Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состав и накопление флавоноидов и танидов у женских и мужских клонов видов рода Salix L.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Оразов, Олег Энверович, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ

X / Л О / . г , На правах рукописи

i* i ! w ^ • / / О ч — / /

К/ il s. ' ^ / < V

/ /

ОРАЗОВ ОЛЕГ ЭНВЕРОВИЧ

УДК 581.143:581.176

СОСТАВ И НАКОПЛЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ И ТАНИДОВ У ЖЕНСКИХ И МУЖСКИХ КЛОНОВ ВИДОВ Р. SALIX L.

03.00.12 - Физиология растений

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к. х. н., ст. н. с.

B.C. Никитина Научный консультант: д. б. н.

А.Ю. Кулагин

Уфа - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ ................................................3

Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ В ОБЛАСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ СОСТАВА, СВОЙСТВ И ПРОЦЕССОВ НАКОПЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В СОСУДИСТЫХ РАСТЕНИЯХ

1.1. Характеристика флавоноидов и танидов как полифено-льных веществ вторичного синтеза сосудистых растений

1.1.1. Флавоноиды...............................7

1.1.2. Таниды...................................12

1.2. О функциональной роли полифенольных соединений .. 15

1.3. Генетическая теория определения пола растений.....24

1.4. Биохимические и физиологические различия особей разного пола....................................25

1.5. Влияние факторов внешней среды на сексуализацию растений........................................26

1.6. Влияние факторов окружающей среды и физиологического состояния растений на накопление флавоноидов

и танидов.......................................31

1.7. Газоустойчивость и физиолого-биохимический статус растений........................................41

1.8. Основные достижения исследований флавоноидов и танидов у представителей р. Salix L..................45

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты изучения.................................57

2.2. Основные этапы исследования.....................58

2.3. Схема изучения структурно-группового состава флавоноидов в листьях растений р. Salix L................60

2.4. Методы выделения и исследования флавоноидов и танидов

2.4.1 .Экстракция и очистка растительных флавоноидов, получение концентратов танидов........61

2.4.2. Методики количественного определения содержания флавоноидов и содержания танидов.......64

2.4.3. Методика определения экстрактивных полифенолов .......................................66

2.4.4. Методы идентификации выделенных флавоно-идных компонентов...........................67

Глава Э. ИЗМЕНЧИВОСТЬ СОДЕРЖАНИЯ ФЛАВОНОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ТАНИДОВ У ИЗУЧАЕМЫХ ВИДОВ р. SALIX L. И ЕЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.....70

3.1. Исследование содержания полифенолов в изучаемых видах р. Salix L...................................71

3.2. Динамика содержания флавоноидов и танидов в разные периоды вегетации...........................73

3.3. Половой диморфизм растений и изменчивость содержания флавоноидов и танидов у некоторых видов

р. Salix L..........................................79

3.4. Сравнительное изучение состава флавоноидов в листьях представителей р. Salix L........................89

3.5. О взаимосвязи фитохимических характеристик видов р. Salix L. с эколого-физиологической устойчивостью

к газообразным поллютантам.......................98

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................104

ВЫВОДЫ.......... ...................................111

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ....................................113

ВВЕДЕНИЕ

Среди проблем, связанных с физиологическим состоянием растений, проблема проявления полового различия особей является не только достаточно интересной, но она имеет важное теоретическое и практическое значение.

Исследования многих авторов посвящены разным аспектам проблемы пола растений и его проявления. Фундаментальные работы в области генетических основ определения пола показывают всю сложность генетической природы дифференциации пола у растений. Развитые в этом направлении представления свидетельствуют о том, что определение пола основано на изменениях в генетическом аппарате, а проявление пола, обусловливается не только генотипом, но и регуляторными процессами, связанными с действием условий внешней среды и внутренними изменениями метаболического характера.

На наш взгляд, обойден вниманием вопрос взаимосвязи полового диморфизма особей с биосинтезом в их органах вторичных метаболитов, в частности флавоноидов и танидов. Несмотря на то, что вопрос о функциях феноль-ных соединений в образующих их интактных растениях до настоящего времени остается еще мало изученным, имеющийся экспериментальный материал и разнообразие строения фенольных соединений, их повсеместное присутствие в растениях предопределяет многообразие их функций. Среди выполняемых в растениях фенольными соединениями функций отмечены, например, такие как защита фотосинтезирующего и генетического аппарата против вредного действия УФ- излучения, как индуктора (сигнальные вещества) во взаимосвязи с патогенами, участие в половом процессе (индукция прорастания пыльцевых трубок) и др..

