Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антистрессовые и антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антистрессовые и антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий"

На правах рукописи

ВАРЮХИНА Светлана Юрьевна

АНТИСТРЕССОВЫЕ И АНТИМУТАГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.К. Шильникова;

доктор биологических наук С.К. Абилев.

Ведущая организация: ФГУП «ГосНИИ Синтезбелок».

Защита состоится «><^У» 2004 г. в « » часов

« минут на заседании диссертационного совета Д 220.043.04 при Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет

Л.И. Воробьева.

МСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА. Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета — кандидат сельскохозяйственных наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Человек является частью природы. Влияние человека на среду обитания всегда зависело от этапа развития цивилизации, исторической и географической ситуации.

На данном этапе прогресс сопровождается глобальными экологическими нарушениями и изменениями. Особое внимание вызывает загрязнение окружающей среды факторами, не свойственными биосфере в норме, что не только испытывает компесаторные возможности природы, но влияет на здоровье людей и уже сейчас может нанести ущерб будущим поколениям. Антропогенное загрязнение мутагенами окружающей среды приводит к увеличению частоты мутаций у микроорганизмов, растений, животных и человека. Предотвратить увеличение мутационного груза, способного вызвать «взрыв» мутабельности и тем самым сохранить наследственность -актуальная и сложная задача стоящая перед человечеством.

Существует несколько подходов к решению проблемы. Предотвращение загрязнения среды а также идентификация и изъятие мутагенов окружающей среды, весьма эффективны, но их реализация является весьма проблематичной. Другим подходом является повышение устойчивости организмов к действию экстремальных факторов. Для этих целей возможно использование антимутагенов - веществ, способных снижать частоту спонтанной и индуцированной мутации (Алекперов У.К., 1989).

Прокариоты как потенциальные источники антимутагенов почти не изучались, хотя учитывая общность фундаментальных реакций прокариот и эукариот, а также способность прокариот осуществлять реакции некоторых уникальных синтезов, позволяют предположить, что бактерии могут быть источниками ценных антимутагенов. Использование бактерий, как источников антимутагенов, имеет ряд преимуществ перед другими источниками. Бактерии способны к эффективному наращиванию биомассы на дешевых средах (например, на отходах некоторых производств) и за довольно короткий промежуток времени. Кроме того, существуют возможности воздействия на бактериальный метаболизм, позволяющие стимулировать преимущественную выработку необходимого человеку продукта и его дальнейшую экскрецию из клеток. Бактерии являются облигатными составляющими нормальной микрофлоры человека и широко применяются в медицине и биотехнологии. Эти полезные бактерии должны быть защищены от неизбежных стрессов, возникающих в условиях микробиологических производств и возможного присутствия мутагенов в пище и в желудочно-кишечном тракте человека.

Кроме антимутагенного действия в отношении мутагенеза, индуцированного химическими соединениями, бактерии привлекли к себе внимание исследователей способностью к реактивирующему действию в ответ на стрессовые ситуации. Стресс- это ситуация, при которой параметры окружающей среды резко отличаются от обычных условий существования организма. Ганс Селье определял стрессовый ответ как запрограмированную реакцию организма на резкое изменение условий окружающей среды. Со времен Г. Селье этот термин стал очень популярен и в настоящее время приобрел более широкий смысл, включая действие экстремальных факторов на биообъект и противодействие им.

Удивительная общность стрессовых ответов у исследованных про- и эукариотных организмов позволила выявить высокую консервативность фундаментальных механизмов их клеточной регуляции. Поэтому микроорганизмы служат хорошими моделями для изучения стрессовых ответов у высших организмов.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение антистрессовых и антимутагенных свойств пропионовокислых бактерий (ПКБ).

В ходе работы решались следующие задачи:

• выделение и очистка внутриклеточного белка пропионовокислых бактерий, обладающего защитными и реактивирующими свойствами в отношении бактерий, подвергнутых стрессорным воздействиям;

• частичная физико-химическая характеристика очищенного белкового препарата;

• изучение AM активности представителей различных видов и штаммов ПКБ с использованием культуральной жидкости (к.ж.), «живых» и «мертвых» клеток в качестве источников антимутагенных факторов;

• исследование наиболее перспективных с точки зрения AM активности штаммов в отношении мутагенеза, индуцируемого мутагенами различного химического строения и механизма действия;

• установление свойств этих антимутагенов и анализ возможного механизма их действия.

Научная новизна работы. В ходе работы был получен в очищенном состоянии белок из клеточного экстракта пропионовокислых бактерий с молекулярной массой 35.0 kDa, обладающий реактивирующей и защитной активностью. Изоэлектрическая точка очищенного фермента определена как 4.95.

Определение аминокислотной последовательности ^терминального и двух интернальных участков молекулы белка позволило охарактеризовать его как

за синтез цистеина из О-ацетил-серина и

сульфида водорода и контролируемый cysK-геном; установлена высокая степень гомологии с цистеинсинтазами других бактерий: Staphylococcus haemoliticus, Lactococcuss lactis, Bacillus subtilis.

При использовании метода двумерного электрофореза внутриклеточного белок-содержащего экстракта Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii показана индукция синтеза фермента, который, видимо, играет важную роль в адаптации бактерий к действию детергентов и к нагреванию.

Впервые показано реактивирующее действие белка в отношении клеток Е. coli подвергнутых тепловому шоку и действию желчных кислот и защитное действие в отношении УФ-облученных клеток. Установлена зависимость защитного эффекта белка от его концентрации.

Изучена антимутагенная активность 17 штаммов бактерий, при этом особое внимание уделено изучению антимутагенеза пропионовокислых бактерий, которые имеют широкое практическое применение.

Исследовалась антимутагенная активность кульуральной жидкости, а также «живых» и «убитых» клеток бактерий.

Установлено, что антимутагенный фактор культуральной жидкости представлен веществом белковой природы, относительно термоустойчивым, с молекулярной массой более 2.0, но менее 12.0 kDа.

