Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эндофитные бактерии растений гороха как активный компонент бобово-ризобиальной симбиотической системы

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эндофитные бактерии растений гороха как активный компонент бобово-ризобиальной симбиотической системы"

На правах рукописи

Гарифуллина Динара Вакилевна

ЭНДОФИТНЫЕ БАКТЕРИИ РАСТЕНИЙ ГОРОХА КАК АКТИВНЫЙ КОМПОНЕНТ БОБОВО-РИЗОБИАЛЬНОЙ СИМБИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

03.02.03 - Микробиология 03.01.06 — Биотехнология (в том числе нанобиотехнология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАМ 2012

Уфа-2012

005043533

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный аграрный университет»

Научные руководители:

доктор биологических наук, заведующий лабораторией Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, профессор Хайруллин Рамиль Магзннуровпч

кандидат биологических наук, доцент кафедры экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет» Гарипова Светлана Равилевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

Киреева Наиля Ахняфовна

доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук Баймиев Алексей Ханифович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, г. Саратов

Защита диссертации состоится «25» мая 2012 г. в 10 часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Тел.: (347)273-58-51

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на официальном сайте www.bgmy.ru

Автореферат разослан 24 апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д. м. н.

К.А. Лукманова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Экологически безопасным приемом повышения продуктивности и устойчивости растений является предпосевная обработка семян микроорганизмами, способными контролировать развитие фитопатогенов и стимулировать рост растений. В настоящее время большие перспективы связаны с разработкой микробных биопрепаратов на основе эндофитных бактерий, которые населяют внутренние ткани растений без вреда для хозяина [Hallmann J. et al., 1997]. К 2006 г список бактерий-эндофитов включал 219 видов, относящихся к 71 роду [Hallmann J., Berg G., 2006]. Ткани бобовых растений помимо ризобий населены неклубенькообразующими эндофитами, относящимися к родам Aerobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Bacillus, Chryseomonas, Curtobaclerium, Enterobacter, Erwinia, Flavimonas, Pseudomonas, Sphyngomonas и др. [Gagne S. et al., 1987; Sturz A. V. et al., 1997]. Взаимоотношения эндофитных бактерий с бобово-ризобиальной симбиотической системой практически не изучены. Поскольку известно, что многие эндофитные бактерии обеспечивают защиту растений от болезней [Sturz A.V., Matherson, 1996; Cho C.J. et al., 2003; Недорезков В.Д., 2003; Ziedan E.H.E., 2006; Berg G. et al, 2008; Chen X.-H.et al., 2009], способны к азотфиксации [Reinhold-Hurek В. and Hurek T. 1998; Gyaneshwar P. et al, 2001; Kuklinski-Sorbal J. et al, 2004], продукции фитогормон-подобных соединений [Long H.H.et al, 2008; Широких A.A. и др., 2008; Jha Р, Kumar А, 2009; Palaniappan P. et al, 2010], стимулированию клубенькообразования на корнях растений [Bai Y. et al, 2003; Lee K.D. et al, 2005], не исключено, что совместное действие эндофитных микроорганизмов с клубеньковыми бактериями может в большей степени повышать экологическую пластичность макросимбионта, чем при индивидуальном бактериальном воздействии. Выяснение фундаментальных вопросов межмикробных и микробно-растительных отношений Позволит познать механизмы формирования высокоэффективных комбинаций макро- и микросимбионтов для повышения продуктивности и устойчивости культурных растений.

Цель исследования:

- в бобово-ризобиальной симбиотической системе оценить роль эндофитных бактерий из корней гороха (Pisum sativum L.) как потенциальной основы микробиологических препаратов для растениеводства.

Задачи исследования.

1 Выделить бактериальные эндофиты из внутренних тканей корней гороха и оценить их фунгистатическую активность по отношению к основным грибным фитопатогенам, вызывающим корневые гнили, а также способность регулировать рост растений.

2 Определить характер взаимоотношений эндофитов с бактериям! Rhizobium leguminosariim bv. viceae in vitro.

3 Получить штамм эндофитной бактерии с репортерным геном gfp и изучить возможные пути проникновения эндофитов в ткани корня гороха.

4 Выявить штаммы эндофитов, перспективные в качестве основы препаратов для повышения продуктивности растений гороха и их устойчивости к корневым гнилям.

5 Оценить эффективность применения экспериментальных препаратов для повышения семенной продуктивности гороха и защиты растений от корневых гнилей.

Научная новизна.

Установлено, что бактериальные эндофиты корня гороха являются широко распространенными компонентами растительно-микробного сообщества, способными активно влиять на формирование бобово-ризобиального симбиоза, устойчивость макросимбионта к корневым гнилям и его продуктивность. Показано, что такими свойствами обладают как отдельные бактериальные штаммы, так и их ассоциации, населяющие клубеньки, а также другие органы растений гороха. С помощью рекомбинантного штамма Serratia sp. с геном зеленого флуоресцирующего белка выявлены способность этой бактерии заселять внутренние ткани корня растения гороха и её локализация в них. Выделены и охарактеризованы новые эндофитные штаммы бактерий Rh.

leguminosarum bv. viceae, а также родов Pseudomonas и Serratia с хозяйственно полезными свойствами.

Практическая значимость работы.

Полученные результаты расширяют представления о составе симбиоти-ческих сообществ гороха с бактериальными эндофитами и процессах их формирования, что повышает эффективность поиска новых штаммов бактерий в качестве основы микробиологических препаратов для растениеводства. Выделены новые штаммы Rh. leguminosarum bv. viceae B2, Rhl6, Serratia sp. Entl6, эффективно повышающие урожайность растений гороха, а также их устойчивость к корневым гнилям. Выделен новый штамм Serratia sp. Entlö, который по совокупности свойств является перспективным в качестве основы биопрепарата для растениеводства. Получен его трансформированный мутант с геном зеленого флуоресцирующего белка, пригодный для изучения мутуалистических взаимоотношения этих бактерий с растения™ гороха.

Положения, выносимые на защиту:

1 Во внутренних тканях растений гороха распространены эндофитные штаммы бактерий с комплексной биологической активностью по отношению к бобово-ризобиальной симбиотической системе.

2 В клубеньках корней гороха встречаются многовидовые бактериальные ассоциации, способные мутуалистически сосуществовать с бактериями Rhizobwm leguminosarum bv. viceae.

3 Штамм Serratia sp. Entl6 является эпдофитным и способен позитивно влиять на рост и развитие растения-хозяина, стимулировать формирование симбиотической системы гороха с ризобиями и повышать продуктивность растений.

4 Новые штаммы Rh. leguminosarum bv. viceae. Rhl6 и Serratia sp. Entlö могут служить основой для производства микробиологических препаратов с целью повышения урожайности зерна гороха.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены и доложены на: Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и

прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007);

IV молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов «Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы» (Уфа, 2008);

V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 18 работ, из которых 4 статьи - в журналах, указанных в перечне ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, 3-х глав, включающих обзор литературы, описание объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы (299 наименования, из которых 231 на иностранном языке). Работа изложена на 124 страницах, включая 12 рисунков и 22 таблицы.

Связь с тематическим планом работ вуза.

