Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика накопления флавоноидов в онтогенезе районированных в Орловской области сортах гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Moench)

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Динамика накопления флавоноидов в онтогенезе районированных в Орловской области сортах гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Moench)"

На правах рукописи

ст^^

Полехина Наталья Николаевна

ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ РАЙОНИРОВАННЫХ В ОРЛОВСКОЙ ОБЛАСТИ СОРТАХ ГРЕЧИХИ ПОСЕВНОЙ (Га^оругитсхси1епШт М.)

Специальность 03.01.05 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013 005540819

Воронеж — 2013

005540819

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Павловская Нинэль Ефимовна

Официальные оппоненты: Корнеева Ольга Сергеевна

доктор биологических наук, профессор Воронежский государственный университет инженерных технологий, кафедра биохимии и биотехнологии, заведующая

Федорин Дмитрий Николаевич

кандидат биологических наук, Воронежский государственный университет, кафедра биохимии и физиологии клетки, доцент

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский институт растениеводства им. Н. И. Вавилова Россельхозакадемии

Защита состоится « 20 » декабря 2013 года в 13 час. 30 мин на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан «19» ноября 2013 г.

Ученый секретарь Л .

диссертационного совета ^//¿^(^О' Брехова Любовь Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Состояние пониженной функциональной активности живых организмов, обусловленное факторами среды (низкая или высокая температура, отсутствие влаги и другие стрессоры), при сохранении их высокой жизнеспособности после восстановления нормальных условий жизнедеятельности и возобновления активной деятельности всех его функциональных систем определяется их адаптационными механизмами, заложенными в физиологических, молекулярно-генетических и биохимических особенностях растительного организма.

Действие приспособительного потенциала на биохимическом уровне проявляется с участием белков и функционально активных молекул в регуляции метаболических процессов.

Полифенольные соединения являются одними из наиболее распространенных представителей вторичного метаболизма в тканях высших растений. Они участвуют в основных процессах жизнедеятельности растительных клеток: дыхании, фотосинтезе, формировании клеточных стенок, защищают растение от действия стресс-факторов абиотического и биотического происхождения [Запрометов, 1993, 1996].

Растительные полифенолы находят широкое практическое применение. Они используются в пищевой промышленности, а благодаря высокой биологической активности, как лекарственные средства с нейрорегуляторными, капилляроукрепляющими, иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами в медицине [Куркин и др., 2003, 2004, Барабой, 1984, Weinreb et al., 2008; Antonio, Druse, 2008].

В последние десятилетия внимание исследователей обращено на растения, характеризующиеся высокой способностью к образованию вторичных веществ, относящихся к полифенольным соединениям рода Fagopyrum Mili, вид Гречиха обыкновенная - Fagopyrwn esculentiim Moench. [Комисаренко, 1973]. Наряду с их типичным представителем вторичного метаболизма рутином в растениях гречихи были обнаружены такие продукты, как хлорогеновая кислота, изокверцетрин, никотифлорин, кверцетин [Анисимова, 2010].

Известно, что накопление рутина является одним из определяющих факторов продуктивности и устойчивости растений гречихи посевной [Клыков, 2000], но остается открытым вопрос по изучению механизмов регуляции накопления не только рутина, но и всего комплекса полифенольных соединений, называемых в дальнейшем флавоноидами. Кроме того, наблюдается взаимосвязь накопления флавоноидов и антоцианов в различных органах гречихи посевной с работой окислительно-восстановительных ферментов растения гречихи посевной в процессе онтогенеза районированных сортов Орловской области. Однако недостаточно изученными являются биохимические механизмы регуляции и

метаболические пути роста и развития растений гречихи посевной, обеспечивающие высокую жизнеспособность растений и причины, вызывающие процесс накопления флавоноидов в процессе онтогенеза. Исследование биосинтеза флавоноидов и антоцианов в растительных тканях позволяет определить пути адаптации растений к неблагоприятным условиям среды и понять физиолого-биохимические механизмы их устойчивости. Поэтому исследование накопления флавоноидов и антоцианов в комплексе имеет большое теоретическое и практическое значение. Познание механизмов регуляции биосинтеза физиологически активных соединений является актуальным в связи с перспективой практического использования растительных объектов с целью получения важных для народного хозяйства метаболитов, получения высоковитаминных растительных продуктов, кормовых добавок для интенсивного животноводства, обладающих высоким фармакологическим и медицинским эффектом. В перспективе растения, обладающие высоким уровнем пигментов, могут быть использованы для генноинженерного конструирования растений с высокой адаптивной и иммунной способностью.

Эндогенный уровень антоциановых пигментов может являться эффективным показателем физиологического состояния клеток растительных организмов, тканей и растительных экосистем в целом. Содержание антоцианов может служить тестом, характеризующим степень стресс-устойчивости растения, что важно для выведения новых сортов.

Изучение механизмов накопления флавоноидов в ходе роста и развития растения с учетом сортового разнообразия, с их локализацией, качественным составом и с потенциалом флавоноидов в защите растений от вредителей и болезней других сельскохозяйственных культур, является актуальным.

Цель и задачи. Целью работы являлось исследование накопления флавоноидов в разных сортах гречихи посевной в процессе онтогенеза и исследование антиоксидантного действия комплекса полифенольных соединений. Задачи:

1. Выявить качественный состав, содержание и локализацию флавоноидов комплекса полифенольных соединений гречихи посевной Fagopyrum ехси1еп1ит М

2. Установить динамику накопления флавоноидов по фазам развития растения гречихи посевной (всходы, ветвление, бутонизация, цветение, плодоношение)

3. Определить динамику накопления флавоноидов по органам гречихи посевной

4. Провести характеристику физиолого-биохимических показателей сортов гречихи посевной по фазам онтогенеза с учетом накопления полифенольных соединений

5. Обосновать практическую значимость флавоноидов и антоцианов

Научная новизна. Впервые проведена оценка качественного и количественного состава флавоноидов и антоцианов районированных сортов гречихи посевной Орловской области в зависимости от физиолого-биохимического состояния растения и активности супероксиддисмутазной ферментной системы. Проведена оценка содержания полифенольных соединений, флавонолов и антоцианидинов в различных органах и периодах онтогенеза. Установлена динамика накопления флавоноидов гречихи посевной в зависимости от физиолого-биохимических особенностей сортов исследуемых растений.

Практическая значимость. Выявлено селекционно-хозяйственное значение динамики накопления флавоноидов и антоцианов для выведения более адаптированных сотов гречихи посевной Орловской области. Проведена токсикологическая оценка флавоноидов и антоцианов гречихи посевной, как природных антиоксидантов, с возможностью их применения в промышленном животноводстве в качестве биологически активного вещества. Разработан стимулятор роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Отдельные положения работы могут быть использованы в преподавании курсов органической химии и химии биологически активных веществ, при проведении занятий по биохимии и основам биохимии и молекулярной биологии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Флавоноиды гречихи посевной представлены О-гликозидами и агликонами кверцетина, цианидином и его гликозидами, хлорогеновой кислотой с локализацией гликозидов в листе и цветке растения, агликонов - в стебле и корне.

2. Динамика накопления флавоноидов гречихи посевной (Fagopyrum esciilentiim) находится в зависимости от активности антиоксидантной системы растения на начальных этапах онтогенеза и мощности пула системы первичного метаболизма.

