Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка мутагенного действия лазерного излучения на клеточном уровне

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Оценка мутагенного действия лазерного излучения на клеточном уровне"

московский ордена лекш1. ордена трудового красного знамени я ордена сктябшжоЗ ревошшй гострствзшй университет

ей9нз !з.в. жюшсона

Еводогк&кдяя факультет

Нз прввег рукошся

щ. €21.375.826: 576.24

тнрсйн! ейатэргш г^пгсрьвенэ

сциш мзгштшого дезлвпя яаеешого нзл7чееэ1 щ юшгскшш уроекз

(s3. со. 03

âBïOPBSSPAT десэртодЕЯ хш casczcsss учсетЭ стетзш ешдздата бзолшнзсйзх Еаув

ÎÎ0CHS3 - iss2

Расюта выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов и в филиале института атомной энергии им. И.В.Курчатова.

Научные руководители:

Официальные огшоненты.1

кандидат биологических наук С.К. Абилев

член-корр. РАН, доктор физико-математических наук, профессор B.D. Баранов

доктор оиологических, наук Б.Г. Капульцевич

доктор биологических наук Г;Я. Фрайкин

Ведущая организация: Онкологический научные центр РАШ.

Зашита состоится

1992 Г. В

■/Г"

часов

на заседании специализированной совета К. 053.05.68 в Московском Государственном университете имена М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан •ИЬ " ОЬт&ГМ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

Б.А. Гуляев

Актуальность дроблены. Определенные типы лазеров в настоящее время широко используются как в диагностике> так и клинической медицине, и сфера их применения с развитием лазерной техники постоянно расширяется; Поэтому исследование генетических аффектов лазерного излучения представляет практическую значимость с точки зрения предсказания возможных негативных последствий для человека при клиническом применении лазеров.

Лазерное излучение в ультрафиолетовой (УФ) области спектра может индуцировать мутации и поэтому увеличивать риск онкологических заболеваний. Это обусловлено тем, что основной мшены» в клетке для коротковолнового (кУФ) и средневолнового (сУФ) УФ-излучения является молекула ДНК. Фотоповревдения ДНК при действш* длинноволнового УФ (дУФ) являются результате»! опосредованных, фотохимических реакций.

Высокоинтенсивное лазерное излучение такте могет вызывать определенные повреждения ДНК вследствие индукции 2-фотонных процессов и образования свооодных радикалов. Вызываемые лазерным излучением генетические эффекты могут отличаться от таковых пря действии низкоинтенсивных источников света с той не длиной волны.

Данные но лутагенной п цптотокспческсй эффективности УО-лазерного излучения малочисленны и противоречивы,,а для определенных длин волн (337 ны) отсутствуют. Использование ограниченного набора биообъектов и методов оценки генотоксичностк не позволяет однозначно трактовать полученные результаты и в связи с этен требует дальнейших исследований в этой области. Генетические еффэкты лазерного излучения в инфракрасной области (ИК) спектра вообще не изучались. Таким образом, вопрос о мутагенности УФ и 15К-.глзерпого излучения нельзя считать окончательно решенным.

фугой важной практической проблемой является поиск и изучение потенциальных ингибиторов лазер-пндуцдрованиого мутагенеза ввиду плоского применения УФ лазечов в кедищше (офтальыологиз-193 ем, сосудистой хирургии, кардиологии-308 нм и др. областях). Некоторые биологически активные соединения, обладавдие антконсидантными свойствами и способные ингабировать свободнорадикальные процессы, являются антимутагенами. Поэтому изучение действия этих природных антимутагенов при лазерном мутагенезе представляется актуальным как для дальнейшего познания явления антимутагенеза - важнейшего фактора задитн и стабилизации генома, так и с практической точки зрения возможности их использования для снижения побочного действия УФ-лазерного излучения.

Цель работы. Изучить цитотоксичность и мутагенную активность лазерного излучения с различными длинами волн в УФ и КК областях спектра на клетках про- и эукариот.

Задачи исследования;

1. Выбор наиболее чувствительной тест-системы для изучения мутагенной активности лазерного излучения.

2. Сравнительное изучение зависимости мутагенной и цитотоксической активности лазерного излучения от длины волны л дозы облучения на клетках про- и эукариот.

3. Изучение антимутагенного действия некоторых биологически активных соединений.

4. Сравнительное изучение антиортидантной активности антимутагенов и установление корреляции между их антиоксидантными и внтимутвген-ными свойствами при химическом,мутагенезе. /

Новизна: исследований. Впервые применен комплексный подход при изучении цитотоксического и мутагенного действия лазерного излучения с использованием 6 типов лазеров и биологических объектов различного уровня организации.

Впервые обнаружена мутагенная активность дУФ-лазерного излучения с к 337 т.

Исследовано действие сУЗКлазерного излучения с ^ 308 вм на индукцию мутаций и выживаемость у сальмонелл. Обнаружен дозозависи-мый мутагенный и летальный эффекты этого излучения. Показано, что . мутагенная эффективность УФ-лазерного излучения при 308 нм примерно в 130 раз больше, чем таковая при 337 нм.

Показано, что излучения 4 изученных типов ИК-лазеров не обладают генотоксическим действием.

