Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические эффекты флавоноидов в бактериальных культурах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетические эффекты флавоноидов в бактериальных культурах"

На правах рукописи

МАКСИМОВ Александр Юрьевич

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ФЛАВОНОИДОВ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУРАХ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2004

Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Демаков В.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Октябрьский О.Н. Белевнч И.О.

Ведущая организация: Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург

Защита состоится "ЛС " ^ Тй 2004 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс: (3422)44 67 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, чл -корр. РАН

Ившина И.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В естественной среде клетки бактерий подвержены влиянию многих химических факторов, в том числе тех, которые не являются элементами питания, но проявляют различную биологическую активность. Некоторые из этих соединений имеют большое значение в стимуляции или ограничении роста бактерий, в формировании, стабилизации и изменении микробных сообществ (Громов, Павленко, 1989). Однако экологическая роль подобных компонентов среды мало изучена. Растительный мир - огромное по разнообразию, численности и общей биомассе царство автотрофных организмов, продуцирующих и поставляющих в среду подавляющую часть природных органических соединений (Ловикова и др., 2001). Растения являются также источником разнообразных биологически активных веществ, являющихся эффективными экологическими факторами в микроценозах (Георгиевский и др., 1990; Cowan, 1999).

Флавоноиды - биогенные фенольные вещества, производные флавана или флавона, которые содержатся в высших растениях. Как и другие фенолы, флавоноиды связывают свободные радикалы, хелатируют катионы металлов. Эти соединения обладают также широким спектром физиологического и биохимического действия на живые организмы различных таксонов (Кретович, 1991). В настоящее время известно более трех тысяч флавоноидов. Разнообразие флавоноидов достигается за счет комбинации заместителей (-ОН,-ОСНз и -СН3 групп) в ароматических кольцах и гликозилирования (Георгиевский и др., 1990). Ежегодно растительный мир Земли продуцирует миллионы тонн флавоноидов, которые поступают в почву и водоемы, в различные пищевые цепи. Бактерии, в отличие от многоклеточных организмов, имеют максимальный контакт клеточной поверхности с внешней средой, поэтому присутствие флавоноидов должно быть для них особенно значимо (Alldrick et al., 1986).

Флавоноиды являются постоянными компонентами продуктов питания человека. Известны их антиоксидантные и антирадикальные свойства (Костюк и др., 1988), цитопротекторное действие на клетки эукариот в различных стрессовых условиях (Duthie et al., 1997), Р-витаминная активность. Сообщается об их мутагенном и антимутагенном действии на эукариоты, а также в микробных тест-системах в условиях метаболической активации (Bjeldanes, Chang, 1977; Nijveldt et al., 2001). В то же время, влияние флавоноидов на '""«•учцпсп- и р"ст бактерий мало изучено. Сведения об их

ЮС к и ч'-НАЛЬНА* iOOif-K

прямом мутагенном действии, антимутагенной активности и антибактериальных свойствах фрагментарны и противоречивы. Отсутствует оценка совместного действия этих соединений с химическими мутагенами и солями металлов. Опубликованные статьи не дают полного представления о роли флавоноидов как экологического фактора для бактерий.

В данной работе исследовано влияние ряда флавоноидов и их комбинации с некоторыми мутагенами на выживаемость и частоту мутаций у бактерий. Определены зависимости выявленных эффектов от дозы флавоноидов, обсуждены их возможные механизмы действия и влияние на жизнедеятельность микробных сообществ. Исследования выполнены в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (№ государственной регистрации темы 01.9.00017990).

Цель настоящего исследования - изучение влияния ряда флавоноидов на частоту мутаций и рост штаммов Escherichia coli и Salmonella typhimurium.

Основные задачи исследования:

1. Изучить влияние различных концентраций флавоноидов на рост энтеробактерий и грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и Bacillus mycoides.

2 Определить влияние флавоноидов на частоту замен оснований и фреймшифт-мутаций у штаммов S. typhimurium.

3. Оценить зависимость мутагенной активности флавоноидов от структуры их молекул.

4. Изучить совместное действие флавоноидов и стандартных мутагенов (9-аминоакридина, К-метил-К-нитро-К-нитрозогуанидина, бихромата, налидиксовой кислоты) на частоту мутаций у энтеробактерий.

5. Исследовать генетические эффекты флавоноидов в присутствии солей двухвалентных металлов.

Научная новизна. Показано цитостатическое действие флавоноидов, относящихся к группам флавонов, флавон-3-олов, катехинов и флаванонов, на клетки S. typhimurium, Е. coli, Rhodococcus sp. и В. mycoides. Впервые обнаружено мутагенное действие флавоноидов в культурах грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides. Установлено, что флавоноиды без метаболической активации индуцируют у бактерий мутации различных типов, наиболее эффективно - мутации типа сдвига рамки считывания генетической информации. Впервые экспериментально показано антимутагенное действие флавоноидов на штаммах S. typhimurium против прямого

мутагена акридинового ряда - 9-аминоакридина и оксиданта - бихромата калия. Выявлена модуляция генетического действия флавоноидов в присутствии солей двухвалентных металлов.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные, свидетельствующие о мутагенных и антимутагенных эффектах флавоноидов, расширяют представление о воздействии флавоноидов на рост и генетическую стабильность бактерий, и их значении, как экологического фактора в микроценозах. Результаты исследования имеют практическое значение для профилактической медицины. Обнаруженное явление значительного усиления в присутствии флавоноидов эффективности мутагенеза, индуцированного нитрозогуанидином, может быть использовано в методологии химического мутагенеза и селекции.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Флавоны (6-гидроксифлавон, 7-гидроксифлавон, хризин), флавон-3-олы (кверцетин, морин, 3-гидроксифлавон, 3,6-дигидроксифлавон, 3,7-дигидроксифлавон), флаваноны (6-гидроксифлаванон, нарингенин, нарингин) и катехин в концентрации свыше 0,1 мМ оказывают бактериостатическое действие.

2. Флавоноиды являются мутагенами прямого действия и индуцируют в клетках бактерий преимущественно мутации типа сдвига рамки считывания.

3. Флавоноиды оказывают антимутагенное и цитопротекторное действие в условиях мутагенеза, индуцированного 9-аминоакридином и бихроматом калия.

4. Генетические эффекты флавоноидов изменяются в присутствии ионов двухвалентных металлов и трехвалентного железа.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-98», Москва; Областной научно-технической конференции молодых ученых "Химия и экология", Пермь, 1999; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-2001», Волгоград; IX и XI Межвузовских конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых "Экология: проблемы и перспективы", Пермь, 2001,2003.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 141 странице машинописного текста, содержит 32 рисунка и 9 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения

результатов, выводов, списка литературы. Список литературы включает 243 наименования работ отечественных (54) и зарубежных (189) авторов.