3. Флавоноиды и антоцианы, выделенные из гречихи посевной, обладают гепатопротекторными и ростостимулирующими свойствами.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на заседании ученого совета ФГБОУ ВПО «ОрелГАУ»; на конференциях: Материалы второго съезда общества биотехнологов России (2004 г.); Материалы научно-методической конференции «Физиологические аспекты продуктивности растений» (2004 г.); Proceeding of the 9th International Symposium on Buckwheat / Congress Centre, University of Agriculture, Prague (2004 г.); Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых 19-22 апреля 2011 «АПК в современном мире: взгляд

научной молодежи» (2011 г.); III Международной интернет-конференции 5 апреля 2010 к 35-летию ОГАУ: «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (2010 г.); Международной научно-практической конференции /Новосибирский государственный аграрный университет.- Новосибирске (2011 г); IV Международной заочной научно-практической конференции 30 мая 2011 г. «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (2011 г.); V заочной научно-практической Интернет-конференции 2 апреля 2012 « Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (2012 г.); региональной научно-практическая конференции молодых ученых 17-18 апреля 2012 «Современный агропромышленный комплекс глазами молодых исследователей» (2012 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в т.ч. 3 в журналах рецензируемых ВАК РФ, Патент РФ №2483105.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 136 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, заключения, приложения, списка литературы, включающего 181 источник. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 52 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационная работа выполнена в период с 2003-2012 г.г. в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса Российской Федерации», приоритетное направление «живые системы», пункт 6 «клеточные технологии», утвержденной президентом РФ от 11 июля 2011г.

Объекты исследования. Исследованию подвергались сорта, районированные в Орловской области селекции ВНИИ ЗБК: детерминантный скороспелый — Темп, детерминантные среднеспелые - Дикуль, Деметра, Дождик, Диалог, детерминантный позднеспелый сорт — Дизайн и индетерминантные среднеспелые сорта - Молва и Баллада, перспективный сорт Дружина, а также сорт селекции Башкирского НИИСХ - Башкирская красностебельная. Лабораторный опыт проводился на водных культурах путем выращивания в программируемой климатокамере "Фитотрон" (производства компании Вюкот) при температуре 25°С и освещенности 35 люкс.

Проращивание семян проведено в рулонах фильтровальной бумаги по ГОСТ — 12038-84. Лабораторные исследования проводились в трехкратной повторности.

Полевые опыты поводились на базе ВНИИ ЗБК. Посев осуществляли селекционной сеялкой СКС-6-10 на делянках площадью 10 м2 под каждый сорт в четырехкратной повторное™ широкорядным способом.

Использовалась общепринятая в данной зоне агротехника. Уборку проводили комбайном «Сампо-130». Химические средства защиты растений не использовали.

Биохимические исследования проводилась на базе «Орловского регионального биотехнологического центра сельскохозяйственных растений» и кафедрах биотехнологии и химии ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет».

Методы исследования. Выделение и анализ флавоноидов и антоцианов проводился по А.И. Ермакову. Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.1) была использована модифицированная методика [Giannopolities and Ries, 1977] с использованием фотореактора [Гринблат, 2007]. Активность малонового диальдегида определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой при высокой температуре в кислой среде (Орехович В.Н., 1997.) Для определения качественного состава флавоноидов использован Милихром-4-УФ, с обращено-фазной колонкой КФХ 6-80-4, сорбент Сепарон С18, элюент ацетонитрил и ТФУ (35:65). Смесь в количестве 100 мкл наносилась в элюенте. Удерживаемый объем колонки 80x2 1000-1300 мкл.

Статистическая обработка данных. Лабораторные опыты проводили в 3 кратной биологической повторности. Достоверность экспериментальных данных оценивали методами математической статистики с привлечением современных программных средств с помощью приложений Microsoft Office Word 7 и Excel 7 для Windows 7.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ ГРЕЧИХИ ПОСЕВНОЙ

Оценка качественного состава флавоноидов гречихи посевной проводилась методом тонкослойной хроматографии по оригинальной методике (Анисимова,2010).

На хроматограмме обнаруживается доминирующее пятно рутина с величиной Rf 0,4, а также и другие пятна веществ. В частности, пятно фиолетового цвета с величиной Rf 0,19 - хлорогеновая кислота, с величиной Rf 0,6 — изокверцитрин, с величиной Rf - 0,45 никотифлорин, с величиной Rf - 0,78 кверцетин, красное пятно антоциана и ряд пятен не идентифицировано.

На основе результатов хроматографического исследования вегетативной массы растения выявлено присутствие рутина, как целевого компонента, во всех сравниваемых сортах гречихи посевной. Флавоноидный состав, обнаруженный в листьях, является наиболее разнообразным.

Наибольшая разнообразность флавоноидов выявлена в листьях и цветках сорта Дизайн.

Полученные фракции элюировали и подвергали обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе «Милихром-4-УФ», колонка 2x80 мм, сорбент Сепарон С-18 с использованием элюента ацетонитрил:трифторуксусная кислота. Расход элюента — 80 мкл/мин. При анализе использовались стандарты: кверцетин, цианидин хлорид и хлорогеновая кислота. Пик 1 соответствовал цианидину, пик 2- хлорогеновой кислоте, пик 5- кверцетину (рис. 1, рис. 2).

А, е.о.п

10,0'' 8,0 6,0 4,0: 2,0

Ш, нм 220 260 310 358

0.0-

10

15

20

■;Т. мин

пик 1- цианидин, пик 2-хлорогеновая кислота,

пик 3, 4,6 - не идентифицированы, пик 5 — кверцетин. Рис. 1 Хроматограмма экстрактов стебля и корня гречихи посевной

А, е.о.п'.'.....-

1,6] 1.4]

И 1,0-]

0,8]

0,6-1

0,4]

0,2-|

0.04—-0

Ш ! т

т. !

та

I \ V!

1 V

2

рЛ*. нм :220 [260 1358

Т. мин

10

12

14

16

18

Пик 1 - 3-рутинозид кверцетина Рис.2 Хроматограмма экстрактов цветков и листьев гречихи посевной

Известно, что гликозиды содержатся в вакуолях, а агликоны и метоксилированные соединения в периплазматическом пространстве клетки [Алехина, Балнокин, Гавриленко, 2005]. В ходе исследования было выявлено,

что в растении гречихи посевной флавоноиды накапливаются в разных органах растения в зависимости от его типа.

Анализ экстрактов из стебля и корня гречихи посевной показал содержание в них цианидина, кверцетина, относящихся по своему молекулярному строению к агликонам. Тогда как экстракты листьев и цветков содержали их гликозидные формы — антоцианы и 3-рутинозид кверцетина (рутин). В отношении локализации рутина в растении гречихи отмечено, что в листьях его содержание больше, чем в других частях растения. Листья и цветки вместе содержат в среднем от 63,2 до 76,5% всего рутина растения, а стебли - от 7 до 15,7%, корни - от 1,7 до 5%, в зависимости от сорта гречихи, что согласуется с предыдущими исследованиями [Клыков, 2000, Горькова. 2002, Анисимова, 2012,].

Таким образом, гликозиды флавоноидов располагаются в цветках и листьях растения гречихи посевной, агликоны флавоноидов локализованы в стебле и корне, как и более простые соединения полифенольной природы.

Для всех растений характерно распределение пигментов цианидинового ряда следующим образом: глюкозиды — в цветках и листьях; пигменты, лишенные углеводистых остатков — в стебле и незначительное количество содержится в корне растения. Это связано с ферментативными изменениями в растении на стадиях преобразования дигидрофлавонолов: для большинства характерен переход дигидрокемпферол—>дигидромирицитин, но у гречихи преобразование идет в направлении дигидрокверцетина и в дальнейшем - цианидина (рис. 3).

1,0

0,8

0,6

нм

220 260 1310 ¡358

0,4 !

