Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АНТИСТРЕССОВЫЕ И АНТИМУТАГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "АНТИСТРЕССОВЫЕ И АНТИМУТАГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ"



На правах рукописи

ВАРЮХИНА Светлана Юрьевна

АНТИСТРЕССОВЫЕ И АНТИМУТАГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Специальность 03.00.07 — микробиология

__АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Л.И. Воробьева.

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

В.К. Шильникова; доктор биологических наук С.К. Абилсв

Ведущая организация. ФГУП «ГосНИИ Синтезбелок».

ОР

Защита состоится « » _2004 г. в « /Ь » часов

«_» минут на заседании диссертационного совета Д 220 043.04

при Московской сельскохозяйственной академии им. К А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49 Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА

Автореферат разослан « ¿>¿7 » с//>/) 9_2004 г.

Ученый г с.

диссертг' 1ш • л /У?

кандид' ' ч- '\озг" . 1ых. . \

профес В.А. Калинин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

л^^^пгть проблемы. Человек является частью природы. Влияние человека -на среду обитания всегда зависело от этапа развита цивилизации, исторической и „

географической ситуации.

На данном этапе прогресс сопровождается глобальными экологическими

нарушениями и изменения*«. Особое внимание вызывает загрязнение окружающей среды

факторами, не свойственными биосфере в норме, что не только испытывает компесаторные возможное™ природы, но влияет на здоровье людей и уже сейчас может нанести ущерб будущим поколениям. Антропогенное загрязнение мутагенами окружающей среды приводит к увеличению час™™ мутаций у микроорганизмов, -растений, животных и человека. Предотвратить увеличение мутационного груза, способного вызвать «взрыв» мутабельности и тем самым сохранить наследственность -

актуальная и сложная задача стоящая перед человечеством.

Существует несколько подходов к решению проблемы. Предотвращение загрязнения среды а также идентификация И изъятие мутагенов окружающей среды,

весьма эффективны, но их реализация является весьма проблематичной. Другим подходом

является повышение устойчивости организмов к действию экстремальных факторов. Для этих целей возможно использование антимугагенов - веществ, способных снижать частоту

спонтанной и индуцированной мутации (Алекперов У.К., 1989).

Прокариоты как потенциальные источники антимугагенов почти не изучались, хотя учитывая общность фундаментальных реакций прокариот и эукариот, а также способность прокариот осуществлять реакции некоторых уникальных синтезов, позволяют предположить, что бактерии могут быть источниками ценных антимугагенов. Использование бактерий, как ночников антимугагенов, имеет ряд преимуществ перед другими источниками. Бактерии способны к эффектному наращиванию биомассы на дешевых средах (например, на отходах некоторых производств) и за довольно короткий промежуток времени. Кроме того, существуют возможности воздействия иа бактериальный метаболизм, позволяющие стимулировать преимущественную выработку необходимого человеку продукта и его дальнейшую экскрецию из клеток. Бактерии являются облигатными составляющими нормальной микрофлоры человека и широко применяются в медицине и биотехнологии. Эти полезные бактерии должны быть защищены от неизбежных стрессов, возникающих в условиях микробиологических производств и возможного присутствия мутагенов в пище и в желудочн^кишечном

тракте человека. „______________

ЦН5МСХА фонд каучной лит§|>ат

Кроме антимутагенного действия а отношении мутагенеза, индуцированного химическими соединениями, бактерии привлекли к себе внимание исстедователей способностью к реактивирующему действию в ответ на стрессовые ситуации Стресс- это ситуация, при которой параметры окружающей среды резко отличаются от обычных условий существования организма Ганс Селье определяя стрессовый ответ как запрограмировалную реакцию организма на резкое изменение условий окружающей среды Со времен Г Селье этот термин стал очень популярен и в настоящее время приобрел более широкий смысл, включая действие экстремальных факторов на биообъект и противодействие им

Удивительная общность стрессовых ответов V исследованных про- и эукариотпых организмов позволила выявить высокую консервативность фундаментальных механизмов их клеточной регуляции Поэтому микроорганизмы с тужат хорошими ч >дезями для изучения стрессовых ответов у высших организмов

Цель и задачи исследования Целью работы быю изучение антистрессовых и антимутагенных свойств пропионовокистых бактерий (ГПСБ)

В ходе работы решались следующие задачи

• выделение и очистка внутриклеточного белка пропионовокислых Оактерий обладающего защитными и реактивирующими свойствами в отношении бактерий, подвергнутых стрессорным воздействиям,

• частичная физико-химическая характеристика очищенного беткового препарата

• изучение АМ активности представителей различных видов и штаммов ПКБ с использованием кугьтуральной жидкости (юк ), «живых» и «мертвых» клеток в качестве источников антимутагенных факторов,

• исследование наиба чее перспективных с точки прения АМ активности штаммов в отношении мутагенеза, ицдувдч^ечого мутагенами различного химического строения и механизма действия,

• установление свойств этих антимутагенов и анализ возможного механизма их действия

Научная новизна работы В ходе работы был получен в очищенном состоянии белок из клеточного экстракта пропионовокислых бактерий с молекулярной массой 35 О Ша, обладающий реактивирующей и защитной активностью Изоэчектрическая точка очищенного фермента определена как 4 95

Определение аминокислотной последовательности М-термннального и двух интервальных участков молекулы бечка позволите охарактеризовать его как цистеинсинтазу фермент, ответственен за синтез цистеина из О ацетил-мерина и

сульфида водорода и контролируемый cysK-геном; установлена высокая степень гомологии с цистеинсинтазами других бактерий: Staphylococcus haemoliticus, Lactococcuss ¡actis, Bacillus subtilis.