Впервые проведено сравнительное изучение действия излучений УФ-лазеров на синтез ДНК в клетках НеЬа. Выявлено ингибирупцее действие лазерного излучения только при 308 нм.

Обнаружено, что аскорбиновая кислота и ее производные, обладая эффективным ангимутагенным действием по отношению к химическим мутагенам, не проявляли защитных свойств при лазерном мутагенезе.

Установлена прямая корреляция между усилением антимутагенной активности аскорбиновой кислоты и ее форм по отношению к химическим мутагенам и увеличением их прооксидантной активности в модельной окислительной системе. На основании полученных данных предложен новый механизм антимутагенного действия изученных соединений.

Практическая ценность работа. Для регистрации генетических Эффектов УФ-лазеряого излучщгая когет быть применен краткосрочный тест Эймса, который позволяет количественно оцэнпть мутагенную активность того или иного излучения.

Полученные в работе результаты могут быть использованы при выработке медицинских рекомендаций, кзсакдшся лазерной безопасности (выбор типа лазера с определенными характеристиками, суммарных доз облучения и т.д.), а такхэ для оценки потенциального генетического риска для людей, подвэргЕЮзихся лазерному облучэнни.

Публикация.результатов -работа. По твкэ диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Апробация работа. Материалы диссертация докг .давалась на заседаниях секции НГС Филиала института атокяой аЕвргии им. И.В. Нучато-ва (Троицк, 1990, 1991, 1592), в Болонскоы Университете (Болонья, 1990) и на советско-американском симпозиуме по науке,, технологии и торговле (Сан-Франциско, 1991). Диссертация апробирована на секции НТО «нлиала института атомной энергии ш. И.В. Курчатова 22.1.1992 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит пз введения, обзора литерачуры, описания материалов-я катодов исследования, глав, содержащих собственные експерпкзнтальнке данные с обсувдением результатов, и выводы. Работа излогена на 130 страницах текста, наглядный материал представлен 18 рисункагн н 24 таблицей. Список литерату^и содераит 186 работ.

ЭКСПЕРИгЕНГАЛШШ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕЩВАШЙ.

Использовали тестерше игшяы Salmonella typhlmurim TAI535 (hla G46, üuvrB, ría), TA1C0 «lis G46, ДоттВ, П^/рКМ101) в TA98 (hia D3052, AuvrB, rfa/pK"l01), любезно предоставленные доктором Эймсом (Университет Беркли, Калифорния, США).

Несшхронизировалная опухолевая культура клеток человека НеЬа была получена в Онкологическом научном центре РАМН.

Среды. В качестве полноцэнной среды для бактерий использовали жидкий или агаризированный мясо-гоптонный бульон. Селекцию ревэртан-тов проводили на минимальной среде.

Клетки НеЬа выращивали на стеклянных подложках, помещенных в , чашки Петри, в среде N 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота и 10 мЫ буфера ОЭИЭС до достижения сплошного монослоя.

Лазерные установки. В работе использовали лазеры, генерирующие излучение с 308 нм; 337 нм; 1,06 мкы; 1,32 мка в 4,82 ыкм. В качестве стандартного монохроматичного источника УФ-излучешя использовали ртутную лабораторную лампу "Хроматоскоп" с 254 ш.

Химические соединения. В работе использованы реактивы и химиката отечественного производства марки "ч.д.а.","х.ч.", "о.с.ч." и импортные: "Hoechst" (ФРГ),"Signa Chemical Со."(ОПА), "Piuca"(Швейцария), б-аскорбилпальмитат синтезирован во ВНИВИ, L-аскорСинат натрия синтезирован в МТИПП. Метиловый эфир олеиновой кислоты дополнительно очищали перегонкой в вакууме.

Методы исследования. Учет генных мутаций у бактерий для оценки мутагенного действия лазерного излучения проводили по модифицированному нами методу Эймса, чашечный тест (Апаз et al., 1973). Степень индуцированного мутагенеза оценивали величиной частоты мутаций, определяемой отношением числа Мз-ревертантов к числу внживяш клеток.

Антимутагенную активность препаратов определяла, используя кодификацию теста Эймса с преинкубацией (Ыагоп, Ames, 1983). Тестируемые вещества растворяли в дистиллированной воде, двкетилсульфоксаде или этаноле и инкубировали в течение часа при 37°С в концентрациях 50, 100 и 150 мкг/мл с клетками бактерий или культурой клеток НеЬа непосредственно перед облучением.

Оценку цитотоксичэского действия излучения лазеров проводили, используя тест по ингибированию синтеза ДНК в клетках Hela. Уровень включения меченного предшественника в ДНК определяли азторадяогра-фически по методу (Ball et al., 1973), для чего сразу после облучения клетки инкубировали в течение 15 мин. при 37°С со средой, содержащей 10 мкСи/мл ^Н-тимидана. Критерием цитотоксичэ ской активности являлась величина ID50 (доза, при которой происходило 50% снижение включения метки).

Количественное определение ДНК выполняли флуориметрзческш методом Хехста (Cesarone et al., 1979). Полученные относительные значения флуоресценции использовали для определения количества клеток на опытной подложке Для этого предварительно на контрольных образцах определили соотношение уровня флуоресценции к количеству клеток, соответствующее этому уровню (подсчет переведенных в суспензию клеток проводили в камере Горяева).