Эти, а возможно, и другие функции фенольных соединений интересны в свете предложенной М.Х. Чайлахяном и В.Н. Хряниным (1982) эколого-гормонально-генетической концепции проявления пола в онтогенезе растений.

Половому диморфизму у разных групп растений посвящено большое количество работ, в которых рассмотрены морфологические, биохимические и физиологические особенности различий между мужскими и женскими растениями. Однако представители широко распространенного многовидового р. Salix L. не нашли достаточного отражения в вопросе изучения физиолого-биохимических свойств мужских и женских организмов.

Известно, что среди древесных растений представители семейства ивовых проявляют отличия у мужских и женских особей в режиме транскрипции и в проявлении устойчивости к газообразным поллютантам.

Наряду с разнообразным прикладным значением видов р. Salix L. в качестве технических культур привлекает внимание химический состав их надземных органов. Изучение химического состава листовой массы ивовых на присутствие биологически активных флавоноидов интересно и значимо в связи с возможностью комплексного использования ивового сырья при промышленном освоении их насаждений.

Целью данной работы являлось сравнительное изучение особенностей изменчивости в структурном составе флавоноидов и уровней накопления флавоноидов и танидов в ходе вегетации растений мужских и женских клонов некоторых видов р. Salix L. в связи со специализированными физиологическими функциями этих вторичных метаболитов. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Сравнительное фитохимическое исследование произрастающих в близких условиях представителей рода ива и определение перспективных по ресурсной характеристике видов для изучения структурного состава флавоноидных соединений

2. Изучение изменчивости количественного содержания флавоноидов в листьях и танидов в коре ветвей у особей разного пола в период вегетации разных видов ивы.

3. Определение структурного состава флавоноидов, накапливающихся в

листьях особей разного пола видов ивы в один срок вегетации.

4. Выявление особенностей биохимических признаков в количественном и качественном составе флавоноидов и соотнесение их с известными из литературы данными об отличиях в устойчивости разных видов к воздействию газообразных поллютантов.

Исследование выполнено в соответствии с планом научно-исследовательских работ по темам: "Изучение антропогенного влияния на популяции лекарственных, кормовых и медоносных растений Башкортостана" (Гос. per. № 01.9.30009997) и "Эколого-биологические особенности лееообразующих видов в связи с охраной и оптимизацией окружающей среды" (Гос. per. № 01.9.30009999) и в соответствии с программой "Оптимизация использования потенциала биологических систем республики Башкортостан" Отделения биологических наук АН РБ.

Научная новизна. Впервые в климатогеографических условиях Пре-дуралья проведены исследования изменчивости состава и содержания флавоноидов интродуцированных видов р. Salix L.; получены сравнительные данные о биопродукционных процессах накопления флавоноидных соединений и танидов у растений разных жизненных форм. Изучено в сравнительном плане содержание флавоноидов и танидов у разнополых клонов одного вида. Выявлены новые перспективные источники флавоноидов.

Практическое значение. Результаты работы могут быть использованы исследователями в области экологической физиологии древесных растений при изучении сравнительной газоустойчивости видов на основе фитохимиче-ских показателей, при сравнительном изучении физиологических свойств разнополых растений двудомных видов, для системного поиска флавоноидонос-ных и высокотанидных видов и форм растений ивы и определения сроков отбора сырья с них, для уточнения систематики многовидовых родов по данным сравнительных фотохимических исследований. Листовые массы ивы трехты-

чинковой Salix triandra L. и ивы остролистной Salix acutifolia Willd. могут быть рекомендованы для выделения флавоноидных биопрепаратов. Предложены модификации некоторых методов анализа флавоноидов растительного происхождения. Предложен способ отбора посадочного материала видов ивы, устойчивых к газообразным загрязнителям.