В качестве источников мутагенов использовали как прямые мутагены, не требующие метаболической активации, так и промутагены, активирование которых проводили путем добавления микросомальной активирующей смеси. Всего было изучено мутагенное действие 8 различных мутагенов, часть из которых обладает канцерогенным действием: 4-нитрохинолин-1-оксид (4-НХО), N-метил N-нитро N-нитрозогуанидин (МННГ), 2-нитрофлуорен (2-НФ), 9-аминоакридин (9-АА), перекись водорода (Н2О2), азид натрия (Na№), 2-амино-1метил-5-фенилимидазопиридин (РЫР), бенз(а)пирен (ВАР). В качестве тест-культуры применяли 4 тестерных штамма Salmonella typhimurium, регистрирующих различные типы мутаций у бактерий: ТА 100, ТА 98, ТА 97, ТА 102.

Практическая значимость. В настоящей работе представлены новые данные о дополнительных ранее неисследованных свойствах пропионовокислых бактерий как пробиотитков, источников антимутагенов, а также факторов протекции и реактивации микроорганизмов, подвергнутых различным стрессовым факторам.

Апробация работы» Результаты исследований были представлены на Международной конференции «Predictive modeling in foods» (Бельгия, Лейвен, сентябрь 2000), на Международном симпозиуме «Propionibacteria» (Швейцария, Цюрих, июнь

2001), на заседании кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им М.В. Ломоносова (17 февраля 2004).

Публикации. Результаты диссертации представлены в 4 работах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения результатов исследований, выводов и списка литературы (88 работ). Работа изложена на 127 страницах, иллюстрирована 24 таблицами и 35 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными объектами исследования служили классические пропионовокислые бактерии, полученные из коллекции кафедры микробиологии МГУ и из коллекции «Centre National de la Recherche en Zootechnii», Франция. Бактерии выращивали на минимальной глюкозной среде следующего состава (%): глюкоза-1.5, триптон («Difco») - 0.1, дрожжевой экстракт C'Difeo") - 0.05, (NH^SOi - 0.3, КН2РО4 - 0.2, CaCb - 0.002, MgS04 -

дистиллированная вода, Культивирование проводили при 30° С в стационарных условиях. Для получения бесклеточных экстрактов в целях выделения внутриклеточного белка бактерии культивировали в течение 72 ч. Экстракты получали, разрушая клетки ультразвуком с последующим центрифугированием для осаждения крупных обломков и клеточных стенок. Для удаления присутствующих в экстракте нуклеиновых кислот в полученный супернатант вносили протаминсульфат.

Дробное фракционирование клеточного экстракта сульфатом аммония осуществляли согласно общепринятой методике (Долсон и др., 1991). В качестве ингибитора сериновых протеаз, использовали фенилметансульфонилфторид (ФМСФ).

Для разделения белковых смесей использовали следующие варианты колоночной хроматографии: ионнообменная хроматография на анионитах DEAE-сефароза, гель-фильтрация на сефадексе G-75 . Хроматографическое разделение проводили при помощи стандартных приемов (Остерман Л.А., 1984). Для анализа гомогенности белковых фракций и определения молекулярной массы белков использовали метод SDS-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Степень гомогенности полученного очищенного белка определяли методом эксклюзивной ВЭЖХ. Для экспресс-определения концентрации белка использовали спектрофотометрический метод Кристиана-Варбурга.

Концентрацию белка подсчитывали по эмпирической формуле

С (мг/мл) = 1.55 Аио-0.76 Ааю

Процент нуклеиновых кислот от массы белка определяли исходя из отношения А280/А260 при помощи эмпирической таблицы - (Долсон, и др., 1991).

Для определения концентрации белка использовали также метод Лоури.

Для определения изоэлектической точки белка, а также в целях изучения биосинтеза у этих бактерий цистеинсинтазы под действием стрессовых факторов суспензия клеток P. freudenreichii subsp. shermanii в контрольном (не подвергнутом стрессу) и в различных стрессовых состояниях была) подвергнута двумерному электрофоретическому разделению.

Клетки предварительно метили смесью [35S] метионина и цистеина.

Для секвенирования N-концевого участка белка использовали «ProSorb sample preparation cartridge» («Applied Biosystem», Foster city, CA) и автоматический «Beckman/Porton LF3000 protein sequencer» («Beckman Instruments», Inc, Fullerton, CA). Обработку данных проводили с использованием «FASTA program» согласно (Pearson and Lipman, 1988).

Белковые фракции, полученные при помощи описанных хроматографических методов фракционирования, испытывались на биологическую активность. Биологическую активность определяли путем подсчета колонийобразующих единиц образованных клетками E.coli AB 1157 в чашке Петри с питательным агаром фирмы «Oxoid» (США) после облучения бактерий УФ-светом. Активность выражали с помощью индекса деления (ИД), то есть отношения числа КОЕ в опытном варианте к количеству КОЕ в контроле. Протекторное действие очищенного белка на клетки Е. coli AB 1157 испытывали также в условиях УФ-облучения, а реактивирующее - в условиях теплового шока и действия желчных кислот.

Для изучения антимутагенного действия применяли модифицированный метод Эймса с использованием в качестве тест-культуры S. typhimurium. Принцип метода состоит в том, что после обработки клеток тест-штамма мутагеном на селективной среде вырастают ревертанты по гистидину (без внешних воздействий реверсии к прототрофности происходят с низкой частотой, что отражает спонтанный фон). В соответствии с этим, обрабатывая те же самые клетки антимутагеном или проводя предынкубацию мутагена с исследуемым антимутагенным агентом, ожидают снижение числа индуцированных ревертантов и определяют степень антимутагенного эффекта.

Антимугагенный эффект модулятора определяли по формуле: Ингибирование (%) = Ca-в) ♦ 100%

где а - число гистидиновых ревертантов, индуцированных под действием мутагена (позитивный контроль); в - число гистидиновых ревертантов, индуцированных под действием мутагена в присутствии антимутагена; с - число ревертантов, вырастающих в результате спонтанного мутирования. Антимутагены не оказывали влияния на уровень спонтанного мутагенеза, поэтому в формуле не учитывали так называемый негативный контроль - число ревертантов, вырастающих в присутствии только антимугагена,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Антистрессовые свойства пропионовокислых бактерий.

Л.И. Воробьевой с соавторами (Vorobjeva et al, 1999) была показана реактивация инактивированных УФ-светом клеток Е. coli, S. cerevisiae, S. typhimurium,C. guelliermondii и целого ряда других микроорганизмов с использованием экстракта клеток Р. freudenreichii subsp. shermanii.