Определение антиоксидантной активности веществ проводили на модельной системе окисления химически чистого метилолеата (Бурлакова и др., 1975). Из кинетических кривых окисления чистого метилолеата и

метшкшата в присутствии изучаемах веществ вычислялась разность периодов индукции окисления. Отношение этой разности к периоду индукции окисления чистого мэтилолеата характеризовало аяткоксидантпую активность-изучаемого соединения.*

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. ВЫБОР ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ТЕСТ-СИСТИ.Ш.

Для использования бактериального метода Эймса в исследовании мутагенеза,'индуцируемого лазерным излучением, необходимым этапом работы является как выбор наиболее чувствительного к атому воздействию тест-иташа бактерий, так и определение ог-иыальных условий эксперимента. "

Презде всего был был подобран наиболее УФ-чувствительный штамм Salmonella typhlmurium. Поскольку главными отличительными генотипи-ческими особенностями тест-штаммов являются тип his-ыутации, а тага» наличие или отсутствие плазкиды в геноме, то для проверки были выбраны различащиеся по этим характеристикам штажи S. typhinurlira: TAI535. TAIOO : ТА98.

На Рис. I представлен! результаты эксперимента то исследованию зависимости частоты мутаций <ЧЫ) для каздого из штаммов от дозы облучения стандартной УФ-ламш (254 нм).Из представленных диаграмм видно, что с возрастанием дозы облучения 4M увеличивается у всех 3 штаммов. Причем величина ЧЫ для итамма TAI00 оказалась при тех ев дозах выше, чем у других, т.е. наиболее^Ф-мутабильным оказался штамм TAI00.

Light dose (J/m) „ О 14.2 2а4

; Рис . I. Сравнительное изучение мутагенного действия УФ (254 вм) на I штшмы S. typhlnurium: :1 - TAI535; 2 - TAIOO; 3 - ТА98.

у О 16 .30 ;

Exposure time (sec)

'этот раздел работа выполнен под руководством к.х.н. Л.Н. Шашкиной в Институте хим.- физики РАН.

Далее Оыл определен наиболее эффективный способ облучения индикаторного штамма УФ-лазером (308 нм). Облучению подвергали суспензии бактерий в жидкой среде и клеточный слой прямо на твердом агаре. Обнаружено, что в обоих случаях индуцированный мутагенез увеличивался по мере возрастания дозы, в то время как выживаемость соответственно падала. Однако при облучении на агаре эта зависимость проявлялась при значительно меньших дозах, что свидетельствовало о большей УФ-чувст-вительности чашечного способа облучения. Методически облучение на агаре также более удобно, так как при использовании длительных временных экспозиций не требует постоянного перемемешивания клеток.

2. МУТАГЕННОСТЬ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ на тест-штаммэЗ. 1урЬ1пшг1ит ТА!00.

2.1. Изучалась мутагенная активность сУФ-лазерного излучения (308 нм) в зависимости от дозы облучения (Рис. 2).

При увеличении дозы облучения до 2,4 «Ю3 Дж/м2 ЧЫ постепенно возрастала, достигая своего максимального значения, а выживаемость клеток снижалась, составляя 2% при дозе 2,4 »103 Дж/м2. При дальнейшем увеличении дозы облучения происходило постепенное снижение ЧЫ.

>Ди!а11ол |г»оиог>су (ЗОвлт; У1аЫ1Цу (»,

3100

10Е-СМ

1-ОЕ-Об

1.0Е-07

ОООО «0200

Сювеи/т*)

Рис. 2. Зависимость ЧИ (I) и выживаемости (2) Б.гурШши-т1т ТА100 от дозы облучения юэксимерного лазера с Я ЗСВнм.

На основании полученных результатов определяли среднюю летальную дозу облучения Ь37, частоту мутаций, соответствующую этой дозе (ЧЫ37), и мутагенную эффективность (МЭ) данного излучения. За МЭ мы принимали отношение ЧМ37 к Ю37, то есть, МЭ выражалась величиной ЧЫ, приходящейся на единицу дозы облучения.

Из прямого сопоставления величин Б37 для кУФ (254 нм) и сУФ (308 нм) излучения следует, что летальная эффективность первого при-

мерно в 60 раз больше. Сравнение показателей Ш для этих излучений показывает, что несмотря на превосходящее более, чем на 9 порядков по интенсивности, лазерное сУФ-нзлучение обладало в 340 раз меньшей мутагенной эффективность®, чем ннзкспгатенсивное кУФ-излучение лампы (Табл.1).

Таблица I. Сравнительное изучение мутагенной и летальной эффективности действия коротковолнового, средневолнового и длинноволнового УФ-излучения на штамме З.гурМшиПит ТАЮТ.

Дтптттй ВОЛНЫ

излучения 254 нм 303 нм 337 нм

% (Дж/Н*) 10 466,6 37050

3,06 «Ю-5 4.24 »КГ6 2,42 *10~6

ЫЭ ЩГ1«2) 3,06 »Ю-6 9,1 *Ю~9 6,53 '»Ю-11

Исходя из особенностей генотипа тест-штамма а базируясь на данных классической фотохимии, а также -современных представлениях о механизмах индуцированного мутагенеза, иосто не только судить о химической природе фотопродуктов, ответственных за мутагенные эффекты при 254 и 308 нм, но и предположить вероятный генетический меха-" низм их мутагенного действия.