Автор искренне благодарен за теоретическую и практическую помощь, поддержку на всех этапах работы научному руководителю работы, к.х.н. B.C. Никитиной, а также Г.В. Шендель за помощь в оформлении рукописи. За предоставление интересных объектов изучения - образцов растений коллекционных видов ивы и данных по газоустойчивости выражаю особую признательность д.б.н. А.Ю. Кулагину и сотрудникам лаборатории лесоведения Института биологии УНЦ РАН.

Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ В ОБЛАСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ СОСТАВА И СВОЙСТВ, ПРОЦЕССОВ НАКОПЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В СОСУДИСТЫХ РАСТЕНИЯХ

1.1. Характеристика флавоноидов и танидов как полифеноль-ных веществ вторичного синтеза сосудистых растений.

Флавоноиды.

Флавоноиды относятся к обширной группе растительных фенольных веществ вторичного синтеза (НагЬогпе, 1964). Все природные флавоноиды являются О- гетероциклами, структурную основу которых составляет трицикличе-ская молекула флавона (2- фенилхромона или 2- фенилбензо-у-пирона) либо флавана (2- фенилбензопирана). Основная флавоноидная структура, следовательно, состоит из двух бензольных колец, обозначаемых А и В, соединенных Сз-фрагментом, образующим вместе с кислородным атомом у- пироновое кольцо (Бритиш, 1986).

Ввиду того, что молекулярную группировку атомов углеродного скелета можно представить как структуру типа Сб - Сз - Сб, то по одной из классификаций флавоноиды относят к веществам дифенилпропанового ряда, подчеркивая их особенность и отличие от других фенольных растительных метаболитов (Барабой, 1976; Георгиевский и др., 1990; Кузнецова, 1991). По структуре про-панового фрагмента (-Сз-) флавоноиды разделяются на 14 классов (Табл. 1. приложения). Связующий Сз у различных классов флавоноидов имеет различную степень окисления. Самый "окисленный" класс - флавонолы и ближайшие к ним флавоны - наиболее обширные и распространенные из флавоноидов (\Уо11еп\¥еЬег, 1982; Киселева и др., 1991) . Во многих растениях также обнаружены представители класса антоцианидины - антоцианы, которые привлекают внимание как важнейшие красящие вещества в растениях (НагЬогпе,

1967; Swain, 1976; Timberlake, 1980).

Меньшее распространение имеют проантоцианидины, флаван-3-олы, флаван-3,4-диолы и относительно недавно открытые бифлавоноиды и изофла-воноиды. Пять классов - халконы, ауроны, дигидрохалконы, флавонолы, ди-гидрофлавонолы относятся к минорным, реже встречающимся, соединениям (Böhm, 1982).

Внутри каждого класса флавоноидные соединения характеризуются числом и положением заместителей в ароматических кольцах. Обычно такие заместители являются ОН- группами, которых бывает от 1 до 6, вследствие чего многие мономерные флавоноиды относятся к полиоксифенолам (Блажей, Шу-тый, 1977) . Встречаются среди флавоноидов также предшественники полимерных соединений - полифенолов, большинство из которых относится к классу катехины (Запрометов, 1974; 1993 a; Ribereau-Gayon, 1972). Катехины в виде эфиров галловой кислоты являются мономерами дубильных веществ.

Из содержащихся в растениях флавоноидных соединений во многих гид-роксигруппы нередко бывают метилированы либо гликозилированы, что определяет огромное разнообразие природных форм флавоноидов. По последним данным, обнаружены и доказаны структуры около 5000 таких соединений (Запрометов, 1993). Однако при всем многообразии флавоноидных структур, характер и локализация заместителей в ароматических кольцах подчиняется некоторым закономерностям, которые указывают на общность биосинтетического пути (Запрометов, 1972; Harborne, 1972; Маргна, 1990).