Исследования выполнялись в рамках заказа Минсельхоза России за счет средств Федерального бюджета в соответствии с тематическим планом работ вуза, утвержденным директором Департамента МСХ РФ по теме: «Разработка полифункциональных биофунгицидов для растениеводства» (№ Госрегистрации 01200853490).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами для выделения эндофитных бактерий являлись растения гороха Pisum sativum L. сортов Чишминский 95 и Орлус. Для оценки ростстимулирующего эффекта эндофитов использовали растения пшеницы Triticum aestivum L. сорта Омская 35, растения рапса Brassica napus L. Штамм

бактерии Rhizobium leguminosarum bv. viceae 1078 был получен из ВНИИСХМ (С.-Пб.-Пушкин). Штамм Echerichia coli XL-blu, содержащий плазмиду pRL-gfp 765, использованный для трансформации штамма Serratia sp. Entl6 был получен из коллекции Института биохимии и генетики УНЦ РАН. В качестве возбудителей корневых гнилей использовали грибы Fusarium oxysporum (Schlecht) f.sp. pisi (Hal.), Bipolaris sorokiniana Sacc. (Shoem) и Botrytis byssoidea из коллекции ФГБОУ ВПО «Башкирский ГАУ».

Для выделения бактериальных ассоциаций из клубеньков отбирали здоровые растения гороха в стадии бутонизации, растущие в поле на черноземе выщелоченном. Для выделения эндофитов из тканей других органов гороха растения выращивали в теплице. Клубеньки, части других органов растений помещали на 20 минут в 0,2%-ный раствор диацида (этанолмеркурхлорид + цетилпиридиния хлорид в соотношении 1:2), который затем удаляли пятикратной промывкой материала в стерильной дистиллированной воде. Затем смачивали спиртом, обжигали в пламени спиртовки 2-3 секунды, после чего микроорганизмы выделяли путем переноса тканей на питательный агар. Изоляты хранили на соответствующих их выделению средах. Чистые культуры бактерий получали общепринятым методом [Егоров Н.С., 1976].

Способность ассоциаций и штаммов бактерий подавлять рост грибных фитопатогенов определяли методом агаровых блоков, в случае большого количества изолятов, использовали репликатор. Для оценки ростстимулирующих свойств штаммов и их ассоциаций суспензией клеток суточных культур инокулировали семена растений. Затем семена проращивали в темноте и через определенное время измеряли размеры органов. Контрольными были семена, обработанные водой.

Суспензии клеток получали смывом с твердой питательной среды 0,9%-ным раствором NaCl культуры бактерий, растущих на гороховом агаре, или на селективной среде для бактерий рода Pseudomonas (HiMedia, Индия), или на среде LB. Необходимую концентрацию клеток различной плотности, измеряемую по оптической плотности суспензии, получали путем кратного разведения.

Видовую идентификацию бактерий осуществляли по морфолого-культуральным и физиолого-биохимическим свойствам методами, описанными в литературе [Определитель бактерий Берджи, 1997; Скворцова И.Н., 1984; Смирнов В.В., Киприанова Е.А., 1990] при помощи тест-систем «Системы индикаторные бумажные для идентификации микроорганизмов» (ФГУП «НПО «Микроген»),

Видовую принадлежность перспективных штаммов уточняли секвенированием клонированного фрагмента гена 16S рРНК, используя автоматический секвенатор ABI PRISM 310 («Applied Biosystems», США), наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1». RAPD-анализ проводили на амплификаторе МС2 «Терцик» («ДНК-технология», Россия) с использованием произвольных праймеров и стандартных наборов для амплификации ДНК.

Штамм Serratia sp. Entl6 трансформировали плазмидой pRL-gfp по протоколу электротрансформации бактерий вида Е. coli [See Ausubel F.M. et al., 1987, Miller E.M. and Nickoloff J.A., 1995]. Визуализация бактерий проводилась на конфокальном микроскопе «Axio Observer.Zl» SP с лазерным сканирующим модулем, а также флуоресцентном микроскопе «Axio Imager Ml».

Полевые опыты проводили согласно методике, описанной Б.А. Доспеховым (1985), в Уфимском районе на черноземе типичном (п. Нурлино), на черноземе выщелоченном (сады «Весна»), а также серой лесной почве в Чишминском районе (п. Алкино). Производственные опыты проводили в ТНВ «Урожай» Илишевского района РБ на выщелоченном черноземе. Норма высева семян гороха 1,25 млн. штук/га. Учетная площадь делянки в мелкоделяночных опытах - 1 м2, в производственном опыте - 2 га. В таблицах указаны средние арифметические и их стандартные ошибки, звездочкой отмечены статистически значимые различия по сравнению с контролем при р<0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Фунгнстатическая и рострегулиругошая активность различных групп эндофитных бактерий

При разработке микробных препаратов комплексного действия для повышения продуктивности и устойчивости бобовых растений предпочтительна стратегия объединения в микросимбионтах свойств азотфиксации и защиты от фитопатогенов. Основная роль клубеньковых бактерий в симбиозе с бобовыми растениями состоит в обеспечении азотного питания растений* поэтому этот симбиоз обычно дополняют ассоциативными стимулирующими рост растений бактериями, к которым относятся также и эндофитные бактерии. Поиск перспективных комбинаций бактерий с комплексной биологической активностью проводили среди различных групп эндофитных бактерий. Первую коллекцию составили клубеньковые бактерии R. leguminosamm bv. viceae; вторую коллекцию - эндофиты корня, выделенные на селективной среде для псевдомонад. Третья коллекция включала изоляты из клубеньков, включающие бактерий R. leguminosarum bv. viceae и их спонтанных эндофитных спутников. При скрининге оценивали фунгистатические свойства и рострегулирующую активность бактерий in vitro, а также способность повышать семенную продуктивность макросимбионта и его устойчивость к корневым гнилям в поле. Среди клубеньковых бактерий три штамма из восьми изученных стимулировали рост корня на 22-35% и четыре штамма показали различную активность по отношению к грибным фитопатогенам (Табл. 1). Это согласуется с данными других авторов о встречающейся у ризобий фунгистатической и ростстимулирующей активности [Arfaoui A. et al., 2006, Hossain M.S., Martensson A., 2008, Vargas P.A. et al., 2009]. Однако в системе in planta в полевых условиях это свойство не коррелировало с продуктивностью растений. Инокуляция семян гороха клетками выделенных ризобий в полевых условиях благоприятного по агрометеорологическим условиям 2008 г. способствовала снижению заболеваемости растений во всех вариантах опыта, а наибольший урожай

(прибавка урожайности 25% по сравнению с контролем) обеспечило

применение штамма ШтВ2. Таблица 1 - Биологическая активность бактерий Я. 1е^иттозагит Ьу. \iceae

Штаммы 1п \itro В поле (чернозем выщелоченный, 2008 г.)