Показано, что защитная и реактивирующая активность сосредоточены в белковых фракциях диализата экстракта, осаждаемых при солевом фракционировании клеточного экстракта сульфатом аммония в интервалах 20-40% и 60-80% насыщения. Было продемонстрировано, что защитная активность связана с нуклеопротеидным комплексом, а реактивирующая активность нуклеопротеидных комплексов напрямую связана с наличием белковых молекул в активных фракциях, и при этом доказан нековалентный характер взаимодействия белка и нуклеотидной составляющей активного комплекса. Из экстракта клеток пропионовокислых бактерий был выделен и частично охарактеризован белок, проявляющий реактивирующую и протекторную активность. Однако, описанные ранее способы выделения белка не всегда воспроизводились, что не позволяло получить в руки очищенный белковый препарат, необходимый как инструмент исследования механизма реактивирующего действия и антистрессовых ответов клетки.

В результате поставленных экспериментов по фракционированию белков клеточного экстракта P. freudenreichii subsp. shermanii получен гомогенный белковый препарат, обладающий защитной и реактивирующей активностью.

Для получения препарата использовали фракцию, полученную при насыщении клеточного экстракта P.fi^eudenreicMi subsp. shermanii сульфатом аммония в интервале 6080% насыщения.

Перед сульфатным осаждением экстракт предварительно обрабатывали протаминсульфатом, чем достигалось значительное освобождение от примесей нуклеотидной природы, а после растворения полученного осадка, белковый раствор инкубировали с ФМСФ для ингибирования протеиназ с целью ослабить или предотвратить протеолиз в процессе выделения белка. Затем было проанализировано хроматографическое поведение белкового материала на сорбентах: DEAE-сефарозе FF и сефадексе G-75.

После разделения фракции 60-80% на анионите DEAE-сефарозе, было получено пять активных фракций, свойства которых представлены в таблице 1. Дальнейшую работу проводили с фракцией II (ИД пред. 1.7, содержание нуклеотидного материала 0.715 %), поскольку по данным электрофореза эта фракция была единственной, которая содержала значительное количество белка с молекулярной массой 35 kDa.

Для дальнейшей очистки полученной белковой фракции использовали метод гель-фильтрации на сорбенте сефадекс G-75. В результате разделения было получено пять активных фракций, свойства которых представлены в таблице 1, однако лишь фракция III (ИД пред.2.3, НК — 0%) обладала высокой степенью очистки (95 %) (рисунок 1).

Таблица 1. Свойства фракций, полученных при разделении на сорбентах.

Фракция Конц-я белка мг/мл, В. НК, % от белка Масса фракций, мг Активность, ИД (пред)

DEAE-сефароза I 0.15 8.9 2.6 1.4

П 1.12 0.715 23.0. 1.7

III 3.53 0.5 72.0 1.0

IV 0.44 13.£5 7.7 1.3

V 0.33 21.0 4.5 1.7

VI <0.1 22.0 <0.5 3.4

Сефадекс G-75 I 0.238 0.7 38 15

II 0.461 — 3.0 1.8

in 0.468 — 8.0 23

IV 0.185 0.1 4.4 1.2

V 0.095 03 3.0 1.3

Таким образом, в результате проделанной работы был получен в очищенном состоянии белок, обладающий защитной активностью с молекулярной массой 35 ^а.

1 2 3 Л S

94 67

43

30 —- _ р35

21 у Ж-

14 4.

Рисунок 1. Электрофореграмма фракции III, полученной при разделения на сорбенте Сефадекс - G 75. 1,2 - стандарты, 3,4,5 - реактивирующий белок Р. freudenreichii subsp. shermanii.

Высокая степень очистки полученного белкового препарата была подтверждена с использованием метода ВЭЖХ.

В дальнейшем было проведено определение аминокислотной последовательности ^терминального и двух интернальных участков молекулы белка, что позволило охарактеризовать его как цистеинсинтазу: фермент, ответственный за синтез цистеина из О-ацетил-серина и сульфида водорода и контролируемый cysK-геном; полученные данные продемонстрировали высокую степень гомологии с цистеинсинтазами других бактерий: haemoliticus, L. В. suЫitts (результаты представлены в таблице 2).

Таблица 2. Аминокислотные последовательности, характерные для антистрессового белка р35 выделенного из клеток Р.АеыёепгвкНп subsp. ¡НвгшапИ (я).

Белковое Наибо- Микроорганизм Pi MM % степень Номер

секвенирование лее близкий белок (kDa) гомологии наиболее близкого образца (Ъ)

SAD IDSITEL1FNTPIVR цистеин Bacillus subtilis 5.6 33 68 SW/P37887

(с) синтеза

LEYFNPAGSVK (d) цистеин синтеза Lactococcta lacló 5.2 33 90 SW/Q9CHFO

QGLGTGFV (е) цистеин синтеза Staphylococcus haemoHticus фрагмент 88 SW/Q59918

• (a) pI = 4.95; MM = 35.0 kDa.

• (b) Данные по цистеинсинтазам других микроорганизмов получены из протеомной библиотеки (SwissProt library) с использованием программы FASTA.

• (с) Секвенирование N-концевого участка молекулы белка осуществлено с использованием реакции Эдмана.

• (d) Секвенирование внутреннего участка молекулы белка осуществлено с использованием масс - спектрометрии.

• (е) Представлен только фрагмент белка.

Двумерный электрофорез с использованием радиоактивной метки клеточного белоксодержащего экстракта P. freudenreichii subsp. shermanii, подвергнутого действию

различных стрессорных факторов, позволил проанализировать синтез полученного фермента в контрольном варианте и под действием различных стрессов. Полученные результаты показали индукцию синтеза цистеинсинтазы пропионовокислых бактерий под действием детергентов и нагревания (рис. 2). Была определена изоэлектрическая точка очищенного фермента, которая составила 4.95.

Рисунок 2. Результаты, полученные при двумерном электрофоретическом разделении суспензии клеток Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, содержащей белок, обладающий реактивирующей активностью, (а) Клетки не подвергнутые стрессу, (b) клетки подвергнутые кислотному шоку, (с) действию желчных кислот, (d) нагреванию, (е) УФ-облучению.

Реактивирующий эффект очищенного белкового препарата с молекулярной массой 35.0 kDa был продемонстрирован в отношении клеток Е. coli, подвергнутых тепловому шоку и действию желчных кислот. Как следует из данных, представленных в таблице 3, постинкубация клеток Е. coli, подвергнутых действию желчных кислот с реактивирующим белком, увеличивало их выживаемость почти в 9 раз. Постинкубация с реактивирующим белком клеток Е. coli, подвергнутых термоинактивации увеличивало их выживаемость в 4 раза.