0,2!

0,0:;

0

10

----'ГГ. мин

1 - Цианидин

Рис.3 Хроматограмма экстракта антоциана из гречихи посевной Таким образом, для всех районированных сортов гречихи посевной Орловской области характерно наличие только одного антоциана -цианидина. Наличие единого красящего пигмента является таксономическим признаком рода Fagopyrum. Таксономическая специфичность растительных пигментов помогает в решении вопросов систематики растений Пасешниченко, 2001].

НАКОПЛЕНИЕ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТЕНИЯХ ГРЕЧИХИ ПОСЕВНОЙ

Содержание рутина в надземной массе Р. еэспкаШт находится в зависимости от продолжительности светового периода и количества осадков. В условиях Дальнего Востока фаза массового цветения гречихи отмечена максимальным накоплением рутина [Клыков, 2013].

В условиях Орловской области установлена нарастающая динамика полифенольных соединений (ПФС) от вегетативного до генеративного периода онтогенеза. Анализ содержания ПФС показывает, что по мере роста гречихи концентрация ПФС в вегетативной массе возрастает (фазы всходы, ветвление, бутонизация), достигая максимума в фазу цветения и начала плодоношения, а далее постепенно уменьшается по мере завязывания плодов (фаза плодоношения) (рис. 4).

Наибольшее содержание полифенольных соединений в фазу плодоношения выявлено у среднеспелых детерминантных сортов гречихи Диалог - 2446,5 мг/г сухой массы, Дружина — 2497,8 мг/г сухой массы, Деметра - 2282,1 мг/г сухой массы (в среднем на растение).

У скороспелых индетерминантных сортов гречихи посевной процесс накопления ПФС происходит по нарастающей, достигая своего максимального значения в фазу цветения - начала плодоношения. Скороспелый сорт гречихи Темп (40 суток) в фазу цветения накапливает ПФС - 946,8 мг/г сухой массы (в среднем на растение).

В ходе изучения полифенольных соединений в динамике выявлено, что наибольшее содержание ПФС встречается в цветках и листьях растения гречихи посевной, а наименьшее - в стеблях и корнях. Однако, в фазу бутонизации, при усиленном накоплении полифенольных соединений, органами накапливающими ПФС являются листья растения. Особенно выделяются районированные индетерминантные сорта гречихи Молва — 166,8 мг/г, Баллада - 164 мг/г, зеленоцветковый сорт гречихи Дизайн - 170,3 мг/г и сорт-стандарт Дикуль - 186,3 мг/г сухой массы.

Эти же сорта гречихи имеют повышенный уровень содержания ПФС в корнях растений в фазу бутонизации по сравнению с другими сортами гречихи. Такое соотношение связано с изменением физиолого-биохимического состояния растения при переходе в генеративный период онтогенеза. Для фазы бутонизации характерно усиление термогенеза, вызывающего повышение температурного режима генеративных органов. С этим связано повышение количества активных форм кислорода, гашение которых обеспечивается флавоноидами.

25 20 i 15 10

И корень я стебель а лист

□ кореш. ШЗ лист

4 5 6 Сортп

я стебель ЕЭ цветок

В

О кореш.

г- юоо

ООО S00 з "00 § 600 ,£ 500 .и 400 £ 300 3 200 100 о

1 2 3 4 5 6 Сорта

Рисунок 4 - Динамика накопления полифенольных соединений гречихи посевной в онтогенезе (2009-2013 г.г.), (n=5; Р <0,05).

Фазы онтогенеза: а - всходы, б - бутонизация, в-цветение, г - плодоношение. Сорта гречихи: 1-Башкирская красностебельпая, 2-

Темп,3- Дружина, 4- Дизайн, 5-Диалог, 6- Деметра, 7- Дождик, 8-Дикуль, 9-Молва, 10-Баллада

Í ........

S 5 i

i.....

и Í I.J Л i J

Результаты анализа локализации свидетельствуют, что сорта гречихи в фазу бутанизации, имеющие обратное соотношение содержания ПФС в корнях и бутонах (сорт Диалог корень: бутоны - 32,8:18,8 мг/г), или практически равное (сорт Дружина) в фазу начала плодоношения лидируют по накоплению ПФС в листьях и цветках.

Таким образом, образование и накопление полифенольных соединений является динамическим процессом, изменяющимся в онтогенезе растения гречихи посевной, зависит от активности физиолого-биохимических процессов в растениях разных сортов гречихи посевной на ранних этапах онтогенеза.

По накоплению флавоноидов имеют преимущество сорта гречихи посевной в период массового цветения - начала плодоношения: Молва -28,21 мг/г, Баллада - 23,78 мг/г. (индетерминантные); Диалог - 27,77 мг/г, Дождик - 24,7 мг/г, Дикуль -25,2 мг/г (детерминантные) (табл.1). Эти сорта отличаются одновременно высоким уровнем накопления как флавоноидов, так и всего комплекса полифенольных соединений (Табл. 1.).

Таблица 1.

Содержание флавоноидов в среднем за 2004-2006 г.г. _(с доверительной вероятностью р<0,05);_

сорт Соцветие, мг/г Стебель, мг/г Лист, мг/г

(Сумма ф+а) * (Сумма ф+а)* (Рутин)

Аромат 12,76±0,23 1,81±0,36 3,83±0,35

Диалог 18,90±1,24 3,93±0,62 4,94±0,60

Молва 14,81±0,31 8,21±0,21 5,19±0,65

Дождик 18,54±0,71 4,73±0,82 1,43±0,26

Баллада 18,58±0,33 2,99±0,39 2,21±0,41

Деметра 6,89±1,19 2,36±0,62 3,25±0,51

Скороспелая 86 9,89±0,73 2,80±0,32 2,25±0,36

Дикуль 12,52±0,81 5,51±0,33 7,58±0,28

*ф+а=сумма флавонолов и антоцианов

Следовательно, накопление полифенольных соединений и флавоноидов, в частности рутина, взаимосвязано и зависит от функционирования биосинтетического аппарата и активности ферментативной системы растения на ранних этапах онтогенеза.

Изучение динамики накопления полифенольных соединений в проростках гречихи посевной

Имеющиеся на сегодняшний день данные о роли полифенольных соединений в жизнедеятельности растений еще неполны и противоречивы, что связано с исключительным разнообразием этих соединений [Запрометов,

1993]. До сих пор недостаточно изучены вопросы о роли полифенолов в защите растений от ряда неблагоприятных факторов внешней среды, в частности от повышения концентрации активных форм кислорода, при этом наблюдается ответная реакция клеточного метаболизма на стресс. В то же время исследование данной проблемы необходимо, поскольку многие виды растений в процессе онтогенеза часто страдают от губительного действия низких температур, особенно гречиха при прорастании семян и в фазу всходов.

2 сутки 10 сутки 15 сутки 20 сутки

прорастания прорастания прорастания прорастания

фаза всходы фаза ветвление

Рис.5. Динамика накопления флавоноидов сорта Диалог на начальных этапах онтогенеза, мг/г .

Образование и накопление флавоноидов является динамическим процессом, изменяющимся в онтогенезе растения посевной, и зависит от многочисленных факторов. В ходе исследования выявлена корреляционная зависимость изменения содержания флавоноидов (флавонолов и антоцианов) в процессе онтогенеза гречихи посевной (0,81). В проростках гречихи сорта Диалог в период с 2 до 10 день содержание флавоноидов увеличилось с 0,97 до 2,17 мг/г, а к 15-му дню прорастания количество флавоноидов увеличивается на 0,83 мг/г. Синтез антоцианов в момент выхода растений на поверхность, увеличился в 18 раз. Проростки гречихи посевной сорта Диалог при прорастании содержат антоцианы в количестве 0,07 мг/г, а к 15-му дню прорастания происходит уменьшение количества антоцианов (1,1 мг/г). Содержание антоцианов с 15 по 20 день практически одинаково. Такая тенденция характерна для всех районированных сортов гречихи посевной с небольшим разбросом в количественном соотношении флавоноидов.

