Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутагенез пропионовокислых бактерий - продуцентов витамина В-12

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Мутагенез пропионовокислых бактерий - продуцентов витамина В-12"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НЯУЧНО-ИССЛЕДОВЛТЕЛЬСКИЙ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

На правах рукописи

ГАНИЧЕВА Тамара Викторовна

МУТАГЕНЕЗ ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ -ПРОДУЦЕНТОВ ВИТАМИНА В-12

Специальность 03. 00. 23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена на Курганском комбинате медицинских препаратов и изделий «Синтез».

Научный руководитель — доктор биологических наук,

профессор Воробьева Л. И.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук

Даниленко В. Н.;

Ведущее предприятие — Институт биохимии им. А. А. Баха РАН, г. Москва.

на заседании специализированного совета 0. 98. 07. 01 Всесоюзного научно-исследовательского проектно-конструкторского института прикладной биохимии.

Отзывы на автореферат, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 125299, Москва, ул. К- Цеткин, д. 4/6, ВНИИбиохиммашпроект, ученому секретарю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИбиохиммашпроекта.

Автореферат разослан « . »1992 г

кандидат биологических наук Захарова Г. М.

Защита состоится

И. И. Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Витамин В-12 нашел большое применение в медицинской практике и животноводстве для лечения различных заболеваний. Это единственный из витаминов, который синтезируется только бактериями. Промышленное производство в нашей стране основано на культивировании пропионовокислых бактерий. Необходимым условием современной микробиологической промышленности является использование высокопродуктивных штаммов. Получение штаммов возможно двумя способами: с помощью методов генной и клеточной инженерии; путем мутагенеза и последующего отбора.

Методы генной и клеточной инженерии значительно расширяют возможности селекции микроорганизмов, но не исключают уже существующие методы традиционной селекции.

Биосинтез витамина В-12 связан с работой большого числа генов, многие из которых в последние годы удалось трансформировать. Однако клонирование генов пока не осуществлено, поэтому главным способом повышения содержания корриноидов в клетках пропионовых бактерий является индуцированный мутагенез.

Цель диссертационной работы: интенсификация промышленного получения витамина В-12 путем селекционирования высокопродуктивного штамма - продуцента витамина В-12; оптимизация условий его культивирования и внедрение этого штамма в производство. Для этого предстояло решить следующие задачи:

- изучить спонтанную изменчивость штамма М-82 Р. БиегтапЦ используемого в производстве;

- изучить индуцированную изменчивость этой культуры под действием различных мутагенов;

- получить высокопродуктивный штамм пропионовокислых бактерий с помощью мутагенеза;

- изучить физиолого-биохимические особенности высокопродуктивного штамма;

- осуществить поиск путей интенсификации процесса ферментации при промышленном получении витамина В-12.

Научная новизна работы заключается в следующем:

I. Впервые в качестве мутагенных факторов в селекции пропионовых бактерий использованы производные дигидроимидазотиазолов, изучены особенности их мутагенного действия.

2. Путем сравнительного анализа различных физиологических свойств мутантного штамма 1-63 выявлен комплекс отличительных признаков в сравнении с исходным штаммом, что позволило отработать оптимальные параметры культивирования нового штамма.

3. Выявлено стабилизирующее действие клеточного экстракта пропионовых бактерий на индуцированную изменчивость культур р _ Eher manii, Pen.chrysogenum, Act.kanamyceticus.

Практическая значимость работы. Получен оригинальный штамм 1-63, превышающий исходный штамм М-82 по влтаминообразованию в лабораторных условиях на 36$, в производственных - на 20$.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы в периодических журналах и сборниках. Подана заявка на изобретение. Получено положительное решение от 25 декабря 1990 г.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав с изложением полученных экспериментальных данных и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 32 таблицы и 22 рисунка. В список литературы входит 72 работы отечественных авторов и 63 - зарубежных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служил штамм М-82 - Propionibacterium shermanii продуцент витамина B-I2, на основе которого осуществлялось производство этого витамина на Курганском комбинате "Синтез" и штамм 1-63, полученный в процессе работы.

