Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и производство новых пробиотиков на основе бактериальных культур

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Создание и производство новых пробиотиков на основе бактериальных культур"

ггз од

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МЖГОБГОЛОГШ И ВИР/ООЛОГИИ

На правах рукописи

ГАВРИЛОВА. Нина Николаевна

СОЗДАНИЕ И ПРОИЗВОДСТВО НОВЫХ ПРОБЮТИКОВ НА ОСТОВЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР

(03.00.07 - микробиология)

Азгорефера т

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Алмэты - 1993

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ

На правах рукописи

ГАВШОВА Нина Николаевна

СОЗДАНИЕ И ПРОИЗВОДСТВО НОВЫХ ПРОБЮТИКОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШЫУР

(03.00.07 - микробиология)

_ Автореферат,

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Алмэты - 1993

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии HAH PK.

Научный консультант: академик HAH PK, доктор апологических ■наук, профессор А.Н.Илялетдинов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт микробиологии АН Узб.

ОФИЦИАЛЬНЫЙ ОППОНЕНТЫ:

1. Доктор оиологических наук Б.Т.Толысйаев

2. доктор биологических наук P.M.Алиева

3. Дцктор технических наук А.В.Витавская

Залита состоится "_"_199 г.в_ час. на

заседании специализированного совета Д 53.24.01 при Институте микробиологии и вирусологии HAH FK по адресу: 480100, г.Алматы, ул. Богенбай Батыра, д. 103.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии HAH PK.

Автореферат разослан "_"__ISS г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Н.А.Айтхожина-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Интерес к микробным препаратам имеет длительную историю, но в последние годы он значительно усилился в связи с тем, что широкая химизация сельского хозяйства приводит к загрязнению химическими веществами окружающей среды, пищевых продуктов растениеводства и животноводства.

Использование антибиотиков л качестве кормовых добавок для стимуляции роста и лекарств для лечения и профилактики болезней вызывает нарушение нормальной микрофлоры человека и животных, нарастание числа штаммов-возбудителей заболеваний, характеризующихся полирезистентностью к действии антибиотиков.

Микробные 1©епараты, изготовляемые на основе молочнокислая бактерий и других симбионтов желудочно-кишечного тракта, в отличие от химяогерапевгических средств способствуют нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта и не вызывают вредных юбочных явлений. Они жгут использоваться в качестве биологических консервантов при заготовке сочных кормов,переработке плодов и овощей, в составе кормовых добавок и лечебно-профилактических препаратов для молодняка сельскохозяйственных животных и птиц.

Для биологического консервирования растительных кормов рекомендуются в основном моно- и смешанные культуры молэчно-кислых бактерий. При этом одни и те же препараты зачастую используются для консервирования как легко-,, так и трудноси-лосушшхся растений. Силосование грубых кормов в последнем случае возможно лишь после предварительной обработки, а также в смеси с легкосилосующимися растениями или с различными добавками: зерноотходами, мукой, мелассой, сывороткой и т.д.

Институтом микробиологии и вирусологии HAH Республики Казахстан предложена новая технология заготовки силоса с использованием трех видов сухих бактериальных заквасок,специализированных для определенного вида растительного сырья (Соколов,' 19®, 1970; Шамис, 1970; Березина, 1976; Базанова и др.,1977; Баяхуноз, Попенко, 1970; Березина, Саубекова,1983). Препарат AMC готовится на основе а ми ло ли ти чес ко го молочнокислого стрептококка Streptococcus lactis diastaticus И используется для силосования трудносилосующихся растений; препарат ПМБ, созданный на основе пенгозосбраживающих молоч-

Н0КИСЛЫХ бактерий Lactobacillus pentoaceticum , р°К0меНД0ва1 для силосования солош; препарат ПКБ, содержащий пропиоково-КИСЛЫЙ бактерии Propionibacterium shermanii , СЛУЖИТ ДЛЯ силосования кукурузы и других высокосэхэрпстьос растений.

Эффективность препаратов была доказана при консервировании растительного сырья в колхозах и совхозах Казахстана, России, Украины, Кыргызстана (Нушатканов и др.,15£0»Ахмедивв, Балагутина, 1991; ГДихяева, 1988). В связи с необходимостью расширения производства к применения биоконсервантов встал вопрос о разработке технологии их промышленного производства.

Микробаотйки по характеру воздействия ка животный организм можно условно разделить на лечебно-профилактические и физиологические. Препараты физиологического действия готовят на основе Целого ряда микроорганизмов: молочнокислых, пропаоновокис-лых и целлшозолитических бактерий, дроажей и др. Они оказывают положительное воздействия на продуктивность животных путем синтеза витаминов, незаменимых аминокислот, органических иг слог, гидролитических ферментов, повышающих усвоение корма." Наиболее изучены микробкотики лечебно-профилактического действия. Однако большинство из них лишь усиливает действие антибиотиков, а не заменяет пх или используется после антибиотико-герапип для восстановления нормальной микрофлоры кишечника. Часты случаи, когда применение рекомендованных препаратов Не эффективно, так как не учитывается характер инфекции,доминирующей в хозяйствах. В рядя исследований, особенно на птицах, при использовании микробиотиков получены противоречивые результаты, что свидетельствует о недостаточной изученноети пробиотических препаратов. Не всегда определена способность входящих в препарат микроорганизмов прикрепляться к слизистой кишечника и предупреждать его колонизацию патогенными микроорганизмами.

Анализ и обобщение теоретических и прикладных исследований показал актуальность разработки гових микробных препаратов, предназначенных в качестве микробиотиков физиологического и лечебно-профилактического действия, для консервирования растительного сырья.

Целью .настоящей работы было создание на основе молочнокислых, пропионо во кислых и целлюло-

эолитических бактерий-новых лечебно-профилактических препаратов и кормовых, добавок для сельскохозяйственных животных и домашних птиц,"микробиологически* консервантов для широкого набора растительного сырья и разработка технологии их промышленного производства.

Исходя из поставленной цели> определены следущие задачи:

- изолировать из желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и домашнах птиц высокоактивные штаммы микроорганизмов с заданным свойствами: антагонистическая активность к патогенным разновидностям коли бактерий, сальмонелл, иигелл; устойчивость к лекарственным препаратам; способность к адгезии, а также к синтезу витаминов группы В, неъамзнишх аминокислот, гидролитических ферментов;

- создать на основе отобранных штаммов лечебно-профилактические препараты, эффективные против талибактериозов и смешанных кишечных инфекций;,

- составить кортовую добавку, гювволяодую повысить переваримость. клетчатки, ворнализовать белковый обмен в повысить продуктивность животных;

- повысить у исходных штаммов молочнокислых и прошоново- . кислых бактерий, рекомендованных для консервировашя растительных корлов, способность к накоплению биомассы, кисяотооб-раэование при сбраживании углеводов растений; антагонистическую активность по отношению к гнилостной микрофлоре и микроскопическим грибам, устойчивость к кормовым антибиотикам,тепловому воздействию;

- определит^ условия культивирования микроорганизмов, обеспечивавшие максимальное накопление биодассы, высокую био-химическув/антагониетическую активность;

- изучить ксеро- и термочувствительросгь микроорганизмов и разработать мзтод их обезвоживания;

- выявить оптимальные условия хранения и реактивации высушенных препаратов;

- проверить эффективность разработанных микробиотиков на 'сельскохозяйственных животных и домашних птицах;

- организовать промышленное производство бактериальных препаратов для консервирования растений.

^В данной работе приведены результаты исследований,выполненные под руководством и при личном участии автора в 1969-1992 гг.,

б

опубликованные в научно-технической литературе и внедренные в микробиологическую промышленность.

- При исследовании микрофлоры желудочно-

кишечного тракта сельскохозяйственных г.пьогных л птиц выделены микроорганизш-антагонисты к различны:.: ьозбудп;олш кишечных заболеваний, продуцент витаминов С, группы В, незаменимых аминокислот, гидролитических ферментов, с повышенной способностью к адгезии, которые, г. лгу г Сыть использованы грп создании новых микробио гиков направленного действия.

Отобрана культура Lactobacillus casei 173а С ЕИрОКИМ спектром антимикробно-;: активности, обусловленной антибиотиком пептидной природы с Уф-спектром 300 км, отдичасдоизя or ранее известных.

.Для культур S.lactis diastaticus, F. shernanii, L. pen-toaceticun , ранее предложенных для • использования в кормопроизводстве, впервые установлены границы чувствительности к температурногду фактору, обезвоживании, выявлены стимуляторы их размножения и метаболизма (экстракты некоторых растении,аглино-кислоты, отходы производства антибиотика розвофунгикз).

Установлена высокая метаболическая активность бактерий Lactobacillus brevis Б-3 ,Lactobacillus casei 139, Lactobacillus casei - I73a, P. shermanii-15

г.ри совместном культивировании, обусловливающая широкий спектр их антимикробно и активности.

Разработаны гаучкпз .основы создания кикробиотиков 'из молочнокислых, п^опноноеокпслых и деллюлозолитических бактерий.

результате теплового воздействия на КОЛОЧЙОКИСЛЫ'! бактерии S.lactis diar.tat.icus И l. pentов-ceticua получены варианты, на основе которых созданы сухие биопрепараты для консервирования растений с повышенным сроком годности. Разработана технология их промышленного получения и организовано серийное производство на заводах микробиологической прсмизленкосги.

Разработан способ приготовления питательной среды из фуга гов бактерий, позволящий организовать процесс производства сухих бактериальных концентратов трех видов по замкнутому Циклу (A.c.'Ji 1423586; А.с. & I3297I7; рзд.предложение,удосго-EepeH28.fi 13).

Выявлены стимуляторы роста .молочнокислых и пропионовокис-

лых"оакгеряй:.. экстракты- вер блажь ей колючки'и полыни"метельчз-Y ■ гойг'огхолы'чроизводсгда .антибиотика. розеофунгйна;.(::А^ с;.,й, ." 1762В37^А.с. 171 Г7®^ГбгокассаBacillus".subtilis:BEQE:'('А.с; -J« 167707ШГ..

Уста но влево, что - для. домине ния' нео бходимого'соотношения:.. КУЛВТУРЗ"."! actis". • diastaticus И, Р. shermanii:.: i (I: I); 1ПреДУ-~ смогрэиного • техшчеокикя' уело вяяш ■ для:.конечного :цродгкла, сов- - -местное'их вырапдавэние' ."следует проБОдиг£"при::гемпераЕУре.31~32-С2\' / A.ci.№.1676573173;,

Предложен." спосабсосаядеяая-биомассн~бак19Рийгс:"помощъв:реа; :; -генгов: (А. с.. й .1091549).:';,

Создана кормовая'добавка:на основе:цедяигозолптячдских;и-" ■■ пропгонавокислаг. бактерий, ;.адсорйировэятс£:"на бентояите^Препарат: спосо-бствует:лавшеняп1расщепления. клетчатки :ко;ша; '-увеличешв-.л синт«за::вигамйналВ^2«"; говывениптрезервной-щёлочности'.тфовй,"!."':, нормали задал1 б елковзго с otfMe нз,: повышению ■ "Продукиетго сти гживог - : -

На основе - LactobacilluslbreTrx~£-3~0"Propi<mibacteriumi'.;™ shermsnii:.:-. 15 создан:гошй:"Л9чдбно-11рофштктический""прехйрзт:".: лактовит-К, -эффейтивннй при "профилактике "в-лочешг.хшшбактг-'.'-' -риодов ,-дошшвяг: птиц :я_те.чят:. (Полояет ;рвшенпе' по заявке ■&■• 4712492/15^приоритет от 29.06.89.)»

разработан ."новый "лёчййно-профялактпчдекай. препаратлголплгк- > совит.на основе'.шлочнокислых бактерийь.Ъгвудв' ' Б-3, I.. :.... casei• 139^.cssei ;173а"и. прошгоновокислыг бактерий: :.р. ; ihernsnii• - 15 прогав;'смэ!вэнной-ишечноа*ивфэкцяи;'-"".

Отработана /технология-получения микробйотиков.