Длина корня проростков гороха, % Зона подавления, мм Семенная продуктивность, г/растение Масса семян, г/м2 Распространение корневых гнилей, %

Г. оху-ярогит В. 50ГО-Ытапа

Ш1В1 126 0 1 3,9±0,2 351 7,3±2,5*

Ш1В2 71 0 1 5,0±0,3* 475 11,7±4,2

Ш1ВЗ 59 3-5 0 4,5±0.3 450 11,4±3,1

Ш1В4 94 0 0 3,9±0,3 371 13,2±5,9

ИЬВЮ 123 0 2-7 3,5±0.3 280 8,8±5Д

Ю1В21 94 10-18 0 4,1±0,3 349 13,9±6,1

Ш116 135* 1-3 5-6 4,6±0,3 391 7,7±4,4*

1078 72 0 0 4,0±0.3 360 13,1±5,7

Контроль 100 0 0 4,0±0,3 360 19,0±4,8

Вторую коллекцию эндофитных бактерий выделяли из корней внешне здоровых хорошо развитых растений, выращенных в теплице. Во внутренних тканях большинства растений встречались бактерии, способные расти на картофельно-глюкозном агаре (КГА) и бобово-глюкозном агаре (БГА). 70% растений содержали бактериальные изоляты, растущие на селективной среде для псевдомонад, свойства которых анализировали более детально. Среди таких растений 100% содержали бактерии в корневой шейке, 25% - в тканях корня, 20% - в клубеньках.

Фунгистатические и ростстимулирующие свойства оценивали у 34 изолятов, изолированных из разных частей корня. Половина изолятов были способны стимулировать рост корней, пятая часть увеличивала длину корней более, чем в 2 раза. Около 40% изолятов активно подавляли развитие одного или двух фитопатогенных грибов. Сочетание ростстимулирующих свойств и антагонистической активности к грибным фитопатогенам обнаружено почти у 60% изолятов, из них сравнительно высокие значения этих показателей отмечены у 19%.

Для инокуляции в полевых условиях из сформированной коллекции было отобрано 8 изолятов, выделенных из прикорневой шейки, корня и клубеньков

(Табл. 2). Все изоляты способствовали снижению распространения корневых гнилей растений и увеличению массы корня, но в связи с крайне засушливым вегетационным периодом 2010 г. продуктивность гороха в целом была очень низкой. В этих условиях при инокуляции семян изолятом 6Ш урожайность возросла на 8%, остальные штаммы в этом отношении были неэффективны.

Таблица 2 - Биологическая активность эндофитов корней гороха, выделенных на селективной среде для псевдомонад

Штамм-мы In vitro В поле (серая лесная почва, 2010 г.)

Длина корня проростков гороха, мм Зона подавления, мм Семенная продуктивность, г/растение Количество кубень- ков, шт./раст Распространение корневых гнилей, %

F. oxyspomm В. byssoidea

Эндофиты клубеньков

17П 58,1±2,2* 0 0 1,6±0,1 8,7±1,0 0

8П 17,1±1,б 7-10 5-7 1,3±0,1* 8,4±0.б 0,7±0,5

17С 46,6±2,2* 0 0 1,6±0,1 11,1±1,4* 0,7±0,5

Эндофиты корня

14К | 60,3±3,1* | 0 | 0 | 1,5±0,1 | 11,4±1,2* | 4,7±2,5

Эндофиты корневой шейки

2Ш 53,2±2,7* 2-4 5-7 1,6±0,1 10,8±4,6* 12,3±4.б

6Ш 22,9±1,8 4 7-10 2,0±0,1 11,6±1,2* 0,3±0,2

16Ш 47,8±3,1* 2-5 2-5 1,9±0,5 9,6±1,2 3,3±1,8

17Ш 37,0±2,5* 0 0 1,3±0,1* 10,9±1,3 1,7±0,7

Контроль 17,4±2,0 0 0 1,9±0,1 8,7±0,8 12,7±0,1

Возможно, по причине неблагоприятного абиотического фактора вклад коллекционных эндофитных бактерий группы псевдомонад оказался недооцененным. Но причиной невыраженного мутуалистического эффекта мог служить и биотический фактор - отсутствие в бактериальном инокулюме ризобиального компонента, как это было показано в других исследованиях [Sturz A.V. et al., 1997], играющего, по-видимому, важную сигнальную и регулирующую роль для реализации мутуалистического влияния эндофитных бактерий. В этой связи нам представлялся перспективным поиск природных бактериальных сообществ ризобий с их естественными спутниками, попавшими в клубенек в природных условиях.

Такие ассоциации бактерий составили третью коллекцию изолятов, выделенных на БГА из клубеньков. Из 120 изолятов примерно четверть

проявила антагонизм к фитопатогенам: 23% -к F. oxysporum и 33% - к В. sorokiniana. Однако сильных антагонистов (зона подавления 5 и более мм) среди эндофитов обнаружено не более 3%. Неспецифический ростстимулирющий эффект по отношению к растениям рапса показали 23% изолятов, при этом 15% стимулировали рост корней в 1,5-2 раза, 3% - более, чем в 2 раза в сравнении с контролем. Сочетание антагонистических свойств со способностью стимулировать рост корней было обнаружено у 16% ассоциаций. В результате скрининга была создана коллекция из 57 изолятов клубеньков гороха, у которых был изучен состав и свойства штаммов. Каждый изолят клубеньков представлял собой бактериальные ассоциации из 3-6 морфотипов клеток. При пересевах и хранении на микробиологических средах между разными штаммами этих ассоциаций наблюдались проявления конкурентного исключения и изменения свойств колоний и биологической активности. Ассоциация 416, сохранившая стабильный состав и свойства в течение 6 месяцев хранения, стала объектом дальнейших наших исследований.

2. Изучение взаимоотношений микроорганизмов в ассоциации 416 и с макросимбионтом

Ассоциация 416 представляла 4 отдельных штамма бактерий. Согласно морфолого-культуральным и физиолого-биохимическим свойствам [Определитель бактерий Берджи, 1997; Скворцова И.Н., 1984; Смирнов В.В., Киприанова Е.А., 1990] и данным секвенирования фрагментов генов 16S рРНК, штаммы были идентифицированы как представители родов Rhizobium, Pseudomonas, Serratia и Bacillus. Первые три названы, соответственно, Rhl6, Psl6, Entl6. Штамм Bacillus sp. в дальнейшем исследовался в лаборатории специализированной научной группой, изучающей бактерии этого рода.

Для выяснения эндофитной природы штамма Entl6 из отдельных клубеньков растений, инокулированных в полевых условиях этим штаммом и его комбинацией с Rh 16, получали реизоляты и сравнивали с помощью ПДРФ-анализа 16S рРНК их ДНК со штаммами исходных культур. Четыре изолята 8.1R, 12.1R, 12.1Р, 8.1Р, выделенные из клубеньков растений, обработанных штаммом Entl6 автономно и в комбинации со штаммом Rhl6, на селективной

среде для псевдомонад характеризовались сходными с ЕпИб морфолого-культуральными свойствами колоний и клеток, а также электрофоретическим спектром фрагментов ДНК при ПДРФ-анализе (Рис. 1).

Рисунок 1 - Электрофореграмма ПДРФ анализа генов 16S рРНК, где 1 - 8.1R; 2 - 12.1R; 3 - Entl6; 4- 12.1Р; 5 - 8.1Р

Поиск сходных последовательностей в базе данных генов, показал, что секвенированные фрагменты длиной около 300 пн, у штаммов 8.1R, 12.1R, 12.1Р, 8.1Р были филогенетически близки представителям семейства Enterobacteriaceae. Штаммы 8.1R, 12.1R, 12.1Р и Entlö - близки к Serratia sp., а штамм 8.1Р - к Pantoea agglomerans.