При использовании метода двумерного электрофореза внутриклеточного белок-содержащего экстракта Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii показана индукция синтеза фермента, который, видимо, играет важную роль в адаптации бактерий к действию детергентов и к нагреванию.

Впервые показано реактивирующее действие белка в отношении клеток Е. coli подвергнутых тепловому шоку и действию желчных кислот и защитное действие в отношении УФ-облученных клеток. Установлена зависимость защитного эффекта белка от его концентрации.

Изучена антимутагенная активность 17 штаммов бактерий, при этом особое внимание уделено изучению ангимутагенеза пропионовокислых бактерий, которые имеют широкое практическое применение.

Исследовалась антимутагенная активность кульуральной жидкости, а также «живых» и «убитых» клеток бактерий.

Установлено, что антимутагенный фактор культуральной жидкости представлен веществом белковой природы, относительно термоустойчивым, с молекулярной массой более 2.0, но менее 12.0 ГОа.

В качестве источников мутагенов использовали как прямые мутагены, не требующие метаболической активации, так и промутагены, активирование которых проводили путем добавления микросомальной активирующей смеси. Всего было изучено мутагенное действие 8 различных мутагенов, часть из которых обладает канцерогенным действием: 4-нитрохинолин-1-оксид (4-НХО), N-метип N-нитро N-нитрозогуанидин (МННГ), 2-нитрофлуорен (2-НФ), 9-аминсакридин (9-АА), перекись водорода (Н2О2), азид натрия (Na№), 2-амиио-1метил-5-фенилимидазопиридин (PhiP), бенз(а)пирен (ВАР). В качестве тест-культуры применяли 4 тестерных штамма Salmonella typhimurium, регистрирующих различные типы мутаций у бактерий: ТА 100, ТА 98, ТА 97, ТА 102.

Практическая значимость. В настоящей работе представлены новые данные о дополнительных ранее неисследованных свойствах пропионовокислых бактерий как пробиотитков, источников антимутагенов, а также факторов протекции и реактивации микроорганизмов, подвергнутых различным стрессовым факторам.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Международной конференции «Predictive modeling in foods» (Бельгия, Лейвен, сентябрь 2000), на Международном симпозиуме «Propionibacteria» (Швейцария, Цюрих, июнь

2001), на заседании кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им MB Ломоносова (17 февраля 2004)

Публикация. Результаты диссертации представлены в 4 работах Структура и обьем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения результатов исстедований, выводов и списка литературы (88 работ) Работа изложена на 127 страницах, иллюстрирована 24 таблицами и 35 рисунками

i

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными объектами исследования служипи классические пропионовокислые бактерии, полученные из коллекции кафедры микробиологии МГУ и из коллекции «Centre National de la Recherche en Zootechnn», Франция Бактерии выращивали на минимальной глюкозной среде следующего состава (,%) глюкоза-1 5, триптон («Difco») - 0 1, дрожжевой экстракт ("Difco ') - 0 05 (NH<)2S04 - 0 3, КН2РО4 - 0 2, CaCh - 0 002 MgSOi -0 002, NaCl - 0 002, CoCh-бНгО - 0 001, дистиллированная вода, рН 6 8-7 0 Культивирование проводили при 30°С в стационарных условиях Для получения бесклеточных экстрактов в целях выделения внутриклеточного белка бактерии культивировали в течение 72 ч Экстракты получали, разрушая клетки ультразвуком с последующим центрифугированием для осаждения крупных обчомков и клеточных стенок Для удаления присутствующих в экстракте нуклеиновых кислот в полученный супернатант вносили протаминсульфат

Дробное фракционирование клеточного экстракта сульфатом аммония осуществляли согласно общепринятой методике (Долсон и др, 1991) В качестве ингибитора сериновых протеаз, использовали фенилметансучьфонилфторид (ФМСФ)

Для разделения белковых смесей использовали следующие варианты колоночной хроматографии ионнообменная хроматография на анионитах DEAE-сефароза, гель-фильтрация на сефадексе G-75 Хроматографическое разделение проводили при помощи стандартных приемов (Остерман Л А, 1984) Для анализа гомогенности белковых фракций и определения молекулярной массы бет ков использовали метод SDS-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия Степень гомогенности полученного очищенного белка определяли методом эксклюзивной ВЭЖХ Для экспресс-определения концентрации белка использовали спектрофотометрический метод Кристиана-Варбурга

Концентрацию белка подсчитывали по эмпирической формуле

С (мг/мл) = 1.55 A2SO-0.76 Аэю

Процент нуклеиновых кислот от массы белка определяли исходя из отношения А2Я0/А260 при помощи эмпирической таблицы - (Долсон, и др., 1991).