Известно, что неспособность внаеплять пиркилдиновые димеры (ЦЦ) сопровождается при увеличении дозы УФ-облучения большей склонностью к ошибкам, чем ненарушенное выцепление в клэтках дикого типа.Поэтому у дефектного по эксцизнонной репарации штатаа S. typhlmurlmi TAI00 возникшие ошибки могут быть причиной мутаций, фиксируемых в ходе репликации. Однако основной путь индукции мутаций связан, по-вздимо-му, с действием ошибочной SOS репвратнвной систейа. Известно, что не-репарированные конститутивными системами ПД могут быть причиной запуска SOS-репарации, в ходе которой происходят ошибки включения оснований. Так как степень экспрессии мутагенной SOS-репарации обусловлена силой ДНК-повреадащего действия, логично предположить, что SOS-мутагенез при переходе в более коротковолновую область УФ будет, усиливаться пропорционально увеличению концентрации нерепарированных ПД - индукторов SOS-репарации. Основываясь на спектре действия ди-димеризации тимина, близкого спектру поглощения ДНК, относительный выход ГШ при 306 нм на несколько порядков шныае такового при 254 нм.

Поэтому весьма вероятно, что обнаруженное уменьшение мутагенного к летального действия при переходе в более длинноволновую область УФ связано с уменьшением относительного вклада ОД в эти эффекты при более длинноволновом уф-излучении.

Таким образом, общий мутагенный эффект при уф-облучении отапма Б.гурМлп1г1ш ТА100 (неспособного выщеплять ОД и обладающего БОБ-ин-дуцибельной системой) может складываться из ошибочного дорешшкатив-ного пути и мутагенной пострепликативной БОБ-репарации ДНК. При этом нерепарированным 1Щ принадлежит решающая роль в индукции и того, и другого мутагенного пути. Определенную роль в средневолновом уф-лазерном мутагенезе могут играть кроме того и 6,4-аддукты. .

2.2. Исследовали зависимость мутагенезе и летальности сальмонелл от дозы облучения дУФ-излучения азотного лазера при 337 нм (Рис.3). Видно, что во всем испытанном диапазоне доз вплоть до 3,8 *Ю4 Дж/м2 ЧМ медленно возрастала в линейной зависимости' от дозы облучения, достигая своего максимального значения при 35% выживаемости.

При сравнительной оценке величин В37 и показателей ИЗ (Табл. I) оказалось, что мутагенная эффективность лазерного излучения с Л. 337 нм приблизительно в 130 и в 4,7 *Ю4 раз меньше этого показателя для излучений при 308 и 254 нм, соответственно. Летальная активность излучения при 337 нм была в 80 и в 3,7 «103 раз соответственно меньшей, чем таковая для излучений при 308 нм и 254 вм. Таким образом, в результате проведенных исследований обнаружено, что эффективность мутагенного воздействия источников УФ-излучения уменьшалась в следующем порядке: У$*-лампа(254 нм) > ХеС1-лазер (308 нм) > Н2-лазер(337 нм),

обнаруженное в экспериментах резкое уменьшение мутагенной и летальной эффективности дУФ-излучения (337 нм) по сравнению с этики параметрами при действии кУФ и сУФ -излучений связано, по-видимому, как с разными молекулярными механизмами образования фотоповреждений, так и с качественным различием самих фотопродуктов.

На следующем этапе работы предстояло выяснить, в результате какого механизма происходит образование фотопродуктов, ответственных за мутагенный и летальный эффекты при действии излучения с \ 337 вм. Известно, что связующим звеном между поглощением излучения в длинноволновой области УФ-спектра и генетическими эффектами могут быть либо кислород-зависимые фотодинамические процессы, протекалцие с участием свободных радикалов и синглетного кислорода и приводящие к образованию одноцепочечных разрывов ДНК, либо реакции молекулярной

а

Рве. э. Завжсииость частота иттаяЯ (1) ж ваяаваююстж (2) ЭЛуришгИи ТА100 от доза облучена» ааотиии) лазера (337 ш).

Рас. 4. Сравнительное *зучэззю згяиямоста жэючфпап щя лвДпндж коротвовэляавого. срелаевсипового ■ у—чанцпи—« Т&чвиучаяя я» агяш Б. гурмяшш ТАЮО: I- 254 ж; 2- эта ж: 3- 337 ет.

фотосенсибилизации, в результате которых образуются Щ.' ■

Для оценки роли активированного кислорода и свободнорадакальных процессов в дУФ-лазер-индуцированном мутагенезе (337 нм) исследовали способность некоторых веществ с антирадикальными и антиоксидантшми свойствами влиять на мутагенез и выживаемость индикаторного штамме под действием этого излучения. В качестве тестируемых соединений были выбраны: I) аскорбиновая кислота; 2) а-токоферол; 3) сочетание аскорбиновой кислолоты с а-токоферолом, которое, как известно, часто усиливает ангиоксидантнсзе действие каждого, взятого по отдельности вещества (синергизм действия). В предварительных экспериментах по изучению антимутагенного -действия этих препаратов при химическом мутагенезе мы обнаружили их высокую протекторную активность (глава 4). Учитывая, что нитрозогуанидин и дУФ-излучение могут вызывать сходные повреждения ДНК (модификация гуанина в 7 положении), приводящие к замене пар оснований, представлялось логичным испытать эти же вещества и в качестве потенциальны^ ингибиторов УФ-мутагенеза при 337 нм.