Ш-ззшзишгйёз&в^жтзш--':

Необходишпть :исследований:1мкроорганязмов-симбаонтов же-:" -удочно-кишчного: тракта для:созданпя'шкрабиотиков^адравлен-г -ого • д е йс гвяя;-:новый"ле чебно-про филами че екай'лрепзра г" лакго ИТ-K," С03данный:ъ*а основе"L.brevis - .Б-3" и': Р. shermanii'-I5,-Ir. эедназначенный;для-лечения колибактеряозов" сельскохозяйствен- .И' нлвогных "и пгиц и. повшения резистентности .к другамгзаболе-' шяя:л;

- яовый:ле4йбно-профилэкгический:препарат1полилакговит^.:: ■зяанныГг на основе'юлочнокяслых,:бакгерий L.brevis-.-..E-3, L. ":. isei-I73a,"L;. casei - 139!и' пропионовоки слых: бактерий: :: P.sher-c --nii.u.. - 15 - антэгонисгов против смешанной'кишечной'ин-"

фекции (в том числе сальмонеллеза) и продуцентов витаминов С, группы В, незаменимых аминокислот, протеолитических ферментов;

- новая кормовая добавка бентобак, составленная из целлю-лозолитических бактерий Cellulomonas flavigena - 22 а

про пио новокислых бак!ёрий P.shermanii - 15, адсорбированных на бентоните, и предназначенная для нормализации белкового обмена и повышения продуктивности животных;

- штаммы МОЛОЧНОКИСЛЫХ бактерий S.lactis diastaticus AMC БН-23 и ь. i>entoaceticumi3MB-X0» характеризующиеся повышенной активностью накопления биомассы и высокой кислотообразующей способности) йри сбраживании углеводов растительного сырья;

- технология производства бактериальных препаратов для силосования растительного сырья.

' Материалы диссертации доложены и обсувдены

на У1 и УП съездах ЙЮ (Рига, 1I23Ö; Алма-Ата, 1985); 9-ом меадуй0р0дн0м 'сйшй'зауйв ао'.'непрерывному культивированию (Чвхо&швакия, •1987)-,"дя/х межведомственных совещаниях по проблема: "Разработка и организация производства бакпрепаратов на основ? модоч^кисл&'б&к*ёрйй (Вильнюс, 1983; Вышний Волочек, 1987); координационном совете по ветеринарии МСХ PK (Алма-Ата, 1985); 9-ти всесоюзных конференциях (Москва, 1973; Фрунзе, 1976; Пущино, 1978; Душанбе, 1981; Киев, 1981; Алма-Ата,1284; Ташкент, I9B9; Алма-Ата, 1990; Степногорск, 1991).

Основные материалы диссертации опубликованы в 47 печатных работах.

Диссертация состоят из введения, обзора литературы, раздела, включающего описание объектов исследований и методики работы, 4 разделов, содержащих результаты экспериментальных работ автора, заключения, выводов, списка цитированной литературы, содержащего 339 источников. Диссертация. изложена на 264 страницах машинописного текста, содержит 103 таблиц и 13 рисунков.

СОДЕРЗАНИЕ РАБОШ Объекты и методы исследоааняя В работе использовали культуры амилолитического молочнокислого стрептококка Streptococcus lactis diastaticus (AMC), пропионовокислых бактерий Propionibacterium shermanii (ПКБ) , пенгоаосбраживашдах. молочнокислых бактерии Lsctotiaciiius

pervtosceticum(IMj), ЦелЛВЛОзОЛИТИЧеСКИХ бактерий Cellulomonas fiavigerm (ЦЛБ), полученные из коллекции Института

микробиологии и вирусологии HAH PK, и 185 нейдентифяцированных штаммов бактерий, выделенных нами из желудочно-кишечного тракта жвачных животных и птиц.

Молочнокислые бактерии выращивали на сусле, средв МРС,а также сахаро-минеральных средах с кукурузным экстрактом.Цро-пионовокислые бактерии культивировали на кукуруз но-глюкоз ной среде с сернокислым амшнкем и кобальтом хлористым, целлолозо-литические бактерии - на среде Гетчинсона, соломенном отваре, а также на кукгрузно-сахэрной среде с добавками различных исто чяиков углерода я азота.

Оптимизацию состава питательной среды осуществляли с помощью метода математического планирования'эксперимента (Бирюков, 1975).

Морфологию клеток бактерий изучали на световом микроскопе Polyvar; электронных микроскопах U-I00 В ( Яювия), ЭМ-125 (СССР).

Для определения ультра структуры клеток сухие препараты растворяли в воде в соотношении 1:1000, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Осадок фиксировали 2,5Й-ным зэсгвором глсгарового альдегида' в ацетатном буфере в течение !,5 ч с последующим фиксированием в 1<£~пом растворе четарех->киси осмия,-^цриготовленного на том же буфере. Дегидратаций 'бьекгов проводили по общепринятой схеме;заливали в смесь поксндных смол. Ультратонкие срезы готовили на ультра томе 3-4. Препарат просматривали на электронном микроскопе СЭД-7А ри ускоряющем напряжении 60 кв.

Икценгификацию микроорганизмов до вида проводили го опре-елителю Берге ( Berge,1974; Берге, 1930).

Титр бактерий определяли путем ряда последовательных раз-здений в стерильной водопроводной воде и высева их в агари-званную питательную среду с последующим подсчетом выросших 5ЛОКИЙ.

Наличие про г еолиги ческой и амилолиги ческой активности нанашивали по зонам гидролиза казеина и крахмала яа твердых -татзльных средах, целлмозолигической активности - по сте-ни разложения целлшозы в среде Гетчинсона и чашечвш мегом по зонам гидролиза Na -КМЦ. Амилолитическую активность

определяли также Содометрическим методом (Рухлядева,1981).

Содержание сахара устанавливали методом Бертрана, органических кислот - по ВигнерУ- и с помощью газожвдкостной хроматографии, кислотность - титрованием 0,1 N НзОН и выражали в градусах Тернера.

Концентрации витаминов группы В определяли методом диффузии в агар с использованием в качестве гест-культур следующих микроорганизмов: ДЛЯ Определения витамина Bj2 - Escherichia coli II3-3; Bj - Endomyces nognusii Ludvig BHLC-I079; B2 - Ostt, rayces japonicus Kudr.ncw BKaC- 655 i Bg - Zygoiab. spor.a nar-

xiane Hansen ЕКЛГ-832; Bg - Deharionyces dispcrus

БКМУ-1034; By - Zygosaccharoayces Eailii ЕЮ,'У-853; -Saccharcnyces carlsbergensis (Hansen) Dekker BtCiiy-1171;

B9-II "Ehodotorula sp. 45 (Одинцова, 1959), а также фотометрическим методом на спектрофотометре спякорд " UWIS " (ГДР).

Определение витамина С проводили пирометрическим методом (йдьченко, 1974).

Качественный и количественный состав аминокислот исследовала на аминокислотном анализаторе марки AAA-339 ЧССР после соответствующей подготовки пробы. Подсчет количества аминокислот проводили по площади пиков на автоматическом интеграторе марки 26-С.

Ксеро- я термограымы бактерий составляли по методу M.S. Бекер (1967).

Для изучения антибиотической резистентности использовали общвпринятуо методику дисков, пЕопагашшзг растворами антибиотиков в следующих концентрациях: стрептомицин, хлортетра-цакдин, окситвтрацикщш, эритромицин, хчорамфвнакол-50 ют/мл; неошцин, палимиксин, капамицин - 30 мкг/мл; одеандо-мавдш-15 мкг/мл; антибиотики нигрофуранового ряда - 50 мсгЛи (фуразоладон - 15 мкг/мл).

'Адгезивную активность бактерий изучали по методу,разработанному С.С.Гизатулиной с соавторами (1289), на эритроцитах морской свинки и петуха. Реакцию оценивали в степенях: I степень - отрицательная реакция, 2 - отсутствие адгезии, 3 -средняя адгезия, 4 - высокая адгезия. Для получения данных по антиинтерфероновой активности использовали препарат человеческого лейкоцитарного интерферона в концентрации 1/40 и 1/60. В качества индикатора наличия или отсутствия интерферона применяли КУЛЬТУРУ Corynebacteriirn xerosis.

Ангибиотические -вещества, образуемые малочнокяслыми бактериями, экстрагировали из фильтрата куль тура ль вой жидкости бутанолом, из биомассы - ацетоном. Для первичной их идентификации использовали следующие методы: определение антимикробного спектра, тонкослойную хроматографию (ТСХ)и зпекгрофо-гомегрию.

Антибиотическую активность устанавливали методом диффузии в агар (Егоров, 1986) в отношении 27-ТЕСТ-микрооргашзмов, в том числа граштрицатедьншс 6aKTePHli:Escherichia coli 79/1, Е.с oli 0/78,E.coli 76/1,Е, coli 4-7,Salmonella typhimuriun, S. dublin.Proteus mirabilis, Oersinia enterocolitica,Enterobacter agglcmerance .Pseudomonas aeruginosa Ha fnia sp. .Citrobacter sp., Serratia narcesSence .Klebsiella pneumoniae 444, Vibrio chole-геа ; грамПОЛОЖИТеЛЬШЙС бактерий: Staphylococcus aureus,

Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus mycoides R- 537, Micrococcus luteus ATCC 9342»Micrococcus sp; кяслогоустоатавшЕ: 6aKTep0ß:Kycobacterium rubrum ; дрояяеподобных грибов: Candida utilis,Candida albicans, Aspergillus niger.

Антибиотики хроматографзроваля на пластинах " suufoi " марок н и uv 25* ( Avaiier ,ЧССР) в системе растворителей хлороформ-метанол (10:1), обнаруживали их на хроматографах визуально, биоазтографически и по свечению в-УФ-свеге. Отдельные компоненты антибиотических веществ накапливали препаративной. хроматографией. После разделения препарата на ся-луфоле активные зоны с пластинок снимали' шесте с основой , элюировэля этанолом (96^), фильтровали. УФ-спектры препаратов в этаноле измеряли на спектрофотометре спекорд "uwis " (ГДР).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. ID ИСК К ИССЛЕДОВАНИЕ МИКР00ЕГАНИЗШВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЛЕЧЕБНО - ПРО 31ЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ'КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕЛЬСЮХОЗЯЙСТЕЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ^

I.I.Отбор и инденгификзция микроорганизмов

При создания шкробиотиков лечебно-профилактического деЗ-' ствия исходили из того принципа, что они должны состоять из высокоадгезивкых штаммов, обладающих антагонистической ак-тйвцосгыз по отношении к различным возбудителям кишечных заболеваний, ввделеннш от больных животных. Для усиления дей-

ствия микробиотика в его состав должны входить также продуценты биологически активных веществ, в частности, витаминов группы В, незаменимых аминокислот, гидролитических ферментов. Важно учитывать также резистентноегъ бактерий к антибиотикам и другим лечебным препаратам.-

Первоначальный отбор бактерий проводили по антагонистической активности к патогенным штаммам энтеробактерий следующих

родов: Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Citrobacter Aerobacter, Yersinia, Edwarsiells, Proteus , ямеЮЩШСЯ в коллекции Казахского института эпидемиологии и микробиологии и Казахского научно-исследовательского ветеринарного института. В результате были отобраны антагонисты к наиболее часто встречающимся воз буди те лш кишечных заболеваний.

В процессе исследования была определена чувствительность отобранных штаммов бактерий к ряду лечебных препаратов.Выявлены резистентные штаммы к стрептомицину, тетрахлорпду,фурагину, сульфадимезину, левомицетину, норсульфазолу, сулъфадиметоксину, стрептоциду, этазолу, эритромицину, фуразолидону, бициллину, тетрациклину, рифампишну , одеакдомицину, бензилпешциллину, ампициллину, линкомицину, оксэцилляну, далимиксину, фузадину, леворину, нистатину, биезптоду, мономицину, фитолизину.Они могут быть целенаправленно использованы для восстановления 'нормальной микрофлоры нелудочно-кишечного тракта при лекарственной терапии.