Список принятых сокращений: 9-АА - 9-аминоакридин; АФК - активные формы кислорода; днДНК - двунитевая ДНК; онДНК - однонитевая ДНК; КОЕ -колониеобразуюпще единицы; МИК - минимальная ингибирующая концентрация; МПА - мясо-пептонный агар; МННГ - Ы-метил-К-нитро-Н-нитрозогуанидин; СОД -супероксиддисмутаза; LB - среда Луриа-Бертаии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Рабочая коллекция бактериальных культур. В работе использовали штаммы S. typhimurium ТА1535, ТА1537, ТА1538, ТА1977, предоставленные проф. Bruce N. Ames (University of California, USA); штаммы E. coli WP2, WP2S, WP6, CM561, из коллекции лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН, а также изолированные из почвы грамположительные штаммы Rhodococcus sp. gtl и В. mycoides В5. В табл. 1 приведена генетическая характеристика исследуемых штаммов энтеробактерий.

Таблица 1.

Генетическая характеристика штаммов энтеробактерий

Штамм Генетическая характеристика Примечание

S. typhimurium

TAI 535 rfa, ДиугВ, AííG46 Миссенс-мутация ауксотрофности по гистидину

ТА 1977 rfa, АиС3076 Фреймшифт-мутация ауксотрофности по

TAI 537 tfa, AuvrB, Ai'jC3076 гистидину типа +1

TAI 538 rfa, AmwB, AÚD3052 Фреймшифт-мутация ауксотрофности по гистидину типа -1

Е. coli

WP2 B/r, trp Ауксотроф по триптофану

WP2S B/r, trp, uvrA То же; дефект эксцизионной репарации

WP6 B/r, trp, pol A То же; дефект ДНК-полимеразы I

CM 561 B/r, trp, lex A То же; дефект SOS-репарации

Культивирование бактерий. Культуры энтеробактерий выращивали в 100 мл ЬВ-бульона в колбах Эрленмейера объемом 250 мл при 37°С, при перемешивании (100 об/мин). Клетки Ккойососсш ер. и В. mycoides В5 культивировали в тех же

условиях, но при 30°С. Рост бактерий контролировали путем измерения оптической плотности суспензии при длине волны 540 нм (ОП540). Количество жизнеспособных клеток определяли методом серийных разведений с последующим высевом на чашки Петри с агаризованной средой ЬВ и подсчетом колоний, как количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл среды. Минимальные ингибирующие рост бактерий концентрации (МИК) флавоноидов измеряли в суспензионном тесте на иммунологических планшетах методом последовательных двукратных разведений.

Характеристика использованных флавоноидов. В работе использовали 12 флавоноидов (производства 81дта-А1&1сЬ-Р1ика), относящихся к 4-м структурным группам (табл. 2).

Таблица 2.

Флавоноиды и их структура

/т э\ Флавопы

ÍÍCÍ "W 1 6-гидроксифлавон

2 7-гидроксифлавон

0 3 Хризин (5,7-дигидроксифлавон)

Флавон-З-олы

4 3-гидроксифлавон

ссх 5 3,6-дигидроксифлавон

■"ОН 6 3,7-дигидроксифлавон

О 7 Кверцетин (3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавон)

8 Морин (3,5,7,2',4'-пентагидроксифлавон)

Флаван-З-олы (Катехины)

ííl Y

9 Катехин (3,5,7,2',4'-пентагидроксифлаван)

Флаваноны

со \J 10 6-гидроксифлаванон

11 Нарингенин (5,7,4'-тригидроксифлаванон)

0 12 Нарингин (нарингенин-7-рамнозидоглюкозид)

Исследование мутагенного и антимутагенного действия. Спот-тест для оценки мутагенности проводили стандартным методом (Фонштейн и др., 1977). Частоту спонтанных и индуцированных мутаций определяли в модифицированном суспензионном тесте Эймса без метаболической активации, как отношение количества рсвертантов к количеству жизнеспособных клеток в единице объема инкубационной среды (Ames, 1975; Фонштейн и др., 1977). Суспензионный тест для оценки

ДНК-повреждающего действия проводили на штаммах Е. coli WP2, WP2s, WP6 и СМ561 (Фо1Шггейн и др., 1985).

Полимеразную реакцию in vitro с ДНК-полимеразой I проводили на матрице однонитевой ДНК бактериофага М13тр18 по модифицированному протоколу приготовления высокомеченных зондов (Маниатис и др., 1984). В качестве затравки использовали универсальный 17-мерный секвенирующий праймер.

Анализ активности антиоксидантиых ферментов. Супероксиддисмутазную активность определяли по методу, описанному Puppo et al., 1989. За условную единицу принимали активность фермента, обеспечивающую 50% ингибирование восстановления нитросинего тетразолия. Каталазную активность оценивали спектрофотометрическим методом (Beer, Sizer, 1952). Активность выражали в мкмоль Н202/мг белка/мин.

Статистическая обработка. Опыты проводили не менее чем в трех повторностях. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение, ошибку средней арифметической, доверительный интервал, достоверность различий по t-критерию Стьюдента. Анализ результатов проводили с помощью стандартных пакетов программ MS Excel 2000, Statistica и Advanced Grapher 2.08.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние флавоноидов на рост бактерий. Мутагенез, как правило, сопровождается замедлением роста, блокированием деления и гибелью части клеток. Эти эффекты проявляются в различной степени в зависимости от природы, дозы, условий действия мутагена и ряда других факторов. В связи с этим выживаемость клеток - это важный показатель, учитываемый при оценке частоты мутаций.

Известно, что флавоноиды кверцетин и хризин способны подавлять рост бактерий (Cowan, 1999). Для оценки влияния на рост и жизнеспособность S. typhimurium и Е. coli исследуемые флавоноиды в концентрациях от 0,05 до 5 мМ добавляли в культуральную среду. Как видно на рис. 1, морин в концентрации 0,1 мМ и выше подавлял рост S. typhimurium TAI537. При содержании морина в среде 1 мМ пролонгировалась лаг-фаза, укорачивалась стадия экспоненциального роста клеток. Однако даже при глубоком подавлении роста бактерий не было обнаружено значительного снижения количества жизнеспособных клеток относительно засевной дозы, из чего можно заключить, что морин оказывает на бактерии в большей степени цитостатическое, чем бактерицидное

действие Подобным же образом действовали на рост бактерий 5 1урЫтипит и Е соИ другие флавоноиды.

ч 2.00Е+09

§ 1,60Е+09 -и,

1.20Е+09 8.00Е+08 -4.00Е+08 0.00Е+00 ***

-1 -2 -3 ■4 -5 ■б

Рис. 1. Изменение количества жизнеспособных клеток при культивировании штамма & ГурМтипит ТА1537 в присутствии морина.

1 - контроль (без флавоноида); 2-5- морин в концентрации: 2- 0,05 мМ; 3- 0,1 мМ; 4- 0,5 мМ; 5-1 мМ; 6- 3 мМ.