Таблица 3. Реактивирующий эффект белка с молекулярной массой 3S kDa в отношении действия желчных кислот и теплового стресса.

• а) Клетки Е. coli инкубировали 10 мин с белком р35 в концентрации 20 мг'л-1.

• (b) Для каждой экспериментальной точки ставили три независимых эксперимента.

• (с) Клетки Е. coli, не подвергнутые стрессу.

• (d) Клетки Е. coli инкубировали 10 мин с желчными кислотами в концентрации 6 гл-1.

• (е) Клетки Е. coli нагревали в течение 90 мин при 45°С.

Защитный эффект белкового препарата с использованием его различных концентраций был также продемонстрирован в отношении клеток Е. coli, подвергнутых действию УФ-света. Полученные данные показали зависимость протекторного эффекта белка от его концентрации (рисунок 3).

ю 4» 40 ео so 100 iao

Концентраций балка (MrtJll

Рисунок 3. Зависимость протекторной активности белка от его концентрации в отношении клеток Е.еоН, инактивированных УФ-светом.

Возникает естественный вопрос о том, каким образом внутриклеточный белок, идентифицированный как цистеинсинтаза, может проявлять защитные и реактивирующие свойства в естественных условиях существования бактерий. Культуральная жидкость ПКБ указанные свойства не проявляла, следовательно, активный белок локализован только в клетках и во внешнюю среду не экскретируется. Видимо, этот белок проявляет свои защитные функции в стрессовых условиях, в которых часть, или большая часть клеток погибает и, подвергаясь дизису, выделяет свое содержимое наружу. В этом случае часть популяции, потенциально способная к репликации, но находящаяся в состоянии шока, получает сигнал, выраженный в присутствии в среде цистеинсинтазы, вероятно способной к связыванию с определенными мембранными рецепторами. Сигнал далее по каскадному механизму поступает в клетку, в которой активизируются естественные репарационные системы. Иными словами, обнаруженный нами внутриклеточный реактивирующий белок может выполнять жизненно важную роль для клеточной популяции в целом, обеспечивая существование вида в неблагоприятных условиях.

Антимутагенные свойства пропиоповокислых бактерий.

Ранее Л.И. Воробьевой с соавторами (Воробьева и др., 1996; Vorobjeva 1999) с использованием модифицированного метода Эймса, было показано, что культуральная жидкость и клетки логарифмической фазы роста пропионовокислых бактерий обладают антимутагенным (AM) действием, в отношении мутагенов, вызывающих как мутации замены пар оснований, так и мутации сдвига рамки считывания у бактерий. Было установлено, что антимутагенный фактор представлен относительно термоустойчивым веществом (веществами) пептидной природы с молекулярной массой менее 12 kDa.

Работы проводились главным образом с одним штаммом пропионовокислых бактерий — Propionibacterium Jreudenreichii subsp. shermanii BKM 101. а также с ограниченным набором' веществ, обладающих мутагенной активностью. Широкого скринингого исследования различных видов и штаммов ПКБ не проводилось.

Настоящая работа представляет собой наиболее полное исследование АМ-свойств пропионовокислых бактерий, а также ряда представителей других видов бактерий, в отношении мутагенеза, индуцируемого соединениями различной химической природы и механизма действия.

Пропионовокислые бактерии, а также бифидобактерии и Enterococcusfaecalis являются постоянными обитателями желудочно-кишечного тракта человека. Поэтому именно эти бактерии были выбраны нами в качестве объектов изучения их АМ-свойств. Дело в том, что почти все продукты как растительного, так и животного

происхождения (особенно при их процессинге), содержат то или иное количество мутагенов и канцерогенов. Мутагены образуют также некоторые бактерии (например, бактерии рода Bacteroides), обитающие в толстом кишечнике человека и животных. Поэтому возможность снижения количества мутагенов с использованием бактерий в качестве АМ-факторов имеет важное значение для улучшения здоровья людей и широкие перспективы их использования в биотехнологии.

В результате поставленных экспериментов была изучена антимутагенная активность 17 штаммов бактерий, при этом особое внимание уделялось изучению антимутагенеза пропионовокислых бактерий. В качестве источников антимутагенов использовали культуральную жидкость, а также «живые» и «убитые» клетки бактерий. Ранее (Lankaputhra, Shah, 1998) была показана АМ-активность «живых» и «убитых» клеток бифидобактерий и молочнокислых бактерий. В настоящей работе также определялась АМ-активность к.ж., «живых» и «убитых» клеток В. bifidum и Е. faecalis, однако она не превышала антимутагенеза ПКБ. Было обнаружено, что не всегда «живые» бактериальные клетки проявляют антимутагенный эффект. Это показывает, что антимутагенная активность клеток не ограничивается лишь их сорбционными свойствами, но может включать дополнительные, пока неустановленные механизмы антимутагенеза. Было изучено мутагенное действие 8 различных мутагенов, часть из которых обладает канцерогенным действием. В качестве тест-культур применяли 4 тестерных штамма. 51 typhimurium, регистрирующих различные типы мутаций у бактерий: ТА 100, ТА 98, ТА 97, ТА 102. При этом удалось показать неодинаковую способность мутагенов индуцировать различные типы мутаций у тестерных штаммов. Для изучения влияния мутагенов на проявление AM активности различными культурами пропионовокислых бактерий, использовали бенз(а)пирен и PhiP и два тестерных штамма S. typhimurium, деффектные по синтезу гистидина - ТА 98 и ТА 100, реагирующих на мутации сдвига рамки считывания и замены пар оснований соответственно. Результаты представлены на рисунках 4 и 5.

Так, мутагенная активность ВАР в отношении тестерного штамма S. typhimurium ТА 98 при использовании к.ж. в качестве антимутагенного фактора всех исследованных бактерий ниже, чем при исследовании активности вещества на штамм ТА 100, однако, при использовании в качестве AM фактора клеток P. freudenreichii subsp. freudenreichii KM 133 активность ВАР ниже в отношении штамма ТА 100. Клетки P. freudenreichii subsp. shermanii KM 103 и Р. acidipropionici CNRZ 86 не проявляют защитного эффекта в отношении мутагенеза, индуцированного ВАР. На основании полученных данных можно предположить, что способность вызывать мутации сдвига рамки считывания у

бенз(а)пирена ниже, чем его способность вызывать мутации замены пар оснований в молекуле ДНК.