С целью выяснения путей колонизации тканей растения штаммом Serratia sp. Entlö он был трансформирован плазмидой, несущей ген зеленого флуоресцирующего белка (Entlögfp). При инокуляции помещенных на агаризованную среду семян гороха суспензией клеток штамма Serratia Eiitl 6gfp в концентрации 10б кл/семя на третьи сутки бактерии были обнаружены на поверхности волосков и в их основаниях (Рис. 2), но не во внутренних тканях корня. По-видимому, микроорганизм получал достаточное питание на поверхности корня, контактирующего с богатой агаровой средой, и поэтому не проникал внутрь растения.

При асептическом выращивании инокулированных растений в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной только водой, начиная с третьих суток, отмечено присутствие единичных бактерий на поверхности корня и волосках (Рис. 3). В отличие от предыдущего эксперимента, бактерии были зафиксированы также и на продольных срезах через сосуды корня, что свидетельствовало о способности штамма проникать внутрь корня и

распространяться по тканям. Серия сканированных срезов через примордий корня проростков показала, что бактерии находятся внутри тканей и, вероятно, таким образом проникают в растения по мере роста корня. Таким образом, данные экспериментов доказали эндофитную природу штамма Serratia Entl6.

А Б В

Рисунок 2 - Продольные срезы корня гороха. А, Б - бактерии Serratia Entl6gfp на поверхности корневых волосков; В - в проводящих сосудах

Межмикробные взаимоотношения бактерий ассоциации 416 были изучены in vitro методом агаровых блочков (Табл. 3). Выяснилось, что к фитопатогену F. oxysporum ассоциация 416 обладает большей антагонистической активностью, чем отдельные ее штаммы (возможно за счет бацилльного штамма, входившего в исходный состав). Кроме того, активным к F. oxysporum был ризобиальный штамм Rhl6 и Serratia Entlö. Примечательно, что последний штамм активно подавлял не только развитие фитопатогена В. sorokiniana, но и рост эталонного ризобиального штамма Rh. leguminosarum bv. viceae 1078, однако был менее агрессивен к Rh. leguminosarum bv. viceae Rhlö из этой же ассоциации.

Таблица 3 - Антагонистическая активность штаммов ассоциации 416 к фитопатогенам и штаммам Rh. leguminosarum bv. viceae

Тест-объект Зона подавления роста тест-объекта, мм

Eilt 16 Psl6 RI1I6 416

F. oxysporum 2 0 3 5

В. sorokiniana 12 0 5 0

Rhl6 3 0 0 0

Rh 1078 12 4 0 0

Влияние штаммов ассоциации на рост растения-хозяина оценивали по увеличению длины корней трехсуточных проростков. Ассоциация 416 в исследованной концентрации клеток ингибировала рост корней, тогда как отдельные штаммы Егй16 и ИЫ6 проявляли ростстимулирующие свойства, которые определялись концентрацией клеток (Рис. 3).

Рисунок 3 - Влияние различной плотности клеток штаммов ассоциации 416 на длину корня растений гороха.

Примечание: 105, 10®, 107, 10®, 109 107 - концентрация клеток/семя

Так как штаммы бактерий были выделены из клубенька растений гороха, может возникнуть вопрос о хозяйской специфичности микроорганизмов и, соответственно, специфичности ответа вида растения. В связи с этим мы оценивали эффект инокуляции семян штаммом Serratia Entl6, на рост проростков пшеницы. Результаты показали (Рис. 4), что штамм стимулировал рост проростков пшеницы на 15-35% в широком диапазоне концентраций.

Сравнение стимулирующих свойств штамма Serratia Entlö с коммерческим препаратом «ЕЛЕНА» (основа - штамм Р. aureofaciens ИБ51) в концентрациях 10б, 107 клеток/семя показало, что штамм Entlö не уступает ему по активности и даже более эффективен. Штамм Psl6 не проявлял ни одно из исследуемых нами свойств.

160 140 120 100 80 60 1 40 20 | 0

120 100 80 60 40 20 0

«Г

N»

Ч» S®

в г

Рисунок 4 - Влияние различной плотности клеток штамма Serratia Entl6 на длину эпикотиля (А) и корня (Б) 3-х суточных проростков пшеницы, сравнение влияния штамма с препаратом «Елена» на длину эпикотиля (В) и корня (Г) Примечание: 105, 10б, 107, 108, 109 107 - концентрация клеток/семя

3. Влияние инокуляции семян клетками штаммов ассоциации 416 на

продуктивность растений гороха и их устойчивость к корневым гиилям

Результаты трехлетних полевых экспериментов (Табл. 4-6) показали, что

инокуляция семян гороха бактериальными препаратами в целом положительно

сказалась на урожайности культуры. Как семенная продуктивность растений,

так и урожайность зерна ни в одном из вариантов инокуляции не были

статистически ниже контроля (без обработки семян).

Таблица 4 - Влияние инокуляции семян гороха штаммами ассоциации 416 на продуктивность растений (чернозем выщелоченный, 2008 г)

Варианты Масса в фазу бутонизации, г Распространение корневых гнилей, % Продуктивность

побега корня клубеньков г/растение г/м2

Контроль 1б,01±1,9 0,59±0,05 0,490±0,053 18,9±4,8 4,0±0,3 360

Rhl078 14,2±0,9 0,68±0,03 0,515±0,053 13,1±5,7 4,0±0,3 360

416 12,8±1,0 0,53±0,03 0,410±0,038 7,2±3,7* 4,4±0,3 330

Rhl6 10,8±0,9* 0,59±0,04 0,354±0,035 7,7±4,4* 4,б±0,3 391

Entl 6 12,8±1,1 0,66±0,04 0,397±0,050 12,3±5,б 4,7±0,3* 376

Pslö 13,б±1,4 0,б1±0,0б 0,432±0,026 13,1±5,7 4,2±0,2 336

Entl 6+ Rhl6 13,6±1,3 0,55±0,05 0,419±0,047 3,6±1,3* 4,9±0,2* 441

Таблица 5 - Показатели продуктивности растений гороха при инокуляции семян штаммами ассоциации 416 (серая лесная почва, 2009 г)

Варианты Масса в фазу бутонизации, г Распространение корневых гнилей, % Продуктивность

побега корня клубеньков г/растение г/м2

Контроль 7,9±0,5 0,24±0,02 0,071 ±0,08 24,4±5,4 1,80±0,10 200

Rhl078 7,7±0,6 0,31±0,02* 0,065±0,06 31,1±8,8 2,2±0,10* 245

Rhl6 9,6±0,9 0,23±0,03 0,060±0,04 16,1±4,7 2,19±0,10 243

Entl 6 9,4±0,6 0,36±0,04* 0,110±0,03* 42,8±6,5 1,96±0,09 218

Entl6+Rhl6 8.9±0,7 0,30±0,02* 0,100±0,03* 16,1±5,5 2,0±0,10 222

Entl 6+ Rhl078 11,2±0,8* 0,28±0.03 0,050±0,03 22,2±7,0 2,2±0,11* 239

Таблица б - Влияние инокуляции семян гороха штаммами ассоциации 416 на морфометрические параметры растений в фазу бутонизации и их продуктивность (серая лесная почва, 2009 г)