Для определения концентрации белка использовали также метод Лоури.

Для определения изоэлектической точки белка, а также в целях изучения биосинтеза у этих бактерий цнстеинсинтазы под действием стрессовых факторов суспензия клеток P. freudenreichii subsp. shermanii в контрольном (не подвергнутом стрессу) и в различных стрессовых состояниях была подвергнута двумерному электрофоретическому разделению.

Клетки предварительно метили смесью [35S] метионина и цистеина.

Для секвенирования N-концевого участка белка использовали «ProSorb sample preparation cartridge» («Applied Biosystem», Foster city, CA) и автоматический «Beckman/Porton LF3000 protein sequencer» («Bcckman Instruments», Inc, Fullerton, CA). Обработку данных проводили с использованием «FASTA program» согласно (Pearson and Lipman, 1988).

Белковые фракции, полученные при помощи описанных хроматографических методов фракционирования, испытывались на биологическую активность. Биологическую активность определяли путем подсчета колонийобразующих единиц образованных клетками E.coli АВ 1157 в чашке Петри с питательным агаром фирмы «Oxoid» (США) после облучения бактерий УФ-светом. Активность выражали с помощью индекса деления (ИД), то есть отношения числа КОЕ в опытном варианте к количеству КОЕ в контроле. Протекторное действие очищенного белка на клетки К coli АВ 1157 испытывали также в условиях УФ-облучения, а реактивирующее - в условиях теплового шока и действия желчных кислот.

Для изучения антимутагенного действия применяли модифицированный метод Эймса с использованием в качестве тест-культуры S. typhimurium. Принцип метода состоит в том, что после обработки клеток тест-штамма мутагеном на селективной среде вырастают реверганты по гистидину (без внешних воздействий реверсии к прототрофности происходят с низкой частотой, что отражает спонтанный фон). В соответствии с этим, обрабатывая те же самые клетки антимутагеном или проводя предынкубацию мутагена с исследуемым антимутагенным агентом, ожидают снижение числа индуцированных ревертантов и определяют степень анти мутагенного эффекта.

Атимушенгалйэффектмодулягораопределяли по формуле Ингибирование(%) = (а-а) »100%

(а-с)

где а - число гиспщиновых ревертантов, индуцированггъгх под действием мутагена (позитивный контроль), в - число гасшдиновых ревертантов, ивдуцированных под действием мутагена в присутствии ашимутагена, с - число ревертантов, вырастающих в результате спонтанного мутирования Антимутагены не оказывали влияния на уровень спонтанного мутагенеза, поэтому в формуле не учитывали так называемый негативный контроль - число ревертантов, вырастающих в присутствии только атимугагена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Антистрессовые свойства пропионовокислых бактерий

ЛИ Воробьевой с соавторами (Vorobjeva et al, 1999) была показана реактивация инактивированных УФ-свстом клеток Е. coli S cerevisiae S typhimunum С guelliermondu и целого ряда других микроорганизмов с использованием экстракта клеток Р freudenreichii subsp shermamt

Показано, что защитная и реактивирующая активность сосредоточены в белковых фракциях диализата экстракта, осаждаемых при солевом фракционировании клеточного экстракта сульфатом аммония в интервалах 20-40% и 60-80% насыщения Было продемонстрировано что защитная активность связана с нуклеопротеидным комплексом, а реактивирующая активность нуклеопротеидных комплексов напрямую связана с наличием белковых молекул в активных фракциях, и при этом доказан нековалентный характер взаимодействия белка и нуклеотидной составляющей активного комплекса Из экстракта клеток пропионовокислых бактерий был выделен и частично охарактеризован белок, проявляющий реактивирующую и протекторную активность Однако, описанные ранее способы выдетения белка не всегда воспроизводились, что не позволяло получить в руки очищенный белковый препарат, необходимый как инструмент исследования механизма реактивирующего действия и антистрессовых ответов клетки

В результате поставленных экспериментов по фракционированию белков клеточного экстракта Р freudenreichii subsp shermamt получен гомогенный белковый препарат, обладающий защитной и реактивирующей активностью

Для получения препарата использовали фракцию, полученную при насыщении клеточного экстракта P.fteudenreichii subsp. shermanii сульфатом аммония в интервале 6080% насыщения.

Перед сульфатным осаждением экстракт предварительно обрабатывали протаминсульфатом, чем достигалось значительное освобождение от примесей нуклеотидной природы, а после растворения полученного осадка, белковый раствор инкубировали с ФМСФ для ингибирования протеиназ с целью ослабить или предотвратить протеолиз в процессе выделения белка. Затем было проанализировано хроматографическое поведение белкового материала на сорбентах: DEAE-сефарозе FF и сефадексе G-75.

После разделения фракции 60-80% на анионите DEAE-сефарозе, было получено пять активных фракций, свойства которых представлены в таблице 1. Дальнейшую работу проводили с фракцией II (ИД при. 1.7, содержание нуклеотндного материала 0.715 %), поскольку по данным электрофореза эта фракция была единственной, которая содержала значительное количество белка с молекулярной массой 3S Юа.