Чаще всего метоксилированными в растениях бывают флавоны, флавонолы и антоцианы, значительно реже - представители других классов флавоноидов (Ebel, 1970; Бандюкова, Аванесов, 1970). При этом С- метилированные флавоны и флавонолы встречаются реже, чем О- метилированные. Для большинства классов флавоноидов характерно гликозилирование, так как при этом флавоноиды становятся гидрофильными и легче растворяются в клеточном соке растений (Harborne, 1967; Минаева, 1978). Разнообразие флавоноидных гли-

козидов определяется особенностями сахаристой части их молекулы; видом, конформацией, количеством Сахаров и местом их присоединения (Geissman, 1962; Харборн, 1968; Mabry et al., 1970; Запесочная, 1983). В состав сахаристой части флавоноидов могут входить моно-, ди- и олигосахариды. Чаще в составе их молекул встречаются такие моносахара, как: D-глюкоза, D-галактоза, L-рамноза, D-манноза, D-ксилоза, L-арабиноза, иногда - D-глюкуроновая кислота, фруктоза и некоторые другие (Harborne et al., 1975; Imperato, 1976; Swain, 1976).

Ко второй группе флавоноидных гликозидов относятся С- гликозиды (гликофлавоноиды), которые можно разделить на С- моногликозиды, С- диг-ликозиды, С- О- дигликозиды, С- О- биозиды (Муравьева, 1978; Клышев и др., 1978). В гликофлавоноидах углеводные заместители связаны с агликоном через атомы углерода в 6- и 8- положениях.

Более сложные формы соединений на основе флавоноидов могут быть образованы присоединением изопреноидных остатков, которые обнаружены у различных участков молекулы. Пренилированные флавоноиды в настоящее время интенсивно изучаются зарубежными исследователями в связи с перспективой создания лекарственных форм (Chen et al., 1993; Ferrary, Messara, 1995; Tahara, Ibrahim, 1995). Когда заместители образуют циклические структуры, в некоторых растениях продуцируются недавно обнаруженные соединения - изофлавоноиды (Dewick, 1982; Kinoshita et al., 1996). Они образуют сложные фурано- и пирановые производные исходных флавоноидных структур, содержащие до шести гетероциклов.

Флавоноиды также могут присоединяться друг к другу через различные гидроксильные группы, образуя димерные бифлавоноидные структуры (Ferreira et al., 1995; Masaoud et al., 1995; Baba et al., 1995); некоторые группы, такие как лейкоцианидины и катехины, могут вступать в реакции полимеризации, при этом образуется соединения дубильной природы - конденсированные дубители (Запрометов, 1973; 1993 а).

В последние годы обнаружены интересные циклические олигофлавоно-идные образования с новыми свойствами (Geiger et al., 1995), аналоги которых получают полимеризацией под воздействием метаболитов бактериальных штаммов (Pourrat, Azizi, 1990).

В растениях флавоноидные соединения накапливаются в различных органах, чаще в виде гликозидов, что придает им, помимо лучшей растворимости в клеточном соке, устойчивость к воздействию ультрафиолетового излучения (Harborne et al., 1975). Флавоноиды имеют как ряд общих физико-химических свойств, так и индивидуально-групповые различия, которые принимаются во внимание при исследовании этих разнообразных полиоксифенольных растительных метаболитов.

Пироновый цикл обусловливает типично флавоновые реакции основного кольца и может подвергаться восстановлению или окислению, при этом возможны ограниченные превращения флавоноидов одного класса во флавоноиды другого (Блажей, Шутый, 1977). Благодаря таким реакциям в растениях часто присутствуют одновременно представители различных классов. К важным химическим свойствам флавоноидов относится их способность ингибиро-вать процессы окисления и улавливать свободные радикалы, образующиеся при воздействии солнечной радиации и различных поллютантов (Ascer et al., 1995; Solah et al., 1995), низкая токсичность для содержащих эти соединения клеток растительных организмов (Кузнецова, 1987).

Флавоноиды, как большинство фенольных соединений, синтезируются в растениях по двум общим механизмам: шикиматному и ацетатно-малонатному (поликетидному) путям (Запрометов, 1973; Swain, 1976). Шикиматный путь объединяет в себе биосинтез ароматических аминокислот, включая L- фенила-ланин, и начальные этапы биосинтеза фенольных соединений (Запрометов, 1993 a; Haslam, 1979). Многие этапы шикиматного пути и участвующие в них растительные ферменты подробно изучены при помощи радиоактивно меченых соединений (Harborne et al, 1975; Ebel, Hahlbrock, 1982). Производные фе-

нилаланина участвуют в образовании кольца В флавоноидов. Кольцо А образуется из ацетата по ацетатно-малонатному пути. Из L-фенилаланина дезами-нированием образует