Бактериальные культуры исследовали на способность к биосинтезу Еягамиков группы В и гидролитических ферментов. Боль- • пщйсгво изученных штаммов бактерий способны синтезировать панготоновую кислоту и инозит. Среди них наибольшим синтезом пантотеновой кислоты отличаится штаммы 173а и Propionobacteriun Sherrapnii ,ЙНОЗйта - 139, р. shernsnii lrj • АКТИВНЫМ про-ДУЦеЦТОМ ццзнокобалсадна является штамм Propionibacterium sher-manii ; фолиевзй кислоты - 139, 173а; пирвдоксяна - p.sher-

mnnii 15 И ШТ.75; НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ - Е-3 И Р. sherisanii

- 15.

Способность гидролизовать крахмал отмечена у II штаммов бактерий, высокая прогеолигичеекая активность выявлена у 9 штаммов.

По результатам исследований отобраны наиболее сильные антагонисты и продуценты биологически активных веществ, у кото-

рых изучены морфологические и физиологе-биохимические свойства и определена их видовая принадлежность: Lactobaciiius îon-gus ЮН- Lacto^acillus fermentera 149> Lacto^acillus casei I73s> ?l?voKacteriUTi norbifiesns I65s.Lactobscillus casei 139.

1.2. Идентификация антибиотических веществ, продуцируемте молочнокислыми бактериями

Выделен и изучен антибиотический комплекс,продуцируемый кульгурой ь. casei 173 а.

Ш дзннш У5-спектрофотометрии, ТСХ, биоавтографии и антимикробного спектра действия установлено, что антибиотическое вчцесгзЬ содержатся преимущественно в биомассе и в меньшей степени в культуральной жидкости, состоит из двух активных компонентов в биомассе и одного - в культуралъной жидкости.

При хроматографирования в системе'хлороформ-метанол (IG:I) с последующей бзоангогрэфией обнаружены пятна с Rf 0,G5 п 0,24 в биомассе,с кг 0,94 в культурзльной жидкости. У£-спектр поглощения основного активного компонента из биомассы и культуральной жидкости характеризуется максимумом при 300 в' (в этаноле).

Выделенный' антибиотик хорошо диффундирует в агар.гер-молайилен.Ио даннш качественных реакций его можно отнести к низкомолекулярному зещесгзу белковой приреды.

Ангябкогок 173з отлдчаггея ¡щрокш спектром антимикробного дчЗсгвпя. Подавляет рост грамогрицагельных (особенно представителей кишечной группы), грамполокительных й кислотоустойчивых бактерий, дро.тлеподобных грибов и Aspergil-Iup r.igcr (тзбл.1). Из 27 взятых для исследования

г°ст-гликрооргзк:гг.1оь он и» акгяавн только в отношении s. cere-visise.

В доступной кац ;птерагуре не описано антибиотиков, п^-о;цуцй..убШХ ::ог.очкок2лав?и бактериями с таким широким ан-г,™:.;лг::'0сн1л.! nn°K?^or.: действия.

Таблица I

Антимикробный спектр действий антибиотического препарата Ii 173а

Те с г-мп кр о о рга п п з мы

дяамет'о зон подавления со с та _____т g с т -к ¿'лът yp х _ ......

. _ _ спщ tobijp _к0 hü2 н тв а iь-_____

из биомассы : из кулътут.зль-_______________

Escherichia coli 70/1 15 -

•E. coli 0/78 17 II

E. coli 76/1 -L 1 12

E. coli 47 15 II

Salmonella typhirauriu» 15 13

3. suis 12 . -

S. duM in 15 13

Yersinia entcrocoli tier. T 2 25

Entero^aoter cgglc~cr-jnce 14 Ю

Citrobacter sp. 14 -

Hofr.ia sp. 12 -

Troteus-siratilis 13 16

Scrrati? rnaruscence 27 12

Klebsiella pntunoniac IG -

Pseuöorcnas aeruginosa 9 -

Vibrio choler^e 23 -

Stephiloccccus aureus 13 -

Starhiloccccus aureus 200*0 1С -

Bacillus SU' tilis ATCC C-W, 13 II

Bacillus r.ycoides ?.-5Z7 13 14

Micrococcus sp. 10 -

"icrococcus lutcus ATCC9541 IG 14

Mycobacteriu-n rubrua О'.' 12

Candida utilis 10 12

Candida albicans 15 14

Aspergillus nigor 15 ' 17

Saccharomyce^ cerevisiae - -

1.3. Исследований адгезивной способности бактерий

Одним из вакних условий эффективности микробиологических препаратов является способность микроорганизмов, входящих в пх состав, прикрепляться к слизистой кишечника. Установлено,что способность к адгезии у бактерий зависит от условий внешней среды и длительности культивирования. При з1Грощ[!вэни[; на ША из 10 штаммов бактерий адгезивными свойства ш обладали лшь Lactobacillus fermenturaI99 (801? бактерий имели 3 степень адгезии) И Lactobacillus casei I73a {60% - 3 степень). Такие кулыпуры, как Lactobacillus longus ХОН, c.fisvigena-22 ^ имели ярко выраженную отрицательную адгезию, но при росте на питательной среде №9, в состав'которой входят кукурузный зкстракг, меласса.пептон,минеральные соли, они проязляют способность к адгезии. У большинства культур микроорганизмов и их сочетаний наиболызая адгезивная активность проявляется через 24 ч культивирования, через Tioe суток адгезивные свойства остаются без изменений или сннг.аюгся (табл.2).

Таблица 2

Адгезивная активноеть бактерий при культивировании на среде S 9

;___®21£5ьносгь_куттивитования1_ч1

Етаг.мл бактерий : 24 : 48 ' : 72

; сте- • г? степень: % :сте- с

пень .клеток. 27трд_ .кле- . пень клеток

* адге- ЗИП " ток "адге-

: зия : : : зии

L. fernentur IPO 4 100 3 100 3 100

L. brevis- Б-3 3 100 3 100 3 100

Р. shernanii -15 3 100- 2 100 2 100

т brevis -Б-3 + 3 m 2 100 2 100

L. feri?.«r.tui Ioc> 4 40

L.cs оеЦЗ^+ПЬЫб 3 ICO 3 100. 2 100

L У: n;."? ПОЛОГ-'П71 ель но» влияние ионов Сэ^ на адгезивную

способность бактерии.

Учитывая, что некоторые микроорганизмы обладаю способностью разрушать интерферон, содержащийся в кропи человека и животных а играющий ванную роль в обеспечении имунной защиты организма, исследовали антяингерфэроновую активность у ряда штаммов бактерий, обладающих антагонистической активностью в отношении воз будя ю лей кшечннх инфекций. При выращивании изучаемых культур В тест-культурыCorynebaeteriun xerosisHa среде МПА с интерфероном в концентрации 1/40 п 1/60 выявлено, что 22 штамма пз 25 взятых для иссдадовэяая кч облодзюг аиги-интерфэроноБОй активность». Иознэчпгельна.ч зкгпзвосгь доявлопа у Lactobacillus lsctis I0g, Lactobacillus fernentum II, Lactobacillus plsntarurr.

Т&кйм образом, отобранные для коне rr.yar-o гоняя препарате микроорганизмы ойяддаэг способносгьз к адгсггп с но кызяг антиинтерфероковой зкеисвостя.

1.4. Разработка л?чебво-пгофишргп»естого препарата лакгоЕИт-К «Г'Огпв колабактяраозоБ колодвяка СйЛЬШ)ХОЗяКСГЗ<»1ШВХ iaiBOrKUX И ШЛИ

Отбор птаммзв молочнокисло:-: бактерий в состав лечебно-профдзг.тпч.зского препарата дакюьат-К про&здзлв по апхагс-вастаческой антвв'юзт:: к гогэгеша штаммам квпччной палочки, гддалпввым от бальвкх nsssoxsizc а пгзд в хозяйствах А.тахпь-ской области. Направленность отбора связана с тем, что среди пв$9КЦйонных болззвчй срльокохозяйсиииных гявогншс и птиц нааболкаоо распросгрсноив« (в случаев) в«ео? колабакг-?-ркоз. '

, По результатом иссдедокшй в соогав тфешоата бш ии»-

4SII mraKT-Loctobacillus brevir, Б-3, KOTOplBi ЯВЛЯОТСЯ аГ.|ЧШ1Ш

антагонистом к ассладовиввш возбулигелям колвбакгерноза, подавляет такке рост някогорцх развоппдвбегзй кигелл я сальмонелл, золотистого стафилококка, гналосгвой кагрофяори желу-дочно-кгаечцого тракта. Является продуцентом ¡ччамиюв В^,!^, В^ и обладает протеолктичеокой активностью.

Учитывая, что животные и птпцн, пораженные колкбактерпогоы, особенно чувствительны к недостатку витаминов группы В, в состав препарата ввели p. shermanii шт. 15, который является продуцентом витаминов В^, %» способен предупреж-

дать ацидоз и кетоз у сельскохозяйственных животных. Оба штамма

устойчивы к ряду лечебных препаратов, в совместной культуре обладают отчетливо выраженными адгезивными свойствами.

I.4.I. Условия получения сухого препарата

Для совместного культивирования бактерий подобраны 2 варианта питательной среды: I) - питательная среда на основе кукурузного экстракта и минеральных солей (г/л): кукурузный экстракт (по с.в.) - 15,0; КН2К)4 - 2,0;ИаС1 - 2,0; ï.!gS<\

- 1,0; СаСОд - 10,0, в которой в качестве источника углерода используют сахарозу и мелассу; 2) - молочная сыворотка с добавкой If кукурузного экстракта.

На обеих питательных средах культивирование проводят при рН 6,0-7,0 в течение 24 ч.

По данным ксеро- и термогрзмм установлено,что культуры ь. Vrevis Б-3 Hp.shermsnii - 15 МОГУТ быть ВЫСУШеНЫ РЭСПЫЛИ-тельным способом. При этом для культурыь.ьгеvis Б-3 температура сушильного воздуха на выходе из сушилки не должна превышать 60-65°C, а для p. sherrnanii - 15 - 75-80°С.

Устойчивость L.brevis Б-3 к высушивании и хранению била повышена путем отбора клеток из культуры, подвергшейся 2-х и 3-х кратной сушке распылением. Это позволило получить ак- . тязеый сухой препарат с солевым и молочным наполнителями при распылительном высушивании совместной культуры молочнокислых и пропяонокясйслых бактерий. При сублимационном высушивании биомассы бактерий получены препараты, содержащие 40 млрд. и более жизнеспособных клеток в I г (габл.З).

Таблица 3

Высушивание бинарной культуры L.brevis Б-3 И P.sher-

nanii ПКБ-15 различными способами

Варианты сушки

Титр препарата,: Антаговисгичес»Вятамян млрд/г кая активность,В™,

: юл : 1 v/мл

исход.: через :четзез: s" : .6 мес._9м*с .3ureus .

Распылительная с Я a CI

Распыли г.с сухим обезжир. молоком

Сублимационный

1,5 1,5 2,5 2,0

1,5 2,0

18 15 0,56

18 15 0,56

20 18 1Д2

При хранении в холодильнике при температуре 4-5°С препарат лактовит на теряет активности в течение 9 мес.

1.4.2. Проверка эффективности лечебного а

профилактического действия микройиотяка лакювит-К

Испытания препарата проводили соялестно с сотрудниками Института зоологии HAH PS ка десятисуточных условно стерильных гусятах.

Отмечено, что при даче препарата в дозе 6-8® к суточной норме корма гусятам, зараженным внутрибргашнво возбудителем 3. coli серо тип 04, выздоровление наступило ка 7 сутки.При вскрытии выздоровевших гусят изменений со стороны внутренних органов не выявлено. При бакпосеве проб с внутренних органов кишечной палочки не обнаружено.

Использование препарата в качестве профилактического средства в количестве 2-4-6^ позволило избежать заболевания и гибели гусят после их заражения.

В контрольной группе на 4-5 день после заражения и в последующие дни отмечался падеж. При вскрытии трупов регистрировали застойную гиперемию печени, .воспаление гонкого и толстого кишечника, гнойно-фибринозный перикардит и дистрофию миокарда.

Эти опыты подтверждают эффективность направленного отбора микроорганизмов в состав препарата по антагонистической активности к возбудителям заболеваний.

