Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и функции сигнальных молекул в симбиозе между афганскими линиями гороха и RHIZOBIUM LEGUMIN0SARUM BV. VICEAE.

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структура и функции сигнальных молекул в симбиозе между афганскими линиями гороха и RHIZOBIUM LEGUMIN0SARUM BV. VICEAE."

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ "" РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИЯ

На правах рукописи УДК: 576.851.155:63:576.8

ОВЦЫНА Александра Олеговна

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ

В СИМБИОЗЕ МЕЖДУ АФГАНСКИМИ ЛИНИЯМИ ГОРОХА И ННПОВЮМ ЬЕСтиММОЗАЯиМ ВУ. У1СЕАЕ.

Специальность: 03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1997

Диссертационная работа выполнена в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно - исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт- Петербург).

Научный руководитель - доктор биологических наук, академик Россельхозакадемии И. А. Тихонович

Официальные оппоненты - д<эктор биологических наук, профессор К. В. Квитко, кандидат ^олоппеишкнаук В, И. Торгов

Ведущее учреждение - кафедра генетики и селекции Санкт -Петербургского Государственного Университета

Защита состоится " ^ " июня 1997 г. в {С-^Ячъс. на заседании Диссертационного совета К 020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно - исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620 Санкт -Петербург, Пушкин - 8, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " " 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

А. Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Симбиоз между _бобовыми растениями и-клубеньковыми

бактериями приводит к связыванию атмосферного азота и к переводу его в доступную для растения восстановленную форму. Биолошчсская фиксации азота является экологически чистой и экономичной альтернативой применению минеральных удобрений. Бобово -ризобиальный симбиоз можно представить как молекулярный диалог между партнерами, в котором появление очередной сигнальной молекулы зависит от понимания предыдущей. В этом диалоге к настоящему времени наиболее полно охарактеризованы два этапа; выделение растением сигналов флавоноидной природы, регулирующих экспрессию бактериальных nod генов, и синтез бактериями продуктов nod генов - Nod факторов -олигомеров хитина, стимулирующих деления клеток коры корня растения, приводящие к образованию клубеньков (Long, 1989).

Химическая структура сигнальных молекул, выделяемых партнерами, определяет специфичность симбиоза (Zaat et al., 1987; Truchet et al., 1991; Spaink et al„ 1991). В лаборатории биотехнологии ВНИИСХМБ изучается высокоспецифичная симбиотическая система - линии гороха афганского происхождения, несущие в гомозиготе ген sym2 и незаражаемые обычными европейскими штаммами ризобий, и штамм А1, способный образовывать хлубеньки на этих линиях. Биохимические основы этого взаимодействия не изучались, и причины расширенной хозяйской специфичности у штамма А1 не были известны.

В связи с эшм нами было предпринято изучение активности, состава и структуры сшнальных молекул, синтезируемых на начальных стадиях симбиоза растениями гороха и бактериями и выявление генетических детерминант, требующихся штамму для заражения афганского гороха. Данная работа выполнялась при финансировании программой "Интербиоазот - 2000" и грантами РФФИ, TSF, INTAS, NWO (Нидерланды) и LNV (стипендия от Министерства сельского хозяйства Нидерландов). Часть работ выполнялась в лаборатории академика РАСХН, профессора Б. Люхтенберга, Лейденский Университет.

генетических механизмов избирательного заражения через определение особенностей продукции сигнальных молекул на ранних стадиях симбиоза между штаммом А1 Ш111оЬшт 1е,§итто5агит Ьу. хчееие и линиями гороха афганского происхождения. Коикрентныс задачи исследования состояли в следующем:

I. Целью настоящей работы явштось исследование молекулярно -

- провести сравнительный анализ количественного и качественного состава флавоноидов в корневых эксудатах афганских и европейских линий гороха;

- изучить специфичность состава Nod метаболитов, продуцируемых штаммом А1;

- определить генетические факторы, необходимые для синтеза специфических молекул, участвующих в данном симбиотическом взаимодействии;

- протестировать биологическую активность Nod метаболитов, выделямых штаммом А1 и эталонным штаммом CIAM1026, in planta и in vitro-,

- на основании полученных данных выявить факторы, придающие штамму А1 способность к заражению линий гороха афганского происхождения;

- разработать способ направленного конструирования штаммов с заданным составом сигнальных молекул.

ранних стадиях симбиоза между штаммом A1 R.leguminosarum и афганскими линиями гороха. Методами TLC и HPLC проведено сравнение состава флавоноидсодержащих фракций корневых эксудатов гороха европейских и афганских линий и охарактеризован состав Nod метаболитов, синтезируемых штаммом А1.

Впервые показано, что к заражению афганских форм гороха способен штамм с высокой продукцией Nod факторов - А1.

Определена структура Nod факторов штамма А1. Штамм А1 является первым вьщелешшм из почв Северо - Запада штаммом R.leguminosarum bv. viceae, у которого в составе Nod факторов описаны дважды ацетилированные молекулы. Среди Nod факторов штамма А1 впервые обнаружены молекулы, несущие в качестве заместителей редкие жирные кислоты.