■ кугътуральная жидкость (ТА98)

■ клетки (ТА98)

0 культура/ъная

жидкость(ТА100) □ кпвтки(ТАЮО)

Рисунок 4. Влияние типа регистрируемой мутации на выражение антимутагенного эффекта при работе с бенз(а)пиреном.

1. Р.]теийепге1ски зуиЪзр. ]тепйепге1ски КМ 133

2. Р. [теийептеЬсНИ subsp. ¡Негшапи КМ 103

3. Р. асКргорюта СМ^ 86

Мутагенная активность РЫР в отношении штаммов Л 1урМтипит ТА 98 и ТА 100 при использовании КТК. И клеток Р. /геиёептски subsp. /геиёептскп КМ 103 и Р. /геиёепгежкп subsp. /геиёептскп КМ 133 в качестве АМ факторов различается незначительно. Это позволяет предположить, что РЫР обладает примерно одинаковой способностью вызывать мутации замены пар оснований и сдвига рамки считывания у бактерий.

1 2

Рисунок 5. Влияние типа регистрируемой мутации на выражение антимутагенного эффекта при работе с РЫР.

1. Р. ].теыс1епге1сНт subsp. ¡Нвгтапи KM 103

2. Р. /ггыс1епге1сНп subsp./ггыс1епге1сНп KM 133

В ходе работы было изучено влияние на АМ-активность бактерий компонентов различных сред, используемых для их выращивания. Как видно из данных, представленных в таблице 4, максимальный АМ-эффект обнаруживается в случае использования к.ж., полученной при росте бактерий на синтетической среде (1). Эта среда почти не проявляла собственного антимутагенного действия. В то время, как в случае двух других сред, АМ-активность культуральной жидкости бактерий была почти в два раза ниже, а АМ-действие самих сред достаточно высоким, особенно при использовании кукурузно-глюкозной среды. Поэтому в основных экспериментах мы использовали стандартную синтетическую среду, как наиболее подходящую.

Таблица 4. Влияние на АМ-акгивносгь ПКБ сред, используемых для их выращивания.

№ Варианты Белок, мг/мл Число ревертантов в чашке (ХЙЕ) АМ,%

1 синт. среда (1) 2097*123.3 0.5

2 к.ж. на среде (1) 0.4 465±24.9 89.5

3 сиит.среда (2)+вотамины 2099±873 27.2

4 клена среде (2) 0.1 , 1255±72.9 462

5 кук-глюк. среда (3) 1453±50.9 36.6

6 клона среде (3) 1.54 129б±46.9 447

*Примечание: спонтанный фон = 273 ±10.4 колоний; негативный контроль = 2106+224.8 колоний.

Было проведено исследование зависимости АМ-эффекта от возраста бактериальных культур. Исследовали 7,17,24,48 и 72 - часовые культуры (рис. 6,7, 8,9). Наибольшую АМ-активность проявляли культуры в ранней и поздней логарифмической фазе роста. На основании полученных данных в основных экспериментах использовали 24 и 48 - часовые культуры бактерий.

Рисунок б. Антимутагенный эффект культуральной жидкости в отношении мутагенеза, индуцируемого 4-НХО, в зависимости от возраста культуры.

Рисунок 7. Антимутагенный эффект культуральной жидкости в отношении мутагенеза, индуцируемого Н2О2, в зависимостиот возраста культуры.

Рисунок 8. Антимутагенный эффект культуральной жидкости в отношении мутагенеза, индуцированного бенз(а)пирепом, в зависимости от возраста культуры.

Рисунок 9. Антимутагенный эффект культуральной жидкости в отношении мутагенеза, индуцированного РЫР, в зависимости от возраста культуры.

В случае работы с мутагенами, требующими метаболической активации, были подобраны оптимальные конценцентрации микросомальной активирующей смеси для каждого из мутагенов (табл. 5,6).

Таблица 5. Влияние концентрации S9 mix на мутагенность ВАР, индуцирующего мутации у S. typhimurium ТА 98.

Конц-я S9 mix Конц-я ВАР (мкг/на чашку) Среднее число ревертантов на чашку, X±SE

5%,100 мкл/ на чашку 0.5 58.0±11.3

2.0 72.0±9.9

5.0 109.0±3.6

10%, 100 мкл/на чашку 0.5 88.7±14.2

2.0 186.3±31.6

5.0 206.7±38.6

10%, 500 мкл/на чашку 0.5 82.7±7.5

2.0 197.7±7.5

5.0 316.3±11.9

*Примечание: спонтанный фон = 18.0±1.4

Таблица 6. Влияние концентрации S9 mix на мутагенность PhiP, индуцирующего мутации у S. typhimurium ТА 98.

Конц-я S9mix Конц-я PhiP (мкг/на чашку) Среднее число ревертантов на чашку, X±SE

5%, 100 мкл/на чашку 0.05 95.0±7.5

0.125 224±19.8

, 0.25 283±50.5

10%, 100 мкл/на чашку 0.05 119.3±0.6

0.125 265.3±50.5

0.25 605.7±45.5

*Примечание: спонтанный фон = 12.7±4.2

Изначально использовали 5% S9 mix в количестве 100 мкл/на чашку как для ВАР, так и для PhiP. Однако, при данной концентрации смеси не наблюдалось ярко выраженного ответа. Поэтому в дальнейшей работе мы увеличили концентрацию микросомальной смеси и использовали 10% S9 mix в количестве 500 мкл/на чашку при

работе с бенз(а)пиреном и 10% S9 mix в количестве 100 мкл/на чашку при работе с 2-амино-1-метил-5-фениоимидазопиридином. Это показывает, что содержание микросомальной фракции имеет неодинаковое действие на проявление мутагенности исследуемых веществ.

Концентрациию мутагенов подбирали путем изучения их влияния на рост тест-культур и использовали концентрации не вызывающие подавления роста бактерий.