В результате проведенных экспериментов обнаружено лишь двукратное снижение летальности клеток, проинкубированных с а-токоферолом (100 мкг/мл) при максимальной дозе облучения. Мы цредполоаили, что протекторный эффект а-токоферола обусловлен его способностью тормозить первичные фотохимические реакции, протекапще при участии свободных радикалов в клеточных мембранах. Предположение о защитном эффекте а-токоферола в результате экранирования кажется маловероятным для 337 нм, поскольку максимум его поглощения располагается в области 290 нм.

Отсутствие вдгибирования мутагенеза с одной стороны и снижение летальности клеток, обработанных антиоксиданташ-с другой, указывает на то, что эти эффекты при действии дУФ-излучения обусловлены различными молекулярными механизмами. Если в первом случае решающее значение, по-видимому, принадлежит кислород-независимым процессам, приводящим к димеризации пиримидинов* то в падение выживаемости определенный вклад вносят также фотохимические реакции, протекающие по фотодинамическому механизму с образованием-свободных радикалов (например, в результате перекисного фотоокисления лшщдов клеточных мембран) и приводящие к образованию фотопродуктов недимерной природы.

2.3. Облучение индикаторных бактерий ИН-лазерами в непрерывном (1,06 мкм и 4,82 мкм) и импульсном (1,06 мкм и 1,32 мкм) режимах не индуцировало мутагенез у сальмонелл во всех интервалах изученных доз. Следует отметить, что излучение неодимового лазера с \ 1,32 мкм стимулировало деление клеток (Табл. 2), что связано,.вероятно, с теп-

ловнм эффектом данного издания. Отсутствие тетатотескс® активности ИК-излучення, го-вндемому, обусловлено тем, что оно не наглодается биологически активными иолекулакя и, следовательно. да приводзт к их повреждению. .

Таблица 2. Влияние излучения Ш:УАС-лззера (1.32 мхм) на, выживаемость и мутагенез ЗлурЬЗшиПоп ТА100 в зависимости от дозы облучения.

Доза Выживаемость Количество ревертантов 'Частота мутаций

на МПА в I мл (ИЕнга.средв)

Контроль 0.68 *10э 2103 3.09

10 сек * 0.73 «I09 1875 2.57

100 сек I.5I *109 2163 1.43

1000 сек 2.05 »I09 1920 0.937

Контроль I.S3 »ЮЭ 2090 1.40

10 сек 1.10 »ю9 1677 1.50

100 сек 2.00 *Ю9 1857 0.93

1000 сек 3.70 »I09 2137 0.58

4000 сек 4.20 »Ю9 3143 0.75

»10

»10

•10"^ •1С-6 . «Ю"6

«ю-6 »ю-6

« 10-секундная экспозиция соответствует дозе 2.7 *104 Дз/ц^

Сравнение трех крявцх доза-мутацки, полученных в опытах-с использованием кУФ, сУФ и дУФ- излучений, представлено на Рис. 4. Видно, что в исследовавшихся диапазонах доз для излучений при 254 в 308 нм имеются максимумы ЧМ, которые для данных излучений оказались близкими по величине (7,21 »Ю-4 и 5,1 »Ю-4, соответственно) п превышали примерно на 3 порядка контрольные показатели. Максимальное значение ЧМ для излучения 337 нм превышало спонтанный фон на од_л -порядок (I,24*10"^). В условиях опыта, по-видимому, не была достигнуты дозы, вызывающие спад ЧМ. >

Форма кривых доза-мутации с перегибом в наксимуке иоаэт быть интерпретирована различным образом. Во-первых, предполспениам о . гетерогенности по УФ-чувствительности клеточной популяции: более устойчивые к летальному действию больших доз облучения клетки, по-видимому, обладают и большей устойчивостью к его мутагенному действию. Поэтому по мере гибели чувствятельн а фракции долаен наблюдаться спад ЧМ. Другим возможным объяснением спада ЧМ при больших дозах может быть избирательная гибель мутантных особей с кношзственными' повреждениями из-за перекрывания эксцизеонних брешей в цепи ДНК в

ходе репарации. В этом случае также доля мутантшх клеток по отношению к выжившим при больших дозах будет падать.

3. ВЛИЯНИЕ ЛАЗЕРНОГО ОБЛУЧЕНИЯ НА СИНТЕЗ ДНК в клетках НеЬа.

Угнетение синтеза ДНК, вызванное излучением, признано чувствительным параметром при оценке воздействия УФ-излучения на клетки млекопитающих. Этот фактор является одним из критерием цитоток-сичности, так как отражает реакцию всех клеточные компонентов, включая нуклеиновые кислота', на действие изучаемого излучения. В связи с этим, мы использовали тест на ингибйроваиие синтеза ДНК в качестве дополнительного метода подтверждения наличия или отсутствия геноток-сичности излучения лазеров на клетках эукариот.