Для поддержания культуры, получения и отбора мутантов использовали агаризованную среду следующего состава (%): глюкоза - 2,0, кукурузный экстракт - 2,0, сернокислый аммоний - 0,2, мел - 2,0, хлористый кобальт -0.Q005, агар-агар - 2,0. Колонии выращивали в анаэростате в течение 10 суток. Определение продуктивности по признаку витаминообразования проводили на среде следующего состава(%) глюкоза - 3,0, лактоза - 1,0, кукурузный экстракт - 7,0, сернокислый аммоний - 0,2, хлористый кобальт - 0,001.Ферментацию проводили в стационарных условиях в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащих 200 мл среды. Кислоты, выделяющиеся в процессе ферментации, нейтрализовали 40%-ным. раствором иаон • ^ культуральную жидкость после 72 часов роста вносили предшественник витамина B-I2 5,6-диметилбензимидазол и выдерживали с ним культуральную жидкость в течение 48 часов. Содержание витамина B-I2 определяли физико-

химическим методом Шешикова и др., 1979). Идентификацию кофер-ментной формы витамина B-I2 проводили методом хроматографии на бумаге ( Holdswor-fch , 1953,' Paweiltiewiez, Walerych , 1959). Отбор вариантов, чувствительных к различным мутагенным факторам, проводили по следующей методике. Односуточную культуру бактерий плотностью Ю9 клеток/мл выращивали на среде следующего состава (%) : кукурузный экстракт - 2,0, глюкоза - 2,0, мел - 2,0, сернокислый аммоний - 0,2. Рассев клеток пропионовокислых бактерий, подвергнутых воздействию какого-либо мутагена, производили на агаризован-ную среду и выращивали в течение 10 суток. Выживаемость определяли путем сравнения количества колоний, подвергнутых воздействию мутагена и колоний контроля. Каждую колонию проверяли на содержание витамина 3-12 описанным выше способом.

В качестве мутагенных факторов использовали ультрафиолетовые лучи в комбинации с N - нитрозо - N - метилбиуретом (НМБ),НМБ, пары диэтилсульфата (ДЭС), акридин - иприт, гидрохлорид -б"- (2-буток-си-5-ацетилбензил) изотиомочевину, гидрохлорид-3-(3-хлор-4-пропок-сифенил) 5,6- дигидроимидазо - (2,1 - ^ ) тиазол.

Источником ультрафиолетовых лучей служила лампа БУВ-15. Пары ДЭС действовали на культуру прзпионовых бактерий, выращенных на скошенном агаре в пробирке. Нитрозоалкильные соединения, акридин-иприт и производные дигидроимидазотиазолов использовали в виде 0,2% и 0,6% растворов, исходная концентрация которых вдвое превышала необходимую. Для обработки сливали равные объемы растворов мутагена и суспензии клеток. Обработку проводили при 29° С на качалке в течение 30 и более минут. Действие мутагена снимали быстрым разведением суспензии в дистиллированной роде или соответствующем буфере.

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ РАЗЛИЧНЫХ МУТАГЕНОВ

В работе использовали ряд традиционных мутагенов, широко применяемых в селекции промысленных микроорганизмов, таких как N -ни-трозо-N -метилбиурет (НМБ), Н.ЧБ + УФ-лучи, пары ДЭС, акридин-иприт, а такке производные дигидроимидазотиазолов, относящиеся к лекарственным формам. За исключением ДЭС, все зьие перечисленные мутагены ранее не использовались в селекции пропионовых бактерий.

На первых этапах изучали мутагенную и летальную активность 1К/1Б как одного, так и в сочетании с УФ-лучами. НМБ относится к классу нитрозоалкиламидов и обладает по отношению к различным продуцента?,: высокой инд,уцирук1;;;е:": способностью образовывать стабильные

b

по признаку антибиотикообразования мутанты (Домрачева и др., 19' Летягин и др., 1975; Шувалова и др., 1976; Жукова и др., 1979; Романова и др., 1982; Русинов и др., 1983). Для НМБ характерно одновременно с высокой мутагенной активностью, наличие слабой i тальности.

Мутагенная активность НМБ определяется продуктами его расг да в зависимости от рН обработки. При кислом рН НМБ образует к бомоизоцианат и в этом случае продукты распада взаимодействуют нуклеиновыми кислотами в качестве карбомоилирующего агента (Сер бряный и др., 1973). В щелочной среде НМБ распадается на диазоа каны, время существования которых невелико, обладающие более си ным мутагенным и летальным действием, чем карбомоизоцианат ( lii élis et al. , > 1965).