В результате исследования установлено, что уровень накопления флавоноидов в процессах прорастания изменяется в ходе онтогенеза и определяется регуляцией процессов трансформации растения в ходе

естественной приспособительной реакции на изменяющиеся условия окружающей среды.

ВАРЬИРОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СОРТОВ ГРЕЧИХИ ПОСЕВНОЙ И ВЗАИМОСВЯЗЬ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО

СОСТОЯНИЯ

В настоящее время практически отсутствуют публикации о роли различных групп низкомолекулярных соединений в функционирование клеточной антиоксидантной системы. Тогда как, флавоноиды в нормальных условиях участвуют в поглощении световой энергии, но и при стрессе являются частью фотозащитной и антиоксидантной систем.

Сложность изучения данной проблемы заключается в том, что усиление биосинтеза одного из низкомолекулярных соединений влечет за собой изменения в метаболизме в целом и перераспределение потребляемых субстратов при изменении энергетических затрат. В настоящее время мало изучено функционирование антиоксидантных ферментов и флавоноидов. Существует два пути адаптации растений: усиление активности антиоксидантных ферментов и второй путь — накопление низкомолекулярных метаболитов.

Поскольку флавоноиды локализуются в эпидермальных клетках, изучение динамики их содержания проводили в листьях, и в корнях гречихи посевной — органах, отличающихся накоплением рутина [Клыков, 2013]. Сравнительный анализ в вегетативный и генеративный периоды по уровню МДА, СОД и ПФС в корнях показал снижение накопления полифенольных соединений при снижении уровня МДА и повышении активности СОД. Такая тенденция прослеживается как в индетерминантных, так и детерминантных сортах гречихи посевной, (табл. 2).

Таблица 2

Уровень МДА, СОД и ПФС в органах гречихи посевной в фазу всходы. __(п=5, Р<0,05)_

Орган растення корень лист

Сорт СОД, ммоль/л МДА, мкмоль/л ПФС, мг/г СОД, ммоль/л МДА, мкмоль/л ПФС, мг/г

Баллада 7 8,2 3 12.35 2,8 9,1

Молва 14 9,6 5,7 17.29 0,8 7,5

Башкирская 14 2,2 17,4 17,29 4,8 7,4

Дизайн 7 1.3 9,9 19,76 6,9 13,7

Дикуль 42 5,6 14,6 14,82 1,3 12,7

Дождик 21 5 8 19,76 4,5 11.5

Деметра 14 0,1 8,6 32,11 16 18.3

Диалог 14 3,9 11,8 22,24 4,5 9,7

Темп 78,75 12.3 15,1 34.59 8,2 10,1

Дружина 70 0,6 15,7 17,29 3,9 11,3

В листьях накопление ПФС происходит при повышении активности СОД с одновременным увелшгением уровня МДА от вегетативного к генеративному периоду. Вегетативный период онтогенеза гречихи посевной, отличающийся низким накоплением флавоноидов, характеризуется низкой активностью СОД и высоким уровнем МДА. В индетерминантных сортах активность СОД от 12 до 17 ммоль/л в листьях и от 7 до 14 ммоль/л в корнях (р<0,05), уровень МДА от 3 до 5 мкмоль/л в листьях и 8,1 и 9,8 мкмоль/л в корнях (р<0,01); в детерминантных сортах активность СОД от 18 до 34 ммоль/л в листьях и от 8 до 77 ммоль/л в корнях(р<0,01) и уровень МДА от 3 до 18 в листьях и от 3 до 15 мкмоль/л в корнях (р<0,05). Сорта Темп и Дружина выделяются по накоплению ПФС в корнях (15,1 и 15,7 мг/г), что коррелирует с повышенной активностью СОД.

Генеративный период онтогенеза с интенсивным накоплением флавоноидов, характеризуется резким скачком активности СОД от 180 до 260 ммоль/л (р<0,05) и снижением уровня МДА в корнях, но с повышением уровня МДА в листьях (табл.3).

Таблица 3.

Уровень МДА, СОД и ПФС в органах гречихи посевной в фазу

массового цветения — начало плодоношения. (п=5, Р<0,05)

Орган растения корни лист

Сорт СОД ммоль/л МДА мкмоль/л ПФС мг/г СОД ммоль/л МДА мкмоль/л ПФС, мг/г

Баллада 241,7 0.6 4,91 80,34 10,5 145

Молва 159,04 1,4 8,7 97,11 6,8 111

Башкирская 276,23 8,1 6 111,88 10,5 200

Дизайн 252,69 1,6 5,1 77,34 8,8 184

Дикуль 263,15 4,5 5,7 18,27 8,3 117

Дождик 173,17 1,3 6,1 67,33 6,8 170

Деметра 166,38 1,7 9,9 66,08 9,3 165

Диалог 190,96 2,6 4,7 113,38 9,6 184

Темп 127,13 1,7 5,3 91,86 6,8 127

Дружина 195,14 1,4 5.2 83,85 8,2 138

Индетерминантный сорт Башкирская красностебельная отличается высоким уровнем накопления ПФС в корнях (17, 4 мг/г), так как при низкой активности СОД наблюдается высокий уровень МДА, что способствует повышению уровня накопления флавоноидов.

Установлено, что накопление флавоноидов в растениях гречихи посевной находится в прямой зависимости от периода онтогенеза и связанной с этим перестановкой всех функциональных систем растения.

сорта гречихи ■ ПФО ■ Антоцианы гречихи

Рис.6. Соотношение содержания антоцианов и уровня активности

полифенолоксидазы в 2-х дневных проростках гречихи посевной

Исследование содержания антоцианов в проростках на 2-ой день прорастания показало, что накопление данных веществ зависит от сортовых особенностей и варьирует от 0.07 мг/г до 0,64 мг/г. Максимальную концентрацию антоцианов имели сорта с высокой энергией прорастания (9798%). Наибольшее количество имел скороспелый сорт Темп -0,64 мг/г, Молва -0,48 мг/г, Деметра - 0,42 мг/г, Дикуль - 0,29 мг/г, Дизайн — 0,24 мг/г (рис. 6).

Такое содержание указывает на повышенный ответ системы адаптации растений сортов с высоким уровнем низкомолекулярных антиоксидантов и усиления процессов окисления флавоноидов под действием окислительно-восстановительных ферментов.

Активность полифенолоксидазы проростков гречихи на 2-е сутки проращивания варьировала от 68 до 88 Е/г сырой массы. При соотношении содержания антоцианов в проростках гречихи посевной и активности ПФО отмечено, что при снижении активности фермента содержание антоцианов выше, рис. 6.

Таким образом, с увеличением активности полифенолоксидазы, катализирующего образование и окисление хлорогеновой кислоты, которая используется в биосинтезе флавоноидов [Гриневич и др., 1973; Саблина, 1983], происходит уменьшение образования антоцианов, но, как сказано ранее, увеличение содержания общего количества флавоноидов.