3.1. Изучалась зависимость ингибирования синтеза ДНК от. дозы облучения УФ-лампы при 254 нм. На Рис. Б видно, что цитотоксичность излучения усиливалась во всем изученном диапазоне доз по мере возрастания дозы облучения. Так, при максимально взятой дозе уровень включения метки снизился более, чем в 4 раза. Величина 1Б5д для кУФ-излу-чения соответствовала дозе облучения, равной 11,2 Дж/кг.

3.2. Результаты экспериментов по оценке цитотоксичности сУФ--лазерного излучения (308 нм), представленные на Рис.6, показывают, что по мере увеличения дозы облучения, наблюдается постепенное снижение уровня включения ^-т в ДНК клеток НеЬа. Причем аффект ингибирования отменен, начиная с пороговой дозы в 600 Дж/м2, что свидетельствует о большей резистентности клеток к суф-излучению по сравнению

с кУФ, где порог дозы отсутствовал. Наибольшее ингибировавие синтеза ДНК было отмечено при максимально взятой дозе облучения: уровень включения метки был ниже естественного фона в & раз. Значение ЗБ^ для сУФ-излучения, полученное путем линейной экстраполяции результатов, соответствовало дозе облучения 3.36 »10° Дж/м2.

Сравнение величин 1Б50 для кУФ и сУФ-лазерного излучения свидетельствует о способности низкоинтенсивного куф-излучения оказывать примерно в 300 раз более эффективное цитотоксическое действие, чем лазерное излучение с л. 308 нм. Эти результаты хорошо согласуются с ранее полученными на микроорганизмах данными о соотношении мутагенной активности этих же длин волн.

3.3. Изучали способность дУФ-излучения азотного лазера в интервале доз до 5 «10^ Дж/м2 ингибировать синтез ДНК (Рис. 7). Характер

UOM oose^/T,* )

Expcaire time(sec)

№> S. Эвпсжкп шжкцивши canten JSS в впэгзх

. 3Н-тиввпюи xamas Hela от лоза Ув-ойиггэягя (254 m).

ïwb.A* Snrjii ||м,1сть шплкроваап caneas J®K в вадоьсвоивчеяа 41-пвидхнаи кявттах Hele от доги «ввересго оолчмая (ЭОВ га).

полученной кривой свидетельствует, что показатели уровня -синтеза ДНЕ по мере возрастания дозы облучения близки контрольным значениям. Это указывает на то, что данное излучение не является цитотсжсичннм для клеток Hela в выбранном диапазоне доз облучения.

Сопоставление результатов опытов на клеточной линии HeLa, полученных при облучении клеток коротковолновым, средневолновым и длинноволновым УФ-излучением, представлено на Рис. 8. Видно,что самым цитотоксичным является наиболее коротковолновое из исследуемых излучение -254 нм. В то время как для этого излучения при дозе 14,2 Дж/м2 отмечалось уже трехкратное снижение включения ^Н-Т, включение метки при 308 нм оставалось на контрольном уровне вплоть до дозы 600 Дж/м2.

Исходя из известных в литературе спектров действия мутагенеза и выживаемости клеток человека, было оценено возможное 500-кратное превышение цитотоксичности излучения при 254 по сравнению с таковой при 308 нм. Полученные нами данные на клетках человека иной природы подтверждают эти расчеты. Усиление цитотоксичности при переходе в коротковолновую область УФ согласуется с максимальным поглощением ДНК в этой области спектра и высоким относительным выходе»! ПД, которые, по всей вероятности, определяют цитотоксический эффект излучения с Л 254 нм. Наличие порога дозы при действии сУФ-лазерного излучения является, косвенным свидетельством того, что кроме ЦД при облучении клеток сУФ образуются фотопродукты, подвергающиеся быстрой репарации. Ими, вероятно, могут быть одноцепочечные разрывы, поскольку, как известно, именно эти дефекты ДНК эффективно устраняются репаративнн-ми системами млекопитающих. Излучение длинноволновой области УФ (337 нм) поглощается иными, нежели ДНК, хромофорами, и последующие опосредованные фотохимические изменения ДНК в этом случае могут приводить к образованию менее губительных для клетки фотопродуктов.

Отсутствие цитотоксического эффекта дУФ-излучения для клеток HeLa и выявленная его мутагенная активность для сальмонелл, по-видимому, объясняется более эффективным устранением предмутационных повреждений в клетках млекопитающих.

3.4. Для выяснения вопроса о том, не индуцирует ли лазерное излучение образование свободных радикалов, исследовали влияние биологически активных соединений с антирадикальными свойствами: р-квротина, витамина А, а-токоферола, а также веществ ряда аскорбиновой кислоты,- на синтез ДНК под действием сУФ-лазерного излучения. Обнаруженное отсутствие защитного эффекта перечисленных соединений косвенно подтверждает, что цитотоксическое действие сУФ обусловлено

Рве. 7 Еэвстгаэ налггангя авотаого ияора (337 ci)

Еа сззтвз ДВК у мвчогах ^-тпляяюа иэкк BsLa.