Наши исследования были направлены на изучение зависимости мутагенного эффекта НМБ от условий обработки. Обнаружено, что в слабокислой среде при рН 6,0 (табл. I) мутагенный эффект НМБ во растает, но при этом наблюдается рост низкоактивных вариантов, щелочной среде при значении рН 9,0 также индуцируются низкоакти ные по содержанию витамина B-I2- мутанты (табл. I).

Под действием НМБ на пропионовые бактерии возникает большо число морфологических мутантов, которые можно разделить на две группы. Первую группу составляют мутанты бордового, красного, к ричневого, белого цветов, по размеру не отличающиеся от контрол вторую - карликовые колонии, имеющие диаметр менее I мм и окраш ные в кремовый цвет. Показано, что морфологические мутанты соде жат незначительное количество корриноидов, поэтому в дальнейшем анализировали на продуктивность только типичные по размеру и цв ту колонии (розовые с диаметром 3-4 мм). Полученные данные подтвердили результаты исследователей (Воробьева и др., 1973; Груз на и-др., 1973, 1974; Купенов, 1973; Рослякова, 1974), что под действием нитрозоалкильных соединений НЭМ, НИМ и НГ, возникает большое количество морфологических мутантов, отличающихся как ц1 том, так и размером и характеризующихся низкой витаминообразухиф способностью.

Использование НМБ в комплексе с УФ-лучами в качестве мутап ного фактора привело к возрастанию летального эффекта в три раз: по сравнению с действием^только одного НМБ (табл. I). Мутагсниьн эффект выразился" в возрастании числа высокопродуктивных вариант! Однако мутанты, обладающие высокой кобамидной активностью, и по;

Таблица I

Индуцированная изменчивость культуры ¿Ьсг/пол/'/ под действием различных мутагенов

Вьиипае-;^-

! вари1°

; антов

Доза мутагена

л:

сг-

С.И

Распределение по классам, продуктивности » по отношению к контролю, %

-г

1-20¡21-40¡41-60¡61-80¡81-100¡101-120¡121-140

НМБ: 0,1%, 60 мин. , „ рН-6,0

НМБ: 0,3%, 5 мин. . тп_3

рН-9,0 4,10

ПО 71,2 20,5 28,8 2 95 90,6 12,1 13,3

Н:.!Б: 0,1%, 30 мин.

рН-6,0 _ 5-10 УФ-лучи:-500 эрг/мм

-2

акридин-иприт: а л

0,001%, 15 мин. У,и

ГХИ: 0,1%, 30 мин. 19,0

спонтанная изменчивость (контроль)

100

140 87,1 12,7 14,5

115 84,3 13,6 15,7

91 89,7 9,6 п,о

172 97,1 6,2 6,4

209 106,0 6,1 5,7

120 95,8 7,7 9,4

II 16 31 36

5 12 60

60 23 -

31 45 20 -

36 43 16 -

12 61 27 -

I 61 28 -

- 19 77 4

12 63 25

5

никшие под действием НМБ УФ-лучи, оказались нестабильными.

Мутагенное действие паров ДХ и акридин-иприта носит менее выраженный характер, чем при действии НМБ. Это подтверждается тем, что варианты располагаются в трех-четырех классах и среднестатистические показатели, особенно у акридин-иприта, незначительно отличаются от спонтанной изменчивости (табл. I). Высокоактивные варианты, полученные под действием этих мутагенов, в дальнейшем не подтвердили первоначальную активность. Дигидроимидазотиазолы относятся к лекарственным формам, обладающим антидепрессивным, жаропонижающим, анальгезирующим и противовоспалительным действием. Пароникян Г.М. с сотр. (1977, 1984) изучали мутагенное действие этих соединений на прокариотах - кишечной палочке и актиномицетах и эукариотах - семенах скерды зеленой и показали, что мутагенная и летальная активность производных дигидроимидазотиазолов сопоставима с действием этиленимина.

В селекции пропионовых бактерий использовали 2 соединения: гидрохлорид - б'- (2-бутокси-5-ацетилбензил) изотиомочевину -■ ГХИ и гидрохлорид - 3 - (З-хлор-4-пропоксифенил)-5,6 -дигидроимидазо -(2,1-4 ) тиазол - ГХТ. Под действием ГХИ и ГХТ происходит сдвиг изменчивости по витаминообразованию в сторону высокоактивных вариантов (табл. I) и число вариантов в классе 101-120 превышает спонтанную изменчивость. Под действием ГХТ возникают варианты в классе 121-140, причем эти мутанты сохранили высокую продуктивность в следующих поколениях. Из представленных данных следует, что наиболее эффективными по индукции высокоактивных мутантов являются ГХИ и ГХТ.

