивыми [Кужир, 1999]. Действие феноксана (КФ) зависело от дозы, повышение которой до 30 мМ усиливало кластогенность ЭМС и в сперматозоидах, и в сперматидах.

Эффекты синтетических антиоксидантов сравнивали с действием природного ан-тиоксидантного комплекса облепихового масла (ОМ). При добавлении ОМ в питательную среду при концентрации 1:200 уровень летальных разрывов хромосом и РСПЛМ, индуцированных ЭМС в сперматозоидах, не изменялся. При повышении концентрации до 1:50 и 1:100 этот препарат усиливал мутагенный эффект ЭМС, не влияя однако на его кластогенность. Предобработка имаго наименьшей дозой модификатора повышала му-табильность зрелых половых клеток почти на 1/3 [Кужир, 1999].

В исследованиях на дрозофиле выявлено, что процесс модификации химического мутагенеза под влиянием антиоксидантов подчиняется определенным закономерностям. При обработке личинок изученные соединения, как правило, подавляют мутагенез и кластогенез, вызванный в половых клетках взрослых самцов ал-килирующим агентом ЭМС. Сравнение эффективности защитного действия изученных антиоксидантов (рис. 2) свидетельствует о преимуществах производных 1,4-ДГИНК, защитное действие которых проявляется при минимальных концентрациях (10-30 мМ). Редуцирующая способность не связана с уровнем ЭМС-мутагенеза, но зависит от дозы антимутагена (рис. 3). При максимальных концентрациях эффективность ДГП достигает 45%.

При обработке антиоксидантами взрослых самцов модификация химического мутагенеза и кластогенеза протекает в основном со знаком "минус" (табл. 3, рис. 4). Уровень ЭМС-индуцированных генных мутаций не удается снизить ни с помощью производного 1,4-ДГИНК, ни под влиянием феноксана. Даже незначительное увеличение дозы антиоксидантов при этом способе обработки повышает уровень как генных мутаций, так и разрывов хромосом. По-видимому, тест, регистрирующий генные мутации, а также сперматиды (по этому тесту) более чувствительны к потенцирующему действию антиоксидантов.

Таким образом, модификация химического мутагенеза в половых клетках дрозофилы изменяется в зависимости от различных факторов: (1) стадии воздействия; (2) дозы антиоксиданта; (3) типа мутационной изменчивости. Если обработка личинок антиоксидантами, как правило, подавляет ЭМС-индуцированный мутагенез и кластогенез, то при обработке имаго спектр их действия изменяется от антимутагенного до потенцирующего. Степень защиты определяется дозой модификатора, но изменение условий его применения может инвертировать эффект. К потенцирующему действию модификаторов более чувствительны взрослые особи по срав-

нению с личинками и, возможно, сиерматиды по сравнению со зрелыми половыми клетками.

Таблица 3

Модификация мутагенного эффекта ЭМС (по частоте РСПЛМ) на двух стадиях сперматогенеза под влиянием предварительной обработки антиоксидантами имаго дрозофилы

Вариант Доза, мМ Ответ сперматозоидов Ответ сперматид

Количество Частота Количество Частота х2

хромосом РСПЛМ, % хромосом РСПЛМ, %

ЭМС 25 2955 33,03 1332 34,61 1,03

ДТП 10 1404 32,48 - -

ДТП 30 1615 37,96 478 43,93 5,52*

ЭМС 25 1797 35,11 1332 35,36 0,02

КФ 10 1361 36,00 806 42,31 4,44*

* Р < 0.05

40 30 20 10 0 -10

1/200 0.125 0.5 0 05 0.01 0.03 0.01-0.25

0ОМ ОЦА ЯИонол I

-10

0.25 0.01-0.25 0 01 0 02 1/50-1/200

■ ц пдгп пгп

Рис. 2. Эффективность антимутагенов (АМ) по их способности редуцировать уровень ЭМС-индуцированных РСПЛМ (а) и летальных разрывов хромосом (б) при воздействии на личинки дрозофилы

По оси абсцисс - концентрации АМ (относительные или в молях); по оси ординат - частота редуцированных мутаций, %

50 ■

40-

д л

г = 0.16

Рис. 3. Эффективность ДГП в зависимости от: (а) уровня ЭМС-мутагенеза _(частота РСПЛМ, %) и (6) дозы антимутагена (мМ)_

ю--10 -30 -50 -70

"0"

0.03 0.01 0.03 Сперматозоиды

0.0 0.01 0.03 Сперматиды

□ ДГП ИКФ

-5

-15

-25+

0.01 0.03 0.01 Сперматозоиды

0.03 0.01 Сперматиды

□ ДГП ИКФ

Рис. 4. Эффективность антимутагенов по их способности редуцировать уровень ЭМС-индуцированных летальных разрывов хромосом (а) и РСПЛМ (б)

По оси абсцисс - доза АМ в молях; по оси ординат — частота редуцированных мутаций, %

Для сравнения эффектов антимутагенов у дрозофилы и млекопитающих изучили влияние двух препаратов (ДГП и ГП) на выход ЭМС-индуцированных микроядер (МЯ) в полихроматофильных эритроцитах у мышей СБА хС57В1/6у Исследованы особенности модификации индуцированного кластогенеза в клетках костного мозга самцов, беременных самок и печени плодов при дробной фиксации материала (каждые 6 ч) в течение 72 ч после инъекции мутагена.

На самцах обнаружено, что частота микроядерных клеток увеличивается через 18 ч после инъекции ЭМС и достигает своего максимума при концентрации 300 мг/кг на 36 ч, а при концентрации 200 мг/кг на 24 ч [Кужир, 1999]. Как видно на

рис. 5а, ДГП в дозе 1/10 ЬП;о снижает уровень ЭМС-индуцированных микроядерных клеток, проявляя максимальный защитный эффект на пике образования микроядер. Аналогичные данные получены при действии ДГП и ГП (0.5-1 мМ) на кла-стогенез, индуцированный меньшей дозой мутагена (200 мг/кг).

25 -20 • 15 -10 5 Н 0

18 24 Время, ч

эмс-

■ДГП

25 20 15 10 5 0

Рис. 5. Ингибирующий эффект ДГП на ЭМС-кластогенез в клетках костного мозга самцов (а) и самок (б) лабораторных мышей

_По оси ординат - частота микроядерных клеток (%о)_

Изучение ЭМС-индуцированного кластогенеза в соматических клетках беременных самок и их плодов показало, что этот мутаген проникает через плацентарный барьер и индуцирует микроядра не только в клетках костного мозга материнского организма, но и печени плода. Подтверждено, что ЭМС в дозе 300 мг/кг продуцирует пик микроядер в клетках взрослых особей на 36 ч с достаточно резким падением уже на 48 ч после введения мутагена. У плодов зарегистрировано повышение частоты этих событий на 18 и 24 ч. Доза ДГП, эффективная для самцов, оказала защитное действие и у самок (рис. 56), но не повлияла на выход микроядер в клетках печени плодов [Кужир, 1999].

Таким образом, производные 1,4-ДГИНК подавляют ЭМС-кластогенез в соматических клетках млекопитающих. Анализ динамики образования микроядер и соотношения поли- и нормохроматофильных эритроцитов в течение 72-х часов после инъекции мутагена показал, что модификаторы (ДГП и ГП) не оказывают токсического действия на костный мозг и не изменяют динамику образования микроядер, а значит, их антимутагенный эффект является реальным. Характерно, что у самцов и беременных самок установлены одни и те же закономерности модификации химического кластогенеза. У плодов, подвергавшихся антимутагенному и мутагенному воздействию в материнском организме, изученный антиоксидант (ДГП) не снижал

частоту микроядерных клеток, что, вероятно, можно объяснить недостаточной экспозиционной дозой антимутагена.

Анализ всех результатов показывает, что антиоксиданты могут быть использованы в качестве защитных средств против действия мутагенов прямого действия, и в частности, против алкилирующих агентов. Среди изученных соединений выделены наиболее эффективные, которые способны (при оптимальных условиях) уменьшать почти наполовину мутагенные и кластогенные эффекты модельного мутагена этилметансульфоната [Кужир, 19826; Goncharova, Kuzhir, 1989; Гончарова и др., 1995]. Полученные данные вносят определенный вклад в дальнейшее развитие представлений о специфичности действия антимутагенов при химическом мутагенезе. Неоднозначность эффектов в одинаковой степени характерна для синтетических и природных антимутагенов. Эта особенность достаточно хорошо проанализирована по отношению к мутагенам и канцерогенам [Stich, 1991; De Flora et al., 1994; Stavric, 1994; Ferguson, 1994]. Co своей стороны, мы показали, что эффекты антимутагенов против одного и того же мутагена изменяются в зависимости от экспериментальных условий: дозы, способа воздействия и состояния внутриклеточной среды. Эти данные имеют прикладное значение и могут быть использованы как для организации скрининга антимутагенов, так и для выработки стратегии их практического применения.

СТАНОВЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКИ ИНДУЦИРОВАННЫХ МУТАЦИЙ НА ПРИМЕРЕ ДЕЙСТВИЯ ЭТИЛМЕТАНСУЛЬФОНАТА У ДРОЗОФИЛЫ

Одной из возможных точек приложения антимутагенов является завершающий этап химического мутагенеза, на котором происходит преобразование первичных повреждений ДНК в мутационные события. Для изучения этого процесса использовано хранение мутагенизированной спермы в семяприемниках самок дрозофилы, которых после оплодотворения несколько раз пересаживали на новую среду. Частоту ЭМС-индуцированных изменений учитывали в 1-й, 3-й и 5-й посадках, соответствующих хранению спермы в течение 1-2,6-7 и 13-14 сут.

Результаты сравнения реакции на хранение РСПЛМ и ЭЛ после воздействия ЭМС в дозе 25 мМ в течение 10 ч представлены на рис. 6. Видно, что в 1-й посадке частота ЭМС-индуцированных РСПЛМ многократно превосходит уровень эмбриональной летальности, что подтверждает преимущественную способность ЭМС индуцировать точковые мутации [Sega, 1984; Vogel, Natarajan, 1979а]. Увеличение периода кормления вдвое привело к повышению частоты РСПЛМ с! 7,46 до 27,35% [Кужир, Даливеля, 1993а, 1994]. Хранение мутагенизированной спермы практически не повлияло на частоту РСПЛМ, тогда как выход эмбриональных деталей существенно увеличился.

контроль 2-я 3 -я 4-я 5 -я посадки

Рис. 6. Динамика выхода ЭМС-индуцированных РСПЛМ и ЭЛ при хранении обработанной спермы у самок в течение 2-х недель

_По оси ординат — частота событий, %_

В дальнейшем детально изучено влияние хранения мутагенизированной спермы у самок на ЭМС-кластогенез по летальности потомков (ЭЛ, ПЭЛ, СЛ) и частоте нелетальных разрывов хромосом. В этих экспериментах использованы линии, содержащие в Y-хромосоме транслоцированные участки Х-хромосомы (Bs или у*), которые позволяли по исключительным фенотипам в F, выявлять потери половых хромосом (ППХ). Частоту ЭМС-индуцированных ППХ, обусловленных разрывами хромосом, определяли по разнице количества самцов Berlin и самок + / Y • Bs или самцов ct v и самокy+ct+v.

Установлено, что динамика накопления характерна не только для ЭМС-индуцированных эмбриональных леталей, но и для повреждений, вызывающих летальность потомков на других стадиях [Кужир, Даливеля, 19936; Кужир, 1999]. Частота летальных разрывов хромосом зависит от экспозиционной дозы мутагена, при этом процент индуцированных событий, вычисленный в соответствии с поправкой Abbott, существенно увеличивается вместе со сроком хранения (рис. 7а). Такие же тенденции характерны для ЭМС-индуцированных нелетальных разрывов хромосом (ППХ) [Кужир, Даливеля, 19936]. Зависимость кластогенного эффекта ЭМС от сроков хранения доказана с помощью корреляционного анализа (рис. 76).

Реализация ЭМС-индуцированных генных мутаций (в данном случае РСПЛМ) и разрывов хромосом подчиняется разным закономерностям, что предполагает вклад разных первичных повреждений ДНК. Динамика ЭМС-кластогенеза при хранении свидетельствует о том, что ответственные за разрывы хромосом аддукты подвергаются изменениям, несмотря на то, что индуцированы в зрелых сперматозоидах, где хроматин конденсирован и ДНК не доступна для репарирующих ферментов. Таким аддуктом может быть 7-этилгуанин. Спонтанный гидролиз глико-•зидных связей приводит к выпадению модифицированного основания с образованием на его месте апуринового (АР) сайта. По-видимому, именно эта ступень преобразования 7-этилгуанина играет определяющую роль в кластогенезе. На рис. 8.

видно, что процессы накопления АР-сайтов (теоретические кривые, полученные на основании сведений о среднем периоде "полужизни" 7-этилгуанина [Вегапек, 1990]) и ЭМС-индуцированных разрывов хромосом (кривые, отражающие динамику событий в эксперименте) имеют общие тенденции.

30 25

15 10

г 2

—1—1—г-^ -гз- - -а

1ИФ

эл

-пэл •

-сл

5_10

| осл onrixl

Рис. 7. Эффект хранения: а) эмпирические данные; б) зависимость эффективности мутагена по частоте летальных (СЛ - Yi) и нелетальных (ППХ - Уг) разрывов хромосом

от сроков хранения мутагенизированной спермы у самок

По оси абсцисс - время хранения, сут; по осям ординат - частота событий, %. На рис. 7 сплошной линией обозначена обработка мутагеном (12.5 мМ); прерывистой-спонтанный уровень событий; ИФ - частота индуцированных событий с поправкой Abbott.

14 сут

По осям ординат: Yi — частота ЭМС-индуцированных событий относительно стартовых значений (3 - ППХ, 4 - CJI); Y2 - теоретически ожидаемые частоты образования АР-сайтов in vivo (1) и in vitro (2), вычисляемые по формуле: Y = 1 - ехр(-0,693 t/h), где h - время полужизни этилированного основания (0.5-6.1 и 6.2-9.4 дней соответственно)

Рис. 8. Динамика депуринизации ДНК и возникновения летальных (СЛ) и нелетальных (ППХ) разрывов хромосом при хранении_

Аддукты ДНК или вызванные ими спонтанные модификации (например, АР-сайты) сохраняются в сперматозоидах до оплодотворения. В их первичной обработке участвуют ферменты яйцеклетки, поэтому их судьба во многом зависит от состояния материнских систем репарации [МепёеЬоп, 1974; АУй^ег й а1., 1986]. Исследован процесс реализации ЭМС-индуцированных разрывов хромосом при

хранении мутагенизированной спермы у самок с разной репарационной способностью [Кужир, Даливеля, 1993в; Кужир, 1999]. Судя по данным табл. 4, дефект экс-цизионной репарации у самок пш-9 повышает частоту ЭМС-индуцированных разрывов хромосом, что проявляется увеличением поздней эмбриональной и постэмбриональной летальности. Наоборот, дефект пострепликативной репарации у самок теь41, снижает кластогенный эффект ЭМС. Эти тенденции наиболее заметны при вычленении частоты событий, отражающих вклад мутагена (рис. 9). В среднем этот фактор по СЛ составляет 19.09+0.11% при хранении мутагенизированной спермы у самок те1-9 по сравнению с 15.55+0.08% у контрольных самок и 12.75+0.06 у самок те!-41 по сравнению с 17.82+0.09 в контроле. Различия достоверны при Р < 0.01.

На основании полученных данных можно заключить, что первичным повреждением ДНК, ответственным за образование ЭМС-индуцированных разрывов и перестроек хромосом в половых клетках дрозофилы, является моноаддукт 7-этилгуанин, а в качестве непосредственного предшественника (предмутационного повреждения) выступают АР-сайты. Об этом свидетельствует не только динамика кластогенеза при хранении мутагенизированной спермы у самок, но и повышение его уровня на фоне материнского дефекта эксцизионпой репарации.

Таблица 4

Влияние дефектов материнских систем репарации на ЭМС-кластогенез

Вариант Выборка Летальность потомков в онтогенезе, %

обработки яиц ЭЛ | ПЛ ПЭЛ СЛ

Berlin wild (mei-9*)

Контроль 11171 8,33 0,62 10,86 18,25

ЭМС 25 мМ 9906 14,20 1,79 17,81 29,42

mei-9 '*' (дефект эксцизионной репарации)

Контроль 7735 3,93 0,56 11,08 14,62

ЭМС 25 мМ 7695 13,26 2,40* 19,61* 29,92

mei-41+

Контроль 11570 7,90 0,53 9,25 16,50

ЭМС 25 мМ 11309 15,30 1,49 18,57 30,65

mei-4l"s (дефект пострепликативной репарации)

Контроль 11835 7,00 1,67 12,26 18,40

ЭМС 25 мМ 11719 13,53* 2,36 17,22* 28,36*

Примечание. В таблице представлены средние значения, полученные на основании нескольких повторностей (экспериментов и посадок). Звездочкой отмечены достоверные различия между средними по критерию х2 (Р < 0.05). Сравнение сопряженных выборок с помощью теста Cochran показало, что показатели СЛ под влиянием ЭМС выше при наличии дефекта эксцизионной репарации (z = 4.52, Р < 0.01) и ниже на фоне нарушения пострепликативной репарации (z = 4.28, Р < 0.01).

Ось ординат - частота индуцированных событий с поправкой Abbott ( PJI - ранняя, ГШ — поздняя эмбриональная летальность; ПЭЛ - постэмбриональная и СЛ - суммарная летальность потомков), %. "Норма" соответствует линиям без установленных дефектов репарации.