Аналогичные опьггы показали, что морин также способен подавлять рост грамположительных микроорганизмов КкоЛососсиз ер. (рис. 2) и В. тусо1с1е5 В5.

3 5.00Е+08

I

О 4.00Е+08 3,00Е+08 2,00Е+08 1.00Е+08 О.ООЕ+ОО

60 80 Время, ч

Рис. 2. Изменение количества жизнеспособных клеток при культивировании штамма Юнм1ососси1 $р. в присутствии флавоноида морина.

/- контроль (без флавоноида); 2-5- морин в концентрации: 2- 0,1 мМ; 3- 0,3 мМ; 4- 1 мМ; 5- 3 мМ.

Добавление морина в концентрации 0,1 мМ в некоторой степени стимулировало рост Rhodococcus sp gtl и В mycoides В5 При более высоких концентрациях флавоноид подавлял рост клеток. Однако данные штаммы оказались более устойчивыми к высоким концентрациям морина, чем S. typhimurium и Е. coli.

Пропорционально концентрации морина повышалась частота появления мутантных клонов Rhodococcus sp. gtl и В. mycoides В5, устойчивых к хлорацетамиду и клонов, дефектных по нитрилгидратазной активности (рис. 3). Таким образом, этот флавоноид способен индуцировать мутации у грамположительных бактерий.

Концентрация морина, мМ

Рис. 3. Частота мутаций устойчивости к хлорацетамиду у штаммов Rhodococcus sp. gtl (7) и В. mycoides В5 (2) в присутствии морина.

Измерение минимальных ингибирующих концентраций флавоноидов для S. typhimurium TAI537 и штаммов Е. coli показало, что флавоноиды, несущие более двух гидроксильных групп, сильнее подавляли рост бактерий. В концентрациях, ингибирующих рост, флавоноиды не вызывали значительного снижения количества жизнеспособных клеток по сравнению с засевной дозой (106), что свидетельствует о цитостатическом действии флавоноидов.

Антибактериальное действие флавоноидов может бьгть обусловлено различными их свойствами: (1) прооксидантное действие хинонных продуктов окисления флавоноидов и комплексов флавоноидов с ионами металлов переменной валентности;

(2) комплексообразование, хелатирование ионов металлов, связывание белков;

(3) специфическое ингибирование ферментов. По нашим данным ингибирующее

действие флавоноидов проявляется как в аэробных, так и в анаэробных условиях, причем в анаэробных условиях, снижающих вероятность окислительного повреждения клетки, наблюдаются более низкие значения минимальных ингибирующих концентраций. Следовательно, окислительные процессы не могут быть признаны основной причиной подавления роста клеток. Небольшое усиление цитостатического действия флавоноидов в анаэробных условиях может быть следствием ингибирования топоизомераз П типа, в частности ДНК-гиразы, содержание которой в клетках, как известно, повышается при анаэробном культивировании (Yamamoto, Droffher, 1995). Это предположение согласуется с данными литературы о селективном ингибировании флавоноидами топоизомеразы IV и ДНК-гиразы (Bernard et al., 1997). Ингибирование топоизомераз приводит к формированию комплексов ДНК-белок, блокирующих матричные процессы (Кафиани, Бронпггейн, 1992).

Влияние морина на репликацию ДНК in vitro. Известно, что флавоноиды связывают ионы металлов, поэтому одной из причин подавления роста может быть ингибирование металлозависимых ферментов. Чтобы проверить это предположение мы исследовали воздействие морина на полимеразную реакцию, катализируемую ДНК- полимеразой I Е. coli на матрице однонитевой ДНК бактериофага М13. Продуктом реакции является двунитевая кольцевая ДНК с разрывом одной цепи.

- дн ДНК М13

- он ДНК М13

1 2 3 4 5 6 7

Рис.4. Влияние морина на полимеразную реакцию, катализируемую ДНК- полимеразой IЕ. coli (фрагмент Кленова) in vitro.

1- он ДНК М13тр18; 2-реакция в стандартных условиях (без флавоноида); 3- 0,1 мМморин; 4- 0,3 мМ морин; 5- 0,3 мМ MopHH+MgS04; б- 1 мМ морин; 7-1 мМ морин+MgSCV

Как видно из рис. 4, морин в концентрациях 0,3 и 1 мМ подавлял полимеразную реакцию. Повышение концентрации ионов магния, кофактора полимеразы, делало возможным протекание полимеразной реакции и в присутствии 0,3 мМ морина. Этот

факт свидетельствует о том, что основной причиной подавления активности ДНК-полимер азы может быть связывание ионов магния флавоноидом.

Мутагенное действие флавояоидов. В спот-тесте было выявлено мутагенное действие флавоноидов кверцетина, нарингина, нарннгенина, хризина, морина, катехина, 3-гидроксифлавона, б-гидроксифлавона и 3,6-дигидроксифлавона на штаммы ГурЫтипит ТА1535, ТА1537 и ТА1538. Данные флавоноиды наиболее эффективно индуцировали реверсии у штамма Я /урЫтигшт ТА 1537, регистрирующего мутации типа сдвига рамки считывания.

В суспензионном тесте исследовали зависимость частоты реверсий к прототрофности от концентрации флавоноидов в инкубационной среде (рис. 5).

1.00Е+10 -|

I

§ 1,00Е+09 -

т 1.00Е-04

-- 1.00Е-05

1.00Е-06 я

ьГ

•• 1.00Е-07 ■ Выживаемость

1.00Е-08 ■ Частота мутавдй

Рис. 5. Влияние морина на частоту мутаций штамма ТА1537.

1 - контроль (без флавоноида); 2-5 - морин в концентрации: 2- 1 мМ; 3- 3,3 мМ; 4- 5 мМ; 5-10 мМ.

Для этого клетки бактерий инкубировали в течение 40 мин в нескольких вариантах: без добавок (контроль спонтанного фона) и с флавоноидом морином в концентрации 1; 3,3; 5 и 10 мМ. При увеличении концентрации морина возрастала частота мутаций. Повышение концентрации флавоноида до 10 мМ увеличивало уровень мутирования более чем на два порядка. Это сопровождалось значительным снижением количества выживших клеток, которое составляло менее 0,1 % от числа клеток в контрольном варианте. Подобное мутагенное действие обнаружено у всех исследуемых флавоноидов.

Зависимость генетической активности от структуры молекул флавоноидов.

Изучение влияния 12-ти флавоноидов на частоту обратных мутаций клеток штамма S typhimurium TAI 537 показало, что все исследованные соединения обладают прямым мутагенным действием. Наиболее высокая частота мутаций наблюдалась при воздействии на клетки 3,6-дигидроксифлавона. Высокую мутагенную активность проявляли также 6-гидроксифлавон, 7-гидроксифлавон, б-гидроксифлаванон, нарингенин, морин, кверцетин и нарингин (рис. 6).