Производственные испытания микробиотина на цыплятах и телятах также показали его высокую эффективность при профилактике и лечении колибакгериозов. При этом отмечено снижение заболеваний кокцидиозом.

Временные наставления по применению препарата лактовит-к и технические условия на производство опытной партии 50 тонн утверждены Главным управлением ветеринарии 2.09.91 г.

Производство препарата организовано с 1992 г. на ошгг-но-промшленной установке института.

1.5. Разработка- лечебно-профилактического препарата полилактовиг против смешанной кишечной инфекции

1.5.1. Отбор штаммов микроорганизмов для включения в состав препарата

Лля составления препарата были отобраны 4 штамма бактерий: Ь.Ьгелгхз Б-3,Ъ. сзБе! 139, Ь. саве1 173а Я гЬегпаихЗ., являющиеся активными антагонистам к патогенным разновидностям кишечной палочки и сальмонелл, а также продуцента!® биологически активных веществ.

Из отобранных штаммов были составлены различные сочетания и определена их антагонистическая активность. Установлено,что ассоциация из 4 штаммов бактерий обладает большей активностью по сравнению с другими сочетаниями (табл.4).

Таблица 4

Антагонистическая активность сочетаний отобранных бактерий в отношения патогенных эшярихий и сальмонелл

Штаммы

НОЕ/

мл

Диаметр зон подавления роста ______те ст^куль TJEa _ш_________

еГ":~s7~:"s~~:~~s.

coli Koli-coli • tr--suis .duMiE 0/78 .76/1; 47 :pnicw

L.brevis +ГШБ-15 1,0-Ю9 13 15 . 8 10 9

L.brevis 3-3+ + L.casei +ПКБ-15 1,08*10® 12 - 8 12 9

L.brevi s В-3+ПКВ-15 + L.casei 159 4,37'Ю9 II II - 13 II

Консорциум ИЗ 4 культур 5,48*I09 19 16 II 10 12 22

У ассоциации 63KTepnÜL.casei 139, L.casei I73a, L.brevis Б-3 и ?. sherrenii -15 выявлона резистентность к неомицину, полимиксину, стрептоциду, лввомшетину, ампициллину, олеавдо-мгаину, б°нзилпенициллину, канамицину, тетрациклину, бисяпто-лу, сульгину, сульфадимезину, норсульфазолу, олететрину.

Установлено, ЧТО монокультуры L.casei 139 L.casei I73a, L. brevisB-3,P.shernanii-I5 и их сочетания способны синтезировать незаменимые аминокислоты (мкмоль/мл): гисгидин (0,016-0,116), изолейцин (0,079-0,280), лейцин (0,046-0,393), лизин (0,071-

0,131), метионин (0,060-0,079), треонин (0,108-0,165),валин (0.168-0,263) и аргинин (0,366-0,573), Наибольшим синтезом аминокислот отличаются штамм L.casei 139 и сочетания культур^, casei 139+L.brevis Б-З+р. shermanii-TJ, L. ca.sei 173-э +L. brevis B-3 + P. sherT.ar.ii.

На основе кулътурЬ. casoi 139,L.casei I73a,ó.brevis В - 3, p.shermanilI5 был составлен лечебно-профилактический препарат полялакговит, з котором n;TaMMp,shern,anii-I5 япляэтся продуцентом витаминов 33, Bg, В^, Bj2',l.brevis Б-3 - антагонистом по отношении К E.coli,Citrc-.ncter clоэсеае ,Prcteur. i г, cons tan s . L. es oc i 139 - продуцентом НвЗЗШВЯМЯХ

аминокислот: гисгидгша, и голе пцпна, лейцина, лкзяка, греовавг, валяна, ей та мл ко в Щ, солиезой кислоты;!.resei 173а -продуцентом протеолйгзчвокях ферментов, взтамзнов Зд, С. Культуры L.casei 139 il со se i I73s ?5ЛЛВГСЯ tskzt а изгони с гами к различным пагогеннш сгазкам сальмонелл.

1.5.2. Получен;!? сухого препарата полплакговяг .

Установлено, чго шгаю.:к бактерий, входяцие в состав препарата подзлактоваг, кэ обладают ипгвбирутещаи действием по от-аоаенвя друг к другу и их кожво кграцкьзтъ совместно па гуку-рузно-сахарной среде, в которой источником углерода является меласса, а также на молочной сыворотке с добавление;«' мелассы я дрожжевого эвтолизага.

3 качестве протекторов при сублимационном высушивания бактерии, входядас в состав препарата полялактовиг, рекомендованы: сухой обрат - 5«, защитная среда £ I елвдуедего состава {%): ватрай ухсусеоэдсякЯ - 2,5, согриЗ лшонкокяслыЯ - 2,5, сахароза - 10,0; защитная среда ,'í 2 (с?): сахароза -8,0, желатин - 1,5, сухое обезжиренное шло ко - 5,0.

В табл. 5 представлены Результаты опыта по ьисуанг,апя:о жидких культур микроорганизмов с уззлитш протекторами.

Установлено,что оптимальным протектором при сушке является сухое обезжиренное молоко, так как при этом получаются препараты, наиболее полно восстанавливающие антагонистическую активность при реактивации (табл.6).

Г.!икробиогик полплактовнт в виде сухого препарата испытан на новорожденных телятах, поросятах, ягнятах. Результаты опытов свидетельствуют о том,что при пероральном его применении в неблагополучных по кишечным заболевания:.! хозяйствах

Та блица 5

Количество жизнеспособных клеток после сублимационного высушивания в зависимости от защитного компонента

Содержание жизнеспособных клеток в сухом

Штаммы :.........ЖШт^Ш'Л................

сухой об-:сухая сы- :среда й I :среда В 2 ______________1рат_5'|___-воротка ..М:__________:________

1.. cssei 139

L.cesei l73a

L.brevig Б-3

?. shernsnii-15

Консорциум из^ 4-х штаммов

2,5-I09 I,4'I09 5,2-Ю6 I,3'I06 4,9.I010 3,2.I010 2,3.I010 I.7.I09

б,6Л09 7.2.Ю9 .

3,2Л0Э 2,7-ю10

5.6Л010 4,ЗЛО10

I.4.I010 2,8Л010

1,5Л010 4,4Л09

5,6Л010 3.4Л010

Таблица 6

Босстаноачение антагонистической активности препарата полилактоБЗт после сублимационного высушивания с сухим обезжиренным молоком

:___Зоны_^нетения^оста_т^^_______

Штам-лы :...........сё§30§акгзвэдди..................

: обрат : сыворотка :пептонная :вода водопро-

„___________.___________»._„ШЗ§:____s.S23S§3______

- :30 :3ч:5ч Гзо :3ч :5ч :30 :3ч:5ч :30 :3 ч: 5ч _____________-мзн:______i'iSSL___£___• ___1ШИ1___1_____

£_ coli 79/1 17 11 14 Ю - 12 - 16 13 13 12 14

E.coli 0/?8 12 - - - - - - 14 - - 13 12

".coli Чо/l - - -- -- - - - - 12 -

E.coli 47 - - 15.....- - - 15

S.typhiT.uriuTi И - - II - - II - - 12 12

S,suis 11 12 " II II - 12 12 - 12 12 -

S'. dubl in - 10 9 12 - - ----- 12

заболеваемость животных снижается в 8 и более раз. При этом отпадает необходимость в применении антибиотиков п других антибактериальных средств для лечения заболевания животных, а также в вакцинапии стельных коров.

1.6. Разработка кормовой добавки бентобак

При разработке кормовой добавки подбор пгаммов микроорганизмов проводили с целью повышения переваримости корма, обогащения его витаминами группы В и нормализации белкового обмена у животных.

Опыты, проведенные на фистульных животных, показали положительное влияние на белковый обмен препарата, состоящего из ЦйЛЛЮЛОЗОЛИГИЧесКИХ бактерий Cellulorronas flsviRcna -22 и пропионовокислых бактерий, адсорбированных на бентоните.В связи с этим встал вопрос о разработке технология его производства.

Подбор питательной среды для выращивания культур

За основу питательной среды для выращивания Ceilulomonas fiavigene -22 была взята среда Ге№неона. Изучена способность бактерий использовать для роста различные углеводы и органические кислоты. Установлено,что лучшими источниками углерода для накопления клеток является солома, крахмал,глицерин, 'рамноза, сахароза. Хорошее накопление бактериальных клеток наблюдается таете на средах с молочной, уксусной и винной кислотами. Наиболее высокая целлвлозолитичаская активность проявляется на средах с пектином,лактозой, крахмалом к соломой в сочетании с глюкозой.

Антагонистическая активность целлюлозолитических бактерий В OTHOfiieWlHEscbericMa col i-b?, Staphíl ососсия aureus -209 отмечена на всех испытанных источниках углерода,причем наиболее высокая она на среде с крахмалом.

Учитывая, что скорость х'сста, целштозолитичсская активность и антагонизм в отношении перечисленных тест-культур выше на среде с крахмалом, его и даедпочтигельнее ипполъзочатъ в составе питательной среды.

Установлено,что включение в постав питательной среды в качестве источника азота аммония сернокислого в сочетании с кукурузным экстрактом оказывает положительное влияние на рост, целлшюэолитическую и антагонистическую активность с. nnvíw-ns -22. Усиление роста и целлюлозолигической активности культуры отмечено также при введении в состав среды "кС1? и

coci2.

Исходя из полученных результатов, для выращивания с. ria-vigene-22 была принята питательная среда следующего состава

(г/л): кукурузный экстракт - 15,0 (по с.в.), крахмал - 10,0 КН2Р04 - 1,0, КС1 - 0,5, 1:езо4 - 0,5 ).,зо4- 2,5, Сб012 " 0,03.

Установлено, что для совместного выращивания двух культур (целлюлозолитйческях и пропионовокислых бактерий) пригодна вышеуказанная среда, но с добавлением 10 г/л глюкозы.

1.6.1. Условия получения сухого препарата

Сухой бинарный препарат ЦПБ+ПКБ получали из 1-суточных монокультур, смешанн?«' перед сушкой в соотношении 1:1, а также из совместно выращенных культур. Биомассу осаждали бентонитом, затем высушивали сублимационным способом.

Из табл. 7,^8 видно, что для получения бинарного препарата целесообразно вьфацивэть культуры шесте с одной ферментации, а не смешизэть их перед сушкой, так как в первом случае происходит большее накопление бактериальных клеток, а также повышается ыеллюлозолптическая активность и синтез Еитамина В^«

Таблица 7

Получение сухого препарата бентобак из моно- и смешанных культур бактерий

Культуры

Тигр жид- гТитр пасты,: Тигр сухого препвра-кой к-ры, : млн/г :.та_шн/г_

млн/мл

:на среде : „ПКБ

наведя

Бинарная ЦЯБ+ГШБ

Смешанная перед сушкой ШЕБ+ПКБ -

ПКБ

ШБ

440

470 700

850

5600

560

2200 330

4300 290

3100 250

1400 300' 250

Таблица 8

Цоллюлозолитяческая активность г'-ней суспензии пастообразных сухих препаратов я содержание в них витамина В^

Варианты опыта Витамин В12> ¿К/ш : Сх, ш

жидкий пастообтэ .: сухой :пасгообг. : сухой

Сглесь 1ИБ+ПКБ 0,34 0,41 0,41 12 13

Бинзрная 11ЛБ+ПКБ 0,44 0,41 0,42 30 14

ПКБ 0,44 0,45 0,44 Нет Нет

ЦЛБ _ _ _ II 14

Контроль-о,К рас- 22

тюр фермента - - — 22

Через 6 мес. хранения в холодильнике препарат не теряет активности.

На основании проведенных исследований разработана технология производства сухого препарата бентобак. Препарат,полученный по предложенной технологии, имеет следующий состав (■£): бентонит - 60-70^, биомасса микроорганизмов 30-40о с содержанием жизнеспособных клеток не менее 5 млн/г.

1.6.2. Испытание препарата бентобак на яивогных

Испытание препарата, полученного на опнгко-промышсенной. установке института, проводили совместно с сотрудниками Института физиологии HAH PK.