Впервые определена последовательность гена nodX из штамма А1, и показана его гомология гену nodX штамма ТОМ.

Впервые продемонстрировано, что фактором, достаточным для придания штамму R.leguminosarum bv. viceae способности к заражению афганского гороха, является наличие в С-б позиции редуцирующего конца Nod фактора не только ацетильной, но и фукозильной группировки.

Обнаружены различия в деформациях корневых волосков в комплементарных и некомплементарных симбиотических взаимодействиях.

На культурах тканей гороха показаны митогенный и некротизиругощий эффекты бактериальных метаболитов. Найдена корреляция между гормональным статусом растения и его чувствительностью к действию Nod факторов.

создавать высококомплементарные симбиотические пары, ще микросимбионт обладает признаками повышенной эффективности азотфиксации и конкурентоспособности, а макросимбионт устойчив к заражению аборигенными ризобиальными штаммами и способен отбирать из почвы внесенный штамм. Данная проблема - регулирование

¡. В работе проанализирован состав сигнальных молекул, участвующих в

Знание механизмов хозяйской специфичности позволяет

процессов узнавания растением почвенных ризобий - является ключевой для понимания вопросов конкурентоспособности. Именно для гороха, довольно слабо отзывчивой на инокуляцию культуры, - направленное _ регулирование процессов узнавания является наиболее актуальным. Результаты данной работа открывают возможность не только селекции природных штаммов, избирательно заражающих афганский горох, но и возможность генетического конструирования таких штаммов. Результаты данной работы используются при селекции юроха с повышенной избирательностью заражения в Институте зернобобовых культур (г.Орсл) в совместной работе с Т. С. Наумкиной.

Апробация„работы. Результаты работы докладывались на 1-й Европейской конференции но азотфиксацип (Cereл, Венфия. 1994), 9-м Баховском коллоквиуме по азотфиксацип (Москва, 1995), 1-м съезде ВОГИС (Саратов, 1994), X Международном кошрессе но азотфиксацип (Csiikt - Петербург, 1995), 2-й Европейской конференции по азотфиксации (Познань, Польша, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания

материалов и методов исследования, полученных результатов и их" обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 184 стр. машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 39 рисунками. Список литературы включает 279 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы

Растительный материал. В работе использовали растения гороха европейского происхождения - линии 32/1, 3/3 (ВНИИСХМБ). сорт К-6132 (ВИР) и линии афганского происхождения, незаражаемые европейскими штаммами ризобий - 2150 (от С.Бликста, Nordic Gene Bank, Landskrona, Sweden), 31/6;(ВНИИСХМБ), сорта К-1887, K-6556 (ВИР) и sym2 - интродупированную линию 37(1)2 (ВНИИСХМБ). Индуцирующую активность эксудатов оценивали также у линий ¡ороха Спринт-2 и SG-2 и у Nod' мутантом, подученных на их основе (Борисов с соавт., ВНИИСХМБ).

Семена сиратро (Macroptilium artropurpureum Urb.) были любезно предоставлены Др. А. А. Н. Ван Брюсселем (Лейденский Университет). .

Изучение деформаций корневых волосков и анализ чувствительности тканей растений к экзогенным фитогормонам в условиях in vitro проводили на растениях гороха описанных выше линий и на растениях вики (Vicia sativa, V.pannonica, V.villosa, ВИР).

Бактериальные штаммы. Анализ продукции Nod метаболитов проводили у штаммов R.leguminosarum bv. viceae, заражающих (AI, ТОМ) и незаражающих (CIAM1026, 248) афганские линии гороха. Штамм AI был выделен из почв Ленинградской области (Четкова, Тихонович, 1986). Штамм ТОМ происходит из Турции (Lie, 1978). Штамм CIAM1026 - эталонный производственный штамм из коллекции ВНИИСХМБ, штамм 248 - эффективный штамм R.leg. bv. viceae дикого типа (Josey et at., 1979).

Дня измерения индуцирующей nod гены активности корневых эксудатов использовали штамм RBL5560 (Zaat et al., 1987): бесплазмидный штамм R.leg. bv. trifolii RCR5 с введеными в него Sym плазмидой pRLIJI из R.leg. bv. viceae и векторной плазмидой рМР154, на которой индуцируемый флавоноидами промотор генов nodABClJ слит со структурным геном ß- галактозидазы lacZ из E.coli.

В экспериментах по переносу nod генов в Rhizobium leguminosarum использовали экспрессируемые в ризобиях плазмнды с nod генами, любезно предоставленные нам Др. Г.П. Спайнком (Университет г. Лейдена, Нидерланды) и Др. Р. Хейдстра (Университет г. Вагенингена, Нидерланды).

Методы исслелоранщ. Корневые эксудаты получали путем культивирования стерильных проростков гороха в воде в течение трех дней. Собранные эксудаты очищали и проверяли на стерильность высевом на твердую среду YMB (Hooykaas et al., 1979).