Для дальнейшей очистки полученной белковой фракции использовали метод гель-фильтрации на сорбенте сефадекс G-75. В результате разделения было получено пять активных фракций, свойства которых представлены в таблице 1, однако лишь фракция III (ИД пред. 2.3, НК — 0 %) обладала высокой степенью очистки (95 %) (рисунок 1).

Фракция Конц я белка мг/мл, В НК, % от белка Масса фракций, мг Активность, ИД (пред)

ОЕАЕ-сефароза I 0 15 89 26 I 4

П 1.12 0.715 23 0 1.7

III 3 53 05 72 0 1 0

IV 0 44 13 £5 7 7 1 3

V 0 33 21 0 45 1 7

VI <0 I 22 0 <0 5 34

Сефадекс С-75 I 0 238 07 38 15

II 0 461 — 30 1 8

III 0 468 — 80 23

IV 0 185 01 44 1 2

V 0 095 03 30 1 3

Таким образом, в результате проделанной работы был получен в очищенном состоянии белок, обладающий защитной активностью с молекулярной массой 35 кОа.

1 2 3 4 5

94 87 4

43 -Я

30 — — р35

21 14 да . Ж 4

Рисунок 1. Электрофореграмма фракции 1П, полученной при разделении на сорбенте Сефадекс - в 75. 1,2 - стандарты, 3,4,5 - реактивирующий белок Р /теиЛептекИй виЬяр. хкеппами

Высокая степень очистки полученного белкового препарата была подтверждена с использованием метода ВЭЖХ.

В дальнейшем было проведено определение аминокислотной последовательности Ы-терминального и двух интернальных участков молекулы белка, что позволило охарактеризовать его как цистеинсинтазу: фермент, ответственный за синтез цистеина из О-ацетил-серина и сульфида водорода и контролируемый сувК-геном; полученные данные продемонстрировали высокую степень гомологии с цнстеинсинтазами других бактерий: £ ЬаетоШсиз, Ь. 1асПз, В. ¿иЫШя (результаты представлены в таблице 2).

Таблица 2. Аминокислотные последовательности, характерные для антистрессового белка р35 выделенного из клеток Р.^гегикпгегсЬН БиЬгр. IЫгтстп (а).

Белковое Наибо- Микроорганизм Pi MM % степень Номер

секвенирование лее близкий белок (kDa) гомологии наиболее близкого образца (Ь)

SAIHDSITELIFNTPIYR цистеин Bacillus subíitis 5.6 33 68 SW/P37887

(с) синтаза

LEYFNPAGSVK (d) цисгеин синтеза Lactococcvs ¡aclis 5.2 33 90 SW/Q9CHFO

QGLGTGFV (е) цистсин синтеза Staphylococcus haemoliticus фрагмент 88 SW/Q59918

• (a) pi = 4.95; ММ = 35.0 kDa.

• (b) Данные по цистеинсинтазам других микроорганизмов получены из протеомной библиотеки (SwissProt library) с использованием программы FASTA.

• (с) Секвенирование N-концевого участка молекулы белка осуществлено с использованием реакции Эдмана.

• (d) Секвенирование внутреннего участка молекулы белка осуществлено с использованием масс - спектрометрии.

• (е) Представлен только фрагмент белка. '

Двумерный электрофорез с использованием радиоактивной метки клеточного белоксодержащего экстракта P. freudenreichii subsp. shermcmii, подвергнутого действию

различных стрессорных факторов, позволил проанализировать синтез полученного фермента в контрольном варианте и под действием различных стрессов Полученные результаты показали индукцию синтеза цистеинсинтазы пропионовокислых бактерий под действием детергентов и нагревания (рис 2) Была определена изоэлектрическая точка очищенного фермента, которая составила 4 95

Рисунок 2. Результаты, полученные при двумерном электрофоретическом разделении суспензии клеток Propionibacterium freudenreichn suhsp shermanu, содержащей белок, обладающий реактивирующей активностью, (а) Клетки не подвергнутые стрессу, (Ь) клетки подвергнутые кислотному шоку, (с) действию желчных кислот, (d) нагреванию, (е) УФ-облучению

Реактивирующий эффект очищенного белкового препарата с молекулярной массой 35 0 kDa был продемонстрирован в отношении клеток F coli, подверг нутых тепловому шоку и действию жеччных кислот Как следует из данных, представленных в таблице 3, постинкубация клеток Е coli, подвергнутых действию желчных кис тот с реактивирующим белком, увеличивало их выживаемость почти в 9 раз Постинкубация с реактивирующим белком клеток F coli, подвергнутых термоинактивации увеличивало их выживаемость в 4 раза

Таблица 3. Реактивирующий эффект белка с молекулярной массой 35 кОа в отношении действия желчных кислот а теплового стресса.

Стрессовые факторы Инкубация с белком р35 (а) (пост) Выживаемость клеток E.coli, (%)(Ь)

Контроль (с) нет 100

Желчные кислоты (<1) нет 4.2

Желчные кислоты Да 30.2

Нагревание (е) нет 22.6

Нагревание да 84.9

• а) Клетки Е. coli инкубировали 10 мин с белком р35 в концентрации 20 мг*л"'.