Изучение накопления полифенольных соединений в зависимости от активности фенилаланинаммиаклиазы Полученные нами результаты о влиянии рутина на устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды дают возможность внести некоторые коррективы в существующие методы селекции гречихи по их совершенствованию, что позволит вести селекцию с этой культурой более

целенаправленно. В работе проведен анализ соотношения полифенольных соединений, флавонолов и рутина некоторых ценных сортов гречихи.

мг/г

3

i рутин □ флавонолы ~~ППФС ~ч сорта

Рис. 7 Соотношение комплекса полифенольных соединений гречихи посевной: 1- сорт Дружина, 2- Диалог, 3- сорта Молва

Полученные результаты свидетельствуют о том, что улучшение признака сопровождается повышением рутина, но не полностью отражает процесс накопления полифенольных соединений и антоцианов, что не мене важно для получения сортов более адаптированных к стрессорам.

Известно, что влияние низких температур на растение вызывает изменения в углеводном, липидном и белковом метаболизме растений [Туманов, 1979, Трунова, 1984, Новицкая и др., 1990, Климов, 2001, Колесниченко, Войников, 2003]. Однако недостаточно данных об их влиянии на фенольный метаболизм [Christie et al., 1994, Solecka et al., 1999, Rivero et al., 2001]. Все это явилось основанием для проведения нами работы в этой области.

В биосинтезе флавоноидов основополагающее значение имеет реакция, катализируемая ферментом фенилаланинаммиаклиазой (ФАЛ), в ходе которой фенилаланин дезаминируется с образованием транс-коричной кислоты. Рядом авторов установлена прямая корреляционная связь между активностью ФАЛ и интенсивностью накопления флавоноидов [Адамовская, 2007], При изменении условий среды наблюдаются значительные сдвиги в активности ФАЛ, что указывает на то, что ФАЛ может являться основным компонентом контрольного механизма, определяющего размеры количественного сдвига в накоплении флавоноидов при перестройках физиолого-биохимических процессов организма при внешних воздействиях на растение.

£

н

<=; <

© л

н

о

0

1 ю з н

х <

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

<

О

га

1

I

5

I

О.

.0

/ ^ У # У У У ^ ^ ^

□ вегететивный период

Сорта гречихи

□ генегативный период

Рис.8 Активность фенилаланинаммиаклиазы в растениях гречихи посевной в генеративный период, Е/мг белка.

Высокой активностью ФАЛ в вегетативный период отмечен сорт Диалог - 0,56 Е/мг и сорт Дизайн — 0,13 Е/мг. Скороспелый сорт Темп отличается средним уровнем активности фермента — 0,15 Е/мг, что характерно и для индетерминантного сорта Баллада - 0,13 Е/мг. В генеративный период, при максимальном накоплении флавоноидов высокой активностью ФАЛ отличаются сорта: Дружина - 0,58 Е/мг, Дождик - 0,48 Е/мг, Деметра - 0,57 Е/мг и Дизайн - 0,45 Е/мг.

Позднеспелые сорта гречихи имеют повышенный уровень накопления рутина в фазу массового цветения, тогда как у скороспелых процесс накопления рутина наблюдается в период роста вегетативной массы растения. Следовательно, окислительно-восстановительные процессы скороспелых и среднеспелых сортов более интенсивно протекают при формировании вегетативных органов в период роста и развития растений гречихи посевной, а позднеспелые сорта предрасположены к более медленному развитию окислительно-восстановительных реакций, но длительно поддерживающиеся на высоком уровне.

Таким образом, накопление флавоноидов зависит от перераспределения вторичных метаболитов в онтогенезе с определенным

действием на метаболизм растений. И если функция первичных метаболитов в устойчивости растений на сегодняшний день исследована достаточно хорошо, то в отношении фенольных соединений наши данные представляют несомненный интерес для исследователей.

Токсикологическая оценка флавоиоидов и антоцианов гречихи

посевной

Изучение влияния на организм флавоноидов и антоцианов из гречихи в разных концентрациях представлены на рис.9.

О мг

=

Е

§

К

5 3

X Я

н

0,05 мг

а к 3 к в я к 3

1,5 мг

и о.

л ::п :;п :о

-

Е

га д

I I й &

3 мг

Рис.9 Содержание общего билирубина в сыворотке крови белых мышей,

мкмоль/л

Среди флавоноидов, при равной концентрации действующего вещества, антоцианы по сравнению с контролем, показали наибольшее снижение уровня общего билирубина (5,20 мкмоль/л), что на 16,1 % сильнее «Аскорутина» (ООО Росфарм, № РЫ001034/01). По сравнению с контролем лютеолин (Сетат) и кверцетин из гречихи снизили уровень общего билирубина в 1,12 раз ив 1,01 раза соответственно.

Таким образом, при добавлении флавоноидов и антоцианов не наблюдается повышения уровня общего билирубина, что не указывает на отрицательное токсическое воздействие.

При изучении биологической активности кверцетина гречихи посевной установлен положительный эффект роста культуральной ткани дрожжей Засскаготусев cerevisiae (рис. 10).

§

ж о

СП

н о га & К X га М Н

н

и

о л

к Й р.

о к <и £ с;

ГГ

К

—О— полифенольные соединения

—О—"кверцетин

■цианидин

■контроль

3 час

6 час

9 час

12 час

Рис. 10 Биологическое действие флавоноидов гречихи на рост клеток

дрожжей

Таким образом, применение флавоноидов гречихи в качестве стимулятора роста дрожжевых клеток для активизации ростовых процессов клеток, приводит к повышению биомассы кормового белка.

Заключение

Изучение механизма накопления биохимических соединений антиоксидантного действия, динамики образования комплекса полифенолъных соединений, флавоноидов, антоцианов в гречихе посевной (селекции ВНИИ ЗБК) в процессе онтогенеза позволило выявить определенные закономерности. Установлен качественный состав комплекса полифенольных соединений, входящих в антиоксидантный комплекс гречихи посевной. На основании полученных данных в наших исследованиях обосновывается практическая значимость антиоксидантов гречихи. Кроме того, выявлена зависимость динамики накопления флавоноидов в гречихе посевной от физиолого-биохимических особенностей сортообразцов.

Выявлено селекционно-хозяйственное значение образования флавоноидов и антоцианов для создания более адаптированных сортов гречихи посевной в Орловской области. На основании анализа полученных результатов разработана гипотетическая схема процесса образования и динамики накопления флавоноидов.

Высокоадаптированнын сорт гречихи посевной

Накопление флавопоидов

Увеличение уровня шпкомолекурярных антиоксидантов, МДА и ПФС

ГЕ

Положительная динамика накопления антоцнанов

Уменьшение активности ПФО

Рост биосинтетнческнх процессов в клетках

Увеличение активности ФАЛ

Увеличение активности СОД

Рис. 11 Гипотетическая схема процесса накопления флавоноидов гречихи посевной Fagopyrum снси1еп1ит М.

ВЫВОДЫ

1. Процесс онтогенеза гречихи посевной районированных сортов Орловской области характеризуется сменой работы ферментативных систем, выражающийся в колебательном характере активности ФАЛ и СОД в и накоплении флавоноидов в зависимости от биологического возраста растений и типа сортообразцов.

2. Исследование состава фенольных соединений растений гречихи посевной методами ТСХ и ВЭЖХ показало, что в листьях он наиболее разнообразен и представлен фенилпропаноидами и флавоноидами (рутином, кверцетином и производными флавонов лютеолина и апигенина), тогда как в стеблях и корнях он представлен лишь фенилпропаноидами (цианидином, кверцетином и хлорогеновой кислотой).

3. Выяснено, что районированные сорта Орловской области имеют практически одинаковый состав полифенольных соединений, но отличаются по соотношению флавонолов и антоцианов.