I 1.00Е-02 -I 1.00Е-03 -| 1,00Е-04 § 1.00Е-05 $ 1.00Е-06 -1.00Е-07 -1.00Е-08

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 Рис. 6. Влияние флавоноидов в концентрации 5 мМ на частоту реверсий штамма S. typhimurium ТА1537.

1- 3-гидроксифлавон, 2- 6-гидроксифлавон, 3- 7-гидроксифлавон,

4- 6-гидроксифлаванон, 5-3,6-дигидроксифлавон, 6- хризин, 7-нарингенин, 8- 3,7-дигидроксифлавон, 9- морин, 10- катехин, 11- кверцетин, 12- нарингин.

Влияние флавоноидов на мутагенез штамма S. typhimurium TAI537, индуцированный 9-аминоакридином. Сравнительное исследование раздельного и совместного действия интеркалирующего мутагена 9-аминоакридина (в концентрации 100 мкг/мл) и флавоноида нарингенина на клетки S. typhimurium ТА1537 показало, что нарингенин в концентрациях 1 и 5 мМ более чем на два порядка снижает частоту реверсий к прототрофности по гистидину, индуцированных мутагеном (рис. 7). Частота мутаций при совместном действии морина и 9-аминоакридина была на порядок ниже, чем при этих же концентрациях флавоноида без мутагена. Таким образом, нарингенин снижал частоту мутаций, индуцированных 9-аминоакридином. Аналогичное действие наблюдалось в опытах со всеми флавоноидами.

1.00Е-03

| 1.00Е-04 -§ 1.00Е-05 -| 1.00Е-06 -

1.00Е-05 -

1.00Е-07 -1,00Е-08 1

Т-1-1-1-1

О 2 4 6 8 10

Концентрация нарингенина, мМ

Рис. 7. Влияние нарингенина на частоту мутаций штамма фрЫтипит ТА1537.

/- нарингснин (без 9-аминоакридина); 2 - нарингенин+9-аминоакридин.

Одновременное и последовательное действие 9-аминоакридина и нарингенина на частоту мутаций 5. ¡урМтипит ТА1537. Причиной антимутагенного действия некоторых фенольных соединений в отношении ряда мутагенов является прямая инактивация или связывание молекул мутагенов. Однако, по нашим данным предварительная совместная инкубация 9-аминоакридина и флавоноидов в растворе без клеток не оказывает существенного влияния на частоту мутаций, индуцируемых при их совместном действии.

Для оценки вероятного механизма антимутагенного действия флавоноидов в отношении 9-аминоакридина исследовано изменение частоты мутаций при совместной и последовательной инкубации клеток 5. ¡урЫтипит ТА1537 с 9-аминоакридином и флавоноидами Обнаружено, что кратковременная инкубация клеток с флавоноидом до внесения 9-аминоакридина практически не влияет на частоту мутаций, индуцируемых при их последующей совместной инкубации. Поэтому, вероятно, флавоноиды не препятствуют проникновению 9-аминоакридина в клетки бактерий, не являются мембранными антимутагенами и их антимутагенное действие обусловлено внутриклеточными процессами. Добавление в инкубационную среду супероксиддисмутазы не влияло на мутагенный и антимутагенный эффекты флавоноидов. Поэтому, вероятно, антимутагенный эффект флавоноидов в отношении аминоакридина не связан со свободнорадикальными процессами.

Как видно из рис. 8, наибольшее снижение частоты мутаций по сравнению с действием одного 9-аминоакридина обнаружено в варианте совместной инкубации

клеток с мутагеном и нарингеннном. Последовательная инкубация бактерий в течение 20 минут с 9-аминоакридином и затем 20 минут с добавлением флавоноида также приводила к значительному снижению частоты реверсий. При добавлении флавоноида после 40 минутной инкубации бактерий с 9-аминоакридином антимутагенного действия не наблюдалось.

В 1.00Е-04 -

| 1.00Б-05 - ^В ВШ

1,00Е-06 - дД Щ ^Л |Н

1,00Е-07 - _ ЯН Щ В| ^Н Щл

1.00Е-08 ———ШШ ■ ——НИИ_, 1 2 3 4 5 6

Рис. 8. Одновременное н последовательное действие 9-аминоакридина и нарингеннна на частоту мутаций 5. фркипигшт ТА1537.

1 - контроль; 2 - 9-аминоакридин, 80 мкг/мл; 3 - 1 мМ нарингенин; 4 - 40' совместная инкубация клеток с 9-АА и нарингенином; 5 - добавление нарингенина после 40'инкубации с 9-АА; б- 20' прединкубация с 9-АА, 20' инкубация с добавлением 1 мМ нарингенина.

Подобные эффекты наблюдались в опытах с другими флавоноидами: морином, кверцетином и катехином. Полученные результаты свидетельствуют о том, что вероятной причиной антимутагенного эффекта может быть влияние флавоноида на процессы репарации ДНК.

Совместное действие морина и бихромата калия на частоту мутаций и выживаемость £ ¡урЫтиНит. Известно, что флавоноиды проявляют антиоксидантные, антирадикальные и, в ряде случаев, прооксидантные свойства. В связи с этим исследовано совместное действие морина и окислителя бихромата калия на выживаемость и мутагенез тестерных штаммов Б. 1урМтипит ТА 1537 и ТА 153 5. На рис. 9 показана частота реверсий штаммов 51.1урМтипит при раздельном и совместном воздействии на клетки морина в концентрации 1, 3 и ЮмМ и бихромата калия в

концентрации 200 мкг/мл. Морин в концентрации 1 и 3 мМ незначительно повышал частоту реверсий обоих штаммов по сравнению со спонтанным фоном, но снижал частоту реверсий, индуцированных бихроматом. В концентрации 10 мМ морин с высокой частотой индуцировал как мутации типа сдвига рамки считывания, так и замены оснований. При обработке клеток ТА1537 бихроматом совместно с морином (10 мМ) наблюдалось повышение на порядок частоты реверсий по сравнению с вариантом, содержащим один бихромат.

1,00Е-08 . I ....... .

0123456789 10 Концентрация морина, мМ

Рис. 9. Влияние морина и бихромата на частоту мутаций штаммов ТА1537 и

а к Ъ - штамм ТА1537; си«?- ТА1535; а и с - морин без бихромата; Ъмк1- морин + 200 мкг/мл бихромат калия.

Таким образом, бихромат, морин и их сочетания способны индуцировать реверсии к прототрофности как на штамме 5. ¡урЫтипит ТА 1535, так и ТА1537. Подобное действие обнаружено в опытах с другими флавоноидами: нарингенином и кверцетином.