Среди штаммов пропионовокислых бактерий, полученных из различных источников обитания, был проведен скрининг, целью которого явилось изучение их антимутагенной активности в отношении мутагенеза 4-НХО и отбор наиболее перспективных штаммов с точки зрения их АМ-эффекта. 4-НХО был выбран на начальном этапе исследования в связи с тем, что представляет собой стабильное химическое соединение, обладает сильным канцерогенным действием, не требует метаболической активации, а также в связи с высокой воспроизводимостью результатов. Со штаммами, проявляющими выраженный антимутагенный эффект были проведены дальнейшие исследования. Их АМ-активность тестировали в отношении мутагенов, вызывающих различные типы мутаций. Особое внимание было уделено изучению АМ-активности двух близкородственных штаммов: P. freudenreichii subsp. shermanii KM 103, Р. /ГеЫепге^Ы subsp. freuuknreichii KM 133, поскольку они проявляли высокую антимутагенную активность, а также, потому что именно эти виды бактерий имеют наибольшее практическое применение. Результаты исследований представлены на рисунках 10 и 11.

Как видно из рисунка 10, что к.ж. P. ГЫепге^и subsp. shermanii KM 103 и Р.

/ГеЫепге^п subsp. АтеЫепге^Ы KM 133 полностью снимали мутагенность NN3. КЖ. других исследуемых штаммов также обладали значительным антимутагенным эффектом. Наиболее ярко выраженный АМ-эффект проявляли клетки Р. АтеЫепге^Ы subsp. shermanii KM 103 и Р. globosum KM 38. Антимутагенность клеток других исследуемых штаммов также была весьма высокой (>60%).

■ культуральная

жидкость Шживые клетки

□мерпые клетки

1 2 3 4 9

Рисунок 10. Антимутагенное действие культуральной жидкости и клеток пропионовокислых бактерий. в отношении мутагенеза, индуцируемого азидом натрия у Л1. typhimurium ТА 100.

"Примечание: пропионовые бактерии выращивали в течение 48 ч., время предынкубации с мутагеном составило 30 мин.

1. Р.АеЫепгекки й^йр. shermanii KM 103

2. P.freudenreichiisubspfrendenreichii KM 133

3. Р. р-еМепт^и йЛйр.р-еМепт^и KM 54

4. P.globosumKM 38

5. Р. petersoniiKM 6

Из данных, представленных на рисунке 11, видно, что юж. Р. freudenreichii й^йр. shermanii KM 103 практически полностью снимала мутагенный эффект 4-НХО (AM эффект 99.0%). К.Ж. Р. freudenreichii яЛйр. freudenreichii KM 54 снижает мутагенный эффект 4-НХО на 59.9% Ингибиторный эффект к.ж других исследуемых бактерий был несколько ниже. Защитный эффект живых клеток довольно высок во всех исследуемых штаммах. Значительное снижение AM эффекта у мертвых клеток наблюдалось лишь в случае. Р. globosum KM 38 и Р.petersoniiХЖ 6.

Рисунок П. Антимутагенное действие культуральной жидкости и клеток пропионовокислых бактерий в отношении мутагенеза, индуцируемого 4-НХО у Ж ХурЫтыпыт ТА 100.

'Примечание: пропионовые бактерии выращивали в течение 48 ч., время предынкубации с мутагеном составило 1.5 часа.

1. Р. ]тгыйгптсНи БиЬБр. ¡Нвгтани КМ 103

2. Р. freыdenreichii БиЬБр.freыdenreichiiКМ 133

3. Р. freыdenreichii suЬsp.freыdenreichiiiКМ 54

4. Р. globosыm КМ 38

5. Р. реХет^отг КМ 6

Для идентификации природы антмутагенного фактора было изучено влияние диализа, нагревания (92°С, 15 мин.) и протеолиза на АМ-акгивность культуральной жидкости. Как видно из данных, представленных на рисунке 12, антимутагенный фактор представлен относительно термоустойчивым соединением белковой природы с молекулярной массой более 2.0 но менее 12.0 кЭа (рис. 12).

Шкж после действия трипома__

■ И-Ж. не обработанная

В ж. после диализа (12 кОа)

О К.ж. после нагревания

■ кж после диатза [1-2kDa)

■ к ж. после действия проназы

2 3 4

Рисунок 12. Влияние диализа, нагревания и протеолиза на антимутагенное действие культуральной жидкости в случае мутагенеза, индуцируемого МННГ, 4-НХО, №N3, 9-АА.

Впервые данные об антимутагеном действии внеклеточного пептида Streptomyces были представлены в работе японских исследователей (Osawa et э1, 1986). Хотя эксперименты ставились по схеме дисмутагенеза (предынкубация мутагена с антимутагеном), тем не менее, мы не можем утверждать, что АМ-действие бактерий ограничивается только дисмутагенезом. Поскольку инкубационная смесь вносилась в чашки Петри с тест-культурой и инкубировалась в течение 48 часов, можно предположить функционирование двойственного механизма АМ-действия, то есть наряду со способностью бактерий к дисмутагенезу, не исключена их способность выступать в роли источников биоантимутагенов.

Таким образом, в настоящей работе представлены новые дополнительные факты, обуславливающие полезные свойства пропионовокислых бактерий, которые открывают дальнейшие перспективы их практического использования.

1. Из клеток P. freudenreichii subsp. shermanii выделен и очищен до гомогенного состояния внутриклеточный белок обладающий защитной и реативирующей активностью в отношении Е. coli, подвергнутой УФ-облучению, нагреванию, действию желчных кислот. Молекулярная масса активного белка 35.0 kDa.

2. Очищенный белок охарактеризован как цистеинсинтаза. Установлена высокая степень гомологии активного белка с цистеинсинтазами других бактерий.

ВЫВОДЫ

3. Показана АМ-активность к.ж., «живых» и «мертвых» клеток ПКБ при изучении широкого спектра мутагенных веществ, вызывающих мутации замены пар оснований и сдвига рамки считывания у бактерий.

4. Показано, что «живые» клетки ПКБ проявляют более высокий АМ-эффект, чем «мертвые», что не исключает участия дополнительных механизмов антимутагенеза наряду с физической сорбцией.

5. Антимутагенез связан с дисмутагенной активностью бактерий, хотя не исключен механизм биоантимутагенеза.

6. Установлено, что основоной ингибитор мутаций представлен относительно термоустойчивым веществом белковой природы.