4. Выявлено, что листья и цветки характеризуются более высокой способностью к синтезу полифенольных соединений по сравнению со стеблем и корнями. Это проявляется как на уровне накопления растворимых полифенолов, так и ферментов фенольного метаболизма.

5. Установлено, что работа фермента ФАЛ приводит к активации фенольного метаболизма растений гречихи. При этом кратковременное повышение активности ФАЛ не способствует возрастанию содержания флавоноидов.

6. Изменения в накоплении фенольных соединений в органах растения связаны с функционированием ферментов антиоксидантной системы, активность которых практически во всех органах снижается.

7. Установлено, что флавоноиды гречихи посевной нетоксичны. Кроме того, кверцетин и цианидин, полученные из исследуемых растений, стимулируют рост биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Павловская Н.Е. Биологически активная добавка для промышленного животноводств/И.А. Гнеушева, И.Ю. Солохина, H.H. Полехина// Пищевая промышленность. — 2012.- №5. - С. 121 -123.

2. Полехина H.H. Токсикологичесая оценка флавоноидов Гречихи посевной / А.И. Гнеушева, И.Ю. Солохина // Вестник ОрелГАУ. - 2012.-№4. - С.75 -77.

3. Полехина H.H. Динамика накопления биохимических соединений антиоксидантного действия в разных органах гречихи в процессе онтогенеза/ Н.Е. Павловская// Фундаментальные исследования. Биологические науки.- 2013.-№10.- С.357-361.

4. Полехина H.H. Пищевые красители из отходов переработки гречихи/ H.H. Полехина, Н.Е. Павловская// Материалы второго съезда общества биотехнологов России, МАКС Пресс, Москва. - 2004.- С. 89-90.

5. Полехина H.H. Выделение и применение антоциановых красителей из отходов переработки гречихи/Н.Н. Полехина// Материалы научно-методической конференции «Физиологические аспекты продуктивности растений», 0рел.-2004. - С.123-126.

6. Полехина H.H. Biotechnological processing of Buckwheat for obtaining food additions and dye-stuffs/N.N. Polehina, I. V. Jorkova, N.E Pavlovskaya // Proceeding of the 9th International Symposium on Buckwheat / Congress Centre, University of Agriculture, Prague. - 2004. — p. 66-70.

7. Полехина H.H. Исследование фенольных соединений в системе «почва-гречиха-гречишный мед» на занятиях кружка по органической химии/Н.Н. Полехина, H.JT. Хилкова, Е.Г. Прудникова// Материалы III Международной интернет-конференции к 35-летию Орел ГАУ «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производств», Орел,- 2010. - С.202-206.

8. Полехина H.H. УИРС по органической химии «Исследование фенольных соединений в системе «почва-гречиха-гречишный мед»/ H.H. Полехина, H.JI. Хилкова, Е.Г. Прудникова/ Сборник научных трудов «Проблемы и перспективы современной науки», Том 3, №1, Томск.- 2011,-С.210-213.

9. Полехина H.H. Сравнительная характеристика содержания флавоноидов гречихи посевной районированных сортов Орловской области селекции ВНИИ ЗБК/Н.Н. Полехина// Сборник тезисов и докладов Международной научно-практической студенческой конференции «Химия и жизнь», Новосибирск. - 2011. - С.43-46.

10. Полехина H.H. Взаимосвязь посевных качеств семян различных генотипов гречихи посевной с накоплением флавоноидов в процессе прорастания/Н.Н. Полехина, Н.Е. Павловская// Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых «АПК в современном мире: взгляд научной молодежи», Орел. - 2011,- С. 108-111.

11. Полехина H.H. Перспективы применения кверцетина гречихи в животноводстве/Н.Н. Полехина// сборник статей по материалам международной научно-практической конференции «Инновации аграрной науки и производства», Орел. - 2011. - С.129-133.

12. Полехина H.H. Натуральные красители из отходов переработки гречихи сорта «Дикуль»/Н.Н. Полехина// Материалы IV Международной заочной научно-практической конференции «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству», Орел. - 2011. - С.174-179.

13. Полехина H.H. Исследование флавоноидных пигментов гречихи посевной районированных сортов Орловской области/Н.Н. Полехина// Материалы V заочной научно-практической Интернет-конференции «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству», Орел. -2012. - С.270-274.

14. Полехина H.H. Полифенолы — флавоноиды гречихи посевной (Fagopyrum esc. М)/Н.Н. Полехина// Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых «Современный агропромышленный комплекс глазами молодых исследователей», Орел. -2012.-С. 140-143.

15. Полехина H.H. Поисковая лабораторная работа студентов по определению химического состава медоноса и меда/Н.Н. Полехина, Е.Г. Прудникова, H.JI. Хилкова// Материалы научно-практической конференции

по пчеловодству, сборник научных трудов по пчеловодству, посвященный памяти Н.И. Кривцова.- Вып. 20, Орел. - 2012. - С. 196-200.

16. Полехина H.H. Генотипические аспекты накопления флавоноидов Fagopyrum esculentum М./Н.Н. Полехина, Н.Е. Павловская// Межрегиональный сборник научных работ «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов»,- Вып. 14.- ВГУ, Воронеж. - 2012. -с.152-155.

17. Полехина H.H. Флавоноиды гречихи - биостимуляторы роста Saccharomyces cercvisiae/H.W. Полехина, Н.Е.Павловская, И.А. Гнеушева// Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Животноводство России в условиях ВТО: от фундаментальных и прикладных исследований до высокопродуктивного производства», Орел. -2013,- С. 312-315.

18. Полехина H.H. Влияние активности ФАЛ на содержание флавоноидов гречихи посевной Fagopyrum esculentum М./ Н. Н. Полехина, Н.Е. Павловская, А.Н. Фесенко// Межрегиональный сборник научных работ «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов».- Выпуск 15, Воронеж,-2013.-С. 162-167.

19. Пат. 2483105 Российская Федерация, МПК C12N 1/18, C12R 1/85. Способ получения стимулятора роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae [Текст]/Павловская Н.Е., Гнеушева И.А., Полехина H.H.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Орловский государственный аграрный университет» (RU). - № 2012124264; заявл. 13.06.2012; опубл. 27.05.2013, Бюл. №15,-4 с.

Выражаю искреннюю благодарность доктору биологических наук, зав. лабораторией селекции крупяных культур ВНИИ ЗБК А.Н. Фесенко за предоставленные для исследований сорта гречихи и помощь на всех этапах выполнения работы.

Подписано в печать 14.11.2013 г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0. Заказ 128. Тираж 100 экз.

Отпечатано в издательстве Орел ГАУ, 2013, Орел, бульвар Победы, 19

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полехина, Наталья Николаевна, Орел

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

04201454460

Полехииа Наталья Николаевна

ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ РАЙОНИРОВАННЫХ В ОРЛОВСКОЙ ОБЛАСТИ СОРТАХ ГРЕЧИХИ ПОСЕВНОЙ {Fagopyrum е$си1еп1ит МоепсЬ^

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель-доктор биологических наук, профессор Н.Е. Павловская

Орел -2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ДИССЕРТАЦИИ ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГСО - государственный стандартный образец ТСХ - тонкослойная хроматография УФ спектр - ультрафиолетовый спектр БХ - бумажная хроматография СОД - супероксиддисмутаза ФАЛ - фенилаланинаммиаклиаза ПФС - полифенольные соединения ПФО - полифенолоксидаза МДА - малоновый диальдегид

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1. Биологическая характеристика и особенности гречихи 10

посевной.