Совместное действие ]Ч-метил-№нитро-№нитрозогуанидина и морииа на клетки щЫтипит ТА1535. Известно, что флавоноиды могут оказывать модулирующее действие на мутагенез, индуцированный алкилирующим агентом И-метил-'М-нитро-Ы-нитрозогуанидином (МННГ) у штамма 5 ¡урЫтигшт ТАЮОИЯ, производного ¡урЫтигшт ТА1535 с усиленной функцией ЭОЗ-мутагенеза.

Нами исследовано совместное действие морина в концентрации 1 и 5 мМ и МННГ в концентрации 50 мкг/мл на выживаемость и мутагенез штамма 5. ¡урМтипит ТА1535 (рис. 10). При совместной 40-минутной инкубации 5 мМ морин более чем на порядок повышал выживаемость клеток и на 30% снижал частоту мутаций, индуцируемых

11,00Е-04 -|1,00Е-05 £ 1,00Е-06

1,00Е-07 А-о-*

ТА1535.

нитрозогуанидином. По сравнению с совместной инкубацией, предварительная инкубация морина с МННГ без клеток не влияла на мутагенный эффект МННГ. Таким образом, снижение частоты мутаций не является результатом прямого взаимодействия флавоноида и МННГ.

1.00Е+09

§

1.00Е+08

1.00Е+07

Т 1.00Е-03 | 1,00Е-04 |> -■ 1,00Е-05 I

-■ 1.00Е-06 1.00Е-07 1.00Е-08

Ш Выживаемость

■ Частота мутаций

¡ 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 10. Влияние морина и МННГ на частоту реверсий и выживаемость штамма £ фрЫтигшт ТА1535.

1- контроль; 2- МННГ; 3-1 мМ морин; 4- 5 мМ морин; 5-1 мМ морин+МННГ; б- 5 мМ морин+МННГ; 7- 40' инкубация с МННГ+ 1 мМ морин; 8- 40' инкубация с МННГ+ 5 мМ морин.

В то же время, за счет увеличения выживаемости клеток, морин повышал эффективность мутагенеза, индуцированного нитрозогуанидином, о чем свидетельствует увеличение числа ревертантов (табл. 3).

Таблица 3.

Количество ревертантов при обработке клеток морином и МННГ

Варианты Среднее количество ревертантов на чашку

Контроль 7

МННГ 745

МННГ+морин с клетками 3839

МННГ+морин, 20' прединкубация, 20' инкубация с 4467

клетками

МННГ+морин, 40' прединкубация 3511

Совместное действие кверцетина и налидиксовой кислоты на частоту мутаций у штаммов Е. coll Известно что флавононды являются ингибиторами ДНК-топоизомеразы IV и ДНК-гиразы. Флавоноид кверцетин, как и классический ингибитор гиразы - налидиксоьая кислота, оказывали мутагенное действие на штаммы Е coli и с максимальной частотой индуцировали мутации у штамма Е. coli WP6, дефектного по полимеразе I (polA). При совместной инкубации клеток с налидиксовой кислотой и кверцетином установлена аддитивность их мутагенного и токсического действия на Е coli. Подобные эффекты обнаружены в опытах с другими флавоноидами. Результаты настоящего исследования свидетельствует в пользу предположения, что флавоноид и налидиксовая кислота действуют на один и тот же репарационный процесс или фермент нуклеинового обмена.

Модуляция генетических эффектов флавоноидов солями металлов. Известно, что флавоноиды образуют комплексы с катионами металлов, но не взаимодействуют с неорганическими анионами (Запрометов, 1974). В связи с этим проведена оценка влияния солей ряда физиологически - значимых металлов на генетические эффекты, вызываемые флавоноидом морином и 9-аминоакридином. Изучение совместного действия 5 мМ морина и 70 мкг/мл 9-аминоакридина с сульфатами магния, марганца, цинка, железа (II) и меди, а также хлоридами кобальта и железа (III) на частоту мутаций у S. typhimurium ТА 1537 показало, что катионы металлов модулируют генетические эффекты флавоноида (табл. 4).

Таблица 4.

Влияние солей металлов на частоту мутаций, индуцированных морином и 9-аминоакридином

Ионы металла Отношение частот мутаций в вариантах морин+металл к частоте мутаций, индуцируемых морином Отношение частот мутаций в варианте морин+9-аминоакридин+металл к частоте мутаций в присутствии морина и 9-аминоакридина

Mg 1,72 1,41

Мп 0,77 0,27

Zn 0,78 0,53

Fe(II) 7,85 0,16

Fe(III) 1,39 1,06

Со 4,46 0,62

Си 1,41 0,26

Как видно из табл. fy, ионы марганца и цинка снижали частоту мутаций, индуцированных морином, а также усиливали антимутагенный эффект морина в сочетании с 9-аминоакридином. Соли магния немного усиливали мутагенное действие морина и ослабляли его антимутагенное действие в отношении 9-аминоакридина. Такой эффект магния может быть связан с его участием в процессах репарации и мутагенеза, как кофактора ферментов нуклеинового обмена. Ионы меди, кобальта и железа явно увеличивали мутагенное действие флавоноида. Это согласуется с данными о мутагенности и ДНК-повреждающем действии комплексов флавоноидов и металлов переменной валентности (Ahmad et al., 1992). Подобные эффекта могут быть связаны с генерацией комплексами свободных радикалов. Соли марганца, цинка, железа (П), меди и кобальта усиливали антимутагенный эффект морина в отношении 9-аминоакридина. Ионы Fe(III) мало влияли на частоту мутаций в сочетании с морином и аминоакридином.

Таким образом, катионы металлов модулируют генетические эффекты модельного флавоноида и стандартного мутагена 9-аминоакридина. Направление такого влияния металлов, вероятно, зависит от их окислительно-восстановительных свойств и физиологической роли в клетке.

ВЫВОДЫ

1.Флавоны (6-гидроксифлавон, 7-гидроксифлавон, хризин), флавон-3-олы (кверцетан, морин, 3-гидроксифлавон, 3,6-дшидроксифлавон, 3,7-дигидроксифлавон), флаваноны (6-гидроксифлаванон, нарингенин, нарингин) и катехин в концентрации свыше 0,1 мМ подавляют рост бактерий. Ингибирование роста бактерий обусловлено в большей степени цитостатическим, чем бактерицидным действием флавоноидов.

2. Установлено, что флавоноиды проявляют свойства мутагенов прямого действия. Концентрационная зависимость их мутагенного эффекта имеет нелинейный характер.

3. Показано, что флавоноиды индуцируют у бактерий преимущественно мутации типа сдвига рамки считывания. Генетическая активность структурно различных флавоноидов проявляется в разной степени.

4. Установлено, что флавоноиды в концентрации до 0,5 мМ обладают антимутагенным и цитопротекторным действием при воздействии интеркалирукмцего мутагена 9-аминоакридина и окислителя бихромата.