7. Полученные результаты демонстрируют, новые дополнительные свойства пропионовокислых бактерий как пробиотиков и как новых источников антимутагенных веществ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М., Варюхина С.Ю. Антимутагенность как дополнительное свойство пропионовокислых бактерий для использования в пище и в процессинге пища // 3ri International Conference on Predective Modelling in Foods. Leuven, Belgium. September 2000. P. 182-184.

2. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М., Варюхина С.Ю., Новые применения пропионовокислых бактерий. // International Symposium "Propionibacteria". Zürich, Switzerland. June 2001. P. 12.

3. Воробьева Л.И., Ильясова О.В., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. и Варюхнна СЮ. Ингибирование индуцированного мутагенеза у Salmonella typhimurium белком Propionibacteriumfreudenreichii subsp. shermanii. Anaerobe. 2001. V. 7. P. 37-44.

4. Воробьева Л.., Леверриер П., Зинченко А., Боявал П., Ходжаев Е., Варюхина С, Пономарева Г., Гордеева Е., Ян Г. // Антистрессовая активность Propionibacterium

freudenreichii subsp. shermanii: идентификация реактивирующего белка. Antonie Van Leeuwenhoek. 2004. V 85. № 1. P. 53-62.

Подписано в печать 29.03.2004 Формат 60х841/6 Объем 15 п. л. Тираж 50 экз. Зак. 159

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Р-75 14

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Варюхина, Светлана Юрьевна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Пропиновокислые бактерии.

1.1.1 Классификация.

1.1.2 Общая характеристика классических пропионовокислых бактерий.

1.1.3 Морфология.

1.1.4 Анатомия.

1.1.5 Питательныевые потребности.

1.1.6 Брожение, осуществляемое пропионовокислыми бактериями.

1.1.7 Синтез витамина В12.

1.1.8 Применение пропионовокислых бактерий.

1.2 Мутагены и мутагенез. Классификация мутагенов.

1.3 Антимутагенез. Классификация антимутагенов.

1.3.1 Свойства и критерии оценки антимутагенов.

1.3.2 Бактериальный антимутагенез - новое важное направление в микробиологии.

1.4 Антимутагенные свойства бактерий.

1.4.1 Антимутагенные свойства молочнокислых и бифидобактерий.

1.4.2 Антимутагенез пропионовокислых бактерий.

1.5 Методы определения мутагенных и антимутагенных свойств химических соединений.

1.6 Стрессы и регуляция стрессовых ответов.

1.6.1 Системы сигнализации.

1.6.2 Перекрывание антисрессовых ответов.

1.6.3 Молекулярные шапероны.

1.7 Тепловой шок.

1.8 Низкотемпературный шок.

1.9 Кислотный шок.

1.10 Окислительный стресс.

1.11 Осмотический шок.

2. Экспериментальная часть.

2.1 Материалы.

2.1.1 Реактивы.

2.1.2 Буферные системы.

2.1.3 Сорбенты.

2.1.4 Среда для выращивания пропионовокислых бактерий, способствующая включению радиоактивных аминокислот.

2.1.5 Рабочая субстанция.

2.1.6 Приборы и оборудование.

2.1.7 Источники мутагенов.

2.1.8 Подготовка микросомальной активирующей смеси (S-9 mix).

2.1.9 Источники антимутагенов.

2.1.10 Тест-культуры.

2.1.11 Условия роста культур.

2.1.12 Растворы используемые для постановки теста Эймса.

2.2 Методы.

2.2.1 Фракционирование клеточного экстракта сульфатом аммония.

2.2.2 Обработка растворов сульфатных фракций PMSF.

2.2.3 Концентрирование белкового раствора (1).

2.2.4 Концентрирование белкового раствора перед электрофорезом (2).

2.2.5 Электрофорез.

2.2.6 Двумерный электрофорез.

2.2.7 Введение радиоактивной метки.

2.2.8 Хроматографические методы.

2.2.9 Определение аминокислотной последовательности белка с N-терминального участка молекулы.

2.2.10 Определение концентрации белка и содержания нуклеиновых кислот.

2.2.11 Определение гомогенности препаратов методом ВЭЖХ.

2.2.12 Определение молекулярной массы белков.

2.2.13 Определение биологической активности белковых фракций.

2.2.14 Постановка модифицированного теста Эймса с использованием индикаторных штаммов Salmonella typhimurium.

3. Результаты.

3.1 Защитные и реактивирующие свойства пропионЬвокислых бактерий.

3.1.1 Фракционирование на DEAE-сефарозе.

3.1.2 Гель-фильтрация на сорбенте G-75.

3.1.3 Изучение физико-химических характеристик очищенного белкового препарата.

3.1.4 Изучение зависимости протекторной активности белка от его концентрации в отношении клеток

Е. coli, инактивированных УФ-светом.

3.1.5 Изучение реактивирующего эффекта белка в отношении действия желчных кислот и теплового стресса.

3.2 Антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий».

3.2.1 Проверка генотипа тест-штамма.

3.2.2 Исследование влияния компонентов сред на антимутагенную активность бактерий, используемых для их выращивания.

3.2.3 Изучение влияния различных факторов на АМ-активность бактерий. а) Исследование АМ-эфекта в зависимости от возраста исследуемых культур. б) Изучение влияния концентрации микросомальной активирующей смеси на выражение АМ-эффекта в) Изучение влияния типа регистрируемой мутации на выражение АМ-эффекта.

3.2.4 Антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий. а) Скрининг штаммов пропионовокислых бактерий в связи с их антимутагенной активностью. б) Антимутагенное действие культуральной жидкости и клеток в отношении мутагенеза, индуцируемого азидом натрия. в) Антимутагенное действие культуральной жидкости и клеток в отношении мутагенеза, индуцируемого 2-НФ. г) Антимутагенное действие культуральной жидкости и клеток в отношении мутагенеза, индуцируемого 4-НХО. д) Антимутагенный эффект культуральной жидкости и клеток P. freudenreichii subsp. shermanii KM 103 и

P. freudenreichii subsp. freudenreichii KM 133 в отношении мутагенеза, индуцируемого Н202, ВАР, PhiP .99 з) Антимутагенный эффект культуральной жидкости и клеток P. freudenreichii subsp. shermanii KM 103 в отношении мутагенеза, индуцируемого МННГ и9-АА.

3.3.3 Исследование механизма АМ-действия эффект культуральной жидкости и клеток P. freudenreichii subsp. shermanii KM 103 вотношении мутагенов, индуцирующих мутации замены пар оснований у тестерного штамма S. typhimurium ТА 100.