1.2. Основные направления селекционной работы с гречихой 22

1.3. Полиморфизм растений по фенольным соединениям 28

1.4. Физиологическая роль флавоноидов и факторы, 36

влияющие на накопление рутина в растениях.

1.5. Антиоксидантная система растений 47

Глава 2. Объекты и методы исследования 50

2.1. Рельеф местности, метеорологические условия, тип 50

почвы

2.2. Объект исследования 51

2.3. Лабораторные опыты 53

2.4. Биохимические методы исследование 56

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждения 59

3.1. Сравнительное исследование флавоноидов гречихи 59

посевной

3.1.1. Сравнительное исследование флавоноидов в разных 61

частях растения гречихи посевной

3.2. Накопление полифенольных соединений в растениях 67

гречихи посевной

3.2.1. Изучение динамики накопления флавоноидов гречихи 67

посевной

3.2.2. Изучение динамики полифенольных соединений в 73

проростках гречихи посевной

3.3. Варьирование биохимических показателей сортов 77

гречихи посевной и взаимосвязь физиологического

СОСТОЯНИЯ

3.3.1. Сравнительный анализ содержания МДА, СОД и ПФС 78 в органах гречихи посевной в онтогенезе

3.3.2. Активность супероксиддисмутазы в онтогенезе 81 растений гречихи

3.3.3. Уровень малонового диальдегида в онтогенезе растений 84 гречихи

3.3.4. Зависимость активности полифенолоксидазы в 86 растениях гречихи посевной от содержания антоциапов

3.3.5. Зависимость активности полифенолоксидазы в 87 растениях гречихи посевной от содержания полифенольных соединений

3.4. Накопление полифенольных соединений в зависимости 91

от активности фенилаланинаммиаклиазы

3.4.1. Содержание комплекса полифенольных соединений 91 гречихи посевной

3.4.2. Изучение накопления полифенольных соединений в 93 зависимости от активности фенилаланинаммиаклиазы

3.5. Оценка флавоноидов и антоцианов гречихи посевной 99

3.5.1. Токсикологическая оценка флавоноидов и антоцианов 99 гречихи посевной

3.5.2. Флавоноиды гречихи - биостимуляторы роста дрожжей 102 ЗассЬаготусеъ сегеу1я1ае

Заключение 105

Выводы 107

Список литературы 108

Приложения 127

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Состояние пониженной функциональной активности живых организмов, обусловленное факторами среды (низкая и высокая температура, отсутствие влаги и другие стрессоры), при сохранении их высокой жизнеспособности после восстановления нормальных условий жизнедеятельности и возобновления активной деятельности всех его функциональных систем определяется их адаптационными механизмами, заложенными в физиологических, молекулярно-генетических и биохимических особенностях растительного организма.

Действие приспособительного потенциала на биохимическом уровне проявляется с участием белков и функционально активных молекул в регуляции метаболических процессов.

Фенольные соединения являются одними из наиболее распространенных в тканях высших растений представителями вторичного метаболизма. Они участвуют в основных процессах жизнедеятельности растительных клеток: фотосинтезе, дыхании, формировании клеточных стенок, а также защите от действия стрессовых факторов биотического и абиотического происхождения (Запрометов, 1993, 1996).

Наряду с этим, растительные полифенолы находят широкое практическое применение. Благодаря высокой биологической активности они успешно используются в пищевой и легкой промышленности, а также в медицине и фармакологии в качестве веществ, обладающих капилляроукрепляющей, нейрорегуляторной, биостатической, иммуномодулирующей и

противоопухолевой активностью (Барабой, 1984; Куркин и др., 2003, 2004; Weinreb et al., 2008; Antonio, Druse, 2008).

В последние 15 лет внимание исследователей обращено на растения рода Fagopyrum Mill., вид Гречиха обыкновенная - Fagopyrum esculentiim Moench., характеризующиеся высокой способностью к образованию вторичных веществ, главным образом, фенольной природы (Комисаренко и др., 1973; Дурмишидзе и

др., 1981; Кемертелидзе и др., 2007). Наряду с их типичным представителем (рутином) в растениях были обнаружены редкие, специфичные продукты вторичного метаболизма, такие как хлорогеновая кислота, изокверцетрин, никотифлорин, кверцетин (Анисимова, 2010).

Известно, что накопление рутина является одним из определяющих факторов продуктивности и устойчивости растений гречихи посевной (Клыков, 2000), но остается открытым вопрос по изучению механизмов регуляции накопления не только рутина, но и всего комплекса полифенольных соединений, называемых в дальнейшем флавоноидами. Кроме того, наблюдается взаимосвязь накопления флавоноидов и антоцианов в различных органах гречихи посевной с работой окислительно-восстановительных ферментов растения гречихи посевной в процессе онтогенеза районированных сортов Орловской области. Однако недостаточно изученными являются биохимические механизмы регуляции и . метаболические пути роста и развития растений гречихи посевной, обеспечивающие высокую жизнеспособность растений и причины, вызывающие процесс накопления флавоноидов в процессе онтогенеза. Исследование биосинтеза флавоноидов и антоцианов в растительных тканях позволяет определить пути адаптации растений к неблагоприятным условиям среды и понять физиолого-биохимические механизмы их устойчивости. Поэтому исследование накопления флавоноидов и антоцианов в комплексе имеет большое теоретическое и практическое значение. Познание механизмов регуляции биосинтеза физиологически активных соединений является актуальным в связи с перспективой практического использования растительных объектов с целыо получения важных для народного хозяйства метаболитов, получения высоковитаминных растительных продуктов, кормовых добавок для интенсивного животноводства, обладающих высоким фармакологическим и медицинским эффектом. В перспективе растения, обладающие высоким уровнем пигментов, могут быть использованы для генноинженерного конструирования растений с высокой адаптивной и иммунной способностью.

Эндогенный уровень антоциановых пигментов может являться эффективным показателем физиологического состояния клеток растительных организмов, тканей и растительных экосистем в целом. Содержание антоцианов может служить тестом, характеризующим степень стресс-устойчивости растения, что важно для выведения новых сортов.

Изучение механизмов накопления флавоноидов в ходе роста и развития растения с учетом сортового разнообразия, с их локализацией, качественным составом и с потенциалом флавоноидов в защите растений от вредителей и болезней других сельскохозяйственных культур, является актуальным.

Цель и задачи. Целью работы являлось исследование накопление флавоноидов в разных сортах гречихи посевной в процессе онтогенеза и исследования антиоксидантного действия комплекса полифенольных соединений.

Задачи:

1. Выявить качественный состав, содержание и локализацию флавоноидов комплекса полифенольных соединений гречихи посевной

2. Установить динамику накопления флавоноидов по фазам развития растения гречихи (всходы, ветвление, бутонизация, цветение, плодоношение)

3. Определить динамику накопления флавоноидов по органам гречихи посевной

4. Провести характеристику физиолого-биохимических показателей сортов гречихи посевной по фазам онтогенеза с учетом накопления полифенольных соединений

5. Обосновать значение практического использования флавоноидов для оценки сортов гречихи посевной и применения их в качестве биодобавки в животноводстве

Научная новизна. Впервые проведена оценка качественного и количественного состава флавоноидов и антоцианов районированных сортов Орловской области в зависимости от физиолого-биохимического состояния гречихи посевной и активности супероксиддисмутазной ферментной системы.

Проведена оценка содержания полифенольных соединений, флавонолов и антоцианидинов в различных органах и периодах онтогенеза. Установлена динамика накопления флавоноидов гречихи посевной в зависимости от физиолого-биохимических особенностей сорта исследуемых растений.