• (Ь) Для каждой экспериментальной точки ставили три независимых эксперимента.

• (с) Клетки Е. coli, не подвергнутые стрессу.

• (d) Клетки Е. coli инкубировали 10 мин с желчными кислотами в концентрации бг-л1.

• (е) Клетки Е. coli нагревали в течение 90 мин при 45°С.

Защитный эффект белкового препарата с использованием его различных концентраций был также продемонстрирован в отношении клеток Е. coli, подвергнутых действию УФ<вета. Полученные данные показали зависимость протекторного эффекта белка от его концентрации (рисунок 3).

Рисунок 3, Зависимость протекторной активности белка от его концентрация в отношении клеток E.coli, инактнвнро ванных УФ-светом.

Возникает естественный вопрос о том, каким образом внутриклеточный белок, идентифицированный как цистеинсинтаза, может проявлять защитные и реактивирующие свойства в естественных условиях существования бактерий Культуральная жидкость ПКБ указанные свойства не проявляла, следовательно, активный белок локализован только в клетках и во внешнюю среду не экскретируется Видимо, этот белок проявляет свои защитные функции в стрессовых условиях, в которых часть, или большая часть клеток погибает и, подвергаясь лизису, выделяет свое содержимое наружу В этом случае часть популяции, потенциально способная к репликации, но находящаяся в состоянии шока, получает сигнал, выраженный в присутствии в среде цистеинсинтазы, вероятно способной к связыванию с определенными мембранными рецепторами Сигнал далее по каскадному механизму поступает в клетку, в которой активизируются естественные репарационные системы Иными словами, обнаруженный нами внутриклеточный реактивирующий белок может выполнять жизненно важную роль для клеточной популяции в целом, обеспечивая существование вида в неблагоприятных условиях

Антимутагепные свойства пропионовокислых бактерий

Ранее ЛИ Воробьевой с соавторами (Воробьева и др, 1996, Уого^еуа 1999) с использованием модифицированного метода Эймса, было показано, что культуральная жидкость и клетки логарифмической фазы роста пропионовокислых бактерий обладают антимутагенным (АМ) действием в отношении мутагенов, вызывающих как мутации замены пар оснований, так и мутации сдвига рамки считывания у бактерий Было установлено, что атггимутагенный фактор представлен относительно термоустойчивым веществом (веществами) пептидной природы с молекулярной массой менее 12 кОа.

Работы проводились главным образом с одним штаммом пропионовокислых бактерий — РгорютЬас1епит /гст1спге1с}т 5иЬзр зИегтапп В КМ 101 а также с ограниченным набором веществ, обладающих мутагенной активностью Широкого скринингого исследования различных видов и штаммов ПКБ не проводилось.

Настоящая работа представляет собой наиболее полное исследование АМ-свойств пропионовокислых бактерий, а также ряда представителей других видов бактерий, в отношении мутагенеза, индуцируемого соединениями различной химической природы и механизма действия

Пропионовокислые бактерии, а также бифидобакгерии и Ешегососсия /аесаЬз являются постоянными обитателями желудочно-кишечного тракта человека Поэтому именно эти бактерии были выбраны нами в качестве объектов изучения их АМ-свойств Дело в том, что почти все продукты как растительного, так и животного

происхождения (особенно при их процессииге), содержат то или иное количество мутагенов и канцерогенов Мутагены образуют также некоторые бактерии (например, бактерии рода Bacteroides), обитающие в толстом кишечнике человека и животных Поэтому возможность снижения количества мутагенов с использованием бактерий в качестве АМ-факторов имеет важное значение для улучшения здоровья людей и широкие перспективы их использования в биотехнологии

В результате поставленных экспериментов была изучена антимутагенная активность 17 штаммов бактерий, при этом особое внимание уделялось изучению антимутагенеза пропионовокислых бактерий В качестве источников антимутагенов использовали культуральную жидкость, а также «живые» и «убитые» клетки бактерий Ранее (Lankaputhra, Shah, 1998) была показана АМ-активность «живых» и «убитых» клеток бифидобактерий и молочнокислых бактерий В настоящей работе также определялась АМ активность к ж, «живых» и «убитых» клеток В bifidum и Е faecalis, однако она не превышала антимутагенеза ПКБ Было обнаружено, что не всегда «живые» бактериальные клетки проявляют антимутагенный эффект Это показывает, что антимутагенная активность клеток не ограничивается лишь их сорбционными свойствами, но может включать дополнительные, пока неустановленные механизмы антимутагенеза. Было изучено мутагенное действие 8 различных мутагенов, часть из которых обладает канцерогенным действием В качестве тест-культур применяли 4 тестерных штамма S typhimurium, регистрирующих различные типы мутаций у бактерий ТА 100, ТА 98, ТА 97, ТА 102 При этом удалось показать неодинаковую способность мутагенов индуцировать различные типы мутаций у тестерных штаммов Для изучения влияния мутагенов на проявление АМ активности различными культурами пропионовокислых бактерий, использовали бенз(а)пирен и PhiP и два тестерных штамма S typhimurium, деффектные по синтезу гистидина - ТА 98 и ТА 100, реагирующих на мутации сдвига рамки считывания и замены пар оснований соответственно Результаты представлены на рисунках 4 и 5