Суммарную биологическую активность корневых эксудатов гороха оценивали по активности ß-галактозидазы в клетках бактерий штамма RBL5560 с репортерным слиянием nodA-lacZ, выращенных при добавлении анализируемых эксудатов. Культуру штамма RBL5560 выращивали в индукционной среде - модифицированной среде 79а (Allen, 1959) с триптоиом (2.5 г/л) и машштолом (2.5 г/л) при 28° С, 180 об/мин до плотности Аббо = 0.3 - 0.4. К 10 мкл культуры добавляли икдуктор (эксудат или коммерческий препарат) и среду до конечного объема пробы 1 мл. Далее пробы инкубировали на качалке в том же режиме до Аббо = 0.3 - 0.4, после чего определяли активность ß-галактозидазы (Miller, 1972).

Корневые эксудаты гороха экстрагировали метанолом, концентрировали и перерастворяли в 100 - 200 мкл 50% водного раствора метанола. Жидкостную хроматографию высокого разрешения (HPLC) флавоноидной фракции проводили на С18 колонке с обращенной фазой (Lichrosorb, 5 мкм, 4x250 мм) в градиентной системе с линейным возрастанием концентрации метанола от 26.5% до 70% при скорости потока 0.8 мл/мин. Поглощение регистрировали при 260 - 290 нм.

Дтя получения бактериальных Nod метаболитов бактерии культивировали в среде В" (Spaink et al„ 1992) с добавлением нарингенина или корневых эксудатов гороха. После 2-3 суток выращивания при 28°С на качалке культургльную жидкость очищали от

бактерий. Бактериальные фильтраты, проверенные на стерильность высевом на среду YMB, тестировали на биологаческую активность.

______Ция очистки Nod факторов методом HPLC бактериальные кул муры, росшие 18-20

ч, экстрагировали 40% n-бутанолом. Бутанольиую фракцию выпаривали под вакуумом, осадок растворяли в 60% ацетонигриле и очищали на С18 колонке (J.T.Baker). Элюат окончательно разделяли методом HPLC на С18 колонке (Pharmacia LKB, 5 мкм, 4x250 мм), с использованием ступенчатого градиента ацетонитрила от 30% до 100% при скорости но i ока 0.7 мл/мин. Адсорбцию регистрировали при 260 и 304 нм. Фракции, содержащие Nod метаболиты, собирали на коллекторе и анализировали методом масс -спектрометрии (Университет г. Утрехта, Нидерланды). В экспериментах по анализу Nod факторов меюдом TLC бактерии инкубировали с меченым С14 предшественником Nod факторов - глюкозамином (0.2 мкКи/мл). Nod метаболиты экстрагаровали п-бутанолом, концентрировали и разделяли на С18 (Sigma) пластинках. Пластинки экспонировали с помощью фосфорного экрана (Phosphor Imager Screen, Molecular Dynamics).

Манипуляции с рекомбинантной ДНК производились в соответствии с протоколами, приведенными Маниатис с соавт. (Maniatis et al., 1982).

Ген nodX из штамма Al R.leg. bv. viceae был клонирован методов ПЦР ¿ помощью специфических праймеров (оМР196 - оМР198), созданных на основании последовательности гена nodX из штамма ТОМ (Davis et al., 1988). Амплифшшрованный фрашент был клонирован в pGEM Т-вектор (Promega) и секвенирован по методу Сэнджера (Sanger et al.. 1У77).

Для экспрессии клонированного nodX raía штамма Al в Rhizobium ой был иереклонирован под последовательность Шайи - Далгарно л вектор PET3d -экспрессируемый в E.cvli вектор с Т7 промотором. Затем ich nodX вместе с последовательностью Шаин - Далгарно был клонирован под индуцируемый nodABCIJ промотор в экспрессируюшийся в Rhizobium leguminosarum вектор рМР3510. От скрещивания полученного штамма 3510-Х и штамма R.leguminosarum дикого nina 248 были отобраны трансконъюганты, несущие ген nudX, коюрые использовались в экспериментах по инокуляции sym2 - гороха.

Мобилизацию плазмид с nod генами из E.coli в R.leguminosarum проводили с использованием и качестве хелпериой плазмиды pRK2013 (Ditta et al., 1980). Транскопьюгантов отбирали на минимальной среде В" с 2 мг/л Те для incP плазмид и с 100 мг/л спсктиномицина для incW плазмид. Отселекгировапные штаммы проверяли на наличие nod iciwii методом ПЦР со специфическими праймерами к этим генам и тонкослойной хроматографией Nod факторов, а затем анализировали их способность к (образованию клубеньков на sym2 - горохе.

Стерильные проростки гороха в возрасте Зх дней высаживались по 6-7 штук в стеклянные 3 или 5 литровые стаканы с красным гравием. После инокуляции

5

соответствующими штаммами ризобий растения выращивались в теплице в стерильных условиях при 21° С. Подсчет числа клубеньков и измерение нитрогеиазной активиости проводили через 3 недали после инокуляции.