5. Обнаружено, что флавоноиды за счет повышения выживаемости клеток увеличивают эффективность мутагенеза, индуцируемого нитрозогуанидином.

6. Генетические эффекты флавоноидов изменяются в присутствии ионов двухвалентных металлов и трехвалентного железа. Ионы двухвалентных металлов, за исключением магния, усиливают антимутагенное действие флавоноидов в отношении 9-аминоакридина. Металлы с переменной валентностью увеличивают частоту мутаций, индуцируемых флавоноидом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Максимов А.Ю Оптимизация метода детекции пероксидазной метки с использованием гематоксилина: исследование спектров поглощения и некоторых физико-химических характеристик продуктов пероксидазного окисления гематоксилина// В кн.: Физиология, генетика и экология микроорганизмов. - Екатеринбург, 1996. -С. 119-126.

2. Демаков В.А., Максимов А.Ю. Оптимизация метода детекции пероксидазной метки с использованием гематоксилина: кинетика пероксидазного окисления гематоксилина//Там же. - С. 111-116.

3. Максимов А.Ю., Ремезовская Н.Б., Демаков В.А. Влияние флавоноидов на частоту мутаций типа сдвига рамки считывания//Проблемы загрязнения окружающей среды-98: Матер. Междунар. конф. - Пермь, 1998. - С. 63.

4. Ремезовская Н.Б., Максимов А.Ю. Зависимость жизнеспособности и частоты мутирования Salmonella typhimurium от концентрации флавоноидов в инкубационной среде//Там же. - С. 73.

5. Максимов А.Ю., Ремезовская Н.Б., Демаков В.А. Генетическая и цитостатическая активность флавоноидов в культуре Salmonella//Проблемы химии и экологии: Матер. Обл. научно-технической конф. молодых ученых и студентов.. - Пермь: ПГТУ, 1999.-С. 11-12.

6. Максимов А.Ю., Ремезовская Н.Б., Демаков В.А. Влияние флавоноидов на рост и жизнеспособность индикаторных пггаммов Escherichia «»////Проблемы загрязнения окружающей среды-2001: Матер. V Междунар. конф. - Пермь, 2001. - С. 82.

7. Максимов А.Ю. Влияние флавоноидов на жизнеспособность и частоту мутаций S typhimurium!'/Экология: проблемы и перспективы: Матер. IX Межвуз. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. - Пермь: ПГУ, 2001. - Ч. 2. - С. 44-46.

8. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов С.В., Максимова Ю.Г., Демаков В.А. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp.gtlZ/Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т 39, N. 1 - С. 63-68.

9. Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Ремезовская Н.Б Совместное действие морина и бихромата калия на выживаемость и частоту мутаций штаммов Salmonella typhimurium

ТА1535 и ТА1537//Экология: проблемы и перспективы: Матер. XI межвуз. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. - Пермь: 111 У, 2003. - С. 112-115.

10. Максимов А.Ю., Ремезовская Н.Б., Демаков В.А. Влияние флавоноидов на экологию энтеробакгерий//Экология. - 2003. - N. 2. - С. 121-125.

Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99

Подписано в печать 19.02.2004. Набор компьютерный Формат 60X84/16 Усл. печ. л. 1,4 Заказ № 77/2004 Тираж 100 экз.

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614000, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к.113, т.(3422) 198-033

РНБ Русский фонд

2006-4 19476

' с % •

VVv

1 5 MAP 2004

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Максимов, Александр Юрьевич

Введение 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Репарация ДНК, мутагенез и антимутагенез

1.1. ДНК-повреждающие и мутагенные факторы

1.2. Репарация ДНК и мутагенез у бактерий

1.3. Механизмы антимутагенеза

Глава 2. Флавоноиды: структура, классификация, свойства, биологическая активность

2.1. Природные фенольные соединения

2.1. Классификация и общая характеристика флавоноидов

2.2. Биологическая активность флавоноидов 36 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты и методы исследования

3.1. Рабочая коллекция бактериальных культур

3.2. Характеристика использованных флавоноидов

3.3. Питательные среды и растворы

3.4. Условия культивирования и определение количества бактерий

3.5. Методы исследования мутагенного, антимутагенного и ДНК-повреждающего действия

3.6. Полимеразная реакция in vitro с ДНК-полимеразой I

3.7. Анализ активности антиоксидантных ферментов

3.8. Статистическая обработка

Глава 4. Влияние флавоноидов на рост бактерий

4.1. Зависимость роста S. typhimurium от концентрации морина

4.2. Влияние морина на рост и частоту мутаций грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides

4.3. Минимальные ингибирующие концентрации флавоноидов

4.4. Подавление флавоноидами роста штаммов Е. coli, дефектных по репарации ДНК

4.5. Влияние морина на репликацию ДНК in vitro 67 ^

Глава 5. Влияние флавоноидов на частоту мутаций у

S. typhimurium и Е. coli

5.1. Мутагенное действие флавоноидов на S. typhimurium

5.2. Совместное действие флавоноидов и 9-аминоакридина на частоту мутаций и выживаемость S. typhimurium ТА

5.3. Совместное действие флавоноидов и бихромата калия на частоту мутаций и выживаемость S. typhimurium

5.4. Совместное действие Ы-метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидина и морина на частоту мутаций и выживаемость S. typhimurium ТА

5.5. Мутагенное действие флавоноидов и налидиксовой кислоты на штаммы Е. coli WP2, WP2s, WP6 и СМ щ

Глава 6. Модуляция генетических эффектов морина солями двухвалентных металлов

6.1. Минимальные ингибирующие концентрации солей ряда металлов для S. typhimurium ТА

6.2. Модулирующее действие соли магния

6.3. Модулирующее действие соли марганца

6.4. Модулирующее действие соли цинка

6.5. Модулирующее действие соли железа

6.6. Модулирующее действие соли кобальта

6.7. Модулирующее действие соли меди

Глава 7. Обсуждение результатов 103 Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетические эффекты флавоноидов в бактериальных культурах"

Актуальность проблемы

В естественной среде генетическая изменчивость и рост микроорганизмов подвержены влиянию различных химических факторов. Достаточно глубоко исследовано влияние некоторых простых ростовых субстратов и необходимых элементов на физиологические процессы модельных ' штаммов бактерий. В то же время, in vivo клетки микроорганизмов подвержены влиянию ряда веществ, не являющихся необходимыми составляющими питательной среды, но проявляющих различную биохимическую и генетическую активность [24, 89]. Некоторые из этих соединений имеют большое значение в стимуляции или ограничении роста бактерий, в формировании, стабилизации и изменении микробных сообществ. Однако экологическая роль подобных компонентов среды мало изучена [11, 18, 20,24].

Растительный мир - огромное по разнообразию, численности и общей биомассе царство автотрофных организмов, продуцирующих и поставляющих в среду подавляющую часть природных органических соединений [18,34]. Растения являются источником разнообразных биологически активных веществ, которые могут быть эффективными экологическими факторами в микроценозах [18, 89].