СТУПЕНЧАТЫЙ ОТБОР ВЫСОКОАКТИВНЫХ ВАРИАНТОВ

Процесс отбора активных вариантов продуцента витамина В-12 состоял из многочисленных этапов. На первом этапе селекции в качестве исходного материала служила культура р. БЬегталЦ штамм М-82. На каждом последующем этапе использовали вариант с повышенной активностью, полученный в результате индуцированной или спонтанной изменчивости. Данные по всем этапам селекции представлены в табл. 2. Многоступенчатая селекционная работа с применением различных мутагенов включала в себя первичную оценку признака вита-минообразования у 31000 вариантов, непосредственно для получения ьысокоактивного штамма - продуцента витамина В-12 потребовалось проанализировать 1284 мутанта.

Таблица 2 Последовательные этапы отбора штамма 1-63 si.err.anii

Ступень отбора Исходный материал Продуктивность к исходному штамму, % ! Мутаген: ! доза

I М-82 «

2 1-63 117 ГХИ: 0,1%, 30 мин.

3 к-90 105 спонтанная изменчивость

4 к-5 114 «

5 к-43 112 II

6 к-25 127 м

7 к-62 122 и

8 к-38 112 II

9 к-26 121 II

10 1-9 119 ГХИ: 0,02%, 30 мин.

II к-22 121 спонтанная изменчивость

12 3-3 122 ГХТ: 0,1%, 30 мин.

13 к-56 126 спонтанная изменчивость

14 к-5 127 спонтанная изменчивость

Селекция штамма 1-63 состояла из 14 этапов, три из которых получены под действием производных дигидроимидазотиазолов. Под действием гидрохлорид-<5~- (2-бутокси-5-ацетилбензил) изомочевины на первом этапе изменился состав бактериальной популяции. Средняя арифметическая возросла до 101% при почти неизменном коэффициенте вариации, что свидетельствует о Селективном действии мутагена в отношении малоактивных мутантов. Это же подтверждается распределением вариантов по классам, большая часть вариантов располагается в классах с активностью от 81-100 и 101-120. Из этого рассева ввделен мутант 1-63, который при нескольких проверках подтвердил повышенную способность к витаминообразованию, сохранившую при пассировании. Как показывают результаты дальнейшей селекции, соотношение вариантов в популяции штамма, однажды подвергнутого обработке мутагеном ГХИ, сохранилось в рассевах без обработки на последующих этапах, каждом из которых были выделены варианты с устойчивым превышением витаминообразованил по отношению к исходному

штамму.

Использование более низкой концентрации ГХИ позволило получить на 10-м этапе селекции вариант с повышенной зитаминообразук щей способностью.

Следующей ступенью индуцированией селекции кзляется 12-й этап, на котором при использовании ГХТ бил выделен мутант 3-3, превышающий исходный штамм на 22%. В результате последующих этапов селекции из естественных рассевов были выделены высокоактивные мутанты, превышающие уровень исходного штамма М-82 на 27%.

МЗИОЛОГО-БИОШМЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ 1ИТША 1-63 Р. зЬегпапИ

Кроме повышения биосинтетической способности штамма 1-63 не обходимо было провести работу по оптимизации сред и условий куль тивирования, повышающих витаминообразезание.

Одним из важнейших условий культивирования являются поддержание оптимальных концентраций водородных ионов - рН температурного режима.

Для пропионовых бактерий благоприятной зоной роста является рН 6,3-7,5 (Неронова и др., 1962). Высокие значения рН, выше 7, вызывают угнетение многих физиологических процессоз. При низких значениях рН в интервале 4,95-5,2, конструктивные процессы так® угнетены, так как происходит интенсивное потребление источников углерода и образование пропионовой и уксусной кислот (Ибрагимова и др., 1971). Для пропионовокислых бактерий характерна двухфаз-ность процесса биосинтеза, когда первая фаза протекает в анаэроб ных условиях, а вторая - в аэробных. Исследования, проведенные п выяснению оптимальных условий среды для обеих фаз биосинтеза позволили выяснить (табл. 3), что для первой фазы необходимо подцер живать значение рН равное 6,8, а во второй фазе - 7,2-7,5, за счс чего возрастает синтез корриноидов на 4-7%:

Не менее важным фактором, влияющим на продуктивность пропио новых бактерий является температурный режим. Повышение температу ры, особенно в первые сутки роста, приводит к ускорению деления клеток, что способствует более быстрому накоплению биомассы и те: самым делает производство более эффективным (Воробьева и др.,196' Работа, проведенная в этом направлении, показала, что повышение температуры до 32°С, 35° С, вместо 29° С, вызывает ускоренный рос1 клеток на 6-14%, и одновременно с этим - резкое снижение синтеза

Таблица 3

Зависимость продуктивности штамма 1-63 3}1еГпапц продуцента витамина 3-12 от значения рН

Часы ооста

рН

Содегаание витамина В-12, мкг/.\:л

оп. I

оп. 2

оп. 3

Среднее значение

1-72 ч. - 1-я фаза 6, ,5

73-120ч. - 2- я фаза 7, ,0

(контроль)

1-72 ч. 6; ,5

73-120 ч. 7, ,2

1-72 ч. 6, ,5

73-120 ч. 7, ,5

1-72 ч. г о. ,8

73-120 ч. 7 ,5

27,5 29,4 29,1 28,7- 100$

27,0 32,2 30,4 29,9- 104$

28,5 31,8 30,4 30,2- 105$

30,0 31,2 30,8 30,7- 107",

витамина на 15-27$. Такая закономерность характерна для штаммов М-82 и 1-63 и объясняется, по-видимому, тем, что синтез белка происходит более активно при повышенной температуре, а синтез корри-ноидов - при более низких.

Оптимизация ферментационной среды заключалась в подборе компонентов и их качественного соотношения. Пропионовые бактерии могут расти на средах с различными источниками углерода, но для ви-таминообразования наиболее благоприятными являются глюкоза и лактоза. Для штамма 1-63 наилучшим соотношением глюкозы и лактозы является 3:1.

Изучали зависимость биосинтеза витамина В-12 от использования в качестве источников углеводов зеленой патоки (глюкоза) и молочной сыворотки (лактоза), являющихся отходами пищевой промышленности. Результаты, полученные на средах с использованием зеленой патоки и молочной сыворотки, говорят о снижении витаминообразопа-ния на 5-10:5. Тем не менее эти данные представляют практический интерес в связи со своей дешевизной, и о случае отсутствия стандартного сырья их можно использовать о производстве.

Использование в качестве минеральных форм азота (кн, )бс , > 1Л;лС1 , ( ) НРС^ и НН4КО3 показало, что 1Ш/|КСз оказывает

токсическое действу,- п.олнсстыо останавливает рост бактерий, ос тальные соли аммония .беспечивают примерно такой же рост, чт^ и ( '01 и ту "«е.- ;;р;луктивн:сть по витамину Б-12.

Использование р качестве органического источника азота кук; рузного экстракта, б:гатогс различными аминокислотами, молочной кислотой, макро- и микроэлементами, витаминами показало, что уве личение его до 7% по техническому весу приводит к возрастанию продуктивности более чем на 20% (табл.4).

Таблица 4

Влияние различила концентраций кукурузного экстракта на образование витамина В-12 пропионовокислыми бактериями

Содержанке кукурузного I Содержание витамина В-12, экстракта в ферментационной I мкг/мл

среде,% ! .

5,0 (контроль) ' 2э,6-100%

6,0 31,3-122%

7,0 32,3-127%

8,0 31,7-124%

В связи с возрастанием витаминообразущей способности пропио! вокислых бактерий можно предположить, что используемая 0,0005%-на: концентрация хлористого кобальта является недостаточной и может служить лимитирующим фактором. При внесении в среду 0,001%-ной ко! центрации хлористого кобальта происходит увеличение продуктивное^ по витаминообразованию на 8% (табл.5).

Таблица 5

Зависимость витаминообразования пропионовокислых бактерий от содержания хлористого кобальта

Концентрация,% | Содержание витамина В-12, мкг/мл

сосЛ_ ' Гэп7Г~["п7^"~0п7з—

0,000э (контроль) 2о,4 22,6 26,7 27,7 25,6-100% 0,001 27,о 25,6 29,4 29,о 28,0-108%

O.OOID 28,0 24,1 28,1 28,9 26,7-105%

В результате оптимизации среды и подбора условий культивирования повысили продуктивность штамма 1-63 со 127 до 136% по отношению к штамму М-82.