Так, мутагенная активность ВАР в отношении тестерного штамма 5 typhimurium ТА 98 при использовании к ж. в качестве антимутагенного фактора всех исследованных бактерий ниже, чем при исследовании активности вещества на штамм ТА 100, однако, при использовании в качестве АМ фактора клеток Р freudenreichu subsp freudenreichu KM 133 активность ВАР ниже в отношении штамма ТА 100 Клетки Р freudenreichu subsp shermanit KM 103 и Я acidipropiomci CNRZ 86 не проявляют защитного эффекта в отношении мутагенеза, индуцированного ВАР На основании полученных данных можно предположить, что способность вызывать мутации сдвига рамки считывания у

бенз(а)пирена ниже, чем его способность вызывать мутации замены пар оснований в молекуле ДНК.

Рисунок 4. Влияние типа регистрируемой мутации на выражение антимутагениого эффекта при работе с бенз(а)пиреном.

1. Р. /геиЛепгеюкп БиЬзр. /геиЛепгекки КМ 133

2. Р. /геи^ептекИИ БиЬэр. аЛегтапи КМ 103

3. Р. асгсИргорютс! 86

Мутагенная активность РЫР в отношении штаммов £ ¡урЫтиггит ТА 98 и ТА 100 при использовании к.ж. и клеток Р. /геис/епгегскИ БиЬБр. /геис/епгекЫг КМ 103 и Р. /гегикт-ек/ги виЬзр. /гешЗепге^ски КМ 133 в качестве АМ факторов различается незначительно. Это позволяет предположить, что РЫР обладает примерно одинаковой способностью вызывать мутации замены пар оснований и сдвига рамки считывания у бактерий.

■ культуральная жидкость (ТА98)

■ клетки (ТА98)

Е1 культуральная

жмдкость(ТА100) □ клетки(ТА100)

Рисунок 5. Влияние типа регистрируемой мутации на выражение аитимутагенного эффекта при работе с PhiP.

1. Р Jreudenreichti subsp. shermamt KM 103

2. P freuderweiL.hu suhsp freudenreichti KM 133

В ходе работы было изучено влияние на АМ-акгивность бактерий компонентов различных сред, используемых для их выращивания Как видно из данных, представленных в таблице 4 максимальный АМ-эффект обнаруживается в случае использования клс~, полученной при росте бактерий на синтетической среде (1) Ora среда почти не проявляла собственного ангимутагенного действия В то время, как в случае двух других сред, АМ-актавность культуральной жидкости бактерий была почти в два раза ниже, а АМ-действие самих срез достаточно высоким, особенно при использовании кукурузно-глюкозной среды Поэтому в основных экспериментах мы использовали стандартную синтетическую среду, как наиболее подходящую

Таблица 4. Влияние на АМ-активность ПКБ сред, используемых дли их выращивания.

№ Варианты Белок, мг/мл Число ревертантов в чашке (Х±5Е) АМ.%

1 синт. среда (1) 2097±123.3 0.5

2 к-ж. на среде (1) 0.4 465±24.9 89.5

3 синт.среда (2)+випамины 2099±87.3 27.2

4 клена среде (2) 0.1 > 1255±72.9 46.2

5 кук-глюк. среда (3) 1453±50.9 36.6

6 юк. на среде (3) 1.54 1296±46.9 44.2

"Примечание: спонтанный фон = 273 ±10.4 колоний; негативный контроль = 2106±224.8 колоний.

Было проведено исследование зависимости АМ-эффекта от возраста бактериальных культур. Исследовали 7, 17,24,48 и 72 - часовые культуры (рис. б, 7,8,9). Наибольшую АМ-активность проявляли культуры в ранней и поздней логарифмической фазе роста. Па основании полученных данных в основных экспериментах использовали 24 и 48 - часовые культуры бактерий.

—р.!г«и<йпгас«1

аиьярдйяопшт! КМ 185

—■—Р.1геш*впгаюЫ|

•иЬ8р.Ггаи!бпгеЮ11

КМ 133__

Рисунок 6. Антимутагенный эффект культуральной жидкости в отношении мутагенеза, индуцируемого 4-НХО, в зависимости от возраста культуры.

7 часов 24 часа 4$ часов

I__

Рисунок 7 Антимутагенный эффект культуральной жидкости в отношении мутагенеза, индуцируемого Н2Ог, в зависнмостиот возраста культуры.

I

| 1 2 3

7часов 24 часа 48 часов

_ ^

Рисунок 8. Антимутагенный эффект культуральной жидкости в отношении мутагенеза, индуцированного 6енз(а)пирепом, в зависимости от возраста культуры

Р *геийепге1с*и» аиЬэр «Ьеппап I КМ 103

Р (геийепгегсЫ! | яиЬзр Ггеийелга с | |Н1 «СМ 133 *

7 часов 24 часа 48 часов

Рисунок 9. Антнмутагенный эффект культуральной жидкости в отношении мутагенеза, индуцированного РЫР, в зависимости от возраста культуры.