Рис. 9. Сравнение эффективности ЭМС при хранении мутагенизированной спермы у самок с разной репарационной способностью

Исследовано влияние ЭМС на частоту возникновения РСПЛМ в половых клетках с различной интенсивностью репарационных процессов. Использован метод последовательных 2-суточных перекидок обработанных самцов к новым вир-гинным самкам. Учитывали мутационный ответ сперматозоидов (1-я посадка) и премейотических клеток: сперматоцитов и сперматогониев (4-я и 5-я посадки). Одновременно исследовали выживаемость самцов и их стерильность. Все эти показатели сравнивали у полноценных самцов (дикого типа или с желтым телом: yellow и у ctv) и с дефектом эксцизионной репарации mei-Ф' или C(l) DX, yf/y mei-9\

В посадках, отражающих вклад половых клеток, обработанных на премейотических стадиях сперматогенеза, продуцировалось меньше потомков F| по сравнению с первыми посадками, при этом стерильность (частота культур, не давших потомства) больше свойственна желтым самцам, в том числе дефектным по репарации (рис. 10). Изучение мутабильности половых клеток на разных стадиях сперматогенеза показало, что у самцов дикого типа происходит снижение частоты ЭМС-индуцированных РСПЛМ в сперматогониях по сравнению со сперматозоидами более чем в 5 раз. У желтых самцов это падение не столь заметно (рис. 10, табл. 5).

Неодинаковый уровень РСПЛМ в сперматозоидах и сперматогониях обусловлен различиями в этилировании ДНК, которые ранее выявлены с помощью радиоактивной метки [Jenkins et al., 1967; Sega, 1984]. Количество продуктов этилирова-ния в свою очередь зависит от активности репарационных процессов. Полученные данные свидетельствуют о том, что на премейотических стадиях сперматогенеза происходит интенсивная безошибочная репарация первичных повреждений ДНК, ответственных за образование генных мутаций. Особенно это характерно для самцов дикого типа. Известно, что основным аддуктом, ответственным за возникновение генных мутаций является Об-алкилгуанин, а его репарация осуществляется О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазой, которая недавно обнаружена и у дрозофилы [Guzder et al., 1991]. По-видимому, снижение частоты ЭМС-индуцированных РСПЛМ на премейотических стадиях сперматогенеза, обусловлено действием

именно этого фермента. Нельзя исключить влияние эксцизионной репарации, работающей преимущественно без ошибок. Вклад этой системы в алкилирующий мутагенез на дрозофиле был впервые показан Vogel с соавторами (1985), которые наблюдали примерно двукратное увеличение частоты ЭМС-индуцированных РСПЛМ на фоне мутаций mei-9и и mus(2)-20lD1 по сравнению с клетками дикого типа. Об этом же свидетельствуют и данные табл. 5.

100

сперматозоиды Berlin mpi-q У ctv

сперматогонии

у mei-9

Berlin

yctv

у т el-9

к эмс

эмс

I РСПЛМ П Фертильность

ЭМС

Рис. 10. Влияние ЭМС на фертильность самцов и мутабильность их половых клеток в зависимости от стадий сперматогенеза

По оси ординат - частота РСПЛМ и фертильных самцов, %_

/—>

Таблица 5

ЭМС-индуцированная мутабильность половых клеток в зависимости от их репарационной способности (данные анализа по тесту Cochran)

Стадия сперматогенеза Количество Средняя частота РСПЛМ, % Критерий z

самцов хромосом

сперматозоиды сперматогонии 263 136 самцы yellow 3692 2442 20,73 14,50 15,85*

самцы у mei-9"

сперматозоиды 274 3490 16,17

сперматогонии 151 3104 14,82 0,41

*Р<0.01

Нами обнаружены некоторые особенности, связанные с генотипом использованных линий. У самцов у те'1-91 частота РСПЛМ в сперматогониях почти не отличается от их уровня в сперматозоидах, т.е. большая часть первичных повреждений

ДНК остается нерепарированной. Это указывает на участие эксцизионной репарации в мутационном процессе. У самцов дикого типа сперматозоиды намного чувствительнее к ЭМС, чем сперматоциты и сперматогонии, тогда как у самцов с желтым телом (у и у ct v) различия в мутабильности пре- и постмейотичеких стадий сперматогенеза не превышают 1,5 раз (табл. 6). Эти факты становятся понятными, если предположить, что у желтых самцов подавлены другие репарационные системы, участвующие в становлении генных мутаций. В данном случае к их числу можно отнести алкилтрансферазы и ферменты, устраняющие ошибки спаривания оснований.

Таблица 6

Анализ чувствительности к мутагену лремейотических половых клеток самцов yellow по сравнению с самцами дикого типа

Количество Частота РСПЛМ, % Отношение

Фенотип хромосом эмпирическая теоретическая 1 частот РСПЛМ спз / спг2

yellow 2442 14.50 14.50 1.43

Berlin 538 3.16 3.70* 5.60

Примечание. Для половых клеток дикого типа рассчитана теоретически ожидаемая частота РСПЛМ в том случае, если бы на стадии зрелой спермы ЭМС вызывал 20.73% мутаций - такую же частоту, как у самцов yellow.

Соотношение частот мутаций в сперматозоидах (спз) и сперматогониях (спг) получено на основании экспериментальных данных (17.71/3.16 для дикого типа и 20.73/14.50 для yellovt)

Таким образом, установлены следующие закономерности ЭМС-мутагенеза и

кластогенеза в половых клетках дрозофилы:

• Хранение мутагенизированной спермы у самок приводит к существенному повышению частоты летальных и нелетальных разрывов хромосом, но не влияет на частоту генных мутаций, предполагая вклад разных адцуктов ДНК.

• ЭМС-кластогенез контролируется материнскими системами репарации.

• Динамика ЭМС-кластогенеза при хранении и противоположное влияние на этот процесс материнских дефектов эксцизионной и пострепликативной репарации указывают на то, что за образование разрывов хромосом отвечают АР-сайты.

• Частота ЭМС-ицдуцированных РСПЛМ зависит сгг стадий сперматогенеза и га гатипа самца.

• Самцы у mei-9' отвечают на действие мутагена одинаковой мутабильностыо пост- и премейотических половых клеток. Это указывает на участие эксцизионной репарации в восстановлении поврежденной структуры ДНК и в то же время свидетельствует о нарушении функционирования других систем репарации, участвующих в становлении генных мутаций. По-видимому, этот неизвестный де-

фект или супрессия соответствующих генов связаны с фенотипом yellow, что может объяснить фактически полное отсутствие репарации в сперматогонияхд' mei-9P.

ВЛИЯНИЕ АНТИМУТАГЕНОВ НА РЕПАРАЦИЮ ХИМИЧЕСКИ ИНДУЦИРОВАННЫХ РАЗРЫВОВ ХРОМОСОМ И ГЕННЫХ МУТАЦИЙ В ПОЛОВЫХ КЛЕТКАХ ДРОЗОФИЛЫ

Учитывая вклад репарации ДНК в химический мутагенез, представляло интерес изучить модуляцию этого процесса под влиянием антимутагенов. Эту возможность при ЭМС-кластогенезе изучали при: 1) предварительной и последовательной обработке антиоксидантами мутагенизированных сперматозоидов; 2) обработке ан-тиоксидантами личинок, различающихся по репарационной способности; 3) обработке антиоксидантами полноценных и репарационно-дефектных самок.

При воздействии на сперматозоиды самцов yv/Y-y* до и после их обработки мутагеном антиоксиданты (ДГП 10 и 50 мМ и ГП 10 мМ) не влияли на ЭМС-индуцированную летальность потомков в онтогенезе (рис. 11а), но в тех же дозах уменьшали частоту ППХ (рис. 116). Ингибирующие эффекты, как правило, проявлялись в 5-й посадке, соответствующей хранению спермы в течение 13-14 сут и наиболее высокому уровню ЭМС-индуцированных событий. Защитный эффект производных 1,4-ДГИНК, выявленный при постобработке самцов-имаго, может свидетельствовать о влиянии этих антимутагенов на процессы становления хромосомных мутаций.

100

50 -

эмс

25мМ

ДГП 50мМ

ЭМС 12,5мМ

ДГП ЮмМ

13 5 13 5 предобработка

□ ЭЛ ИПЛ ППЭЛ

13 5 13 5 постобработка

1, 3, 5 - посадки

2 п

1.5

°::JHl

12,5 10 10

предобработка

12,5 10 ЮмМ постобработка

|иэмс рдгп агп|

Рис. 11. Влияние производных 1,4-ДГИНК на ЭМС-индуцированные летальные (а) и нелетальные разрывы хромосом (б) при пред- и постобработке взрослых самцов

Ось ординат - частота событий, %

В ряде экспериментов использованы самцы Berlin wild, mei-9^' и mei-4105, Y-хромосома которых содержит транслоцированный участок ^'-хромосомы с локусом Bs. Личинки выращивались на среде, содержащей глутапирон, а взрослые самцы обрабатывались ЭМС и спаривались с интактными самками дикого типа. В одних и

тех же культурах учитывали летальность потомков Р| и исключительные фенотипы, свидетельствующие о потере X или У-хромосомы сперматозоидом.

Установлено, что обработка глутапироном личинок "нормального" генотипа эффективно защищает половые клетки взрослых самцов от последующей индукции летальных и нелетальных разрывов хромосом. В отличие от этого, самцы с нарушениями эксцизионной и пострепликативной репарации оказались нечувствительными к обработке антимутагеном (Рис. 12). Защитный эффект, наблюдаемый при предобработке личинок, которая на несколько суток опережает воздействие мутагена, предполагает опосредованные механизмы действия производных 1,4-ДГИНК. Возможно, антиоксиданты индуцируют эндогенные компоненты, участвующие в де-токсикации ксенобиотиков, либо способствуют активизации безошибочных систем репарации. И в том, и другом случае, клетка оказывается подготовленной к встрече с мутагеном.