Биологическую активность бактериальных фильтратов оценивали по реакции на них корней вики и эксплантов гороха в условиях in vitro. На корнях растений в световой микроскоп наблюдали эффекты Tsr (Thick short root, "толстый короткий корень"), Hai (root Hair induction, "индукция корневых волосков") и Had/Hab (root Hair deformation / buldjing, "деформации / вздутия корневых волосков"). В условиях in vitro учитывали степень некротизации эксплантов, % каллусообразования, деформации волосков, морфогенетический и митогенный эффекты фильтратов. Устойчивость эксплантов растений к экзогенным фитогормонам оценивали по реакции тканей на ауксины - 2,4-Д (дихлорфеноксиуксусную кислоту) и НУК (нафтклухсусную кислоту) и цитокинины -кинетин и БАП (бензиламинопурин), сочетаемых в средах в различных концентрациях. Статистическую обработку результатов проводили по критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

1. Анализ индуцирующей активности и состава флавоноидов в корневых эксудатах гороха.

Активность флавоноидов оценивали на разных генотипах гороха с целью выявления их специфики у афганских линий по сравнению с европейскими.

Различия в средних величинах активности ß- галактозидазы, индуцированной эксудатами гороха линий 32 (евр.) и 2150 (афг.), оказались несущественными. При этом отмечалось высокое внутрилинейное варьирование данного показателя. Таким образом, неспособность к клубенькообразованию у афганского гороха при инокуляции обычными штаммами не является следствием изменения активности флавоноидов в корневых эксудатах. Данное наблюдение подтверждается также анализом индуцирующей активности эксудатов у Nod" мутантов гороха. Сравнение активности ß-галактозидазы, индуцированной мутантными растениями линий Спринт-2 и SG-2, неспособными к клубенькообразованию, и немутантными растениями исходных линий, показало, что среди растений исходных линий встречаются такие, у которых количество индукторов в эксудате снижено по сравнению с мутантными. Следовательно, дефицит флавоиоидных индукторов в корневых эксудатах гороха не является причиной Nod' фенотипа у мутантов гороха и у афганских линий при взаимодействии с некомплементарными штаммами ризобий.

Качественный соства флавоноидов оценивали методом HPLC. Оказалось, что в профилях всех исследуемых линий имеются 3 сходных пика (рис.1). Величины пиков были сходными у обеих афганских линий и европейской линии 32, тогда как в линии 3/3 был максимально выражен пик, выходящий на 35 мин, а в линии 6132 - на 37 мин. Пик,

6

выходящий на 44 минуте, во всех вариантах являлся минорным. Компонентов, характерных только для афганских или только для европейских форм, не было выявлено. Линии гороха различались лишь по относительному количеству флавоноидных компонентов.

% от обшей площади пиков

о и .1 г д —ai - и яиь........ — I a wf i

L31/6 L21 SO L3/3 L6132 L32

лтия гороха

Рис.1. Соотношение флавоноидных компонентов в корневых эксудатах гороха различных линий.

Таким образом, специфичности в продукции фтавоноидов растениями гороха афганских и европейских линий обнаружить не удалось. Следующим этапом нашей работы явился анализ бактериальных сигналов, синтезируемых в ответ на индукцию флавоиондами - Nod факторов.

2. Анализ Nod метаболитов штамма A1 Rhizobium leguminosarum bv. viceae.

Данная работа проводилась в сотрудничестве с коллегами из университета г. Лейдена - Г. П. Спаннком, И. М. Лопес-Лара, Б. Люхтенбергом и университета г. Утрехта - Дж. Томас - Оатс и Э. Эссер (Нидерланды). Количество Nod факторов, продуцируемых штаммом, оценивали методом TLC с использованием меченого С14 глкжозамина, далее разделяли Nod факторы методом HPLC. Методом масс - спектрометрии устанавливали окончательную структуру молекул.

Оказалось, что штамм А1 продуцирует Nod метаболиты на высоком уровне, сравнимом со стандартным штаммом Rlv, и по количеству синтезируемых Nod факторов

7

намного превышает штамм ТОМ. При этом корневые эксудаты гороха позволяют индуцировать более высокую продукцию Nod факторов, чем нарингснин. Максимальный синтез Nod факторов вызывали эксудаты европейской линии 32 и афганской линии 6559. Среди афганских линий гороха были обнаружены генотипы как сильно, так и слабо индуцирующие nod гены бактерий. Таким образом, различия между линиями гороха по способности эсудатов индуцировать синтез Nod факторов не коррелировали с присутствием рецессивной аллели гена sym2.

Анализ качественного состава Nod метаболитов штамма А1, проведенный методом HPLC, показал, что профили Nod метаболитов, индуцированных корневыми эксудатами афганской и европейской линии и нарингснипом, практически не отличаются друг от друга. При мониторинге абсорбции в области 304 им выявляются две 1руппы пиков (рис.2). У штамма А1 по сравнению со стандартным штаммом R.leguminosarum bv. viceae обнаруживается, однако, дополнительный ник (рис.2).

абсорбция при 304 нм

стандарт

20

30

40 время выхода, мин

абсорбция

20

30

4Q время выхода, мин

Puc.2. HPLC профили Nod метаболитов штамма А! и стандартного штамма R.leguminosarum bv. viceae. Стрелкой показан дополнительный пик у.штамма AI.