Флавоноиды — биогенные фенольные вещества, производные флавана или флавона, содержащиеся в тканях высших растений. В настоящее время известно более четырех тысяч индивидуальных флавоноидов и их производных. Разнообразие флавоноидов достигается за счет комбинации заместителей (-ОН, -ОСНз, -СНз и др. групп) в ароматических кольцах, гликозилирования и димеризации [142]. Как и другие фенольные вещества, флавоноиды связывают свободные радикалы, хелатируют катионы металлов. Эти соединения обладают широким спектром физиологического и биохимического действия на живые организмы различных таксономических групп: участвуют в процессах дыхания, онтогенеза, окислительновосстановительных и защитных системах растений [10, 32] влияют на проницаемость мембран [208], являются эффекторами или субстратами ряда ферментов различных организмов [161]. Известны антиоксидантные [74], антирадикальные [73], противоопухолевые [206], антимутагенные [235] и противовирусные [92] свойства флавоноидов, Р-витаминная активность [208].

Ежегодно растительный мир Земли продуцирует миллионы тонн флавоноидов, которые в существенных количествах поступают из растительных тканей в почву и водоемы, во все пищевые цепи, являются постоянными компонентами среды обитания значительной части живых организмов [10, 32, 128]. В отличие от многоклеточных организмов, бактерии имеют максимальный контакт клеточной поверхности с внешней средой, поэтому присутствие флавоноидов должно быть для них особенно значимо [20].

Флавоноиды являются постоянными компонентами продуктов питания человека [4, 21, 22]. Некоторые из них, например кверцетин и его гликозид рутин, используются в медицине. В то же время известно, что кверцетин мутагенен для эукариот [214]. Поэтому исследование генетических эффектов флавоноидов актуально для профилактической медицины [161].

Состояние вопроса

Известны антиоксидантные [201] и антирадикальные свойства флавоноидов [6, 12], цитопротекторное действие на клетки эукариот в различных стрессовых условиях, основанное на связывании свободных радикалов [95, 119, 132].

Активно исследуются медицинские аспекты антирадикальных [167], ангиопротекторных [161,180,189], гепатопротекторных [55,119,165], антибактериальных [89], противовоспалительных и иммуномодулирующих [160, 161] свойств препаратов флавоноидов, их цитостатическое действие в отношении злокачественных клеток [99,170,238]. Сообщается об их мутагенном и антимутагенном действии на эукариоты, а также в микробных тест-системах в условиях метаболической активации ферментами микросомальной фракции печени животных [21,70,170]. Обнаружено антибактериальное действие кверцетина, хризина и катехина [89].

В то же время, влияние флавоноидов на изменчивость и рост бактерий мало изучено. Сведения об их прямом мутагенном действии, антимутагенной активности, антибактериальных свойствах фрагментарны и противоречивы. Опубликованные статьи не дают полного представления о значении флавоноидов как экологического фактора для бактерий. До настоящего времени не проводилось комплексного исследования влияния флавоноидов на рост, жизнеспособность и изменчивость симбиотической и патогенной для человека микрофлоры. Отсутствует оценка баланса мутагенных и антимутагенных свойств этих соединений, их совместного действия с химическими мутагенами и солями металлов [22,44,47].

Цель настоящего исследования - изучение влияния ряда флавоноидов на частоту мутаций и рост штаммов Escherichia coli и Salmonella typhimurium.

Основные задачи исследования:

1. Изучить влияние различных концентраций флавоноидов на рост энтеробактерий и грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и Bacillus mycoides.

2. Определить влияние флавоноидов на частоту замен оснований и фреймшифт - мутаций у штаммов S. typhimurium.

3. Оценить зависимость мутагенной активности флавоноидов от структуры их молекул.

4. Изучить совместное действие флавоноидов и стандартных мутагенов (9-аминоакридина, М-метил-К-нитро-К-нитрозогуанидина, бихромата, налидиксовой кислоты) на частоту мутаций у энтеробактерий.

5. Исследовать генетические эффекты флавоноидов в присутствии солей двухвалентных металлов.

Научная новизна

Показано цитостатическое действие флавоноидов, относящихся к группам флавонов, флавон-3-олов, катехинов и флаванонов на клетки ^ грамотрицательных бактерий Е. coli и S. typhimurium, а также грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides. Впервые обнаружено мутагенное действие флавоноидов в культурах грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides. Установлено, что флавоноиды без метаболической активации индуцируют у бактерий мутации различных типов, наиболее эффективно - мутации типа сдвига рамки считывания генетической информации. Впервые экспериментально показано антимутагенное действие флавоноидов на штаммах S. typhimurium против прямого мутагена акридинового ряда - 9-аминоакридина и оксиданта - бихромата калия. Выявлена модуляция генетического действия флавоноидов в присутствии солей двухвалентных металлов.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные, свидетельствующие о мутагенных и антимутагенных эффектах флавоноидов, расширяют представление о воздействии флавоноидов на рост и генетическую стабильность бактерий, и их значении, как экологического фактора в микроценозах. Результаты исследования имеют практическое значение для профилактической медицины. Обнаруженное явление усиления в присутствии флавоноидов эффективности мутагенеза, индуцированного нитрозогуанидином, может быть использовано в методах химического мутагенеза и селекции.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Флавоны (6-гидроксифлавон, 7-гидроксифлавон, хризин), флавон-3-олы (кверцетин, морин, 3-гидроксифлавон, 3,6-дигидроксифлавон, 3,7-дигидроксифлавон), флаваноны (6-гидроксифлаванон, нарингенин, т> нарингин) и катехин в концентрации свыше 0,1 мМ оказывают бактериостатическое действие.

2. Флавоноиды являются мутагенами прямого действия и индуцируют в клетках бактерий преимущественно мутации типа сдвига рамки считывания.

3. Флавоноиды оказывают антимутагенное и цитопротекторное действие в условиях мутагенеза, индуцированного 9-аминоакридином и бихроматом калия.

4. Генетические эффекты флавоноидов изменяются в присутствии ионов двухвалентных металлов и трехвалентного железа.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертационной работы доложены на Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-98», Москва; Областной научно-технической конференции молодых ученых "Химия и экология", Пермь, 1999; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-2001», Волгоград; IX и XI Межвузовских конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых "Экология: проблемы и перспективы", Пермь, 2001, 2003.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Список принятых сокращений

9-АА - 9-аминоакридин;

АФК активные формы кислорода; днДНК - двунитевая ДНК; он ДНК - однонитевая ДНК;

КОЕ колониеобразующие единицы;

МИК минимальная ингибирующая концентрация;

МННГ - N- метил -N - нитро -N- нитрозогуанидин;

МПА мясо-пептонный агар; сод - супероксиддисмутаза;

LB среда Луриа-Бертани

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Максимов, Александр Юрьевич

выводы

1. Флавоны (6-гидроксифлавон, 7-гидроксифлавон, хризин), флавон-3-олы (кверцетин, морин, 3-гидроксифлавон, 3,6-дигидроксифлавон, 3,7-дигидроксифлавон), флаваноны (6-гидроксифлаванон, нарингенин, нарингин) и катехин в концентрации свыше 0,1 мМ подавляют рост бактерий. Ингибирование роста бактерий обусловлено в большей степени цитостатическим, чем бактерицидным действием флавоноидов.