пп + пэл__ппх

| -' 1 ВегНп

Рис. 12. Сравнение модифицирующих эффектов глутапирона при обработке личинок, полноценных и дефектных по системам эксцизионной (те/-9и) и пострепликативной (те'1-4105) репарации

1 и 5 - посадки (без хранения и 12-14 сут хранения спермы у самок); темной штриховкой обозначена обработка имаго мутагеном, светлой - предварительная обработка личинок _глутапироном (10 и 20 мМ); по оси абсцисс - частота событий, %_

Наиболее детально изучено влияние некоторых антиоксидантов на материнскую репарацию первичных повреждений ДНК, ответственных за возникновение разрывов хромосом (табл. 7). При этом антимутагенной обработке подвергались самки, тогда как мутаген воздействовал на самцов. Все изученные антиоксиданты в той или иной степени положительно влияли на функционирование нормальных материнских систем репарации, что приводило к подавлению ЭМС-кластогенеза. У самок с дефектами эксцизионной и пострепликативной репарации {те1-(/' и те'1-411 ъ соответственно) изученные антиоксиданты проявляли неустойчивое, а иногда противоположное действие [Кужир, Даливеля, 1993а; КигЫг, ОопсЬаго\а, 1997;

Кужир, 1999]. Однако при обработке самок те'1-Ф' ДГП и ГП все же снижали уровень ЭМС-индуцированной летальности потомков в онтогенезе, тогда как при обработке самок те1~4105 изученные препараты либо не изменяли, либо увеличивали кластогенность этилметансульфоната.

Таблица 7

Влияние антиоксидантов на материнскую репарацию первичных повреждений, ответственных за возникновение разрывов хромосом (средние значения показателей)

Вариант Выборка Летальность потомков, %

обработки яиц ЭЛ ПЛ ПЭЛ СЛ

самки тс1-9+те'1-41+

Сахароза, ЭМС 13954 23,10 2,85 20,73 38,61

ДГП, ЭМС 13625 21,06 2,72 17,44 34,19*

ГП, ЭМС 11041 18,31 1,95 14,71 29,65*

Д, ЭМС 12803 24,10 3,14 17,90 36,76*

КФ, ЭМС 9069 18,27 2,56 18,27 35,37*

самки те'1-91''

Сахароза, ЭМС 7509 18,40 3,80 14,15 29,32

ДГП, ЭМС 7488 15,32 2,65 11,07 24,49*

ГП, ЭМС 6437 14,40 2,56 11,75 24,27*

Д, ЭМС 4793 22,26 3,38 13,81 32,57*

КФ, ЭМС 2129 17,80 3,24 19,63 33,72*

самки те'1-4105

Сахароза, ЭМС 8821 14,02 1,88 11,48 23,70

ДГП, ЭМС 6329 15,39 2,45 11,17 24,55

ГП, ЭМС 7240 13,01 2,88 12,30 23,56

Д, ЭМС 7219 15,22 - 14,35 27,57*

КФ, ЭМС 4608 15,89 - 26,19 37,13*

*Р <0.01

На рис. 13 представлены средние значения РФ, характеризующие эффективность изученных антиоксидантов при обработке полноценных в репарационном отношении (контроль) и дефектных самок теьЯ1' и те1-411Ъ. Видно, что РФ имеет достаточно большой размах колебаний по повторностям, особенно при дефектах репарации. Эти колебания могут быть вызваны разными причинами. С помощью корреляционного анализа (рис. 14) исключено влияние таких факторов, как уровень химически индуцированных событий или недостатки тест-системы.

те/-9

те/'-41

□ ЭЛ ШГШ ЕПЭЛ ИСЛ

ИГЛ ВДГП ОД ИКФ

Рис. 13. Эффективность защитного действия изученных антиоксидантов при обработке репарационно-полноценных (а) и дефектных (б) самок

По оси ординат - средние значения РФ, %. На рис. 136 показаны ошибки средних по отношению к числу гювторностей (опытов и посадок). Ошибки средних по отношению к выборке яиц не превышали ±0.3%.

30 25-

го

15 10 50-5-10-15

30 40

о ГП ДДГП

80 40 0 -10-80 -120 -160

60 70

□ Контроль о те1-9 д теМ1

Рис. 14. Зависимость эффективности антимутагенов от уровня ЭМС-кластогенеза (а); соответствие эффектов по эмбриональной и поздней эмбриональной летальности

На рис. 14а) по оси ординат - частота редуцированных СЛ (%) при кормлении АМ репарационно-активных самок; по оси абсцисс - частота ЭМС-индуцированных СЛ. На рис. 146) по оси ординат - частота редуцированных ПЛ, по оси абсцисс - ЭЛ, %.

Эффективность антимутагенов при обработке самок зависит от репарационной способности их ооцитов. Нарушения в системах репарации приводят либо к полной утрате самками чувствительности к защитному действию изученных препаратов (теи41), либо их реакция неоднозначна (те1-9). Защитный эффект стабильно проявляется только у самок, репарационные системы которых функционируют нор-

малыю. Таким образом, определяющее значение для реализации антикластогенного потенциала имеет состояние материнских систем репарации.

Этот же подход использовали при изучении влияния антимутагенов на репарацию аддуктов алкилирования, ответственных за возникновение генных мутаций. Показано, что кормление глутапироном самок дикого типа (табл. 8) способствует снижению частоты РСПЛМ, индуцированных ЭМС в сперматозоидах.

Таблица 8

Влияние ГП (10 мМ) на материнскую репарацию ЭМС-индуцированных первичных повреждений, ответственных за генные мутации (кормление самцов ЭМС б мМ, анализ мутационного ответа сперматозоидов)

Доза AM, мМ Самки Berlin wild Самки у et V

количество хромосом частота РСПЛМ, % количество хромосом частота РСПЛМ, %

сахароза 510 24,12 405 20,00

ГП 10 790 17,85* 811 18,86

*Р <0.01

Для изучения возможного влияния антимутагенов на репарацию ДНК у самцов их сначала кормили глутапироном (5-10 мМ, 2 сут), а затем мутагеном (6 и 12.5 мМ, 20-24 ч), после чего каждые двое суток спаривали с новыми виргинными самками Base, добиваясь последовательной реализации половых клеток, обработанных на разных стадиях сперматогенеза. Сравнивали мутабильность половых клеток без установленных дефектов репарации (дикий тип, у cl v и у) с имеющими дефект в системе эксцизионной репарации (mei-9и и у mei-91). Параллельно исследовали жизнеспособность и плодовитость самцов, эти показатели анализировали по частоте неразвившихся культур в F|, либо учитывали отдельно частоту погибших особей и особей не давших потомства. Установлено, что ЭМС негативно влияет на плодовитость самцов, которая особенно резко снижается на премейотических стадиях сперматогенеза. Характерно, что самцы yellow оказываются столь же (если не более) восприимчивыми к стерилизующему действию мутагена, как и самцы с дефектом эксцизионной репарации. ГП при предварительной обработке личинок и имаго либо не изменяет, либо незначительно улучшает физиологические показатели [Ку-жир, 1999].

Данные табл. 9 показывают, что глутапирон не изменяет количество пораженных особей, однако индивидуальная защита при определенных условиях осуществляется за счет снижения частоты половых клеток, несущих мутации. Антиоксидант не влияет на частоту ЭМС-индуцированных мутаций в сперматозоидах независимо

от наличия или отсутствия в них дефекта эксцизионной репарации. Премейотиче-ские стадии сперматогенеза проявляют дифференциальную чувствительность к антимутагену: защитный эффект наблюдается только в клетках без явных нарушений репарации. Эти данные указывают на то, что глутапирон вмешивается в репарационные процессы, участвующие в становлении ЭМС-индуцированных генных мутаций, и способствует частичному устранению соответствующих аддуктов ДНК.

Таблица 9

Влияние глутапирона на ЭМС-индуцированную мутабильность половых клеток в зависимости от их репарационной способности

Выборка самцов Количество особей с мутациями, % 1-я посадка 4—5-я посадки

Вариант обработки количество хромосом частота РСПЛМ, % количество хромосом частота РСПЛМ, %

самцы yellow

Сахароза 144 85,06 1718 29,07 642 23,38**

ГП 200 86,74 2597 27,17 689 19,38

Cochran-тест для ГП z = 0.61 z= 1.06 z= 1.92*

самцы у mei-9"

Сахароза 364 77,65 3511 16,74 3102 17,21

ГП 5 401 73,69 3744 17,98 2715 16,33

Cochran-теет для ГП z = 0.24 z = 0.79 z = 0.44

*Р < 0.05

Таким образом, изученные антиоксиданты при воздействии на материнский организм существенно снижают частоту генных мутаций и разрывов хромосом, индуцированных этилметансульфонатом в сперматозоидах дрозофилы. При предобработке взрослых самцов глутапирон подавляет мутабильность только премейоти-ческих половых клеток без явных дефектов репарации. Эти факты свидетельствуют о влиянии производных 1,4-ДГИНК на репарационные процессы, вовлеченные в химический мутагенез. Особи с дефектами репарационных систем менее чувствительны к антимутагенам, показывая, что для реализации защитного потенциала необходимо их нормальное функционирование.