Варианты Масса побега, г Высота растения, см Количество клубеньков Распространение корневых гнилей, % Продуктивность

г/растение г/м4*

Контроль 3,4±0,2 25,7±1,0 13,7±1,1 15,0±3,7 1,5±0,1 164

Rh 1078 4,0±0,4* 2б,6±1,3 13,Ш,0 11,3±4,5 1,3±0,1 144

Rhl6 3,5±0,3 26,6±1,2 13,0±1,0 7,6±3,1 1,4±0,1 181

Entl 6 3,б±0,3 28,1±1,2* 13,9±1,3 7,0±2,8 1.2±0.3 149

Entl 6+ Rh 16 3,4±0,2 25,5±1,1 1б,4±1,1* 3,7±1,7* 1.4±0,1 189*

При обработке семян, например, клетками Rh 16 и комбинацией штаммов [Entl6+Rhl6], все три года стабильно семенная продуктивность растений была выше (на 15-23%), в сравнении с контрольными. Эффективность применения эталонного штамма Rh. 1eguminosartm bv. viceae 1078 и Serratia Entl б

варьировала в разные годы. Применение клеток штаммов Rhl6 и комбинации [Entl6+Rhl6] во всех трех полевых экспериментах стабильно снижало степень поражения растений корневыми гнилями (Табл. 4-6).

Ростстимулирующий эффект бактериальных обработок зависел от агроклиматических условий сезона. В достаточном по влагообеспеченности 2008 году на черноземе выщелоченном в фазу бутонизации значения массы побега, корня и клубеньков в большинстве варинтов были на уровне или ниже контроля. По-видимому, затраты на формирование симбиоза с внесенными эндофитными бактериями для растения оказались выше, чем использование доступного минерального питания в почве у контрольных растений. Однако в засушливых условиях 2009 г и в более бедной азотом серой лесной почве преимущества симбиоза проявлись в стимуляции роста корня от 17% до 50%, клубеньков - до 55%, побега - до 42% в отдельных вариантах инокуляции в сравнении с контролем.

Поскольку по результатам 2008 г на выщелоченном черноземе наибольшую семенную продуктивность обеспечила инокуляция гороха комбинацией клеток штаммов [Entl6+Rhl6] и ризобиального штамма RhB2, эффективность применения препаратов на основе этих микроорганизмов испытывалась в производственных условиях ТНВ «Урожай» Илишевского района Республики Башкортостан в 2009 г. Семена гороха сорта Чишминский 95 обрабатывали суспензией клеток бактерий Serratia Entl6 и Rh. legttminosarum bv. viceae Rhl6, полученной смешиванием суточных культур из расчета концентраций, соответственно 10б клеток/семя и 107 клеток/семя. Расход препарата 1 л/т, рабочей жидкости - 10 л/т семян. Агротехника возделывания культуры была общепринятой для данной природно-сельскохозяйственной зоны. Уборка урожая проводилась комбайном. Оценивали бункерную массу зерна. Результаты испытаний показали (Табл. 7), что обработка семян экспериментальными препаратами была эффективна.

Таблица 7 - Хозяйственная эффективность предпосевной инокуляции семян гороха клетками новых штаммов бактерий (ТНВ «Урожай» Илишевского района Республики Башкортостан, 2009 г)

Показатели Варианты

Контроль Entl6+Rhl6 RhB2

Урожайность зерна, т/га 1,5 1,7 1,6

Прибавка урожайности, т/га 0 0,2 0,1

Наибольшая прибавка урожайности - 0,2 т/га или 13,3% в сравнении с контролем получена при обработке семян смесью клеток культур бактерий [Entl6+Rhl6]. Расчет затрат на применение препарата, содержащего клетки этих штаммов бактерий для предпосевной обработки семян гороха выявил экономическую эффективность данного агротехнического приема.

ВЫВОДЫ

1 Среди клубеньковых бактерий Rhizobium legiiminosarum bv. viceae встречаются штаммы с комплексной биологической активностью, проявляющие антагонизм к грибным фитопатогенам и стимулирующие рост растений гороха.

2 Во внутренних тканях корней гороха с частотой не менее 60% распространены неклубеньковые эндофитные бактерии, способные стимулировать рост проростков этого и других видов растений, а также проявлять антагонизм к грибным фитопатогенам, вызывающим корневые гнили сельскохозяйственных культур.

3 В клубеньках гороха обнаружены многовидовые ассоциации эндофитных бактерий с сохраняющимся в течение определенного времени стабильным составом, несмотря на парные антагонистические взаимоотношения друг с другом in vitro. Обработка семян гороха клетками отдельных представителей ассоциации, а также их искусственных объединений способна приводить к стимуляции роста макросимбионта и биоконтролю над распространением корневых гнилей.

4 Выделен новый штамм Serratia sp. Entlö, способный стимулировать рост растений и подавлять развитие некоторых грибных фитопатогенов in vitro. Установлено, что этот эндофит может проникать в корни гороха через примордия и распространяться в растении по сосудам.

5 Предпосевная обработка семян гороха комбинацией эндофитных бактерий Serratia sp. Eilt 1 б и Rh. leguminosarum bv. viceae Rh 16 позволяет получить в производственных условиях прибавку урожайности зерна до 2 ц/га. Указанные штаммы могут служить основой микробиологических препаратов для растениеводства.

Список работ, опубликованпых по теме диссертации Статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ

1.Иванчина Н.В., Гарипова С.Р., Шавалеева Д.В., Уразбахтина H.A., Захарова Р.Ш., Хайруллин P.M. Влияние штаммов Bacillus subtilis на продуктивность растений гороха при автономной и совместной инокуляции со штаммом Rhizobium leguminosarum bv. viceae 1078 II Агрохимия. - 2008. -№ 10. - С. 34-39.

2. Гарипова С.Р., Шавалеева Д.В., Иванчина Н.В., Маркова О.В., Хайруллин P.M. Влияние ассоциаций эндофитных бактерий с ризобиями на продуктивность бобовых растений // Бюллетень МОИП, 2009. - Т. 114. Выпуск 2. - С. 36-37.

3. Иванчина Н.В., Шавалеева Д.В. Поиск эндофитных штаммов Bacillus subtilis с комплексной биологической активностью для повышения продуктивности и устойчивости растений гороха // Аграрная Россия. - 2009. -Специальный выпуск. - С. 85.

4. Гарипова С.Р., Гарифуллина Д.В., Маркова О.В., Иванчина Н.В., Хайруллин P.M. Изучение бактериальных ассоциаций эндофитов клубеньков, способствующих увеличению продуктивности бобовых растений // Агрохимия. -2010. ~№ 11. -С. 50-58.

Статьи в других изданиях

1.Гарипова С.Р., Шавалеева Д.В., Иванчина Н.В., Хайруллин P.M. Выделение из клубеньков гороха бактерий, подавляющих корневые гнили и стимулирующих рост растений // Современная физиология растений: от молекул до экосистем: Материалы докладов Международной конференции. Часть 3. - Сыктывкар, 2007. - С. 322-323.