£S4 rasáe) ЗСЗ nasi*) 837 rcate) HcLa

№. 8. Сразяятагьзсв Езучениэ даяцтвяя отэтховодзсетго, срвда-ххшюгого ■ дшшсюшвого УФ^од^шя ва ^mvffl'^rfffffî^ csarresa SIX у меченых Зн-пнвлвэсм EJBTox Hela: о - 254 газ; + - 303 rai;

X - 337 и».

-15 х

повреждениями ДНК в ходе фотохимических реакций, протекающих без участия свободных радикалов. Таким образом, механизм действия излучения с Л. 308 нм, по всей вероятности, заключается в образовании фотодефектов ДНК в результате прямого поглощения квантов сУФ-света и не связан с индукцией 2-квантовых реакций под действием высокоинтенсивного лазерного излучения или других механизмов с участием свободных радикалов.

4. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ .

НА ИНДУЦИРОВАННЫЙ НИТР030ГУАНЩШ0Ы МУТАГЕНЕЗ у БЛурМшгХш.

4.1. Изучали влияние аскорбиновой кислоты (АК) и ее производных: аскорбината натрия (АН) и аскорбилпальмитата (АП) на химический мутагенез, индуцированный ннтрозогуанидином (МННГ). Результаты, представленные в Табл. 3 показывают, что все исследуемые вещества во-всем диапазоне взятых концентраций дозозависимым образом эффективно ингиби-руют химический мутагенез. Наибольшую антимутагенную активность проявил АП. ,

4.2. Далее, чтобы выяснить вероятную точку приложения антимутагенного действия АК и АП в клетке бактерии, мутаген и антимутагены инкубировали в 5 различных последовательностях (Табл. 4). Видно, что в случае АК наибольший антимутагенный эффект достигался, когда создавались условия для непосредственного взаимодействия АК и МННГ (III и IV). АП обнаружил более выраженную антимутагенную активность по сравнению с АК. Наибольшее снижение мутагенности МННГ наблюдалось в варианте II, то есть, при предварительной инкубации клеток с антимутагеном с последующим внесением в среду МННГ. Известно, что АП в отличие от АК хорошо растворяется в кирах и. соответственно, может легко встраиваться в фосфолшшдный слой клеточных мембран. По-видимому, данное свойство АБ играет существенную роль в его антимутагенной активности. АП встраивается в фосфолшшдный слой периплазматической мембраны своим жирнокислотным "хвостом", а полярная его часть - остаток АК - остается в периплазме. Таким образом, на мембране бактерий создается оболочка из остатков АК. Инактивация МННГ, вероятно, происходит в результате его взаимодействия с этими остатками АК в периплазме. По механизму действия АП может быть отнесен к антимутагенам мембранного действия.

4.3. Результаты эксперимента по сравнительной оценке антиокси-даятной активности АК, АП и АН в модельной окислительной системе

1с

твбляи э.

Вягаша АК, Ш, АН и а-токоферола ва мутагенное ДбВогшз ШШГ ПЗ ВТН£» Э. црМя/игЗиа ТА100.

1 АЯТИ-! мута- Доза Ентимутагеяа, ИОУчаЕХУ. Колпэство МЗ^-рвВЗрТШГГОВ/ЧйЗ-Ку'игоЬпря дозах ННКГ

ген О.ббмкг/чашку 21ЖГ/Ч0СЙ.У

I" ' 0.7Т - 0.05 2.4 1 0.2

АК 10 0.73 * 0.04 2.0 . ± 0.2

100 0,76 4 0.04 1.8 1 0.1

1000 0.34 - 0.01 1.7,0 * 0.06

I ■ 0.80 * 0.05 .2.3 4 0.1

АН ю О.Ш ' 0.05 1.51 * 0.03

. 100 0.43 * 0.02 1.84 4 О.Сб

1000 0.36 ^ 0.01 1.79 ± 0.05

•I 0.53 * 0.03 1.6 * 0.2

АП 10 О.ЗЭ * 0.02 1.6 * О.Г

1 100 0.21 ± 0.01 1.63 - О.ОЭ

1000 0.172 - О.СХЗЗ 0.277 * О.ЮЗ

а-токсферол 4 . 0.63 ± 0.04

гс 0.27 4 0.01

100 0.014 ± 0.001

Н^споят.фщ) '

Контроль 0.150 ± 0.002 0.79 *„0.02 г.б * о.з

» сраднэв из трех повторвостей

»» Весовая концентрация I нкг/чазху в тесте ЗЯмса

соответствует молярное концентрации 1.14 .1 (Г5!! дм АК; 1.01 Л0"Т( ДЛЯ АН и 0.43 .10_5Н ДЛЯ АП.

. Тебина 4.

Антикутагопиое деаствие 1К и АН ври различии условиях яакусвцкй о оахтеравд . S. typhiwuriüa TAÍOO В МННГ

м.

Взрсдт аз™- Ко'д-во ы.з+-реБврхаатов/ Ыутагехшбя - УМ- . ч смзси jigj, чгшу'ШО **). - акткввость 1№Г(»)

I ах ,г.э ± о.г ,:". ioo . ап г.О ± o.i , ' ; - то .

и АК 3.0 i 0.3 .100 ал 0.39 i 0.02 13 •.