Препарат скармливали валухам казахской гоккзрунвой породы с фистулами рубца и дуоденальным анастомозом л дозе 1,5 г на I кг массы тела животного. Доза препарата была предварительно отработана на чистом бентоните.

Ус га ноше но, что при включении в рацион животных сухого препарата на бентоните происходит понижение содержания азотистых -веществ в рубцовом содержимом. Аналогичное явление происходит с химусом 12-ти перстной кишки. Значительно увеличился процент переваримости клетчатки. Под влиянием исследуемого препарата в крови снизилось содержание аммиака и мочевины при незначительном увеличений летучих жирных кислот. Отмечено увеличение резервной щелочности крови. Этот факт, на наш взгляд, имеет чрезвычайно важное значение, так как при истощении щелочных -резервов в организме отмечается склонность животных к заболеванию ацидозом.

При использовании В кормлении биомассы C.flavißena + P.nher-manii наблюдается активизация бродильных процессов,доказательством чему является усиленное газообразование. Однако в вариантах с сухим препаратом бентобак, несмотря на присутствие бактерий, газообразование не повышено, так как образующиеся газы адсорбируются бентонитом. Дополнительный привое животных в згой группе составил 115 г/сутки. При испытании препарата на Дквтыгенском комплексе при откорме бычков в течение 85 дней дополнительный привес составил 43,9 кг на одну голову

2. РАЗРАБОТКА. ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СИЛОСОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

2.1. Селекпия активных штаммов молочнокислых и пропионовокислнх бактерий я адаптация их к распылительному высушивания

Для повышения активности исходных штаммов бактерий проводи отбор более активных вариантов, возникающих при культивировании на .различных питательных средах, а также в процессе длительного хранения. При ввделекяи вариантов S.iaetis diasta-ticus использовала тагом метод непрерывного культивирования в аппарате "Анкутл-2". Первоначальный отбор клеток проводили по диаметру зон просветления вокруг колоний, выросших на твердой питательной среде с мелом (с густотой посева 30 колоний на чашке).Просмотрено свыше 5 тыс.колоний. При последующем отборе учитывали накопление биомассы, кислотообразующую способность при сбраживании различных углеводов и антагонистическую активность в отношении гнилостной микрофлоры и микроскопических грибов.

В результате проведенной работы повышена способность культуры Streptococcus lactis diastaticus накапливать биомассу в 1,3-1,5 раза и в 2 раза - органических кислот по сравнению с исходной культурой. Так, если при росте на средах с крахмалом исходный штамм имел 1,5-2,5'Ю® клеток в I мл,кислотность 35-40°Т, то отобранный - IQ-I2-I03 кл/мл, кислотносгь-65-80оТ. Удалось повысить в 2 раза накопление биомассы у культуры L. ре r,t оа Ceti ел (с 5.10^ до Ici. IG3 клеток в I мл).

В связи с тем, что полученные нами первые партии сухих заквасок АЧО и ПКБ уле через 3 месяца храпения в холодильной камере при температуре flo°C потеряли жизнеспособность, провели отбор клеток 3.1 г- с t i s (Hnstaticun И L. pont cacet icuis ИЗ культур, подвергпшихся трижды сулке распылением с наполнителем Nrст при следующем температурном режиме: для амилолятн-чрского молочпокнет ого стрептококка 1.30-140° С/?0-Я00С, для пентозосбгп;:;;па,.?а!1Х молочнокислых бактерий - 120/60-68°С.

Установлено, что закваска AMC сохраняется лучше при приготовлении из культуры, подвергаемся двухкратной сушке. При хранении р холодильнике титр ее остается приблизительно па одном уровне г> течение 7 месяцев, в комнатных условиях значительно ск;и;;лется, но восстанавливается после шестичасовой реактивации

в питьевой воде» После трехлетнего хранения в холодильнике закваска после реактивации имела 18*10® жизнеспособных клеток в I грамме. Эта же закваска, хранившаяся при комнатных условиях, содержала 2,5*10® клеток/г. Закваска из культуры трехкратной сушки через 3 года хранения в холодильнике имела 4,5*Ю5 клеток/г, при комнатных условиях - 2*Ю5. В течение двух лет хранения препарат не терял амалолитическую активность.

Закваска ПМБ из культуры, подвершейся двух- а трехкратной сушке,сохраняет жизнеспособность в течение двух лег как при хранении в холодильнике, так и при комнатной температуре.

Отселекционированйые штаммы бактерий являются более сильными антагонистами в отношении гнилостных МИКрООргаНИЗМОвВ. subtilis B.mesentericus, P.fluorescens и бактерий группы кишечной палочки. Наибольшие зоны подавления роста тест-культур дает амилолигический молочнокислый стрептококк. Активным антагонистом к указанным тест-культурам являются также пентозосбраживаюцие молочнокислые бактерии, однако в. coli они подавляют слабее. Рост всех испытанных микроскопических грибов подаазяег амалолигический молочнокислый стрептококк. Пентозосбраживаюцие молочнокислые бактерии утнетаюг рост F.soiani и В. cinerea в меньшей степени и не шияют на niger .Односуточная культура пропионовокислых бактерий подавляет рост ЛИШЬ Р. solani.

При совместном выращивании КУЛЬТУР S.lactis äiastaticus и р.Rherraanii повышаемся антагонистическая активность к гнилостной микрофлоре и микроскопическим грибам по сравнена» с монокультурами.

Антагонистическая активность культур сохраняется п в сухих бактериальных препаратах.

Изучена резистентность бактерий к ряду кормовых и лечебных препаратов. Наиболее устойчивыми к ним оказалась отселекциони-рованнке штаммы. При атом отличительным признаком амилолити-ческого молочнокислого стрептококка является устойчивость к кормогризину (40 мг/мл), пропионовокяслых бактерий - к биовигу (50 мг/мл), пенгозосбраживающих молочнокислых бактерий ~ к микс (60 мг/мл)»

Таким образом, отобранные штаммы бактерий бол^е активно сбраживают углеводы растительного сырья, устойчивы к ряду антибиотиков, к распылительному высушиванию, являются антагонистами гнилостной микрофлоры и микроскопических грибов. Штаммы

прошли производственные испытания и были рекомендованы для производства препаратов.

2.2. Подбор питательной среды для выращивания бактерий

С помощью метода математического планирования эксперимента для культивирования амядолитического молочнокислого стрептококка и пентозосбраживающих молочнокислых бактерий-в промышленных условиях рекомендована питательная среда, состоящая из 1,5-3,0^ кукурузного экстракта и 0,5-1,0^ сахара, для пропионовокислых бактерий - из Ш кукурузного экстракта, I мгй С0С12» 0,3£ ( бо^ и 2% глюкозы.

Данные питательные среды вошли в технологические инструкции по производству заквасок и опытно-промышленный регламент по производству бакконценгратов.

Изучено действие некоторых биостимуляторов на рост молочнокислых и пропионовокислых бактерий.

Установлено,что'введение з состав питательной среды для выращивания амилолигического молочнокислого стрептококка от 14 до 70 мг£ спиртового экстракта верблюжьей колючки повышает выход бактериальных клеток з 2,6-3,5 раза. Экстракт полыни метельчатой увеличивает содержание молочнокислых бактерий в 1,7-3,4 раза.

При введении п питательную среду О,Г2 лазпна накопление клеток амплолнтяческого молочнокислого стрептококка увеличивается р Ю раз по сравнению с контролем, пропионовокислых бактерий - ч 5 раз. Для понтозосбраживзяцих молочнокислых бактерий опшуларуидай эффект лизина не выявлен.

Подобраны питательные среды для а.г.лолнтпческого молочнокислого стрептококка ц пептозосбраживзющпх молочнокислых бак- * терпи на -основе гидролиза?ов БВК, отрубей и кукурузной муки, на которых по выкается скорость роста бактерий и кислотообразующая способность.

При организации производства бакконценграгоз "Казахсил" нл Вг-пнг-лаюпком заводе ф^рменткых препаратов в качестве источника углерод бия рекомендован прогидродизовзиный крахмал. 3 результате проведанной оптимизации питательные среды имеют следующий состав (глбл.Р),

Таблица 9

Состав питательных сред для выращивания бактерий

Куль- :_____________Компоненты,^___________________________

гура :крахмал :кукурузный : i.inso. : СоС1_ : 0«0,,so ______:№ШГ20Й1§кст]отт___1___________5.______.1___L____

АМС 2,0-2,5 1,5-2,0 0,016-0,032

ПКБ . 3,0-4,0 2,0-2,5 - 0,001-0,01 0,1-0,3

ПМБ 2,5-3,0 2,0-2,5 0,016-0,032

2.3« Совместное выращивание культур ашло.литического молочнокислого стрептококка и пропионовокислых бактерий

В процессе силосования высоко сахаристык растений с закваской ПКБ принимают участие как спонтанные молочнокислые бактерии, которые сбракиваот водорастворимые сахара до органических кислот (молочной и уксусной), так и проотоновокислые бактерии, усваивающие часть молочной кислоты с образованием менее диссоциируемых прошоновой и уксусной кислот и тем самым обеспечивающие получение умеренно кислого силоса. Поэтому целесообразно получать закваску из .смеси пропионовокисльк к молочнокислых бактерий, чтобы регулировать молочнокислое брожение в желаемом для технологии кормопроизводства направлении.

Из литерагурных источников известно,что некоторые штаммы молочнокислых бактерий отрицательно влияют ка развитие пропионовокислых бактерий. Следовательно, .для силосования высокосахаристых растений целесообразно применять смешанную закваску, составленную из специально подобранных штаммов молочнокислых и пропяоновокислых бактерий, положительно влияющих друг на друга.

Совместное культивирование бактерийs.iactis diastaticus и p. sher.nanii в течение 18 сут показало, что они не проявляют антагонистических свойств по отношению друт к другу.

Установлено,что амилолигический молочнокислый стрептококк стимулирует образование летучих кислот (уксусной и пролпоно-бой) прошоновокислыми бактерия ми. Совместное кулг.тяеировакпе не втаяло на амилолитическу» активность молочнокислого стрептококка и витаминооОразушую способность пропионовокислчх бактерий.

При использовании бинарной закваски АМС+ПКБ для силосования лнсокосахаристга растений повидается сохранность питательных веществ на 10% по сравнения с закваской ПКБ (Кугмэтлганов, 1984). Начиная с 1986 г.,на заводах микробиологической промышленности (Вышневолоцком а Еердском) производится бинарная закваска согласно ОСТ 64-042-87 "Закваски Сакте-рлздьнга для ся.чосованяя кормов".

2.4. ПсполъзоЕПНяе ожгадоэ фолзводсгна а составе Пйга?*лыгоЗ сраин для кграцзнзнйя молочнохгслха: я прслясдозокяслыд бактерий

ПРИ ярэязяоясгяе сухях кояязнгряроязяялх заквасок для сялэ-гозчогюз смогом псойз«одсг"гз дялязгоя <*згзги,содрг.'ЭДН« б сзо^п состой ог.гзяяяескяе mjccosn 1-3"., згивзен О.о-Г", ягзняшкготч, ?!!?«! группы 3 я дитя« о::олегячпс;:^ з:сгпгнт:"

Тгтзяогдяро, -то -осло етогсэргззацзз еутагоэ пз азоту углепядагл их :.:о;::тто яязяь попользовать з качестве питательной срчдп для з-.тзг„чвзг'ая бпктернй, пренмуцястзепно по елчягс^й сх«:"»: f.mz-i М.'С - для в:фаазвзвля аропзовокгаыгаг я пзкгезг-сбгз.~:!п?v ■.'олоялодяялля tfwpsit, frr::?;: ЛлБ - для лзяг::''-сбрзг:язя \дя модояпокпеллх бактяряя я ялялоля"гяг:-~скоро мало я -дашслэго сгряпто-'о!-«!, дутагн ITS - для г,.я«х грчх гульгур.

я ПХР лоляо ясязлъзоran, тз<я!;я для Б^яряппзяяяя

ГСЗР0ТЯ"ССД^;:::?,"'ТХ -'роядод RrC(ietor":le ut: i ni ч ,РоК0МЯ!ПУеМ!Г:

з тсзчрогт" о г1 г голого ког-r! для голедя r-rf, ГТря этом кзаболь-иоксд :еяяе басма ссч стл^я^яз на iyro"e Л.\!С с .^ба-япяяя

мелассы.