8

В результате анализа структуры Nod факторов выяснилось, что в пробах содержатся всс описанные ранее для R.leguminosarum bv. viceae стандартные Nod факторы (рис.3). Среди них - цента- и тетрасахаридиые Nod факторы с высоконенасыщенной жирной кислотой (С18:4) п факторы с неспецифическими жирными кислотами (С18:1, С16:1 и С16;0). Однако, кроме стандартных молекул, пиамм AI сишезировал и необычные Nod факторы. Так, дополнительный пик. выявленный у AI, представлял собой нешасахаридный Nod фактор, несуший ацетнльную группу на редуцирующем конце, присоединение которой контролируется геном nodX, и было впервые описано на штамме ТОМ (Firmin et al.. (993). В виде минорных фракций в образцах присутствовали Nod

факторы с редкими жирными кислотами (С18:2 и С18:3) и Nod факторы с

/

гидроксилнрованной жирной кислотой <С18:1-ОН).

В составе фракций Nod метаболитов, индуцированных нарингенином и корневыми эксудатами, значительных качественных различий не было обнаружено, но выявлено, что нарингенин - индуцированные бактерии производят меньше три- и тетрасахаридных Nod факторов, чем культуры, индуцированные эксудатами. Мы полагаем, что эти количественные различия между вариантами связаны с кинетикой синтеза Nod факторов в культурах с разным уровнем экспрессии nod генов.

Таким образом, было показано, что штамм AI продуцирует широкий спектр Nod факторов, среди которых содержатся как стандартные для R.leguminosarum bv. viceae метаболиты, так и специфические молекулы. Состав Nod факторов, производимых 5актериями при использовании различных индукторов, практически не различается.

Для оценки функциональной роли дважды анешлировашшх Nod факторов в заражении аф1анского гороха и для сравнения структуры и функции (сна nodX из штамма AI с уже изученным геном nodX из штамма ТОМ (Davis et al., 1988; Pirmin et al., 1993), Зыла поставлена задача выделения гена nodX из штамма AI, определения его последовательности и переноса его в штамм, не заражающий афганский горох.

Анализ структуры гена nodX и его роли в заражении афганского гороха.

Ген nodX из штамма AI был клонирован из ПНР продукта и секвенирован. сравнение последовательности гена nodX с аналогичной последовательностью из штамма ГОМ показало, что эти гены различаются лишь г/о 3 основаниям и полностью идентичны ia аминохнелотном уровне. По-видимому, такая высокая консервативность белка NodX !влястся функционально необходимой для преодоления устойчивости к заражению (фганского гороха и поддерживается в популяциях достаточно сильным давлением естественного отбора.

Для того, чтобы выяснить, является ли наличие гена rtodX необходимым и юстаточным условием для заражения ризобиями афганского гороха, ген nodX был

9

переклонирован в экспрессируемый в ризобиях вектор рМР3510, пол nodABCIJ промотор. Полученная плазмида с рА-nodX была перенесена з штамм дикого типа R.leg. bv. viceae 248, неспособный к симбиозу с афганским горохом. У трансконъюгантов штамма 248, несущих ген nodX, методом TLC была обнаружена продукция дополнительного меченого компонента, соотвествующего дважды ацетилированному Nod фактору. Общая продукция Nod метаболитов у этих клонов сохранялась, как и у исходного штамма 248 и у штамма AI, на высоком уровне. Инокуляция афганского гороха штаммом 248-Х привела к образованию на растениях розовых эффективных клубеньков, в количестве 20-40 штук на растение.

Таким образом, нам удалось клонировать полностью функциональный ген nodX из штамма AI. Наличия этого гена оказалось достаточно для преодоления устойчивости афганского гороха к заражению штаммом 248. При этом, как и штамм AI, штамм 248-Х продуцировал Nod метаболиты на высоком уровне, и эго не явилось препятствием для заражения афганского гороха.

Далее перед нами возник следующий вопрос: является ли ацетильная группа на редуцирующем конце единственно возможной модификацией, позволяющей штамму вступать в симбиоз с афганским горохом, или наличие иного заместителя в этой позиции также может позволить штамму преодолеть sym2- детерминированную устойчивость?

Для проверки этого предположения на основе штамма 248 Rlv была создана серия изогенных штаммов, различающихся по наличию генов - модификаторов Nod фактора и регуляторного гена nodD-FITA (Flavonoid Independent Transcription Activation -независимая от флавоноидов' активация транскрипции) - гибридного nodD гена, который активирует транскрипцию без присутствия флавоноидов и может повышать уровень экспрессии nod генов (Spaink et al., 1989). В качестве генов, модифицирующих Nod фактор в позиции С-б редуцирующего конца, были взяты гены nodX и tiodZ, находящиеся на плазмидах incP и incW групп несовместимости под nodABCIJ промотором (табл.1). Ген nodZ кодирует фермент фукозилтрансферазу, осуществляющую перенос фукозы в С-б позицию Nod фактора, и является необходимым дня заражения сиратро (Macroptilium artropurpureum Urb.) штаммами Bradyrhizobium juponicum (Stacey et al., 1994) (рис.3).