С целью выяснения возможности использования штамма 1-63 в производстве необходимы результаты полупрокзводственной и производственной проверок. Результаты обеих проверок представлены в табл. 6 и 7.

Таблица 6

Результаты проверки штамма 1.-63 р. зКегиапЦ в полупроизводственных условиях

Штаммы

Количество ¡сРеАний объ-

| ральнои [ЖИДКОСТИ, г

Истинное содержание витамина,% (данные электрофореза)

штамм 1-63

штамм М-82 (контроль)

10 5,2 - 137% 10 4,74- 100%

28,1 - 118% 23,7 - 100%

88,78 - 100" 88,74- 100-5

Таблица 7

Результаты проверки в производственных условиях штамма 1-63 Р.БЬегтапЦ

1990 г. (месяц) Средний объем (содержание витамина в данном объеме культуральной жидкости, г) Количество ферментации

штамм М-82 (контроль) ! ! штамм 1-63 ! штамм М-82 (контроль) штамм 1-63

июнь 270,8 371,5 69,0 5,0

июль 270,4 331,5 81,2 37,8

август 270,0 317,0 7,0 132,0

сентябрь 280,1 345,6 66,4 65,4

среднеззвешенное значение 273,4 - 100% 328,6 - 120% 223,6 240,6

3 полулроизводственных условиях получено превышение по отношению к исходному штамму М-82 на 18%, в производственных - на 2ОТ На основании этих данных штамм 1-63 внедрен з октябре 1990 г. в производство Курганского комбината медицинских препаратов изделий "Синтез". Экономический эффект от внедрения этого штамма составляет 300 тыс. рублей в год.

АН TVJ.iy ТА ГЕННЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОЧНОГО ЭКСТРАКТА ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЯ

В 50-е годы Новак А. и Сцилард Л. показали, что введение пу-риновых оснований в среду для роста бактерий приводит к значительному снижению уровня спонтанной изменчивости ( Novick, Ssiiard, 1952). Это явление получило название антимутагенеза, а вещества, обладающие указанными свойствами - антимутагенами. В настоящее время известно около 200 природных и синтетических соединений, обладающих способностью снижать частоту мутаций. К ним относятся некоторые аминокислоты, нуклеиновые основания, витамины, ферменты, некоторые фармакологические средства, акридин-иприты и их производные. Наиболее перспективными'антимутагенами являются природные, выделенные из различных видов растений и животных. Поэтому вещества, содержащиеся в клеточном экстракте пропионовокислых бактерий и обладающие антимутагенными свойствами, представляют практически интерес.

Исследования, направленные на выделение клеточного экстракта пропионовых бактерий и изучение антимутагенной активности, были осуществлены Воробьевой Л.И. в 1990 году. Нами установлено, что в присутствии белковой фракции, выделенной из клеточного экстракта пропионовых бактерий, происходит снижение индуцированной и спонтанной изменчивости продуцентов витамина B-I2 P#shermanii пенициллина Pen. chrysogenum, канамицина Act. kanamyceticus . В случае прединкубации бактерий p.shermanii в растворе антимутагена (AM) перед воздействием нитрозогуанидина выживаемость увеличивается в 30 раз по сравнению с неинкубированными клетками. Спонтанная и индуцированная изменчивость по отношению к витаминообра-зованию снижались и наблюдался сдвиг в сторону более высокой продуктивности (табл.8). Возможно, что в клеточном экстракте пропионовых бактерий содержатся вещества, препятствующие метилированию или активирующие репарационные механизмы .(Walker , 1984).

Таблица 8

Стабилизирующее действие клеточного экстракта пропионовых бактерий на индуцированную и спонтанную изменчивость & г Лег/пол/^

Кул ьтура мутаген, доза Антимутаген (0,5 мкг/мл по белку) Выживаемость, % Количество вариантов : Распределение вариантов по классам по отношению к контролю, %

X. ! 1-20121-40 41-60 1 1 г ¡61-80Í8I-I00!I0I-I20

i i т i i i

ч \ N НГ: 0,01%, 30 м. рН -6,0 + 1,7.Ю-2 114 97,5 11,5 - - - 16,7 43,8 39,5

S 0 N НГ: 0,1%,30м. - 6,5-Ю-3 104 90,5 18,1 - - 5,8 17,3 46,2 30,7

1 спонтанная изменчивость + 100 124 106,0 6,3 - - - - 20,2 79,8 '