Пока?яно, что для гдялуляяяя гес^я бактерий могут бмть лолъзоззял отходя Я1 оияг'-одстга антибиотика рогпслулгпна (Нядятяяа, Лтлугяяа, IГ'-р). '^стяяовлепо, что добавка в питательную пг'у'У 1-2"" яодного остатка ядзтояс-он ямтя.ддя .лз :.:я-я"ляя -д-.тдг бзктеряалыях клзгод з 2-3 рпзя. Гядро-

лнззт мя!!пляя (1-я") способствует уз.ядяяпня:а кодияеетяз я-лятяя; я'-чп'ояоебгя.хпзяяли молочнокислых бактерий я пропяоповокяслых ^яяядя!:' з 12-2Г1 раз, агл-долитияяского молочнокислого стрептококка з 23-"6 раз.

2.5« Получение сухих бактериальных заквасок методом распылительной сушки

Анализ ксеро- и термограмм бактерий позволил сделать заключение, что для выстаивания сухих препаратов АМС, ПКБ к ШБ приемлем распылительный способ .высушивания.

Подобран следующий реким распылительного высушивания культур:

1. Теш ера тура сушильного воздуха при входе в сумлку 120-130°С, при выходе из сушилки 50-60°С дяя ЖЕ а 65-70°С для АМС и ПКБ.

2. Максимальная длительность пребывания сухой культуры при темпера гуре 50-70°С не более 3 мин.

3. Конечная влажность сухих заквасок не более 10%.

Лучшая выживаемость у исследованных культур при распылительном высушивании наблюдается в конце логарифмической -

- начале стационарной фазы: АМС 8-12 ч, ПМБ - 11-12 ч, ПКБ -

- 13-24 ч.

2.5.1. Выбор наполнителя и защитной среды для распылительного высушивания АМС,ПКБ и ПМБ

Удовлетворительная выживаемость молочнокислых и пропионовокислых бактерий получена при использовании в качестве наполнителя сухого обезжиренного молока.

В связи с тем, что сухое обезжиренное молоко является ценным пищевым продуктом, проводились опыты по изысканию резервных наполнителей. В результате подобраны условия получения сухого препарата с использованием в качестве наполнителя поваренной соли в сочетании с защитными компонентами.

« Как видно из табл.10,получены одинаковы" результаты по

выживаемости культур как в случае применения в качестве наполнителя сухого обезжиренного молока, так п ¡¡аС1 в сочетании с фосфатидным концентратом.

Солевой наполнитель был рекомендован народу с молочным для производства заквасок.

Таблица 10

Влияние вида наполнителя на выживаемость культур при распылительном высушивании

Культура

Количество клеток в I г .......UPSSSEaга___.......

Ж1ШШЙ с наполнителем

сухой :сухой ;после б :мес.хра-.......-:-КеНИЯ„_

AMC

ПКБ

ПМБ

20? NrCl+0,5^ фосфагнд-ного концентрата

203 сухого обезжиренного молока

;i,-)Ci+o,5'3 фосфатпд-ного концентрата

20t сухого обезжиренного молока

201 asci+o,53 фосфатпд-ного концентрата

203 сухого обезжиренного молока

15"10® 20"I03 4'108

II-I08 20'108 4*108

7-I08 б'Ю3 4-Ю8

12 * 10® 8'108 зчо8

I7-I08 10'Ю8 5*Ю8

10 ТО8 8*10® 4,5'Ю8

2.5.2. Условия хранения и реактивации сухих заквасок

Проведенные исследования показали, что сухие препараты лучше хранятся в герметически запаянных полиэтиленовых пакетах при температуре +8 +Ю°С с остаточной злэжносгыэ 6-83.

Нейтрализация жидкой культуры перед сушкой и отбор кле-гок,устойчив;^ к распылительному высушиванию, способствовали попка?ша срока годности сухой зоктоскл.

Подобгаии условия реактивации препаратов, высушенных с солсвш или молочжсл наполнителями.

Устзточлпио.что длительно хрчнвздувся (до 3-х лет) сухув закваску AL1C можно воссгановягь до исходной активности при Гозктптотгая ее при 37°С в течение 6 ч а 5?-ном растворе саха-Грзя, т:э вянем отвар« с матом, молоке, в 0,53 растворе пептона, дрожжевой воде. Лучшей средой является травяной отвар с магом.

Оптимально.::! условиями реактивации сухой закваски ПКБ является вцдяржпвани" ее в водопроводной зоде в виде I« сус-

вензии в течение 2 ч при температуре 0-10°С. Эффективность этого способа показана на сухой закваске, хранившейся в течение 3 лет. При этом активность восстановленной культуры была на уровне исходной, не годвергашейся суше.

Реактивация сухой закваски ПИБ в водопроводной воде в течение б ч позволяет повысить число жизнеспособных клеток в 10 раз. Такой же эффект дает реактивация закваски в сусле и 10» растворе сахарозы. В дрожжевой воде и обезжиренном молоке количество жизнеспособных клеток увеличивается приблизительно в 30 раз.

2.6. Получение сухих бактериальных концентратов

2.6.1, Подбор условий концентрирования биомассы

Технологию получения сухих концентрированных бактериальных препаратов отрабатывали на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов.

Отделение биомассы от кульгуральной жидкости проводили на центрифуге ОТР-Ю при 15 тыс.об/мин. Установлено,что оптимальной скоростью подачи кульгуральной жидкости является 100-120 л/ч; при этом потери клеток с фугатом составляют 0,01-0,02 млрд/мл по сравнению-с 0,8-1,0 млрд. при скорости подачи квдкости 360-400 л/ч. Получаемая при этом бактериальная паста содержит 50-701 сухих веществ.

При использовании в питательной среде крахмала в качестве источника углерода йуль'туральная жидкость обладает большей вязкостью и содержит больше сухих веществ,чем при использовании сахарозы. Это способствует лучпему отделению биомассы от кульгуральной жидкости при центрифугировании.

Нами отработан также способ осаждения биомассы бактерий с помощью бентонита и хлористого кальция, позволяющий без энергозатрат сконцентрировать биомассу в 3 раза.

2.6.2. Условия высушивания концентрированной биомассы

Поиск оптимальных режимов замораживания и сублимационного высушивания бактериальных концентратов проводила на установках ТГ-50.

Подобран следующий режим высушивания:

величина загрузки - 30 кг,

давление в сублимационной камере - 75 ~ 100 мкм,

время замораживания продукта при -40°0 6 ч, температура плит - Ю°С, температура досушивания - 2о+5°С разатанио - 40-50 ма.

Установлено,что в качестве защитных гомпонеягов для сублимационного высушивания бактерий мо;хно использовать: тпомо-чевпну - 0,5*2, тломочешву 0,5 + мелассу 1% я фзсфатцдный концентрат - 0,5'? к объему вы суп а вае мой массы, а также защитную среду следующего состава (1): сахароза - 10,0, уксуснокислый натрий - 2,5, лимоннокислый натркй - 2,5.

Отмечено, что использование в составе питательной среды крахмала поитарг в: ~авз злость бакт^раа ара суй,.;а:.:сц.понко:л висуаавапаи.

Показана возможность получения cjxtx ковцрпгряроззвн&х препаратов, содерз-ззсах от 20 до 6?. гетрд/г >:яешс плосок, на СШ1ГП02 растраsp.»hoü сусялка:iiro-¿t crdгег а на прогсзлчн-вой супадкп СРД йрз температуре суппльвого воздуха пэ входе в отладку 120-130°С, на вжод? аз супилки 60-70°С.

Пзаболзлда" ваход 'snspsnoccíH-cí клеток наблюдается ара высушивании бксгзсси пз распадатольпоа зуладзея с взавглзчдс:: темпера т/рой тпаловзоаз^дя (температура Суз:::."::ого воздула? та вхол° и 70-с:0°С, на зл-ааздр аз сулалап 35-42°С).

2.6.3. "злпиопап удытосгруктл« клеток а:.азолягзч?ского молочнокислого стрептококка яря распали тельном высушивании

Чтобы утшньквгь потеря ^яспчспособп.а кл>»гек, обычно под-барают оптимальна;*] рглкам cyraai, заззапгаз гсо-гдапенга. Бол««! Ползав правде на о ргпатв зту задачу возмомко в том сдучз°, если известен Д"рявг">р по вр ".ад чага клоток, зсзнакзпщ;!'? в процессе судка.

Я латпратурках лгзоаавках нам ае встречалась информация об аз?.в-алг;аа уз:ъграезругл:урп молочнокислых бактерий, высуженных рзспаааТ'-'Лыпз.! способом. 3 связи с этим нгмв было изучено изменена" ул:.трпс?гучтуг:1 бактерии ;ъннх клеток на примере S.lac-tis dinstnticus.

йсслпдотпля еярдукда ларязнгк сухих препаратов: I) куль-туральапя --'.-дкость зысуазво с одним из наполнителей - сухим обезжиренном мазоком л поваренной солью при тегязерагуре супила во го воздуха 130+5°С на зходе в супилку>прз 65-70°С - на

выхода из сушилки; 2) осажденная с помощью бентонита биомасса бактерий высушена при том же рехиме; 3) сконцентшро-ван-ная биомасса высушена на низкотемпературной распылительной сушилке при температуре 38-40°С. Контролем служила дативная культура.

Установлено, что при высушивании сконцентрированной биомассы на низкотемпературной распылительной сушилке клетки претерпевают в основном незначительные изменения. Клеточная стенка и штоплазматическая мембрана не нарушены. В цитоплазме хорошо различаются рибосомы. В некоторых клетках образуются вакуоли, содержащие электронноплотный материал, ядерное вещество обособлено. Однако, встречаются клетки с измененной структурой. Отмечено разрушение клеточной стенки, а также наигпе-

ние целостности штоплазматической мембран». Наблюдается образование полостей на периферии и в центре цитоплазмы, а между ними расположен электронноплотный слой с зернистой стпук-турой.

Культура•■аиилолитаческого молочнокислого стрептококка, высушенная с.молочным наполнителем, имеет много клеток с утонченными клеточными стекший, пктошшзматическая мембрана не выражена. Структурные элементы отсутствуют. У многих клеток в 'цитоплазме ооразуются вакуоли к электронноплотные участки.

При высушивании с солевым наполнителем клеточная оболочка становится более массивной, ярко выраженной. "Ч некотошх клетках она разрушена. Цитоплазматическая мембрана у одних клеток разрушена, в Других сохшкяет 3-х слойную структуру. В клетках видны полости, занимающие- значительные прсстоанст-ва. Сохранившаяся цитоплазма имеет зернкстьй характео или скоагулирована.

Культура, осажденная бентонитом и высушенная распылительным способом при повышенной температуре, имеет те же настае-ния, что и высушенная с молочным наполнителем. Имеются клетки с разрушенными клеточными стенками и цитсплазиатической мембраной. Исчезает структура цитоплазмы, она становится более электронноплотной, появляются вакуоли.

Таким ооразом, при высушивании амилолктического молочнокислого стрептококка распылительным способом наблюдаются изменения ультраструктуры клеток. При этом меньшее количество разрушенных и измененных клеток отмечено при исгсльяочании

низкотемпературной сузки. Изменения в клетках пли высушивании o молочным наполнителем и бентонитом, используемым для осаждения биомассы, одинаковы и вызваны, по-видимому, преимущественно тепловкм воздействий». При высушивании с соленчм наполнителем к тепловому чсздейотяп!) шжсседкпяется влияние осмотического давдения.

2.6.4. Сохранение основных пЕоизводстяеннс-ыенньк свойств культур АГЛС, ПКБ и ГП.Е в сухих препаратах

При хранении в холодильнике пвзпасаты "Разах с/л" сох-

Т "с í, В *" " ■ -Л' f; '- с • , ~ ~ Г' 'Л Ч '. е На —

ется.