Практическая значимость. Выявлено селекционно-хозяйственное значение динамики накопления флавоноидов и антоцианов для выведения более адаптированных сотов гречихи посевной Орловской области. Проведена токсикологическая оценка флавоноидов и антоцианов гречихи посевной, как природных антиоксидантов, с возможностью их применения в промышленном животноводстве в качестве биологически активного вещества. Разработан стимулятор роста дрожжей.

Отдельные положения работы могут быть использованы в преподавании практического курса по физиологии и биохимии растений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Флавоноиды гречихи посевной представлены О-гликозидами и агликонами кверцетина, цианидином и его гликозидами и хлорогеновой кислотой с локализацией гликозидов в листе и цветке растения, агликонов - в стебле и корне.

2. Динамика накопления флавоноидов гречихи посевной (.Fagopyrum esculentum) находится в зависимости от активности антиоксидантной системы растения на начальных этапах онтогенеза и мощности пула системы первичного метаболизма.

3. Флавоноиды и антоцианы, выделенные их гречихи посевной, обладают гепатопротекторными и ростостимулирующими свойствами.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на заседании ученого совета ФГБОУ ВПО «ОрелГАУ»; на конференциях: Материалы второго съезда общества биотехнологов России (2004 г.); Материалы научно-методической конференции «Физиологические аспекты продуктивности растений» (2004 г.); Proceeding of the 9th International Symposium on Buckwheat /

i

11

l

Congress Centre, University of Agriculture, Prague (2004 г.); Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых 19-22 апреля 2011 «АПК в современном мире: взгляд научной молодежи» (2011 г.); III Международной интернет-конференции 5 апреля 2010 к 35-летию ОГАУ: «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (2010 г.); Международной научно-практической конференции /Новосибирский государственный аграрный университет.- Новосибирске (2011 г); IV Международной заочной научно-практической конференции 30 мая 2011 г. «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (2011 г.); V заочной научно-практической Интернет-конференции

2 апреля 2012 « Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (2012 г.); региональной научно-практическая конференции молодых ученых 17-18 апреля 2012 «Современный агропромышленный комплекс глазами молодых исследователей» (2012 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в т. ч.

3 в журналах рецензируемых ВАК РФ, патент РФ №2483105.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 136 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, заключения, приложения, списка литературы, включающего 193 источника. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 42 рисунками.

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 Биологическая характеристика и особенности гречихи посевной Fagopyrum esculentum Moench.

Гречиха - ценная крупяная культура, которую возделывают в Российской Федерации и за рубежом для получения зерна, используемого для получения ценного продукта питания - гречневой крупы.

В литературе существуют различные точки зрения о месте, времени и условиях происхождения культуры гречихи. Большинство исследователей отмечают, что гречиха посевная азиатского происхождения. Считается, что родина гречихи - Монголия или Индия. Другие исследователи считают, что родина гречихи именно Гималаи (Киселева, 2009; Куркин, 2007; Ohnishi, 1989).Там ее начали культивировать 4 тыс. лет тому назад. Позже она попала в Китай и Среднюю Азию, а затем - в Средиземноморье. На Русь гречиху впервые завезли греки, почему наши предки и стали называть ее «греческим злаком» -гречкой (Шумный, 1985; Кузнецова, 1992).

Огромный интерес к возделыванию гречихи обусловлен тем, что она является одной из немногих культур, которая обладает комплексом уникально полезных качеств. Гречиха посевная широко используется для продовольственных нужд в виде крупы. По питательности и вкусовым качествам гречка является одной из лучших (Киселева, 2009; Куркин, 2007).

В XVIII веке Карл Линней придумал для гречки латинское название — Fagopyrum, то есть «орешек букоподобный». И во многих европейских странах её вскоре стали называть «буковой пшеницей» (нем. Buchweizen). Родовое наименование Fagopyrum происходит от лат. fagus (бук) и греч. ругоп (пшеница) из-за сходств трехгранных плодов гречихи с плодами бука.

Видовой эпитет «esculentus» (съедобный) образован от латинского «esca» (пища, приготовленное кушанье); видовое определение «sagittatus» (стреловидный) - от «sagitta» (стрела)(Муравьева, 2002). (рис. 1).

Рис. 1 - Гречиха посевная - (Гс^оругыт е&си1еп\ит М.) сорт Башкирская красностсбельиая, сорт Дружина, сорт Темп

В семейство Гречишные входит около 800 видов. Из них типичными для семейства и широко распространенными в нашей стране является гречиха посевная.

Рис. 2 - Гречиха посевная - Fagopyrum esculentum M., Сем. Гречишные -Polygonaceae

Современная ботаническая систематика относит отделу Цветковые растения (Magnoliophyta), классу Двудольные (Magnoliopsida), порядку Гречихоцветные (Polygonales), семейству Гречишные - Polygonaceae, род Гречиха - Fagopyrum Mill., вид Гречиха посевная - Fagopyrum sagittatum Gilib. или Гречиха обыкновенная - Fagopyrum esculentiim Moench (Gross, 1973), (рис.2.).

Гречиха посевная - однолетнее травянистое растение. Стебель прямой, ветвистый, высотой 10-60 см, ребристый, чаще всего красноватый или фиолетовый. Листья длиной 1,7-6,5 см, треугольно-сердцевидные, на верхушке заостренные, при основании с округлыми или заостренными нижними лопастями, голые, желто-зелёные, нижние - длинночерешковые, верхние - почти сидячие (Фесенко, 2001,2009). Цветки обоеполые, в кистях, на длинных пазушных цветоносах, на верхушке стебля образуют щитовидное соцветие с сильным ароматом. Околоцветник розовый или белый, пятираздельный, доли его длиной 34,5 мм, яйцевидные. Тычинок 8, из них 5 образуют круг, а 3 составляют внутренний круг. У гречихи по сравнению с надземной массой слабо развита корневая система. Уже на 18 день после появления всходов корни гречихи начинают буреть, что связано с их ранним старением, и отмирать. К началу цветения бурую окраску приобретают 50% корней, к полному цветению - 75, а к началу созревания - 100%, в результате чего недостаток питательных веществ обуславливает недоразвитость и отмирание большого числа цветков и плодов.

Плод - орешек, трехгранный, односемянный, длиной 5-7 мм, яйцевидный, коричневый (рис. 3). Растение цветет в июне-июле, плоды созревают в августе-сентябре (Чикова, 1980).

Рис. 3 - Гречиха посевная (Fagopyrum esculentum Moench.)

1 - репродуктивный побег; 2 - цветок; 3 - цветок в разрезе; 4 -тычинки; 5 - пестик; 6,7 - плод в продольном и поперечном разрезе. Семейство Polygonaceae Lindl, гречишных объединяет 40 родов и 900 видов. Растения этого семейства (многолетние травы, кустарники, лианы и деревья)

широко распространены на земном шаре. Культурно возделывается 3 рода: Fagopyrum Mill., Rheum L., Rumex L. Наиболее известен в хозяйственном отношении род Fagopyrum - Гречиха. Однако заслуживают внимания и изучения и другие виды, как ценные генетические источники по ряду признаков, к их числу относятся и виды рода Polygonum L., которые являются филогенетически близкими к гречихе.

В настоящее время род гречихи Fagopyrum Mill, представлен тремя обособленными видами: гречиха посевная (F. esculentum Moench), гречиха татарская (F. tataricum (L.) Gaertn.) и гречиха полузонтичная (F. cymosum Meissn.).

Род Fagopyrum Mill., прошел длительный путь исторического развития. Представляющие его виды и разновидности отличаются по морфологическим признакам, биолог