Ц ч- спонтанная изменчивость - 100 108 97,8 11,8 - - • - ИД 33,3 55,6

? ч á НГ: 0,25%, 120 м. + 8 100 94,1 •23,4 4,0 9,0 4,0 9,0 38,0 36,0

ч* •Kl' Я) НГ: 0,25%, 120 м. спонтанная изменчивость + 12 100 100 88 55 107 85,0 31,0 100,7 5,0 95,5 6,5 4,5 1,1 - 2,3 8,0 3,7 40,0 49,0 77,5 52,1 49,0 18,7

1 НГ: 0,2% + З-Ю"1 108 78,0 22,0 0,9 2,8 H.I 32,4 46,1 7,4

2 часа - 9-Ю-2 103 74,5 25,6 - 1,9 15,6 32,0 44,7 5,8

» спонтанная изменчивость • + 100 100 50 50 98,7 89,4 13,5 17,0 - 2,0 6,0 8,0 20,0 48,0 46,0 40,0 28,0

Результаты изучения действия клеточного экстракта - А'.' на спонтанную и индуцированную изменчивость Act.kanamyceticus показали, что стабилизирующее действие AM проявляется также у акти-номицетов, имеющих близкое филогенетическое родство с пропионово-кислымн бактериями (табл.8).

Экстракт пропионовых бактерий оказывает защитное действие против токсичности мутагенов не только у прокариот, но также у низших эукариот, представителей низших грибов Pen. chrysoeenum продуцента пенициллина. Прединкубация конидий pen.chrysogemm приводит к десятикратному увеличению выживаемости после воздействия НГ (табл. 8). Исходя из представленных данных, следует, что антимутагенное свойство клеточного экстракта пропионовых бактерий представляется одним из перспективных и новых направлений использования этой группы бактерий. Особенно важно стабилизирующее значение этого фактора в процессе хранения различных микроорганизмов-продуцентов антибиотиков, ферментов, витаминов, так как любая чистая культура производственного штамма представлена рядом мутантных форм, то есть гетерогенна по своему составу.

ВЫВОДЫ

1. Изучено летальное и мутагенное действие НМБ, НМБ+Уй-луч, ДЭС, акридин-иприта и производных дигидроимидазотиазолов в отношении пропионовокислых бактерий - продуцентов витамина B-I2.

2. Наиболее высокой мутагенной активностью по отношению к культуре P.shermanii обладают производные дигидроимидазотиазолов: гидрохлорид - С- (2-бутокси-5-ацетилбензил) изотиомочевина

и гидрохлорид-3-(3 -хлор-4-пропоксифенил) 5,6 - дигидроимидазо (2,1-Ь ) тиазола.

3. В результате мутагенеза под действием дигидроимидазотиазолов и ступенчатого отбора мутантов был получен высокопродуктивный вариант - штамм 1-63 p.shermanii

4. Изучены физиолого-биохимические и культуральные свойства полученного штамма и оптимизированы условия культивирования и состав ферментационной среды.

5. Показана возможность стабилизации ферментаций продуцентов витамина 3-12, канамицина и пенициллина путем использования клеточного экстракта пропионовых бактерий.

6. ¡3 результате проведенных исследований получено увеличение витаминообразоваиия штаммом 1-63 в лабораторных условиях на 36%,

в производственных - на 20% по отношению к исходному штамму М-82.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ганичева Т.В., Воробьева Л.И. Изменчивость пропионовокис-лых бактерий под действием химических мутагенов // Микробиология.-1991. - Вып. I. - № I. - С. 101-106.

2. Воробьева Л.И., Чардынцева Т.А., Воробьева Н.В., Ганичева Т.В. Прописновокислые бактерии как источник антимутагенов // Достижения биотехнологии - промышленному комплексу. - 1991. -Т.2.-С. 135.

3. Воробьева Л.И., Ганичева Т.В., Русинов С.Ф., Широносова Л.А., Шищенко Л.Д., Воробьева Н.В., Чардынцева Т.Ф. Стабилизация микробных ферментаций путем использования экстракта пропионово-кислых бактерий II Прикл. биох. и микроб. - 1992. - Т. 61, вып. 3.