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ АНТИМУТАГЕНОВ ПРИ ХИМИЧЕСКОМ МУТАГЕНЕЗЕ. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Как известно, спонтанный мутагенез обусловлен ошибками репликации, репарации и рекомбинации ДНК. По современным представлениям большую роль в этом процессе играют свободные радикалы кислорода, которые образуются в организме в ходе нормального метаболизма и при многих патологических состояниях. В работе показано, что производные 1,4-ДГИНК с наиболее высокими показателями антиоксидантной и электронодонорной активности эффективно снижают уровень спонтанных мутаций в половых клетках дрозофилы, влияя, по-видимому, именно на эту составляющую мутагенеза. Кроме того, соединения этой группы по своей химической структуре аналогичны никотинамидным коферментам, участвующим в транспорте электронов. Возможно, эти вещества могут служить дополнительным источником энергии, повышая точность репликации и репарации ДНК.

Производные 1,4-ДГИНК in vivo защищают половые клетки дрозофилы и соматические клетки мыши от действия ЭМС, снижая уровень генных мутаций и хромосомных нарушений. Они являются более эффективными ингибиторами химического мутагенеза, чем цистеин, цистеамин, производные фенола и облепиховое масло. Однако для проявления их антимутагенного потенциала необходимы определенные условия. В опытах на дрозофиле показано, что защитные эффекты изученных препаратов наиболее выражены и устойчиво проявляются при заблаговременном воздействии на личинки. При последовательном применении антимутагенов и ЭМС у имаго уровень химического мутагенеза и кластогенеза либо не изменяется, либо повышается. Оба результата указывают на то, что в условиях целостного организма антимутагены действуют преимущественно опосредованным путем. Известно, что производные 1,4-ДГИНК (в частности, дилудин) повышают содержание эндогенного глутатиона, витаминов С и Е [Вальдман и др., 1977]. Обезвреживание ЭМС у млекопитающих происходит путем его конъюгации с глутатионом [Roberts, Wazwich, 1985]. Следовательно, можно предположить, что эти препараты влияют на системы, участвующие в детоксикации электрофилов.

Из опосредованных механизмов наиболее детально изучено влияние антиок-сидантов на репарационные процессы. Установлено, что при воздействии на самок дрозофилы антимутагены снижают уровень разрывов хромосом и генных мутаций, индуцированных ЭМС в сперматозоидах. Предобработка глутапироном всего пула половых клеток у взрослых самцов приводит к снижению ЭМС-мутагенеза только на премейотических стадиях сперматогенеза. Дефекты репарации уменьшают чувствительность половых клеток (ооцитов и сперматогониев) к антимутагенам. Все эти факты свидетельствуют о том, что производные 1,4-ДГИНК, также как и некоторые другие антиоксиданты, способны модулировать репарацию ДНК.

Анализ собственных результатов и данных литературы свидетельствует о разнообразии эффектов и множественных механизмах действия антиоксидантов при химическом мутагенезе. Схематически они представлены на рис. 15.

Системы антиоксидантной (АО) защиты: АО ферменты; эндогенные АО; металлосвязывающие белки; АО компоненты крови и др.

Экранирование нуклеофильных сайтов; изменения конформации, оптимизирующие работу ферментов репликации и репарации

стимуляция / индукция безошибочных систем; оптимизация работы ферментов; подавление склонной к ошибкам репарации

Регуляция защитных реакций на посттрансляционном уровне

вмешательство в биоэнергетические процессы, влияние на поли-АОР-рибозилирование и апоптоз

Рис. 15. Механизмы действия антимутагенов при химическом мутагенезе _у высших эукариотических организмов_

Важнейшей составляющей процесса модификации химического мутагенеза является внутриклеточная среда, которая способствует или препятствует реализации тех или иных механизмов действия антимутагенов / антиоксидантов. В условиях целостного организма антимутагены могут действовать как индукторы или модуляторы защитных, в том числе репарационных систем.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучен процесс модификации химического мутагенеза под влиянием антимутагенов / антиоксидантов у высших эукариот. На основании полученных данных сделаны следующие выводы:

1. Среди производных 1,4-ДГП выявлены эффективные антимутагены, подавляющие спонтанную мутабилыюсть половых клеток дрозофилы на 30-50%. Антимутагенное действие обусловлено химической структурой соединений, а именно замещением в 4-м положении. Установлена симбатная зависимость антимутагенной активности от антиоксидантной способности одноядерных производных 1,4-ДГП. Обнаружена тесная корреляция между их эффективностью (РФ) и электронодонор-ной способностью [1^, 6, 7].

2. Показано, что уровень ЭМС-индуцированных летальных и нелетальных разрывов хромосом увеличивается при хранении мутагенизированной спермы у самок. Динамика образования разрывов хромосом соответствует динамике гидролиза 7-этилгуанина и накоплению АР-сайтов [1, 21,23].

3. Уровень ЭМС-кластогенеза контролируется материнскими системами репарации: дефект эксцизионной репарации повышает, тогда, как дефект пострегошка-тивной репарации при некоторых условиях уменьшает кластогенность алкилирую-щего агента [1, 22, 28].

4. Частота ЭМС-индуцированных рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ) не изменяется в процессе хранения мутагенизированных сперматозоидов у самок, что указывает на внутрилокусную природу этих событий. У самцов дикого типа выход ЭМС-индуцированных генных мутаций на премейотиче-ских стадиях сперматогенеза ниже в 5 раз по сравнению со сперматозоидами. У самцов yellow с дефектом эксцизионной репарации мутабильность пре- и постмейо-тических половых клеток практически не различается [1, 21, 23, 26, 27, 29].

5. При обработке личиночной стадии развития самцов дрозофилы изученные антимутагены защищают половые клетки взрослых особей от действия ЭМС. Производные 1,4-ДГИНК наиболее эффективны по сравнению с другими изученными антиоксидантами (аминотиоловыми соединениями, производными фенола, природным антиоксидантным комплексом облепихового масла). Эффективность защитного действия этих соединений зависит только от их концентрации в среде культивирования личинок [1, 5,7, 19, 24].

6. При обработке взрослых самцов дрозофилы изученные антиоксиданты проявляют разнонаправленные эффекты: от защитных до комутагенных. Препарат ди-

гидропиридинового ряда и феноксан существенно повышают частоту ЭМС-индуцированных РСПЛМ в сперматидах по сравнению со сперматозоидами [1, 24].

7. Установлена динамика образования микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга самцов и самок гибридных мышей СБА *С57В1/6] с максимальным выходом на 24-36 ч после воздействия ЭМС. Антиоксиданты (ДТП и ГП) снижают частоту ЭМС-индуцированных микроядерных клеток, защитный эффект наиболее выражен на пике образования микроядер [1].

8. Изученные антиоксиданты при обработке полноценных в репарационном отношении. самок существенно снижают частоту летальных разрывов хромосом, индуцированных ЭМС в сперматозоидах. При этих же условиях они не эффективны на фоне дефекта пострепликативной репарации. Их защитное действие носит нестабильный характер на фоне дефекта эксцизионной репарации. Защитный эффект изученных антиоксидантов опосредован материнскими системами репарации [1, 23, 24,26,27].

9. При воздействии на материнский организм глутапирон снижает частоту РСПЛМ, индуцированных ЭМС у самцов. При обработке самцов защитное действие этого препарата проявляется только на премейотических стадиях сперматогенеза в клетках без явных дефектов репарации, т. е. зависит от функционирования репарационных систем [1, 26, 27, 30].

10. Установленные закономерности модификации химического мутагенеза и зависимость этого процесса от ряда внешних и внутренних факторов отражают как специфичность, так и приоритетность опосредованных механизмов действия антимутагенов / антиоксидантов в условиях целостного организма. Подавление мутагенных и кластогенных эффектов ЭМС может достигаться за счет модуляции репарационных процессов [1,19, 20,25-27, 30].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Книги:

1. Кужир Т.Д. Антимутагены и химический мутагенез в системах высших эу-кариот- Минск: Технология, 1999. — 267 с.

Статьи:

2. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д., Левина А.Б., Дубур Г.Я. Антимутагенная активность некоторых дигидропиридинов // Доклады АН БССР -1974 - Т. 18.—С. 167-168.

3. Кужир Т.Д. Цитогенетическая активность трехъядерного дигидропиридина в культуре клеток человека // Вести АН БССР. Сер. биол. наук -1975 - № 1.- С. 106-109.

4. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д., Дубур Г.Я., Уддрикис Я.Р. Сравнительное изучение антимутагенного действия соединений дигидропиридинового ряда в связи с их антиокси-дантной активностью //Доклады АН СССР.-1980-Т. 255, № 6,- С. 1483-1486.