В случае работы с мутагенами, требующими метаболической активации, были подобраны оптимальные конценцентрации микросомальной активирующей смеси для каждого из мутагенов (табл. 5, б).

Таблица S. Влияние концентрации S9 mix на мутагенность ВАР, индуцирующего мутации у & typhimurium ТА 98.

Конц-я S9 mix Конц-я ВАР (мкг/на чашку) Среднее число ревертантов на чашку, Х±БЕ

5%,100 мкл/ на чашку 0.5 58.0*11.3

2.0 72.0±9.9

5.0 109.0±3.6

10%, 100 мкл/на чашку 0.5 88.7±14.2

2.0 186.3±31.6

5.0 206.7±38.6

10%, 500 мкл/на чашку 0.5 82.7±7.5

2.0 197.7±7.5

5.0 316.3±11.9

♦Примечание: спонтанный фон = 18.0±1.4

Таблица 6. Влияние концентрации S9 mix индуцирующего мутации у S. typhimurium ТА 98. на мутагенность РЫР,

Конц-я S9mix Конц-я PhiP (мкг/на чашку) Среднее число ревертантов на чашку, Х±8Е

5%, 100 мкл/на чашку 0.05 95.0±7.5

0.125 224±19.8

. 0.25 283±50.5

10%, 100 мкл/на чашку 0.05 119.3±0.б

0.125 265.3±50.5

0.25 605.7±45.5

♦Примечание: спонтанный фон = 12.7±4.2

Изначально использовали 5% S9 mix в количестве 100 мкл/на чашку как для ВАР, так и для PhiP. Однако, при данной концентрации смеси не наблюдалось ярко выраженного ответа. Поэтому в дальнейшей работе мы увеличили концентрацию микросомальной смеси и использовали 10% S9 mix в количестве 500 мкл/на чашку при

18

работе с бенз(а)пиреном и 10% S9 mix в количестве 100 мкл/на чашку при работе с 2-амино-1-метил-5-фениоимидазопиридином Это показывает, что содержание микросомальной фракции имеет неодинаковое действие на проявление мутагенности исследуемых веществ

Конценграциию мутагенов подбирали путем изучения их влияния на рост гесг-культур и использовали концентрации не вызывающие подавления роста бактерий

Среди штаммов пропионовокислых бактерий, полученных из различных источников обитания, был проведен скрининг, целью которого явилось изучение их антимутагенной активности в отношении мутагенеза 4-НХО и отбор наиболее перспективных штаммов с точки зрения их АМ-эффекта. 4-НХО был выбран на начальном этапе исследования в связи с тем, что представляет собой стабильное химическое соединение, обладает сильным канцерогенным действием, не требует метаболической активации, а также в связи с высокой воспроизводимостью результатов Со штаммами, проявляющими выраженный антимутагенный эффект были проведены дальнейшие исследования Их АМ-активность тестировали в отношении мутагенов, вызывающих различные типы мутаций Особое внимание было уделено изучению АМ-активности двух близкородственных штаммов Р Jreudenreichn subsp shermanu КМ 103, Р Jreudenreichn subsp freudenreichu KM 133, поскольку они проявляли высокую антимутагенную активность, а также, потому что именно эти виды бактерий имеют наибольшее практическое применение Результаты исследований представлены на рисунках 10 и 11

Как видно из рисунка 10, что к ж Р freudenreichu subsp shermanu KM 103 и P freudenreichu subsp freudenreichu KM 133 полностью снимали мутагенность Na№ К ж. других исследуемых штаммов также обладали значительным антимутагенным эффектом Наиболее ярко выраженный AM эффект проявляли клетки Р freudenreichu subsp shermanu KM 103 и P globosum KM 38 Антимутагенность клеток других исстедуемых штаммов гакже была весьма высокой (>60%)

Рисунок 10. Антимутагенное действие культуральной жидкости н клеток пропионовокислых бактерий в отношении мутагенеза, индуцируемого азидом натрии у & фрЫтипит ТА 100.

♦Примечание: пропионовые бактерии выращивали в течение 48 ч., время предынкубации с мутагеном составило 30 мин.

1. Р. ^еискпгеккИ виЬзр. зИегтапп КМ 103

2. Р. /геискпгек/гп ьиЪяр.^геиЛепгекИИ КМ 133

3. Р. /геиЛетекИИ яаЪяр.^-еис/епгекЫ! КМ 54

4. Р. й/ойоя/от КМ 38

5. Р. ре1ег$опИ КМ 6

Из данных, представленных на рисунке 11, видно, что к.ж. Р. /геиЛепгекЫ! виЬвр. зИегтапН КМ 103 практически полностью снимала мутагенный эффект 4-НХО (АМ эффект 99.0%). К.ж. Р. /гешкпгекИИ БиЬзр. /гешкпгеккН КМ 54 снижает мутагенный эффект 4-НХО на 59.9% Ингибиторный эффект к.ж других исследуемых бактерий был несколько ниже. Защитный эффект живых клеток довольно высок во всех исследуемых штаммах. Значительное снижение АМ эффекта у мертвых клеток наблюдалось лишь в случае. Р. gloЬosum КМ 38 и Р. ре1егзопН КМ 6.