2. Иванчина Н.В., Шавалеева Д.В. Оценка фунгистатической активности штаммов бактерий, выделенных из клубеньков гороха // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Региональная конференция молодых ученых с международным участием. - Екатеринбург -Пермь, 2007.-С. 59-61.

3. Иванчина Н.В., Гарипова С.Р., Шавалеева Д.В., Уразбахтина H.A., Минина Т.С., Лукьянцев М.А., Хайруллин P.M. Влияние штаммов Bacillus subtilis на продуктивность растений гороха (Pisum sativum L.) при автономной инокуляции и в сочетании со штаммом Rhizobium leguminosarum bv. viceae 1078 и молибденом II Влияние физических, химических и экологических факторов на рост и развитие растений: материалы 4-ой Всероссийской научной конференции в МГОПИ. - Орехово-Зуево, 2007. - С. 76-79.

4. Шавалеева Д.В., Иванчина Н.В., Маркова О.В. Морфология клеток и колоний бактерий, выделенных из клубеньков гороха и фасоли // Актуальные аспекты современной микробиологии: II Международная молодежная школа-конференция. - М., 2007. - С. 129-130.

5. Шавалеева Д.В. Морфо-физиологическая характеристика ассоциаций микроорганизмов, выделенных из тканей гороха // Молодежь и наука на Севере: I Всероссийская молодежная научная конференция. - Сыктывкар, 2008. - С. 326-327.

6. Иванчина Н.В., Шавалеева Д.В., Гарипова С.Р. Связь между ростстимулирующими свойствами штаммов Bacillus subtilis in vitro и семенной продуктивностью растений in situ при различных вариантах обработок гороха //

Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам: Вторая Всероссийская конференция. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 253-255.

7. Маркова О.В., Шавалеева Д.В., Ахмадеева Э.М. Эффективность инокуляции гороха (Pisum sativum L.) и фасоли (Phaseolus \nlgaris L.) ассоциациями эндофитных бактерий, выделенных из клубеньков бобовых растений // Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы: II Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и аспирантов. - Уфа, 2008. - С. 14-16.

8. Шавалеева Д.В., Иванчина Н.В., Гарипова С.Р. Идентификация и оценка ростстимулирующей, антагонистической активности и безопасности штаммов рода Pseudomonas, перспективных для инокуляции гороха // Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам: Вторая Всероссийская конференция. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 280-282.

9. Шавалеева Д.В., Иванчина Н.В., Гарипова С.Р., Хайруллин P.M. Биоразнообразие микроорганизмов в клубеньках и тканях гороха (Pisum sativum L.) // Биоразнообразие, охрана природы и здоровье населения в республике Башкортостан: Сб. материалов заочной международной науч.-практ. конф. -Стерлитамак, 2008. - С. 35-36.

10. Шавалеева Д.В. Ростстимулирующая и антагонистическая активность эндофитов, выделенных из разных тканей гороха // Экология и научно-технический прогресс: Вторая Всероссийская конференция с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. -Пермь, 2009. - С. 85-86.

Подписано в печать 25.04.2012. Формат бумаги 60х84'/]б. Усл. печ. л. 1,28. Бумага офсетная Печать трафаретная. Гарнитура «Тайме». Заказ 256. Тираж 100 экх

Типография ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» 450001, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гарифуллина, Динара Вакилевна

Введение.

Обзор литературы.

1. Глава 1. Экологическая роль симбиоза эндофитных бактерий с растением.

1.1 Эндофитные бактерии и их экологические ниши.

1.2 Методы выявления эндофитных бактерий.

1.3 Биоразнообразие и численность эндофитых бактерий в тканях ^ сельскохозяйственных растений.

1.4 Пути проникновения эндофитных бактерий в растение и их вклад ^ в формирование мутуалистических взаимоотношений.

1.5 Бактериальные эндофиты бобовых культур как перспективная ^ основа экологически безопасных препаратов для растениеводства

Собственные исследования.

2 Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Микробиологические среды.

2.3 Скрининг эндофитных бактерий с комплексной биологической ^ активностью.

2.4 Выделение эндофитных бактерий из растений, выросших в ^ тепличных условиях.

2.5 Выделение чистых культур бактерий рода ЯЫгоЫит.

2.6 Идентификация штаммов по биохимическим свойствам.

2.7 Оценка антагонистической активности.

2.8 Оценка ростстимулирующего эффекта у бактериальных изолятов

2.9 Определение видовой принадлежности бактерий методом секвенирования гена 16S рРНК.

2.10 Трансформация штамма Serratia sp.

2.11 Изучение динамики колонизации тканей и поверхности корня растения гороха трансформированным штаммом Serratia sp. с 39 помощью конфокального и флуоресцентного микроскопа.

2.12 Методика полевых экспериментов.

2.13 Агрометеорологические условия вегетации гороха.

2.14 Статистическая обработка результатов.

3 Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1 Комплексная биологическая активность бактерий Rh. leguminosarum bv. viceae из клубеньков гороха.

3.2 Характеристика бактериальных эндофитов корней гороха и их ^ влияние на бобово-ризобиальную симбиотическую систему.

3.2.1 Характеристика свойств эндофитных бактерий in vitro.

3.2.2 Влияние предпосевной инокуляции семян изолятами эндофитных бактерий на симбиотический аппарат и продуктивность растений 54 гороха.

3.3 Эндофитные бактерии в клубеньках гороха и их свойства.

3.3.1 Характеристика неризобиальных бактерий, выделенных из клубеньков.

3.3.2 Идентификация бактерий методом секвенирования гена 16S рРНК

3.3.3 Доказательство эндофитной природы штамма Entl6 с помощью ^ трансформации вектором, несущим ген gfp.

3.3.4 Взаимоотношения изолятов ассоциации клубенька и эндофитов

Влияние инокуляции эндофитными штаммами бактериальной ассоциации клубенька корней гороха на рост, развитие и 83 продуктивность растений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эндофитные бактерии растений гороха как активный компонент бобово-ризобиальной симбиотической системы"

Актуальность темы.

Напряженность проблем продовольственной и экологической безопасности, энерго- и ресурсосбережения вызывает необходимость широкого внедрения в сельскохозяйственное производство методов, дружественных окружающей среде. Одним из важных условий создания экологически сбалансированных систем растениеводства является восстановление утраченных в результате искусственного отбора и длительного окультуривания почв симбиотических связей между главными компонентами агроэкосистемы - растениями и микроорганизмами. Раскрытие механизмов функционирования этих взаимоотношений позволило бы сформировать цельную стратегию экологически устойчивого растениеводства, основанную на замене агрохимикатов (азотных удобрений, пестицидов) микробными препаратами комплексного действия, способными снизить значительные вложения энергии в агроэкосистему за счет большей пластичности растений к неблагоприятным факторам окружающей среды [Жученко, 2008].