5. Ганчарова P.E., Кужыр Т.Д., Левша А.Б. Мадыфшуючы эфект цыс1эам1'ну на ¡ндуцыраваную этылметансульфанатам мутабшьнасць самцоу дразафшы // Весщ АН БССР. Сер. Яял. навук.-1982.-№ 1.-С. 61-64.

6. Кужир Т.Д. Влияние триядерных производных 1,4-дигндропирцдина на спонтанную мутабильностъ самцов дрозофилы // Вести АН БССР. Сер. биол. наук -1982а- С. 105-106.

7. Кужир Т.Д. Изучение влияния 1,4-дигидропиридинов на спонтанный и индуцированный мутационный процесс у Drosophila melanogaster: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.15-Минск, 19826.- 16 с.

8. Гончарова Р.И., Кужир ТД, Левина А.Б. Влияние некоторых фталатов на развитие и выживаемость дрозофилы // Вести АН БССР. Сер. биол. наук- 1984 - № 3.- С. 4750.

9. Гончарова Р.И., Кужир ТД, Левина А.Б., Забрейко С.П. Мутагенная активность димегилтерефгалага//Доклады АН БССР.-1984,-T. XXVIEI, № 11.-С. 1041-1044.

10. Ганчарова P.I., Кужыр Т.Д., Левша А.Б., Прышывалка Л.1. Адчувальнасць раннк стадый развщця дразаф'шы да пашкоджвальнага дзеяння дыметылтэрафталату // Весщ АН БССР. Сер. бит. навук,- 1984.-№ 5,- С. 50-52.

11. Кужир ТД., Гончарова Р.И., Золотарева Г.И. Цитогенетический эффект 1,4-дигидропиридина в различных тест-системах // Цитология и генетика.- 1984,- Т. 18, № 5-С. 343-347.

12. Кужир ТД., Гончарова Р.И., Левина А.Б. Изучение токсического эффекта те-рефталевой кислоты и ее диметилового эфира // Охрана окружающей среды: Сб. ст. / Минск: Высшая школа, 1985.-С. 38-45.

13. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д., Левина А.Б., Пришивалко Л.И., Забрейко С.П. Токсикогенетическая характеристика диметилтерефталата // Оценка суммарной активности природных и сточных вод: Сб. ст. / Ярославль: ВИНИТИ, 1986.-С.81-85.

14. Гончарова Р.И., Левина А.Б., Кужир ТД. Анализ чувствительности отдельных особей дрозофилы к мутагенному действию этилмегансульфоната // Современные проблемы теории химического мутагенеза: Сб.ст. / Таллин, 1987.- С. 27-36.

15. Гончарова Р.И., Кужир ТД., Забрейко С.П., Левина А.Б. Анализ генофондов лабораторных популяций дрозофилы по мутациям, влияющим на жизнеспособность // Цитология и генетика-1988 - Т.22, № 5,- С. 47 -51.

16. Гончарова Р.И., Левина А.Б., Кужир Т.Д. Индивидуальная чувствительность Drosophila melanogaster к мутагенному действию этилметансульфоната // Доклады АН БССР.-1988.- Т. 32, № 4,- С. 357-360.

17. Гончарова Р.И., Кужир ТД., Забрейко С.П., Левина А.Б. Концентрация рецессивных мутаций в популяциях Drosophila melanogaster, не подвергавшихся воздействию мутагенных факторов // Доклады АН БССР,-1988.- Т. 32, № 6,- С. 562-565.

18. Гончарова Р.И., Левина А.Б., Кужир ТД. Изучение чувствительности отдельных особей дрозофилы к мутагенному действию этилметансульфоната // Генетика - 1988,- Т. 24, №12.-С. 2141-2148.

19. Goncharova R.I., Kuzhir T.D. The comparative study of the antimutagenic effects of antioxidants on chemical mutagenesis in Drosophila melanogaster // Mutation Res - 1989 - Vol. 214, №2,-P. 257-265.

20. Кужир ТД., Даливеля O.B. Влияние антиоксидантов на формирование индуцированных этилметансульфонатом разрывов хромосом в зависимости от систем материнской репарации у D. Melanogaster II Вестник РАМН - 1993а.- № 1.- С. 56 -64.

21. Кужир Т.Д., Даливеля О.В. Закономерности процесса становления ЭМС-индуцированных мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster И Доклады АНБ. 19936.- Т. 37, № 4,- С. 77-82.

22. Кужир ТД., Даливеля О.В. Участие систем материнской репарации в реализации инактивирующего действия этилметансульфоната у Drosophila melanogaster // Доклады АНБ.-1993в.- Т. 37, № 5.- С. 72-76.

23. Кужир ТД., Даливеля О.В. Эффект хранения при ЭМС-мутагенезе у Drosophila melanogaster и возможности его модификации // Проблемы генетики: Сб. ст. / Мн.: "Наву-ка i тэхшка", 1994-С. 204-216.

24. Гончарова Р.И., Кужир ТД., Даливеля О.В., Дубур Г.Я., Улдрикис Я.Р. Производные 1,4-дигидроизоникотиновой кислоты (1,4-ДГИНК) - ингибиторы химического мутагенеза //Вестник РАМН,- 1995.-№ 1.-С. 9-20.

25. Кужир ТД., Гончарова Р.И. Механизмы ингибирующего действия производных 1,4-дигидроизоникотиновой кислоты при химическом мутагенезе // Вестник РАМН-1995.-№1.-С. 20-29.

26. Кужыр ТД. Уплыу антымутагенау на працэсы рэпарацьи пры х!м!чным мутагенезе у даследаваннях на дразафше // Becui Акадэми Навук Беларусь- 1996.- № 1.- С. 80-88.

27. Kuzhir T.D., Goncharova R.I. Some effects of 1,4-dihydroisonicotinic acid derivatives on repair pathways involved in EMS mutagenesis // Biochemical Society Transactions - 1997-Vol. 25.-P.139.

28. Кужир Т.Д. Некоторые особенности репарации ДНК у Drosophila melanogaster. Вклад пострепликативной репарации в формирование химически индуцированных разрывов хромосом // Молекулярная генетика и биотехнология: Сб. ст. / Минск, 1998.- С. 55-57.

29. Кужир Т.Д. Репарация аддуктов алкилирования ДНК, ответственных за образование генных мутаций у Drosophila melanogaster II Молекулярная генетика и биотехнология: Материалы Международной конф. «Молекулярная генетика и биотехнология», Минск, 6-8 апреля 1998 г. / Минск, 1998.- С. 57-59.

30. Кужир ТД, Даливеля О.В., Савина Н.В. Модификация процессов репарации при химическом мутагенезе у Drosophila melanogaster // Генетика.- 1999.-Т. 35, № 7,- С. 919-924.

30а Kuzhir T.D., Dalivelya O.V., Savina N.V. Modification of repair processes in chemical mutagenesis of Drosophila melanogaster II Russian Journal of Genetics- 1999- Vol. 35, №7,-P. 919-924.

Тезисы докладов:

1. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д., Рокицкий П.Ф. Влияние химических антимутагенов на спонтанный мутационный процесс // Молекулярные механизмы генетических процессов; мутагенез и репарация: Тез. докл. II Всесоюз. симпоз., Москва, 12-15 ноября 1973 г. / М., 1973-С. 148-149.

2. Кужир Т.Д. Генетическая активность некоторых одноядерных дигидропиридинов // Пути повышения продуктивности животных и растений: Тез. докл. конф. молодых уче-ных/Изд-во «Зинатне»,- Рига, 1975.-С.94.

3. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д. Изучение антимутагенного действия дигидропиридинов // Генетика и селекция животных. Генетика человека и медицинская генетика: Тез докл. III Съезда ВОГиС, Ленинград, 16-20 мая 1977 г. / Ленинград, 1977 - Ч. 11(1).- С. 56.

4. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д. Изучение антимутагенного действия дигидропиридинов // XIV Международный генетический конгресс: Тез. докл., Москва, 2130 августа 1978 г. / Москва, 1978-Ч. И, секция 21-32,- С. 222.

5. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д. Некоторые результаты изучения действия дигидропиридинов // Критерии необходимых и достаточных тест-систем для идентификации потенциальных мутагенных и канцерогенных факторов в окружающей среде: Тез. докл. участн. V Советско-американского симпоз., Пущино - Баку, май - июнь 1978 г У Москва, 1978,-С. 39-40.

6. Кужир Т.Д., Гончарова Р.И. Модифицирующий эффект цистеина на индуцированную этилметансульфонатом мутабильность самцов Drosophila melanogaster // Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций: Тез. III конф. по теоретическим вопросам мутагенеза/Вильнюс, 1980.-С. 108-109.

7. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д., Левина А.Б. Влияние некоторых антимутагенов на индуцированный этилметансульфонатом мутационный процесс у дрозофилы // IV Съезд ВОГиС: Тез. докл./Кишинев, 1981.-Ч. 1,-С. 63-64.

8. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д. Влияние одноядерного производного 1,4-ДТП на спонтанный и индуцированный гамма-лучами выход хромосомных аберраций в сперматозоидах дрозофилы // [Усъезд БелОГиС: Тез. докл., Минск, 15-16 октября 1981 г. / Минск, 1981,-Ч. II,-С. 53.