I ■ куль тур алькая I

1 ЖИДКОСТЬ

< ■ живые клетки

□ мертвые клетхи

12 3 4 5

I

Рисунок 11. Антимутагепное действие культуральной жидкости и клеток пропноновокислых бактерий в отношении мутагенеза, индуцируемого 4-1ГХО у 51 Iуркипипит ТА 100.

•Примечание пропионовые бактерии выращивали в течение 48 ч, время предынкубации с мутагеном составило I 5 часа.

1. Р /геиЛепгаски зиЬяр зИегтапи КМ 103

2. Р /геис/епгасИи эиЬвр /гешкпгысИи КМ 133

3. Р /геис/епгас/ш зиЬхр /гешкпгегсЫп КМ 54

4. Р gloЬosum КМ 38

5. Р ре1ег.тпи КМ 6

Для идентификации природы аншмутагенного фактора было изучено влияние диализа, нагревания (92°С, 15 мин) и гтротеолиза на АМ-акгивность культуральной жидкости Как видно из данных, представленных на рисунке 12, антимутагенный фактор представлен относительно термоустойчивым соединением белковой природы с молекулярной массой более 2 О но менее 120 кОа (рис 12)

■ (Ж. не обработанная

■ клс после диализа (1-

2к0а) И ж. после диализа (12 kDa)

Окж после нагреваю«

■ к.ж. после действия проназы

■ кж после действия трипсина

1

2

3

4

Рисунок 12. Влияние диализа, нагревания и протеолиза иа антимутагенпое действие культуральной жидкости в случае мутагенеза, индуцируемого МННГ, 4-НХО, 9-АА.

Впервые данные об антимутагеном действии внеклеточного пептида !йгер1отуее$ ¡¡изею были представлены в работе японских исследователей (Оваада е! а1,1986).

Хота эксперименты ставились по схеме дисмутагепеза (предынкубация мутагена с антимутагеном), тем не менее, мы не можем утверждать, что АМ-действие бактерий ограничивается только дисмутагенезом. Поскольку инкубационная смесь вносилась в чашки Петри с тест-культурой и инкубировалась в течение 48 часов, можно предположить функционирование двойственного механизма АМ-дейсгвия, то есть наряду со способностью бактерий к дисмутагенезу, не исключена их способность выступать в реши источников биоантимутагенов.

Таким образом, в настоящей работе представлены новые дополнительные факты, обуславливающие полезные свойства пропионовокислых бактерий, которые открывают дальнейшие перспективы их практического использования.

1. Из клеток Р. freudenreichii subsp. shermanii выделен и очищен до гомогенного состояния внутриклеточный белок обладающий защитной и реативирующей активностью в отношении Е. coli, подвергнутой УФ-облучению, нагреванию, действию желчных кислот. Молекулярная масса активного белка 35.0 kDa.

2. Очищенный белок охарактеризован как цистеинсинтаза. Установлена высокая степень гомологии активного белка с цистеинсинтазами других бактерий.

ВЫВОДЫ

3 Показана АМ-актисность к.ж, «живых» и «мертвых» клеток 11КБ при изучении широкого спектра мутагенных веществ, вызывающих мутации замены пар оснований и сдвига рамки считывания у бактерий

4 Показано, что «живые» клетки ПКБ проявляют более высокий АМ-эффект, чем «мертвые», что не исключает участия дополнительных механизмов антимутагенеза наряду с физической сорбцией

5 Антимутагенез связан с дисмутагенной активностью бактерий хотя не исключен механизм биоантимутагенеза

6 Установлено, что основоной ингибитор мутаций представлен относительно термоустойчивым веществом белковой природы

7 Полученные результаты демонстрируют новые дополнительные свойства иропионовокистых бактерий как пробиотиков и как новых источников ангимутагенных веществ

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М., Варюхина С.Ю. Антимутагеююсгь как дополнительное свойство пропионовокислых бактерий для использования в пище и в процессинге пищи. // У* International Conference on Predective Modelling in Foods. Leuven, Belgium. September 2000. P. 182-184.

2. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М., Варюхина С.Ю., Новые применения пропионовокислых бактерий. // International Symposium "Propionibacteria". Zurich, Switzerland. June 2001. P. 12.

3. Воробьева Л.И., Ильясова O.B., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. и Варюхина С.Ю. Ингибирование индуцированного мутагенеза у Salmonelta typhimxir'mm белком Propionibacterium jrevdenreichii subsp. shermanii. Anaerobe. 2001. V. 7. P. 37-14.

4. Воробьева Л.., Леверриер П., Зинченко А., Боявал П., Ходжаев Е., Варюхина С., Пономарева Г., Гордеева Е., Ян Г. // Антистрессовая активность Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii: идентификация реактивирующего белка. Antonie Van Leeuwenhoek. 2004. V 85. № 1. P. 53-62.

Подписано в печать 29 03 2004 Формат 60х84Ш6 Объем 1,5 п л Тираж 50 экз Зак 159

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44