Плазмиды с nod генами были мобилизованы из E.coli в Rhizobium по отдельности и в комбинациях (табл.1). Трансконъюганты были протестированы на продукцию модифицированных Nod факторов методом TLC и на наличие генов nodX и nodZ методом ПЦР. Полученными штаммами были проинокулированы афганские линии гороха и sym2 -интродуцированная линия 37(1)2.

Все nodX - содержащие штаммы образовали эффективные клубеньки на линиях 2150 и 6559 афганского гороха дикого типа и на линии 37(1)2. Неожиданно, эффективное клубенькобразование на афганском горохе наблюдалось и со штаммами, содержащими ген nodZ (табл.1), независимо от наличия гена nodD-FITA. В присутствии гена nodD-FITA

10

Табл.1. Клубеиькообразование и эффективность азотфиксации изогенных производных штамма 248 R.leguminosarum bv.viccae на sym2 - интродупировапной линии гороха 37(1)2.

Введенный nod ген

количество клубеньков ацетилен- Число

/растение ~ -----------редукция----------- расте-

___/растение, иМ_нпй

«ofifDFITA-incP (рМР604)

r.odX- incP (рМР1071)

nodX-incP (рМР1071)+ nodDFYTA-mc'W (рМР1604)

nodX-mcW (рМР2102)

nodX-incW (pMP2102)+ m>itf)FITA-incP (pMP604)

nodZ-incP (pMP2450)

nodZ-incP (pMP2450)+ noi/DFITA-incW (pMP1604)

nodZ-incP (pMP2450)+ nod,Г-incW (pMP2102)

0-3

0-5 10-30

10-25

15-3(1

10-25

5-10

15-30

10-25

2252.2 3427.2 20628.5

9139.2

15014.4

12011.5 7572.5 15928.3 6826.4

количество клубеньков несколько увеличивалось, и повышалась доля крупных клубеньков, арупированных на главном корне. Шгамм, несущий комбинацию теней nodX и nodZ, также образовал клубеньки на афганском юрохе, хотя и в несколько меньшем колнчесгве, чем в случае присутствия каждою из этих генов в штамме по отдельности.

В обратной ситуации - при заражении cnpaipo штаммами, несущими ген nodX вместо гена nodZ, также произошло образование клубеньков, наиболее ярко выраженное в случае переноса гена nodX в штамм R.leguminosarum на incW пяазмиде. Клубеньки, образованные на сиратро транскоиъюгантными штаммами, эффективными не были, поскольку в качестве реципиентного использовался штамм R.leguminosarum bv. viceae.

Таким образом, мы показали, что ген nodZ может заменить ген nodX для заражения афганского гороха и наоборот, присутствие гена nodX делает возможным образование клубеньков на сиратро. Клубеньки, образованные штаммом Rlv с nodZ геном на афганском горохе, эффективно фиксируют азот. Следовательно, признаки специфичности инокуляции н эффективности азотфиксации являются независимыми.

По литературным данным, для заражения сиратро необходимо, чтобы бактериальный Nod фактор нес на редуцирующем конце фукозил или сульфат. Нами показано, что наличия в том же положении ацетила также достаточно для заражения

cochj

fJodX—- j О

Ri=C18:l Ri=C18:4 или C18:l, n=2 или 3

А Б

Рис.3. Структура Nod факторов Bradyrhizobium japonicum (А) и штамма Al Rhizobium leguminosarum bv. viceae (Б).

сиратро. Таким образом, для заражения сиратро структура заместителя в С-б позиции редуцирующего конца фактора не столь принципиальна, а важен сам факт его присутствия. Из наших экспериментов следует, что к структуре факторов ризобий, заражающих афганский горох, по - видимому, предъявляется аналогичное требование. Не исключено, однако, что не любой заместитель способен функционально заменить ацетил или фукозил. Тот факт, что такие структурно различные заместители, как фукоза и ацетил, компенсируют неспособность штамма заражать sym2 - несущий горох, свидетельствуют не в пользу гипотезы об узнавании дважды ацетилированного фактора специфическим рецептором на корнях афганского гороха. Поскольку известно, что модифицирующие группы повышают устойчивость Nod факторов к шдролитическим ферментам растения; мы полагаем, что способность штамма заражать афганский горох определяется устойчивостью Nod факторов этого штамма по отношению к системе защиты афганского гороха. Факторы, декорированные дополнительными группами на редуцирующем хонце, медленнее разрушаются ферментами растения, в частости, хитшшами, выполняющими функции защиты растения от проникновения внутрь биологически активных молекул. Наличие дополнительной модифицирующей группы на молекуле Nod фактора является необходимым и достаточным условием для заражения афганского гороха.

4. Анализ биологической активности бактериальных фильтратов in planta и in vitro.

анализа эффекта Nod факторов растением из группы инокуляции R.leg.bx.viceae оказала« Vicia sativa. На корневой системе вики были проанализированы Tsr, Hai и Hab/Had ■

ффекты фильтратов бактерий, активированных корневыми эксудатами гороха и одержащих, таким образом, полный набор Nod факторов, синтезируемых бактерией.