Установлено , что лизл'здэяхельпветг йяктэгнй у ".ссетл-

тг.т;\чв чс ч с" ■ '' ■ " то*1е!г.'е i ■ ч. л" [ ' что ^лслллч

оакко:и;екг:х;тм не о?л;:ч£«.?ся и:) г с но ян*-*: срс;'.стт?ах от исхгд-нчх культу;;.

Изучен сост;.« гл инокислот в пгсп;-:; тах Л"" 4 ?г?пс;ч,хсти от тегип пгивча.-т к у-пелн.'-и1!"/.-., псг.ет«:.!уя í.'.n'-ткислот. Ггмеченя

ИрЛь.ЛЯ Л.ЛЛ ' 'Л Ч 'Л -'Л'.' ..; -: ЛЛ-.Ч V г- 'ЛЛХ'' ХЛХ Ч" '7/ 07ЛЛ

и •~-::bí!it4!ív:\iH4'<: клеток /\пс. I, 2/.

ч пгог.есос члол.ч^очствл су чех :п.к»асек культу гч кккрсорга-г:<.!.:•>..о» ¡;. ,im.;>r:iv топ гг.лг.кпик» всяг.р.'ст»«п:: ¡'вменение рН лх. л лчл;ле, ¡¡лтг-.г'шг-й температуры, что ;.л>*ет сказч-чат.чч ни ;••: «;>аналоге-:,к.»•/v/чоскгх счонстпах. ч связи с ;>тим ипу-uw/ и.»г.-ен-ячость лспнскислчч при прсиз-

родстве аыкконцентуато-о с аель> отсора asar Солее активных ■вархантов.

у? пй!)т;:;- ; рвпр.те.точ, получештос при различных режимах сучки, в-.'лелену паггянтч молочнокислнх Оактесий, отличахиае-

га

Ж)

■ ......* ... I Л-----Л---* « . '

47,5-10

9

(Ао цо I оо ео со ао го

Рис* ^ ..Хроматограмш аминокислот высушенной . культуры 3. 1ас41а diastaticцe (темшратура ШСуШЦБаНИЯ 120-Х30/60-65°С ца СРП, защитная среда молоко) I - дсларапшовая кислота, 2 яреонаы, *3 - серии, 4 - глуташшовая кислота, 5 - пролил, 7 - глицан, В - ялшшп, 9 - валцц, II - цзолейцин, 12 - лойцин, 13 - тирозин, 14 - фешлалашш, 15 - гистадин, 16 ~ ли зли, 18 - аргиндц.

(В .

f2

37,5*ГО

9

к

я н о да Р-

Я

«

то.

iza,,

15»

за

со

40

20

Рис. 2... Храмагогрги.ыа ..аминокислот высушенной культури s. iacti3 diaotaticua (температура высушивания Ш/41)°0 па СРЦ, защитная среда Uaci + тиомочешла) I-,. Аснарагановая кислота, 2 - троошш, 3 - сорин, 4 - глу тактовая кислота, 5 - пролин, 7 - глицин, 8 - алашт, 3 - валил, II - иаолвЛцин, 12 - лоВцин, 13 - тирозин, 14 - фтшлалашн, 15 - глстддпн, 1С - лизни, 13 - аргишщ.

ся значительными колебаниями в синтезе молочной кислоты и накоплении биомассы.

Из препарата ,АМС отобран активный вариант БК-23,обладаю-щий способностью более активно сбраживать крахмал с образованием молочной кислоты. Этот вариант отличается также большим накоплением биомассы (габл.,11) .

Таблица II

Сравнительная характеристика отобранного штамма 3.1всИз diastaticus БК-23 С ИСХОДНОЙ КУЛЬТУРОЙ

Варианты

эриа! ÄMC

: ■Органически^ кислоты^ Титр, . ~5воббдныё

Ш1ш/мл : уксус -: модо ч: mc; I ^маеля -.ная ;ная :ля-;ная :ная '

Б-23 Исходи.

4.8

4.9

1,35 0,65 0,7 0,45

2,9 1.2

1,15

0,8

Из сухого препарата ШБ выделены более активные варианты 10 и 4 аб (ra'ün.-I2).

Таблица 12

Сравнительная характеристика штамма ь. pentoacetitÄ^ 10 С ИСХОДНОЙ КУЛЬТУРОЙ

Варианты ШБ : РН, :-Тигр. .млрд/мл 1 •__QE52S32§S5S§_£2£522Sif____ £.„-„2§2£!232Ш_____i.S§2§iSSS§_

: уксусная :молоч-:мае-; уксус~:мас "вая 'ля- "ная ля: :gaB : :ная

4 аб 4,4 1,9 0,24 2,4 - 0,6

Ю 4,7 1,3 0,21 2,0 - 0,5

исходн. 5,1 0,5 0,55 1,0 - 0,6

Варианты AMC БК-23 и ПМБ-Ю внедрены в производство.

2.7. Выбор предпочтительных вариантов технологических линий производства сухих бактериальных препаратов для силосования кормов

Цри организации производства заквасок на предприятиях микробиологической промышленности отработан рад вариантов технологического процесса, исходя из конкретных условий за-

вода, наличия сырья, технологического оборудования.

Анализ имевшиеся вариантов технологического процесса проведен совместно с сотрудниками Института математики НАН РК. Рассмотрены следующие стадии технологического процесса;приготовление питательных сред, обработка кулътуральной жидкости перед сузкой (сгущение), сушка.

Предложенный алгоритм реализован на ЭВМ СМ-1406. Дэретко-оптимальное множество составлено из сести вариантов. Из них наиболее предпочтительным с точки зрения условий является следующий вариант: приготовление питательной среды для роста бактерии на основе гидролизатов сырья, сгущение культуральной жидкости путем добавления наполнителя иди центрифугирования, высушивание сгущенной биомассы.

Ш этим показателям технология производства бактериальных -концентратов "Казахсил" ютла в число оптимальных вариантов.

2.3. Внедрение технологии промышленного производства сухих бактериальных заквасок на заводах микроб по логической промышленности

В 1970-1971 гг. разработаны технологические инструкции по промышленному получению препаратов АМС и ПКБ без существенных изменений режимов и рецептур, рекомендованных в лабораторном регламенте. Инструкции утверждены Ученым Советом КЛВ АН РК и согласованы с ;ЛСХ 1{азССР. 3 1972 г. утверждены Республиканские стандарты КазССР и организовано производство 800 кг сухого препарата ПКБ .на Владимирском заводе бактериальных препаратов. В 1973 г. переработаны технологические инструкции в соответствии с новыми рецептурам питательных сред.

В 1975'г. составлены промышленные регламенты по производству препаратов АЖ, ПКБ и ГИБ, которые согласованы с МСХ КазССР я Алма-Атинским бяокомбинатом.

С 1975 г. начато производство сухих бактериальных заквасок на Киевском заводе бактериальных препаратов.

Так как Киевский завод бактериальных препаратов был на в состоянии обеспечить потребность в заквасках одновременно хозяйств Украины и Казахстана, обеспечение заквасками в 1976 и 1978 гг. было возложено на завод "Прогресс", который наработал й г препарата с молочным наполнителем а 15 г с поваренной солью. *

- Работа по освоению технологии получения бакконцеагра-гов "Казахсил" (ТУ 59,05.100.89-85) осуществлена в соогввг-

стбии с -приказом Минмедбиопрома СССР от 13.12.85 № 72 АК. Серийное производство бакконцентратов начато на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов в 1956 г. Экономический эффект от производства составил 427,6 тыс.руб. в год,

В IS87 г; разработан и утвержден в установленном отрддке Отраслевой стандарт ОСТ 64-042-87 "Закваски бактериальные для силосования кормов, сухие",который внедрен на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов, Бердском хешческом заводе, ' Туркестанском заводе кормовых антибиотиков.

, <. . - ВЫВОДЫ

I; При исследовании Микрофлоры желудочно-кишечного -тракта сельскохозяйственных животных и птиц выявлены микроорганизмы-антагонисты к возбудителям различных кишечных заболеваний, продуценты витаминов С, группы В, незаменим® Аминокислот, • гидролиги чески ферментов, сдовшенной сдаюЪносгьо к адгезии, которые югу г быть использованы при создании 'йовых микробиоти-ков направленного действия.

2. Выделены и изучены молочнокислые бактерии Lactobacillus casei 173а с широким спектром антимикробной активности,

обусловленной антибиотиком пептидной природы- с УФ-спекгром 300 нм, отличающимся от ранее известных^

3. ДЛЯ КУЛЬТУРS.lactis diastaticus, P. shermanii

L. pentoaceticum , ранее предложенных для использования в кормопроизводстве, впервые установлены границы чувствительности к температурному фактору, обезвоживании. Выявлены стимуляторы их размножения и метаболизма ('экстракты некоторых растений, аминокислоты, отходы производства антибиотика розеофун-. гина и др.).

. 4. В Результате теплового воздействия на юлочнокислые бактерии получены новые варианты Streptococcus lactis diastaticus БК-23 И Lactobacillus pentoaceticum -Ю, превышающие исходные в два и более раз по накоплению биомассы,кислото-образованив при сбраживании углеводов растительного сцрья,антагонистической активности к гнилостной микрофлоре и микроскопическим грибам. Полученные на их основе сухие биопрепараты отличаются повышенны.! сроком годности.

5. Из культур L.brevis Б-3 и P.shermanii- 15 создан НОВЫЙ лечебво-профялакгический препарат лактовит-К, аффективный при

профилактике я лечении колибаетериозов домашних птиц и телят.

6. На основе молочнокислых бактерий L.brevis Б-3, ь.са- . sei 139,L.casei 173а и пропЕоговокасдих бактерий - антагонистов против смешанной кишечной инфекции (в том числе сальмонеллеза) и продуцентов вгггаютов С, группы В, незаменимых аминокислот, протеодитичвскшг ферментов получен новый лечебно-профилактический препарат полгшзкгоотг.

7. Составлена кормовая добавка из целлюлозолягячдских бактерий Ceiiuiomonas fiavigena -22 п пропионовокислых бакте-рзй P.shermanii-I5, адсорбированных на бентоните, способствующая усилению процесса расщепления клетчатки корма, увеличению синтеза витамина В^2»повышэкию резервной щелочности крови, нормализации белкового обмена, повышению продуктивности мвотвых.

8: разработана технология производства бактериальных препаратов для консервирования растительного сырья,основанная на селекции активных штаммов бактерий, стабилизация их производственно-полезных свойств при направленном кулыгавярованяи, высушивании, хранении. Серийное производство препаратов организовано нэ заводах микробиологической промышленности (Киевском заводе бакпрепаратов, -Туркестанском заводе кормовых антибиотиков, Вышневолоцком заводе ферментных препарагов,Берд-ском химическом заводе).

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОШГБЛШЮВШЖ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. ГЪнчаров .'Л.Д., Тэрасюкова 3.И..Гаврилова H.H. и др.Зак-васка сухая для силосования кортов (Бактериальный препарат из чистых культур амилолитического молэчнокислого стрептококка и пропионовокислых бактерий). Республиканский стандарт Казахской ССР, 183-72 и 194-72.

2. Гаврилова H.H., Захаренко Л.И., Ерковская Г.П.Изысканив путей удешевления ферментационной среды для выращивания амилолитического молочнокислого стрептококка // Известия All КазССР, сер.бяол.- 1975.- № I.- ГГ.36-40.

3. Гаврилова H.H., Захаренко „Т.И. Разработка методики прогноза стойкости сухой закваски из культуры амялолатическою молочнокислого стрептококка // Известия АН КазССР,сэр. биол.-1977.- J5 6.- С.37-38.

4. Гаврилова H.H.,Гончаров М'.Д. и др. Закваски сухие ддя силосования кормов. Технические условия. РСТ КазССР 183-78.-

Алма-Ата,- 56 с.

5« йвршгова Н.НЛепрерывное культивирование амилолитяяеско- ' го .молочнокислого стрептококка / В сб.: "Теория; и-практика:.':: непрерывного культивирования микроорганизмов.ТезИсы-ддокл.. П Всес.совещания.-. Пущщго, 1978.- С.85-86.