1п ак 1.65 * ó.06 ; .54 •. , - . ап 1.02 i 0.07 35 • ,

tv . ак ' 1.98 i 0.09 к с8 ' ап 0.07 i 0.06 ' 30-' - '

, .v ' -'..,, г.» - о.г • ■ кй

■ * Срешев из трех повтор тгей •« I: югапш + МННГ1, затей'антимутаген II: кяэтки \ ввтимутагев, затей UKHT III: ШНГ 4 ввтЕиутвгвн, затеи клетки IV: влэтки ♦ антимутагея + МННГ. V: клетка + МННГ

представлены на Рис. 9.

Рис. э. Влияние аскорбиновое кислоты а ее производных 88 окисление ивгажыюата.

0. Нулевая линия соответствует контроле (чистий металолеат)

1. (+) Аскорвинат натрия (2,5 ЧСГ6 - 1,25 ЧО"2 Ы)

2. ( ) Аскорбиновая кислота 12.S "Ю-® - 1,42 И:

3. (*) Аскорбшшалыштат (1,6 -1С~Ь - 5,6? чсГ" w

Из приведенных данных видно, что практически все Форш АК во всем изученном интервале концентраций проявляют прооксидантные свойства. Лишь ан показывал слабую антиоксидантную активность. По способности ускорять окиление МО исследуемые вещества можно расположить в следующем порядке: ал > ак > ан. Это свидетельствует о том, что вещества ряда ак не способны взаимодействовать с радикалами roo*, т.е. не являются "истинными", антиоксидантами, а их защитный эффект, обнаруженный в экспериментах, очевидно, обусловлен синергитическиы взаимодействием с природными антиоксидантами (а-токоферолом), присутству ишими в биологических системах.

Сопоставление результатов Табл. 3 и Табл. 4 свидетельствует о наличии прямой корреляции между антимутагенной и прооксидантной активностью различных форм АК. Химический механизм антимутагенного действия АК может объясняться прямым взаимодействием АК и ее производных (или их окисленных форм) с молекулой МННГ с образованием устойчивого соединения, не способного к дальнейшей,метаболической трансформации, ведущей к образованию мутагенных продуктов.

выводы

I. Установлено, что для оценка мутагенного действия лазерного УФ-излучения мотат быть применен бактериальный тест Эйюа с использованием штата S. typblmurlÜQ TAI00.

Z. Обнаружено, что мутагенной и летальной активностью обладает не только лазерное излучение средневолновой УФ-области (308 ни, XeCI лазер), во и длинноволновое лазерное уф-нзлучение (337 нм, N2 лазер).

Эффективность мутагенного действяя лазерного излучения с длшаки волн 308 ем 'и 337 ем в 340 и в 4,7 «i04 раз соответственно меньше таковой низкоинтенсивного УФ-излучения бактерицидной лашы (254 на).

Излучения лазеров ИК-даапазона мутагенной активности во обнаруживают.

3. На клетках млекопитающих показано, что цитотоксическое действие оказывает лазерное излучение только средневолнового УФ-диапа-зона (308 ем) . Эффективность этого действия го отноиешв к таковому для 254 нм в -00 раз кеньие, что согласуется, с соотноаением ыута-генной эффективности для этих видов УФ-ззлучония.

4. Установлено, что некоторые биологически активные соединения (а-токоферол, аскорбиновая кислота, аскарбэшгагьшиат и аскорбинат натрия), обладая эффективный рчтимутагенным действием по отношению к химическим мутагенам, не оказывают защитного действия в случае лазерного уф-мутагенеза, что свидетельствует о различных механизмах индукции мутаций под действием этих факторов.

5. При использовании лазеров УФ-даапазона в медицинской практике более перспективным с точзси зрения тнЕкального риска потенциальных повреждающих последствий следует считать применение длинноволнового лазерного УФ-излучения.

В соответствии с полученными данными, лазерные установки, генерирующие средневолновое УФ излучение, могут быть применены только при определенных режимах облучения с суммарными дозами, не превыяающики. I кДж/м2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тырсина Е.Г., Россихина О.Г., Синеокий С.П. Бактериальные экспресс-методы оценки генотоксичэского воздействия лазерного излучения и химических веществ. Препринт, изд-во ИАЭ им И.В. Курчатова, N 5382/13, 1991, г. Иосква, 37 с.

2. Тырсина Е.Г., Россихина о.Г., Тырсин Ю.А., Абилев С.К. Аскороилпальмитат - антимутаген мембранного действия. Доклады Академии Наук СССР ("Генетика"), 1991, т.318, N4, с.992-994.

3. Тырсина Е.Г., Россихина О.Г. Изучение мутагенного действия лазерного излучения на тест-штаммы Salmonella typhlmurlum. Экоген, 1992, 1.2.7.

4. Tyrslna E.G., Rosslk&lna O.G.. Abllev S.K., Tyrsln Yu.A.

A new approach to the mechanism of antlmrtagenlc action oi ascorbic acid and Its derivatives. Biomedical science, 1992 (в печати).

5. Tyrslna E.G., RosslWUna O.G. Investigation or laser Irradiation mutagenic action. Доклад на советско-американском симпозиуме по науке, технологии и торговле, 1991, 13-16 марта Сан-Франшско, США.

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ ВОНЦ АМН СССР пода • К ПЕЧАТИ Л •' ЗАКАЗ 293 ТИРАЖ Ю О эю.