2. Установлено, что флавоноиды проявляют свойства мутагенов прямого действия. Концентрационная зависимость их мутагенного эффекта имеет нелинейный характер.

3. Показано, что флавоноиды индуцируют у бактерий преимущественно мутации типа сдвига рамки считывания. Генетическая активность структурно различных флавоноидов проявляется в разной степени.

4. Установлено, что флавоноиды в концентрации до 0,5 мМ обладают антимутагенным и цитопротекторным действием при воздействии интеркалирующего мутагена 9-аминоакридина и окислителя бихромата.

5. Обнаружено, что флавоноиды за счет повышения выживаемости клеток увеличивают эффективность мутагенеза, индуцируемого нитрозогуанидином.

6. Генетические эффекты флавоноидов изменяются в присутствии ионов двухвалентных металлов и трехвалентного железа. Ионы двухвалентных металлов, за исключением магния, усиливают антимутагенное действие флавоноидов в отношении 9-аминоакридина. Металлы с переменной валентностью увеличивают частоту мутаций, индуцируемых флавоноидом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Максимов, Александр Юрьевич, Пермь

1. АбилевС.К. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений. / С.К. Абилев, Г.Г. Порошенко // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Токсикология.- 1986.-Т. 14.- 171 с.

2. Акиньшина Л.П. Генотоксичность фармакопейных производных 5- нитрофурана в бактериальных тест- системах / Л.П. Акиньшина, Т.Б. Танирбергенов, Е.В Бобринев., Г.Н. Золотарева // Генетика. 1992. -Т. 28,№2.-С. 89- 98.

3. Алекперов У.К. Антимутагенез. Теоретические и практические аспекты. -М.: Наука, 1984.- 104 с.

4. Альберт А. Избирательная токсичность. М.: Медицина, 1989. -Т. 1.- 400 с.

5. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Наука, 1975. - 464 с.

6. Афанасьев И.Б Свободнорадикальные ингибиторы и промоторы в биологических процессах // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига: РМИ. - 1988. - С. 9-25.

7. Бигалиев А.Б. Генетические эффекты ионов металлов. -Алма-Ата: Наука, 1986.- 134 с.

8. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов / Под ред. Ю.А. Ершова. М.: Высш. шк., 2000. - 560 с.

9. Благой Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (Ионами металлов, красителями, лекарствами) // Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 10 - С. 18-24.

10. Ботанико фармакогностический словарь / Под ред. К.Ф. Блиновой и Т.П. Яковлева. - М.: Высш. шк, 1990. - 272 с.

11. Бриан Л.Е. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам. М.: Медицина, 1984.- 272с.

12. Бродский А.В. Изучение механизма антиоксидантного действия рутина / А.В. Бродский, А.И. Дорожко, И.Б. Афанасьев // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига: РМИ, 1988. - С. 25-28.

13. Васильева С.В. Репарационный эффект генетически активного природного соединения парааминобензойной кислоты в опыте с N-нитрозометилмочевиной / С.В. Васильева, JI.C. Давниченко, Е.В. Луцкова // Докл. АН СССР. 1979. - Т. 247, № 1. - С. 226-230.

14. Васильева С.В. Усиление пара-аминобензойной кислотой процессов репарации ДНК в Escherichia coli К-12 / С.В.Васильева, Л.С. Давниченко, И.А. Рапопорт // Генетика. 1982. - Т. 18. - С. 381 -391.

15. Винклер Г.Н. Генетическая активность катехинов, выделенных из чайного растения / Г.Н. Винклер, М.Н. Запрометов, В.К. Щербаков // Докл. АН СССР. 1967. - Т. 177, № з. с. 699-708.

16. Гауптман 3. Органическая химия/3. Гауптман, Ю. Грефе, X. Ремане. -М.: Химия, 1979. -832 с.

17. Георгиевский В.П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В.П. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, С.Е. Дмитрук. -М.: Наука, 1990.-336 с.

18. Гончарова Р.И. Антимутагенез.- Минск: Наука и техника, 1974. 144 с.

19. Громов Б.В. Экология бактерий / Б.В. Громов, Г.В. Павленко Л: ЛГУ, 1989.-248 с.

20. Дурнев А. Д. Мутагены и антимутагены в продуктах питания// Генетика. 1997. - Т. 33, № 2. - С. 165-176.

21. Дурнев А.Д. Мутагены. Скрининг и фармакологическая профилактика воздействий / А.Д. Дурнев, С.Б. Серединин. М.: Медицина, 1998.- 328 с.

22. Жестяников В.Д. Генетика репарационных процессов у микроорганизмов / Генетика микроорганизмов // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Микробиология. 1985. - Т. 15. - С. 5-149.

23. Жизнь микробов в экстремальных условиях / Под ред. Д. Кашнера.- М.: Мир, 1981.-520 с.

24. ЗасухинаГ.Д. Рекомбинантный интерферон эффективно защищает клетки от действия мутагенов / Г.Д. Засухина, И.М. Васильева, И.В. Колонина // Докл. АН СССР. 1987. - № 2. - С. 485-487.

25. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот.- М.:Мир, 1987.-584 с.

26. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. М.: Высш. шк., 1989.-591 с.

27. КалоусВ. Биофизическая химия / В. Калоус, 3. Павличек. -М.:Мир, 1985.-446 с.

28. Кафиани К.А. ДНК топоизомеразы и механизм действия антинеопластических соединений / К.А. Кафиани., И.Б. Бронштейн // Усп. биол. хим. - М.: Наука, 1988. - Т. 29. - С. 84-112.

29. Колчин Ю.Н. Влияние блокатора 5-липоксигеназы кверцетина на функциональные и морфологические проявления поражения миокарда при ишемии и реперфузии сердца / Ю.Н. Колчин, Л.Ф. Попович, А.Н. Грабовский // Кардиология. 1990. - Т. 30, № 3. - С. 72-75.

30. Костюк В.А. Антиоксидантная активность флавоноидов в различных системах перекисного окисления липидов / В.А. Костюк, А.И.Потапович, С.М.Терещенко, И.Б. Афанасьев // Биохимия. 1988. -Т. 53, №8.-С. 1365-1370.

31. Кретович В.Л. Биохимия растений. М.: Высш. шк., 1980. - 445 с.33