Растительный организм представляет собой своеобразную субсистему, организующую целостное сообщество микроорганизмов, выполняющих множество значимых для хозяина функций. Поддерживая на поверхности своих органов, в тканях и клетках микробный консорциум, отдавая ему часть своих ресурсов, растения дополняют свое свойство автотрофно связывать углерод способностью симбиотрофно фиксировать молекулярный азот. Благодаря микроорганизмам растения иммобилизуют труднодоступные источники минерального питания, защищаются от болезней, фитофагов и абиотических стрессов. Стратегия симбиотических (кооперативных) адаптаций является не менее, а может быть даже более распространенной в живой природе, чем стратегия индивидуальных (автобиотических) адаптаций [Тихонович, Проворов, 2009].

В настоящее время детально на молекулярном и биохимическом уровне исследованы взаимоотношения между партнерами бобово-ризобиального симбиоза, эндо- и экзомикоризы, а также экологическая роль ассоциативных бактерий, обитающих в ризосфере и ризоплане растения. Менее изученным является симбиоз неклубенькообразующих эндофитных бактерий. Если наличие мутуалистической эндомикрофлоры кишечника животных является для всех привычным явлением, то существование таких эндофитных бактерий долгое время рассматривалось только с позиций явного или латентного паразитизма. Позже было дано определение эндофитов как бактерий, которые населяют внутренние ткани растений без нанесения вреда хозяину [Hallmann J. et al., 1997]. Лишь в последнее десятилетие активное изучение этого симбиоза выявило огромное разнообразие бактерий, многие из которых можно отнести к мутулистическим. К 2006 г. список известных бактерий-эндофитов включал 219 видов, относящихся к 71 роду [Hallmann J., Berg G., 2006]. Выяснилось, что многие эндофитные бактерии обеспечивают защиту растения от болезней [Cho C.J. et al., 2003; Недорезков B.B., 2003; Ziedan E.H.E., 2006; Berg G. et al., 2008; Chen X.-H. et al., 2009], способны к азотфиксации [Reinhold-Hurek В. and Hurek T. 1998; Gyaneshwar P. et al., 2001; Kuklinski-Sorbal J. et al., 2004], продукции фитогормон-подобных соединений [Long H.H. et al., 2008; Широких A.A. и др., 2008; Jha P., Kumar A., 2009; Palaniappan P. at al., 2010], стимулированию клубенькообразования на корнях растений [Bai Y. et al., 2003; Lee K.D. et al., 2005].

Все перечисленные свойства эндофитных бактерий рассматриваются в контексте перспективы разработки на их основе биопрепаратов для повышения продуктивности и устойчивости растений. Уже широко применяются микробные средства биофунгицидного действия: например,

Интеграл, Фитоспорин на основе Bacillus subtilis [Широких A.A., 2008],

RhizoStarR на основе Serratia plymuthica [Berg G., 2008]. Вместе с тем вопросы о совместимости эндофитных бактерий с ризобиями мало изучены, 6 хотя объединение свойств азотфиксирующей, рострегулирующей и биоконтрольной функций микробного сообщества эндофитных бактерий является ценным с хозяйственной точки зрения. Кроме того, понимание механизмов этих взаимоотношений и их экологической роли является важным для развития наших знаний о микробно-растительных симбиозах. Цель исследования:

- в бобово-ризобиальной симбиотической системе оценить роль эндофитных бактерий из корней гороха {Pisum sativum L.) как потенциальной основы микробиологических препаратов для растениеводства. Задачи исследования.

1 Выделить бактериальные эндофиты из внутренних тканей корней гороха и оценить их фунгистатическую активность по отношению к основным грибным фитопатогенам, вызывающим корневые гнили, а также способность регулировать рост растений.

2 Определить характер взаимоотношений эндофитов с бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viceae in vitro.

3 Получить штамм эндофитной бактерии с репортерным геном gfp и изучить возможные пути проникновения эндофитов в ткани корня гороха.

4 Выявить штаммы эндофитов, перспективные в качестве основы препаратов для повышения продуктивности растений гороха и их устойчивости к корневым гнилям.

5 Оценить эффективность применения экспериментальных препаратов для повышения семенной продуктивности гороха и защиты растений от корневых гнилей.

Научная новизна.

Установлено, что бактериальные эндофиты корня гороха являются широко распространенными компонентами растительно-микробного сообщества, способными активно влиять на формирование бобоворизобиального симбиоза, устойчивость макросимбионта к корневым гнилям и его продуктивность. Показано, что такими свойствами обладают как отдельные бактериальные штаммы, так и их ассоциации, населяющие клубеньки, а также другие органы растений гороха. С помощью рекомбинантного штамма Serratia sp. с геном зеленого флуоресцирующего белка выявлены способность этой бактерии заселять внутренние ткани корня растения гороха и её локализация в них. Выделены и охарактеризованы новые эндофитные штаммы бактерий Rh. leguminosarum bv. viceae, а также родов Pseudomonas и Serratia с хозяйственно полезными свойствами. Практическая значимость работы.

Полученные результаты расширяют представления о составе симбиотических сообществ гороха с бактериальными эндофитами и процессах их формирования, что повышает эффективность поиска новых штаммов бактерий в качестве основы микробиологических препаратов для растениеводства. Выделены новые штаммы Rh. leguminosarum bv. viceae B2, Rhl6, Serratia sp. Entl6, эффективно повышающие урожайность растений гороха, а также их устойчивость к корневым гнилям. Выделен новый штамм Serratia sp. Entl6, который по совокупности свойств является перспективным в качестве основы биопрепарата для растениеводства. Получен его трансформированный мутант с геном зеленого флуоресцирующего белка, пригодный для изучения мутуалистических взаимоотношения этих бактерий с растениями гороха. Положения, выносимые на защиту:

1 Во внутренних тканях растений гороха распространены эндофитные штаммы бактерий с комплексной биологической активностью по отношению к бобово-ризобиальной симбиотической системе.

2 В клубеньках корней гороха встречаются многовидовые бактериальные ассоциации, способные мутуалистически сосуществовать с бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viceae.

3 Штамм Serratia sp. Entl6 является эндофитным и способен позитивно влиять на рост и развитие растения-хозяина, стимулировать формирование симбиотической системы гороха с ризобиями и повышать продуктивность растений.

4 Новые штаммы Rh. leguminosarum bv. viceae. Rh 16 и Serratia sp. Entl6 могут служить основой для производства микробиологических препаратов с целью повышения урожайности зерна гороха.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены и доложены на: Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов,

2007); IV молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов «Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы» (Уфа,

2008); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 18 работ, из которых 4 статьи - в журналах, указанных в перечне ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), собственных исследований (2-х глав), выводов, списка литературы (299 источников, из них 66 отечественных и 231 зарубежных). Диссертация изложена на 124 страницах, содержит 12 рисунков и 22 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гарифуллина, Динара Вакилевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение взаимоотношений между растениями и микроорганимами -одно из активно развивающихся направлений современной биологии. Эти вопросы объединяют предмет и методы исследований разных отраслей биологии - микробиологии, экологии, физиологии и биохимии растений, генетики, эволюционного учения и др. Есть мнение, что данная область знания может быть вычленена в самостоятельную биологическую науку — симбиологию [Seckbach D., 2002], в которой уже сформировалось отдельное направление - симбиогенетика [Тихонович И.А., Проворов H.A., 2009].