В некомплементарной комбинации "афганская линия гороха 31/6 - европейский ггамм CIÄM 1026"' наблюдались"такие"" же"эффекты Tsr и Hai, так и в эффективной омбинаиии "лиши 31/6 - штамм AI". Отличия между комбинациями были обнаружены в орфолоши корневых волосков вики. Картины деформаций корневых волосков оеговерно различались у растений, обработанных фильтратами бактерий, пдуцированных эксудатами комплементарных и некомнлементарных линий гороха. Так, очетаине "афганская линия 31/6 - штамм CIAM 1026" вызывало в основном слабые еформации типа Had, тогда как при активации того же штамма эксудатами омплеменгарного хозяина - европейской линии гороха 32 - наблюдалось увеличение еформаций типа Hab (с разрастаниями волоска), достигающее 60%. В др)гпх омплементарных комбинациях также наблюдалось преобладание Hab - деформаций (до 0-90 %) (рис.4). Таким образом, биологическая активность фильтратов дифференциально ктивированных бактерий была различной. Отсюда следует, что состав Nod факторов, родуцируемых в ответ на ивдукцию эксудатами негомологичного растения - хозяина, miгчается от состава, производимого в комплементарной комбинации. Вопрос о природе гах изменений (количественные они или качественные) требует дальнейших сследований.

'с от общего числа учтенных волосков

/с. 4. Соотношение типов деформаций корневых волосков Vicia sativa после обработки ильтратами дифференциально индуцированных бактерий.

00 n*ff

□ Abd

□ Had ■ Hab

контроль 31/6- 31/6-Al 32- 32-AI CIAM1026 CIAM1Ü26

Действие фнльтратор Rhizohium ца ткани гороха in vitro. Nôtf факторы ризобий являются сигналами, индуцирующими образование меристемы клубенька и способными, таким образом, воздействовать на клеточный цикл растительных клеток. Митогснньш эффект бактериальных фильтратов был проанализирован нами в условиях in vitro, на корневых п стеблевых эксплантах и на суспензионных культурах гороха. Фильтраты индуцированных нарингенином или корневыми эксудатами бактерий (активные) стимулировали каллусообразование на эксплантах более эффективно, чем фильтраты неиидуцированных бактерий (неактивные). Экспланты, культивируемые на среде с неактивным фильтратом, оставались зелеными и формирован! на срезе зеленый каллус, тогда как экспланты на среде с активным фильтратом образовывали на срезе каллус, который вскоре некротизировался. '

Добавление бактериальных фильтратов к суспензионным культурам гороха также имело митогенный эффект, за которым следовала ускоренная гибель клеток. Следовательно, стимулирующая клеточные деления активность Nod факторов в использованных системах проявлялась лишь в узком диапазоне концентраций и в течение недолгого времени. Небольшое превышение оптимальной концентрации и длительное воздействие вызывали защитную реакцию экспланта (некрозы) и гибель клеток гороха, культивируемых in vitro.

Поскольку действие Nod факторов, по - видимому, опосредуется растительными фитогормонами (Verma et al., 1992), была выдвинута гипотеза о том, что отзывчивость корней на Nod факторы может быть связана с чувствительностью тканей растения к экзогенным фитогормонам. Было выявлено, что экспланты Vicia sativa обладают исключительно высокой чувствительностью к ауксину 2,4-Д и к смесям ауксинов и цитокннинов с большим преобладанием одного из - фигогормонов. Экспланты Pisum sativum и Vicia pannonica являются гораздо более устойчивыми к фитогормонам и формируют каллусы на тех средах (с 1-10 мг/л 2,4-Д и др.), где экспланты V. sativa полностью погибают. При этом деформации корневых волосков на корнях гороха и V.pannonica отслеживаются хуже и не отражают специфичность взаимодействия, как в случае с V.sativa (см. выше). Таким образом, установлено, что вика посевная является очень чувствительной к экзогенному смещению фитогормонального баланса, и это свойство может определять ее высокую отзывчивость на бактериальные Nod факторы, делающую ее наиболее пригодным для проведения биотестов растением.

ВЫВОДЫ

1. Корневые эксудаты неинокулированных европейских и афганских линий не имеют существенных отличий по способности к индукции бактериальных nod генов i по составу флавоноидсодержащих фракций.

14

2. Обнаружена высокая индивидуальная изменчивость растений по способности к индукшш nod генов, которая может влиять на эффективность клубснькообразования, но не приводит к Nod" фенотипу.

3. "Проанализирована" продукция~ Nod~ факторов, производимых штаммом Al RAeguminosarum bv. viceae. Показано, что штамм Al продуцирует Nod факторы в количествах, сравнимых со стандартным штаммом, и значительно превосходит по уровню их продукции штамм ТОМ.

4. Штамм А1 производит большое семейство факторов, которое включает как стандартные для штаммов R.leguminosarum bv. viceae молекулы, так и специфически модифицированные - несущие дополнительную ацетатную группу или редкие жирные кислоты.

5. Качественный состав Nod факторов, синтезируемых штаммом Al, не зависит от использованного индуктора. Общее количество Nod метаболитов и относительное количество отдельных компонентов может меняться при индукции бактерии корневыми эксудатами разных линий гороха и коммерческими индукторами. Форма аллели sym2 не влияет на индуцирующую способность корневых эксудатов гороха.