9. Кужир Т.Д. Влияние триядерных соединений дигидропиридинового ряда на спонтанную мутабильность самцов дрозофилы // IV съезд БелОГиС: Тез. докл., Минск, 15-16 октября 1981 г./Минск, 1981.-Ч. II.-C.62.

10. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д., Левина А.Б. Влияние некоторых антимутагенов на химический мутагенез в половых клетках дрозофилы // Генетические аспекты загрязнения окружающей среды: Тез. работ секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера", Ашхабад, 29 сентября -1 октября 1982 г. / Ашхабад, 1982 - С. 96-97.

11. Левина А.Б., Кужир Т.Д. Изучение модифицирующего эффекта некоторых радиопротекторов на химически индуцированный мутагенез у дрозофилы // Актуальные исследования в генетике и практическая реализация их результатов: Тез. докл. / Изд-во «Наука и техника»,- Минск, 1982 - С. 86."

12. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д. Фталаты - новые мутагены окружающей среды // Тест-системы для оценки мутагенного потенциала загрязнителей окружающей среды: Тез. докл. зас. Секции генетических, аспектов проблемы "Человек и биосфера" МНТС ГКНТ, Иркутск, 4-6 июля 1984 г. / Иркутск, 1984,- С. 16.

13. Левина А.Б., Кужир Т.Д., Пришивалко Л.И. Мутагенная активность диметилте-рефтапата в опытах на дрозофиле // XIV Ежегодная конф. Европейского общества по му-

тагенам внешней среды: Тез. докл., Москва, 11-14 сентября 1984 г. / Москва, 1984- С. 291.

14. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д. Антимутагенное действие антиоксндантов на химический мутагенез в половых клетках дрозофилы // Биоантиоксидант: Тез. докл. II Всесоюзной конф., Черноголовка, 14-16мая 1986 г./Черноголовка, 1986-Т.Н.-С. 182-183.

15. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д. Модифицирующий эффект фенозана в опытах на дрозофиле // Биоантиоксидант: Тез. докл. II Всесоюзной конф., Черноголовка, 14-16 мая 1986 г./Черноголовка, 1986.-Т.Н.-С. 181-182.

16. Гончарова Р.И., Кужир ТД. Защитное действие дигидропиридина в половых и соматических клетках in vivo II Генетические аспекты проблемы "Человек и биосфера": Тез. докл. секции МНТСГКНТ, Орджоникидзе, 2-4 июля 1986 г. /Орджоникидзе , 1986-С. 37.

17. Левина А.Б., Гончарова Р.И., Кужир ТД. К вопросу о существовании скрытой генетической изменчивости в лабораторных линиях дрозофилы // Генетические аспекты проблемы "Человек и биосфера": Тез. докл. секции МНТСГКНТ, Орджоникидзе, 2-4 июля 1986 г. / Орджоникидзе. 1986 - С. 77.

18. Левина А.Б., Кужир ТД. Изучение индивидуальной чувствительности самцов дрозофилы к этилметансульфонату при разных уровнях мутагенеза // V съезд БелОГиС: Тез. докл.,Горки,25-27 июня 1986г./Горки, 1986.-Ч.2.-С. 51-52.

19. Аношенко И.П., Кужир Т.Д. Влияние этилметансульфоната на жизнеспособность особей в экспериментальных популяциях дрозофилы // Экологическая генетика растений и животных: Тез. докл. / Кишинев, 1987 - С. 9

20. Кужир ТД., Гончарова Р.И. Сравнительная оценка защитного действия антиоксндантов различной химической структуры в опытах на дрозофиле // Секция генетических аспектов программы "Человек и биосфера": Тез. докл., Ереван, 13-15 октября 1987 г. /Ереван, 1987,-С. 60.

21. Левина А.Б., Кужир ТД. Оценка генетической изменчивости в линиях и популяциях дрозофилы // V съезд ВОГиС,: Тез. докл., Москва, 24-28 ноября 1987 г. / Москва, 1987-T. I.-C. 156-157.

22. Kuzhir T.D., Goncharova R.I. Modification of chemical mutagenesis by antioxidants in germ and somatic cells // Abstr. EEMS XVIII Annual Meeting / Bulgaria, Varna. 1988.- P. 139.

23. Кужир ТД., Левина А.Б. Специфичность проявления мутагенного действия ди-метилтерефталата в опытах на дрозофиле // Заседания секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" при ГКНТ СССР: Тез. докл. / Киев, 1988 - С. 69.

24. Гончарова Р.И., Левина А.Б., Кужир ТД. Влияние хронической обработки популяций дрозофилы диметиловым эфиром терефталевой кислоты (ДМТФ) на мутационный процесс и приспособленность особей к индуцирующему фактору // Эколого-генетические последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов: Тез. докл. II Всесоюз. координ. совещ., Сыктывкар, 21-23 марта 1989 г. / Сыктывкар, 1989-С. 51-52.

25. Гончарова Р.И., Левина А.Б., Кужир ТД. Отдаленные эффекты хронического воздействия на популяции дрозофилы малых доз диметилтерефталата. // Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ: Тез. докл. Всесоюз. симпоз., Ленинград, 22-26 мая 1989 г. / Ленинград, 1989- С. 31-32.

26. Гончарова Р.И., Кужир Т.Д., Левина А.Б. Мутационный груз и приспособленность популяций Drosophila melanogaster после продолжительной обработки промышленным загрязнителем диметилтерефталатом (ДМТФ) // VI Всесоюз. совещ. по

проблемам биологии и генетики дрозофилы: Тез. докл. совещ., Одесса, 7-12 сентября 1989 г. / Одесса, 1989,- С. 26.

27. Кужир Т.Д., Даливеля О.В. Влияние эффекта хранения на выход разрывов хромосом, индуцированных этилметансульфонатом (ЭМС) в сперматозоидах Drosophila melanogaster // VI Всесоюз. совещ. по проблемам биологии и генетики дрозофилы: Тез. докл. совещ., Одесса, 7-12 сентября 1989 г./Одесса, 1989.-С. 53-54.

28. Кужир Т.Д., Даливеля О.В. Влияние генотипической среды на реализацию разрывов хромосом, индуцированных ЭМС в сперматозоидах дрозофилы // Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами: Тез. докл. Всесоюз. конф. / Самарканд, 1990- С. 56.

29. Кужир ТД, Даливеля О.В., Макаренко B.C. Модификация антиоксидантами (АО) эффекта хранения при ЭМС-мутагенезе у дрозофилы // Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами: Тез. докл. Всесоюз. конф. / Самарканд, 1990-С. 60.

30. Кужир ТД. Влияние производных 1,4 -дигидроизоникотиновой кислоты на реализацию ЭМС-индуцированных разрывов хромосом у дрозофилы //VI съезд БОГИС: Тез. докл., Горки, 2-4 июля 1992 г. / Горки, 1992.- С. 13-14.

31. Кужир Т.Д., Даливеля О.В., Плеханова Л.Г. Влияние фенозана на реализацию ЭМС-индуцированных разрывов хромосом у дрозофилы // Биоантиоксидант: Тез. докл. IV конф., Москва, 2-4 июня 1992 г. / Москва, 1993 - Т. 2 - С. 146.

32. Кужир ТД., Даливеля О.В., Улдрикис Я.Р. Влияние производных 1,4-дигидроизоникотиновой кислоты на становление ЭМС-индуцированных мутаций у дрозофилы // Биоантиоксидант: Тез. докл. IV конф., Москва, 2-4 июня 1992 г. / Москва,

1993.-Т. 2,-С. 147-148.

33. Kuzhir T.D. Some approaches to elucidate mechanisms of inhibitors modulating DNA repair in Drosophila assays // Abs. of 4th International Conference on Mechanisms of Antimutagenesis and Anticarcinogenesis.-1994 - P. 43.

34. Dalivelya O.V., Kuzhir T.D. Effects of 1,4-dihydroisonicotinic acid (1,4-DHINA) derivatives on maternal repair of EMS-induced chromosome breakage in D. melanogaster II Abs. of 4th International Conference on Mechanisms of Antimutagenesis and Anticarcinogenesis-

1994,-P. 44.

35. Kuzhir T.D., Dalivelya O.V., Savina N.V. Effect of 1,4-DHINA derivatives on repair of DNA adducts responsible for EMS-induced point mutations in Drosophila males // Abs. of 4th International Conference on Mechanisms of Antimutagenesis and Anticarcinogenesis. -1994 - P. 45.

36. Кужир Т.Д., Савина H.B. Некоторые подходы к изучению механизмов модификации химического мутагенеза, связанных с процессами репарации ДНК у дрозофилы // 1 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС): Тез, докл., Саратов, 20-25 декабря 1994 г. / Генетика,- 1994 - Т. 30, Приложение - С. 82.

37. Кужир ТД. Изучение механизмов подавления химического мутагенеза, связанных с влиянием антимутагенов на системы репарации // Современные проблемы генетики и селекции : Тез. докл. Респ. конф., Минск, 4-6 июля 1995 г. / Минск, 1995 - С. 38.

38. Kuzhir T.D., Goncharova R.I. Some effects of 1,4-dihydroisonicotinic acid derivatives on repair pathways involved in EMS mutagenesis // Biochemical Society Irish Area Section: Abs. of the Conference, University of Ulster.- Coleraine, 1996 - P. 21.