Эндофитные бактерии, активно изучаемые в настоящее время, привлекают внимание ученых не только перспективой их хозяйственного использования в практике экологически чистых биотехнологий растениеводства. Раскрывая роль эндофитных бактерий в эволюционном и экологическом континууме микробно-растительных отношений широкой и узкой специализации, а также разной степени факультативности и облигатности, познавая механизмы взаимодействия макро- и микросимбионтов, мы расширяем наши представления о вариантах коадаптации различных видов в сообществах, что имеет важное фундаментальное значение.

Хорошо изученными эндофитами являются клубенькообразующие азотфиксаторы бобовых растений, для гороха - это представители Rhizobium leguminosarum bv. viceae. Однако в последнее десятилетие в качестве мутуалистических не образующих клубеньки внутренних обитателей бобовых растений выявлено более 200 видов бактерий, описанных ранее как поверхностные ризосферные микроорганизмы [Hallmann J., Berg G., 2006]. Одновременно выяснилось, что ризобии являются эндофитами не только бобовых, но и других видов растений, выполняя функции ростстимулирующих ризобактерий без образования клубеньков [Guiterries

В свете новых представлений о бобово-ризобиальном симбиозе и потребностей активизации полезных симбиотических связей в селькохозяйственных экосистемах нами была поставлена цель - изучить экологическую роль эндофитных бактерий в симбиозе с растениями гороха. И первым этапом исследований была оценка у Rhizobium leguminosarum bv. viceae общих с ростстимулирующими ризосферными бактериями свойств -способности активировать рост корней и подавлять развитие грибных патогенов in vitro. Выяснилось, что из 8-и выделенных из местных почв штаммов ризобий 6 штаммов проявили антагонизм к разным фитопатогенным грибам, 3 штамма - ростимулирующий эффект и один штамм сочетал эти свойства. Обнаруженные свойства ризобий согласуются с другими исследованиями [Vargas Р.A. et al., 2009]. Однако, в системе ш planta в полевых условиях это свойство, по-видимому, не имело селективного преимущества и соответственно, не коррелировало с продуктивностью растений. Это еще раз свидетельствует о том, что основной вклад в продуктивность бобовых растений при инокуляции ризобиями обеспечивается за счет их способности к биологической азотфиксации. Следовательно, дополнительные микробные эффекты, влияющие на устойчивость и рострегуляцию растений, могут быть достигнуты путем создания разновидовых бактериальных комбинаций в консорции с растением-хозяином.

При инокуляции клубеньковыми бактериями местной селекции был найден перспективный штамм RhB2, который в различных экологических условиях способствовал увеличению клубенькообразования, снижению заболеваний корневыми гнилями и повышению семенной продуктивности растений гороха (на 25 % в оптимальных по влагообеспеченности условиях и на 12 % при сильном водном стрессе) по сравнению неинокулированным

90 контролем и эталонным штаммом Rhizobium leguminosarum bv. viceae 1078. Однако в поисках бактерий для мультифункционального биопрепарата наше внимание было обращено к выяснению экологической роли сообщества неризобиальных эндофитов корня гороха.

Среди псевдомонадной группы бактерий, обитающих в зоне корня, обнаружено множество потенциальных антагонистов фитопатогенов с выраженной способностью усиливать рост корней, что косвенно указывает на продукцию этими бактериями фитогормон-подобных веществ. В корневой шейке отмечено наибольшее видовое разнообразие бактерий, оцененное по количеству мофотипов клеток и колоний. Это вызывает предположение о преимущественном обитании эндофитов группы псевдомонад в сосудах растения и ограничении хозяином распространения бактерий по другим тканям. При изучении путей проникновения эндофитного штамма Entl6 это предположение было подтверждено визиуализацией в сосудах меченых зеленым флуоресцирующим белком GFP бактерий под конфокальным микроскопом.

Лучшие по ростстимулирующим свойствам и фунгицидной активности штаммы псевдомонадной группы испытывали в полевых условиях. В экологических условиях крайнего дефицита влаги четыре коллекционных штамма стимулировали клубенькообразование аборигенными ризобиями, практически все обработки привели к снижению распространения корневых гнилей, но только один штамм 6Ш способствовал увеличению семенной продуктивности. Возможно, по причине неблагоприятного абиотического фактора вклад коллекционных эндофитных бактерий группы псевдомонад оказался недооцененным. Но причиной не выраженного мутуалистического эффекта мог служить и биотический фактор - отсутствие в бактериальном инокулюме ризобиального компонента, как это было показано в других исследованих [Sturz A.V. et al., 1997], играющего, по-видимому важную сигнальную и регулирующую роль для реализации мутуалистического влияния эндофитных бактерий. В этой связи нам представлялся перспективным поиск природных бактериальных сообществ ризобий с их естественными спутниками, попавшими в клубенек в природных условиях агроценоза.

Из растений гороха, выросших в поле, было протестировано 120 изолятов клубеньков и выявлено, что каждый третий изолят проявлял невысокую фунгистатическую и ростстимулирующю активность, каждый пятый - стимулировал рост тест-растений рапса. Но изоляты клубеньков представляли собой многовидовые сообщества бактерий, которые при пересевах и хранении на средах меняли свой состав. В отсутствие растения-хозяина в результате конкурентного исключения из сообществ были элиминированы ризобии и преобладали преимущественно спорообразующие бактерии с высокой антагонистической активностью. Одна из ассоциаций 416, сохранившая исходный состав и свойства, была изучена более детально.

Методами физиолого-биохимических и генетических исследований был определен видовой состав ассоциации: Rhizobium leguminosarum bv. viciae, Pseudomonas sp., Serratia sp., Bacillus sp. Пространственная экологическая ниша эндофитного штамма Serratia sp. Entl6 была изучена с помощью RAPD-анализа реинокулянтов клубеньков растений, обработанных исходным штаммом, а также с помощью визуализации на конфокальном микроскопе трансгеномного деривата штамма Entl6, снабженного репортерным геном GFP. Внедряясь через примордия боковых корней, штамм Entl6-gfp, оказывался в сосудах растения гороха. Предполагается, что в клубенек этот штамм проникал по апопласту, а излишки численности этих бактерий, возможно, удалялись растением-хозяином через сосуды.

В результате изучения взаимных антагонистических отношений было выяснено, что штамм Serratia sp. Entl6 в слабой степени подавлял рост Rhizobium leguminosarum bv. viciae Rh 16, что не мешало сохраниться обоим штаммам в ассоциации при хранении и проявлять мутуалистические свойства в системе in planta при инокуляции. После оценки безопасности штамма Entl6 и подбора оптимальной ростстимулирующей численности бактерий для внесения на семена, комбинированный биопрепарат из штаммов Rhl6+Entl6 испытывали в полевых условиях. Три вегетационных сезона в различных почвенно-экологических условиях указанный препарат способствовал повышению урожая семян на 15-23 % по сравнению с необработанным контролем. Положительный эффект на продуктивность растений сопровождался увеличением количества клубеньков и снижением заболеваемости корневыми гнилями. Эффективность биопрепарата была подтверждена в производственных испытаниях 2009 г. в Илишевском районе Республики Башкортостан.

Таким образом, наши исследования показали перспективность использования эндофитных бактерий в качестве основы биопрепарата для повышения продуктивности и устойчивости гороха.