6. Последовательность гена nodX штамма Al практически 100% гомологична последовательности гена nodX штамма ТОМ. Введения гена nodX из штамма Al в штамм шкого mira Rhizobium ¡eguminosarum bv. viceae, неспособный к заражению афганских тнний. до<лагочио для придания штамму способности к заражению этих линий.

7. Фукозилнрование Nod фактора Rhizobium ¡eguminosarum bv. viceae в той же тозишш, где происходит nodX - опосредованное ацетнлирование, позволяет штамму тражать sym2 ~ несущие линии гороха. Следовательно, гены nodX и nodZ являются функционально взаимозаменяемыми. Модификация С-6 позиции редуцирующего конца 5актериального Nod фактора какой - либо из названных групп я&тяется необходимым и юстаточньгм условием для включения афганского гороха в круг хозяев данного штамма.

8. Nod факторы обладают бнологаческой активностью на корнях Vicia sativa и на жеплантах и клетках гороха in vitro. Фильтраты бактерий, активированных эксудатами «комплементарных линий гороха, вызывают более слабые, чем в комплементарной гамбннации, деформации корневых волосков вики. В узком диапазоне концентраций >актериальные фильтраты стимулируют клеточные деления на раневой поверхности жеплантов и в суспезионной культуре клеток гороха. Отзывчивость на Nod факторы шределяется генотипом н зависит от фитогормоналтлюго статуса растения, в частности, от увствительности тканей растения к экзогенным фитогормопам.

9. Манипулирование nod генами ризобий позволяет менять состав Nod метаболитов, то вызывает направленное изменение специфичности инокуляции.

1. Борисов А.Ю., Розов С.М., Цыганов В.Е., Куликова О.А., Колычева А.Н., Якоб! Л.М., Овцына А.О., Тихонович И.А. 1994. Выявление симбиотических генов горох; (Pisum sativum L.) с использованием экспериментального мутагенеза. Генетика, т.ЗО, N11 1484-1494.

2. Овцына А.О. 1994. Особенности продукции Nod метаболитов штаммом Rhizobiun leguminosarum А1, обладающим расширенной хозяйской специфичностью. Материалы съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Генетика, т.ЗО, приложение с.112.

3. Ovtsyna А.О., Tikhonovich l.A. 1994. Nod metabolite production by the strain Rhizobiun leguminosarum bv. viceae A1 which effectively nodulates Afghanistan peas. In: Proceedings of th( 1st European Nitrogen Fixation Conference. G.B.Kiss, G.Endre (eds.). Officina Press, Szeged Hungary', p.312.

4. Овцына A.O., Тихонович И.А. Особенности продукции Nod метаболита штаммом Rhizobium leguminosarum bv. viceae. 1995. Тезисы докладов, 9-й Баховскш коллоквиум по азотфиксации. Пушино: с.17.

5. Kiavchenko L.V., Makarova N.M., Ovtsyna АО., Kulikova О.А., Spaink HP. Lugtenberg B.J. J., Tikhonovich I. A. 1995. Competitiveness of Rhizobium leguminosarum strains ir the connection with Nod factor production. In: Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications Proceedings of the 10-th International Congress on Nitrogen Fixation. I.A.Tikhonovich V.A.Romanov, N. A.Provorov, W.E.Newton (eds ). Kluwer Acad. Publ. Dordrecht, the Netherlands p.313.

6. Ovtsyna A O., Veldhuis A., Lopez-Lara I.M., Wijfjes A.H.M., Quinto C., Geurts R. Bisseling Т., Scott D.B., Tikhonovich I. A., Lugtenberg B.J.J., Spaink H.P. 1996. The host - specifi* role of chemical modifications at the reducing terminus of lipo - chitin oligosaccharides. In: Eds Andrzej Wojtowisz, Joanna Stepkowska, Aldona Szlagowska., Proceedings of 2nd Europear Nitrogen Fixation Conference, Scientific Publishers OWN, Poznan, p.27.

7. Kulikova O., Makarova N.. Ovtsyna A., Ushakov K., Naumkina Т., Tikhonovich I. 1996 Molecular genetic and symbiotic characteristics of Rhizobium leguminosarum bv. viceae strain A-l and its derivatives. In: Eds. Andrzej Wojtowisz, Joanna Stepkowska, Aldona Szlagowska. Proceedings of 2nd European Nitrogen Fixation Conference, Scientific Publishers OWN, Poznan p.123.

8. Ovtsyna AO., Veldhuis A., Lopez-Lara I.M., Wijijes A.H.M., Quinto C., Geurts R. Bisseling Т., Scott D.B., Tikhonovich I.A., Lugtenberg B.J.J., Spaink H.P. 1997. The Host Specific Role of Chemical Modifications at the Reducing Terminus of Lipo - Chitii Oligosaccharides. In: Biological Fixation of Nitrogen for Ecology and Sustainable Agriculture A.Legocki, H.Bothe, A.Puhler (eds ). Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, pp. 25-29.