39. Кужир ТД., Савина H.B., Ровбель Н.М., Трус Т.М. Исследование адаптивного ответа у дрозофилы // VII съезд БОГИС : Тез. докл., Горки, 16-19 июля 1997 г. / Минск, 1997,-С. 62-63.

Резюме

Кужир Татьяна Дановна

Проблемы модификации химического мутагенеза под влиянием антимутагенов в системах высших эукариот

Ключевые слова: антимутаген, антаоксвдант, антимутагенез, мутаген, алкилирую-щий агент, этилметансульфонат, химический мутагенез, кластогенез, репарация ДНК, модификация, эффект (шггимугагенный, антикластогенный, комугагенный, хранения, материнской репарации), генная (точковая) мутация, разрыв хромосомы, микроядро, полихро-матофильный эритроцит, половая клетка, дрозофила, мышь.

Проанализирована генетическая активность 12 производных 1,4-дигидро-пиридина (1,4-ДГП) по тесту рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ) у дрозофилы. Выявлены эффективные антимутагены, показана зависимость антимутагенной активности от химической структуры, антиоксидантной и электронодонорной способности соединений.

Изучено влияние ряда антиоксидантов (производных 1,4-ДГП, цистеина, цис-теамина, ионола, феноксана, облепихового масла) на химический мутагенез, индуцированный в половых клетках дрозофилы апкилирующим агентом этилметан-сульфонатом (ЭМС). Показано, что действие антиоксидантов изменяется в зависимости от экспериментальных условий, в том числе от физиологического и биохимического состояния половых клеток. Защитный потенциал проявляется при обработке личинок, тогда как обработка имаго вызывает разнонаправленные эффекты, что свидетельствует о специфичности и опосредованных механизмах действия антимутагенов в организме. Антикластогенная активность производных 1,4-ДГП подтверждена по микроядерному тесту у мышей.

Показано, что хранение спермы у самок в течение 12-14 сут не влияет на частоту ЭМС-индуцированных генных мутаций (РСПЛМ). В то же время уровень разрывов хромосом, вызывающих эмбриональную и постэмбриональную летальность, а также потери половых хромосом, существенно увеличивается. Динамика накопления этих событий соответствует динамике образования АР-сайтов. Процесс формирования разрывов хромосом контролируется материнскими системами репарации: дефект эксцизионной репарации повышает, а дефект пострепликативной репарации снижает уровень ЭМС-кластогенеза. Частота ЭМС-индуцированных РСПЛМ зависит от стадий сперматогенеза и генотипа самца.

Антиоксиданты снижают уровень химически индуцированных мутаций и разрывов хромосом, влияя на материнские системы репарации. Защитный эффект глу-тапирона по тесту РСПЛМ у самцов проявляется только на премейотических стадиях сперматогенеза. Дефекты репарации в ооцитах и сперматогониях уменьшают их чувствительность к антимутагенам. Установлено, что антиоксиданты способны модулировать репарацию ДНК при химическом мутагенезе в половых клетках.

Рэзюмэ

Кужыр Таццяна Данауиа

Праблемы мадыфжацьп х1ммнага мутагенэзу пад уплывам антымутагенау у сютэмах вышэйшых эукарыёт

Ключавыя словы: антымутаген, антыаксщант, антымугагенэз, мутаген, алкшруючы агент, этылметансульфанат, хмчны мутагенэз, кластагенэз, рэпарацыя ДНК, эфект (шггымутагенны, антыкластагенны, комутагенны, захоування, магчынай рэпарацьп), генная (кропкавая) мутацыя, разрыу храмасомы, м1краядро, пол1храматафшьны эрытрацыт, палавая клетка, дразафша, мыш.

Праанашзавана генэтычная актыунасць 12 вытворных 1,4-дыпдрашрыдыну (1,4-ДГП) па тэсту рэцэс'|уных счэпленых з полам лятапьных мутацый (РСПЛМ) у дразафшы. Выяулены эфектыуныя антымутагены, паказана залежнасць антымута-геннай актыунаещ ад х1м1чнай структуры, антыакЫдантнай 1 электронадонарнай здольнасщ рэчывау.

Даследаваны уплыу шэрагу антыакс1дантау (вытворных 1,4-ДГП, цыстэшу, цыстэамшу, ¡анолу, фенаксану, аблятхавага алею) на хЫчны мутагенэз, шдукаваны у папавых клетках дразафшы алкшруючым агентам этылметансульфа-натам (ЭМС). Паказана, што дзеянне антыаксщантау змяняецца у залежнасщ ад эксперыментальных умоу, у тым лшу ад ф1з1ялапчнага 1 б1ях!\нчнага статусу пала-вых клетак. Ахоуны патэнцыял праяуляецца пры апрацоуцы л1чынак, тады як апра-цоука ¡мага выюнкае розныя эфекты, што сведчыць пра спецыф1чнасць 1 апасродка-ваныя мехашзмы дзеяння антымутагенау у аргашзме. Антыкластагенная актыунасць вытворных 1,4-ДГП пацверджана па мжраядраваму тэсту у мышэй.

Паказана, што захоуванне апрацаванай мутагенам спермы у самак на працягу 12-14 дзен не уплывае на частату ЭМС-шдукаваных генных мутацый (РСПЛМ). У той жа час узровень разрывау храмасом, яюя выклкаюць эмбрыянальную ! постэм-брыянальную лятальнасць, а таксама страты палавых храмасом, значна павя-л1чваецца. Дынамжа накаплення гэтых пашкоджванняу адпавядае дынамщы утварэння АР-сайтау. Працэс фарм1равання разрывау храмасом кантралюецца мат-чыными астэмам1 рэпарацьп: дэфект эксцьшйнай рэпарацьп павышае, а дэфект по-стрэплжатыунай рэпарацьп зшжае узровень ЭМС-кластагенэзу. Частата ЭМС-¡ндукаваных РСПЛМ залежыць ад стадый сперматагенэзу 1 генатыпу самца.

Антыаксщанты зшжагоць узровень х1м1чна шдукаваных мутацый 1 разрыва^ храмасом, уплываючы на матчыны астэмы рэпарацьп. Ахоуны эфект глуташрону па тэсту РСПЛМ у самцо^ праяуляецца толью на прэмеётычных стадыях сперматагенэзу. Дэфекты рэпарацьп у палавых клетках (аацытах 1 сперматагошях) памяншаюць ¡х ад-чувальнасць да антымутагенау. Установлена, што антыаксщанты здольныя маду-л1раваць рэпарацыю ДНК пры Х1м1чным мутагенэзе у палавых клетках.

Summary

Kuzhir Tatiana Danovna

Problems of chemical mutagenesis modification by antimutagens in the higher eukaryotic systems

Key words: antimutagen, antioxidant, mutagen, alkylating agent, ethyl methanesulfonate, chemical mutagenesis, clastogenesis, DNA repair, effect (antimutagenic, anticlastogenic, comu-tagenic, storage, maternal repair), gene (point) mutation, chromosome break, micronudeus, polychromatic erythrocyte, germ cell, Drosophila, mouse.

Genetic activity of 12 1,4-dihydropyridine (1,4-DHP) derivatives was analyzed by the sex-linked recessive lethal mutation test (SLRLs) in Drosophila. Effective antimutagens were revealed and the relationship between antimutagenic activity and chemical structure, antioxidant and electron-donor capacity of compounds was shown.

The effect of some antioxidants (derivatives of 1,4-DHP, cysteine, cysteamine, ionol, phenoxane, sea-buckthorn oil) on chemical mutagenesis induced in Drosophila germ cells by alkylating agent ethyl methanesulfonate (EMS) was studied. The antimutagenic action was shown to change depending on experimental conditions, including physiological and biochemical status of germ cells. A protective potential manifests itself in larva treatment while imago treatment causes different effects that indicates specificity and mediated mechanisms of the antimutagenic action in organism. Anticlastogenic activity of 1,4-DHP derivatives was verified in micronucleus assay in mice.

Sperm storage in females for 12-14 days was not shown to affect the frequency of EMS-induced SLRLs. At the same time the level of chromosome breaks leading to embryonic and post-embryonic lethality, as well as the loss of sex chromosomes increases greatly. The accumulation dynamics of these events corresponds to the dynamics of AP-site production. Chromosome breakage is controlled by maternal repair systems: the excision repair deficiency increases the level of EMS-clastogenesis and that of post-replication repair decreases it. The frequency of EMS-induced SLRLs depends on spermatogenesis stages and male genotype.

Antioxidants were shown to reduce the level of chemically induced mutations and chromosome breaks affecting maternal repair systems. The antimutagenic effect of glutapirone in SLRLs test in males is detected only at premeiotic stages of spermatogenes. Repair deficiencies in oocytes and spermatogonia decrease their sensitivity to antimutagens. Antioxidants were revealed to be able to modulate DNA repair involved in chemical mutagenesis in germ cells.

Информация о работе

Кужир, Татьяна Дановна
доктора биологических наук
Минск, 1999
ВАК 03.00.15

Автореферат

Похожие работы