б'. Таврилова H.H. Йсчег параметров непрерывного культивира-'->-вания.АМС на основе анализа периодического процесса / Ъ * Г, сб.:"Производство-новых микробных.препаратов в Казахстане.т--.■ Алма-Ата, 1979.- G.5-II.

7. йврилова H.H.,Захарента Л.И. Совместное культивирование i-".-■-амидолитического молочнокислого стрептококка и прошоново^:, кислых бактерий. Там же.-С.12~15.

8.Гаврилова H.H., Пятаева Е.И. Технология производства ;сухихн:: бактериальных заквасок / В сб.:"У1 съезд Всес.еткрабйол^х.. общества'!. Тезисы докл.-Рига,1980.-т.4,- C.I04. ..

9. Пягаева М.Й.,Бзврилова Н.Н.,2анкулиева' М» Подбор-условий;;;::; реактивации сухой закваски пропиояовокйсяых бактерий;:;:". Депонированная рукопись КазНйШИД981.- ?-2I3.ÍIQ-c: о,

Ю.Гаврилова H.H., Тарасюксва З.И. Условия ргакгивададпсухайхо:; закваски ШБ с солевым ватта чтем а Депанированная'рукоутз-пись ВШШТИ.-19В2.- № 4055-82,- 8 с.

II. Закваски бакгеряальвые для билбсовзвия кормов.Технизесвде;-:« условия ОСТ 59.04.070. 13- 82 ^ ; Д S33. - 20 с.

' 12. йврилова H.H. Технологические инструкции по грс-извод- -стну сухих.заквасок MC, ПКБ, ШБ.- Алма-Ата,- 1933.~:12 с. г..

13. Шпенко А.К.,Чуканов Н.К.,.Гаврилова H.H.,Захареяко -Л.И..:.'. Влияние .шлочнокислых и пропионовокясльк бактерийрна бро-рг дильные процессы // Вестник сельхоз.науки Казахстана. 1983.- №10.- С. 84-87.

14; Гаврилова H.H.,Захаренко Л.И., Тарасюкова З.И..Повышения...^ устойчивости молочнокислых бактерий к режимам распылитель-v. -ного высушивания и хранения // Труды Ин-та микробцол.-си. ВИРУСОЛ. АН Каз'ССР,- 1984.- Т.29.- С.Ю0-Ю4. i.

15. Пусковой регламент по производству жидкой бактериальной- .о р. закваски "Казахсил".- ВПО " Оо юз бакирв парат".- I984Í- 14 с. ; .

■16. йврилова H.H., Захаренко л.И. Опытно-промцпленный'грег-"'1-ламент на производство бакконценгргга "Казахсил'Ч-.-Вышкий;::-:. Волочек.- 1984.-123 с.

17." Ияялетдинов А.Н.,Гаврияова H.H. и др. тЛспользовзние;дея-."с-гельности микроорганизмов в производстве к орлов://. Пр'ойлв-..--

мы освоения пустынь.- 1985,- .'S I.- C.70-80.

IG. Гз Бредова H.H. Оптимизация технологии производства сухих •бактериальны: заквасок для силосования кормов / В сб.: "УП съезд Всесоюзного мнхробнол.общества".Тезисы докладов,-Алма-Ата, 1985.- Т.4.- С.27.

19. Гаврллозз H.H. Закваски, применяемые для силосования кормов з СССР // Сельскохоз.биология,- 1985.- JS 6.- C.III-II5.

20. Гаврпловэ H.H., Нагаева M.ÍI. и др. Спзсоб получения бактериально;! закваски для силосования кормов.А.с. Ю91549 (СССР).

21. Гаврзлоьа H.H., Ззхаренко Л.¡Г. Езккснцептрат "Казахеад" ТУ 59.05.100.89-95.- Москва, 1985.- 18 с.

22. Гагрпло-'Т H.H., Тора с? нко Т.Г. Технологическая инструкция по производству сухой закваски из цедлкяозолятзческях бактерии для силосования соломы.- Алма-Ата, I2S5.- 9 с.

23. Гэзрпловэ H.H., Тарасонко Т.Г. Способ выраппвання водных дрогзей и амилолчтзческогс молоитокяачого стрэптокскгз по безотходной технологии. Рацпредложение - 13.-' Алма-Ата.- ISC6.

24. Газрилова H.H., Ззхаренко Л.И. Аптзтонамичвсяая активность и устойчивость к антибиотикам молочнокислых я про-::;юкогокислых бзктеряй, составлявших основу заквасок "Казахе :и" // Биотехнология.-1987.- й 2.-С. 169-172. '

25. Илплетдпнов А.II., Га вралогз H.H. Закваска бактери&тъныа для силосования кормов. Отраслевой стандарт.ОСТ 64-04287.- LI.-1937.- 22 с.

25. Слрсембзев К., Чулков A.B., Новожилова J.I.II., Мукашзв Н.З., Ртрплозз H.H. Способ подращивания .молоди рыб.A.c. Л 1329717, 19П7.

27. Гзпрчлосл Н.Н.,Затаренко jt.II. Антагонистическая активность молочнокислых и пропяоновокнелкх бактерий / В сб.: "2-й сиг.зозпум по молочнокислым бактерия.:, Генетика, метаболизм и прк:;«!!»н1ч. Тезисы докладов.-Нидерланды, 1987.

28. Гавгплова H.H.,Пятпева ¡Л.11. Испытание контактно-сорбциоя-иого способа обезвоживания бактерий // Труды Лн-га микробиологии и вирусологии АН IÖ3CCF.- 1988.- т.33.- С. II9-I25.

29. йариловл H.H. Основы биотехнологии получения микробных препаратов для животноводства.Там же.- С.*""24-35.

30. Пятзевз М.И., Гаврилова H.H., Иванов А.П. Ультраструктура клеток змилолигаческого молочнокислого стрептококка, высу-

шейного расшдагедъяда способом // Био технологов.-1988.--№ 3.- С.354-355;

31. Гаврилова H.H., Захаренко Л.И., Пягаева М.И. и др.Споооб приготовления закваски "Казахсил" для силосования кормов. A.c. № 1423586, одубл.в Б.И; 1988, Ш 39.

32. Гаврилова H.H., Пягзева М.И., Илялевдшов А.Н. Кормовая добавка бектобак.А.с. № 1684972, 1991.

33'; Гаврилова H.H., Пятаева М.И., Захаренко Л.И. Выживаемость молочнокислых и пропио новокислых бактерий в зависимости от состава питательной среды и способа концентрирования биомассы / В сб.*Использование новьж микробных препаратов . в народном хозяйстве".- Алма-Ата, IS89.- T.35.-C.4I-47.

34. Гаврилова Н.В.,Захаренко Л.И., Никитина Е.Т.,Ватлугина JUA. "Способ культивирования молочнокислых и пропионово-каслах-ба1»ериГ'- A.c. Й17П788, 1991.

35. Гаврилова H.H.., Захаренко Л.И., Никитина E.Ï., Ветдугина Л.А., Способ культивирования молочнокислых, И ПРОПИОНОВО- ■ кислых бакгоряВ, А.с.й 1769837.. ,1992.

36. Илялегдшвов; Гаврилова H.H., Рагшкова И.А.Основнне принципы создания щкробяогиков для ливотдаводстза / В сб. :"Мшсрооргадизмытстдагулеторы роста растений.в животных.

- Тезисы докд.Врес.ковф.- Ташкент,1989.-T.I.- С. 80-81.

37. Пзвраяова Н.,.Н., Рагшкова ¡H.A. ,ЛУкашева Л.М. Микробиошш в профилактике и лечении желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных / в сб.:"Микробиологические и биогехнологические основы интенсификации растениеводства и животноводства. Тезисы докл. Всес.конф,- Алма-Ата,1990.-C.I8.

38. йврилова H.H., Захаренко л.И. Изменчивость молочнокислых бактерий в процессе производства сухих препаратов."Рви же.-С.20.

39. Гаврилова H.H., Лукашева Л.М., Юшлегдинов А.К. и др. Способ лечения и профилактики желудочш-квшечиых заболеваний птиц. Заявка на изобретение te 4712492/15 (089216),приоритет от 29.06.89. ,

40. Гаврилова H.H., Ратникова И.А.,ЛУкашева Л.М. Мякробиотики в профилактике и лечении желудочно-кишечных заболеваний животных.// Тезисы докд.Всес.конф. "Микробиологические и Оиотехнологические основы интенсификация растениеводства .и кормопроизводства"»АдаЭ'Ага»Х990.- C.I8.

41. Гаврил о бэ H.H., Ратникова И.А., Лукаше'ва JI.M. и др. Изучение антагонизма микроорганизмов-симбионтов желудочно-кишечного тракта по отношению к возбудителям салшо-неллеза. // Материалы И Всес.семинара. Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения. Степногорск, 18-20 июня, 1991,- С.66.

42. Временное наставление по применению лактовита-К в ветеринарии.- М.,1991.- 2 с.

43. Кирилова H.H. Лзктовит-К. Технические условия ТУ 10.07.175-91, - 8 с.

44. Гаврилова H.H., Пягаева М.И., Илялетдинов А.Н. и др.Кор-мовзя добавка бе нго бак .Экспресс-информация // Новости науки Казахстана.- IS9I.- J5 I.- С. 53-54.

45. йврилова H.H., Лукашева Л.М., Илялетдинов А.Н. Способ лечения и профилактики колибактериозов домашних птиц.-Экспресс-ин^рлация //Новости науки Казахстана.-1991,-И .- С. 49-50. .

46. Илялетдинов А.Н., Гаврилова H.H. Смешанные культуры микроорганизмов в биотехнологии кормопроизводства // Изв. АН PK.- 1992.- № 5.-С.34-40.

47. Ряховская Т.В.,Захаренко Л.И., йврнлова H.H. Антимикробная актп'люоть некоторых видов рода Artenisia// Лекарственные растения Казахстана.Алюты: Гилым.-1992.-С.94-99.

Н.Н. Гаврилова "Бактериялык; культуралар негхзшде х;а-• ца пробиотиктерд! жасау мен ендеу"

Тужырым

Жануарлар мен вгустардыц шек-к;арындарынан ертурлх хшек ауруларын цоздыргыштарына ^арсьшыч; керестуяп, бел-riai 6ip багыттагы эсер ететхн жана шкробиотмктчрдт жасауга аса цажетт! С жэне В тобындавы виташндерд1 тузетхн микробтар болгнгп алынды.

Cyt, пропион к£1щылдары, целлюлоза ь1дьграт\лш,1 бакте-риялардан микробиотиктер жасаудьщ тылами Heffai жасалды.

йумыс жаца микробтыц препараттарды: avtjji шаруашылын; малдары мен куетардыц колибактериозын емдеу мрн одан сак;тандьфуга арналган лактовит-К, аралас щек инфекция-сына, соньщ шгнде сальмонеллезге каРсы ?;олданута ар-налган полилактовитт1, азьп^ крртылгыштыгы мен мал онт-мдхл1Г1Н арттыруга кемяктесетм белок алмасуый калыща ■келт!рет1Н, азьпда доспа рет!нде колданылатын бййтобакты жэне eHflipici шкробиологиялык; енеркэсш заводтарында y!i-ымдастырылган есхмдхктердх биологиялык; жолмен консйрвг-лейт1Н препараттар ал.умен ая^талды.

Summary

Н.Н. Gavrilova " Creation and production of new probibtics based on bacteriaj. .cultures" ■

Microorganisms-antagonists to different pathogens of intestinal diseases, producers of vitamins С, В group, irreplaceable amino acids which can be used in preparation of new microbiotics with the directional action have been isolated from the gastrointestinal tract of animals and fowls.

Scientific fundamentals for production of microbiotics from lactic-acid, propiotiic-acid and cellulolytie bacteria have been worked out .The new microbial preparations produced are as follows: Lactovit К _ for treatment and prophylaxis of co-libacteriosis in farm animals and fowls; Polylactovit - against mixed intestinal infection including salmonellosis; a fodder additive, Bentobac - for normalization of protein metabolism and to increase fodder digestibility and animal productivity; ' and biological conservants of vegetal raw stuff produced at the plants of microbiological industry.