3.3.4 Изучение влияния нагревания, диализа и протеолиза на антимутагенное действие культуральной жидкости P. freudenreichii subsp. shermanii KM 103 a , P. freudenreichii subsp. freudenreichii KM 133.

3.3.5 Изучение АМ-свойств представителей другигих видов бактерий.

4. Обсуждение результатов.

4.1 Антистрессовые свойства пропионовокислых бактерий.

4.2 Антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антистрессовые и антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий"

Человек является частью природы. Влияние человека на среду обитания всегда зависело от этапа развития цивилизации, исторической и географической ситуации.

На данном этапе прогресс сопровождается глобальными экологическими нарушениями и изменениями. Особое внимание вызывает загрязнение окружающей среды факторами, не свойственными биосфере в норме, что не только превосходит компесаторные возможности природы, но влияет на здоровье людей и уже сейчас может нанести ущерб будущим поколениям. Антропогенное загрязнение мутагенами окружающей среды приводит к увеличению частоты мутаций у микроорганизмов, растений, животных и человека; При этом особенно опасным представляется то обстоятельство, что большинство мутаций рецессивны, то есть они не проявляются в фенотипическом состоянии. Отсутствие фенотипических проявлений позволяет таким мутациям избегать действия естественного отбора и незаметно распространяться Вт популяциях, постепенно накапливаясь. Каждое поколение получает от предыдущего определенное количество мутаций и на протяжении своей жизни в условиях мутагенного загрязнения окружающей среды приобретает еще некоторое дополнительное число, мутаций, передавая последующему поколению значительно больше мутаций. Предотвратить увеличение мутационного груза, способного вызвать «взрыв» мутабельности и тем самым сохранить наследственность - актуальная и .сложная задача стоящая перед человечеством.

Существует несколько подходов к решению проблемы. Предотвращение; загрязнения среды а также идентификация и изъятие мутагенов окружающей среды, весьма эффективны, но их реализация является весьма проблематичной. Одним из подходов является повышение устойчивости организмов к действию экстремальных факторов. Для этих целей возможно использование антимутагенов, веществ, способных снижать частоту спонтанной и индуцированной мутации (Алекперов, 1989).

Прокариоты, как потенциальные источники антимутагенов почти не изучались, хотя, учитывая общность фундаментальных реакций прокариот и эукариот, а также способность прокариот осуществлять реакции некоторых уникальных синтезов, позволили ученым предположить, что бактерии могут быть источниками ценных антимутагенов. Есть и другие положения, подтверждающие важность поиска и использования бактериальных антимутагенов. Во-первых, трудности по получению и использованию микробной биомассы сведены к минимуму, так как бактерии в большинстве своем эффективно наращивают биомассу на дешевых средах (например, на отходах некоторых производств) и за довольно короткий промежуток времени. А также, существуют возможности воздействия на бактериальный метаболизм, позволяющие стимулировать преимущественную выработку необходимого человеку продукта и его дальнейшую экскрецию из клеток. Во-вторых, бактерии являющиеся облигатными составляющими нормальной микрофлоры, а также используемые в приготовлении разнообразных продуктов < представлены главным образом анаэробами. Значит, они в большей степени, чем аэробные микроорганизмы, нуждаются в защите от кислорода и его активных форм, и, следовательно, должны иметь эффективнейшие системы с антимутагенной активностью.

Кроме антимутагенного действия в отношении мутагенеза, индуцированного химическими соединениями, бактерии привлекли к себе внимание исследователей способностью к реактивирующему действию в ответ на стрессовые ситуации. Стресс-это ситуация при которой параметры окружающей среды резко отличаются от обычных условий существования организма. Венгерский врач Ганс Селье, дал имя и идею, стрессорного ответа как запрограмированной реакции организма на резкое изменение условий окружающей среды. Со времен Г. Селье этот термин стал очень популярен и приобрел более широкий смысл, включая сейчас действие экстремальных факторов на биообъект и противодействие им.

Удивительная общность стрессорных ответов у всех исследованных про- и эукариотных организмов1 позволила выявить высокую консервативность, фундаментальных механизмов клеточной регуляции. Поэтому микроорганизмы могут служить моделями для изучения стрессовых ответов.

Целью настоящей работы стало изучение, с одной стороны, антистрессовых, а также антимутагенных свойств пропионовокислых бактерий, что открывает широкие перспективы их практического использования в качестве профилактических и лекарственных препаратов.

Объект наших исследований выбран нами в связи с тем, что пропионовокислые бактерии рассматриваются как перспективные пробиотики, положительное влияние которых на здоровье человека общепризнанно. Пропиновокислые бактерии:

• подавляют активность гнилостных грибов и патогенных грибов,

• образуют витамины группы Вив большом количестве витамина В12,

• некоторые штаммы вызывают торможение роста раковых клеток,

• обеспечивают защиту от кишечной инфекции.

Кроме того, пропионовокислые бактерии не перевариваются в желудочно-кишечном тракте людей, устойчивы к действию желчных кислот и выдерживают низкую (рН 2.0) кислотность желудка. Р. аЫсИргорюпШ ингибирует акивность /3-глюкурон ид азы, азаредуктазы и нитроредуктазы - ферментов, образуемых кишечной микрофлорой и вовлекаемых в образование мутагенов, канцерогенов и промоторов роста опухолей. Пропионовые бактерии стимулируют рост фекальных бифидобактерий и помогают в лечении бактериальных дисбактериозов.

1. Обзор литературы

1.1. Пропиоповокислые бактерии

1.1.1 Классификация

Пропионовокислые бактерии (ПКБ) относятся к семейству Propionibacteriaceae, роду Propionibacterium. Другой род этого семейства Eubacterium. После исследований X. Дугласа и С. Гантера в род Propionibacterium стали включать виды анаэробных коринебактерий. Коринебактерии живут на поверхности кожи людей; их выделяют также из угрей, ран, крови, гнойных и мягких тканей. Поскольку поверхность кожи людей -главное место обитания коринебактерий, их также стали называть кожными пропионовокислыми бактериями. А бактерии, выделенные из сыра и молока, -молочными или классическими. Классические и кожные пропионовые бактерии различают не только места их обитания, но также и ряд биохимических особенностей. Так классические пропионовые бактерии, в отличие от кожных, не образуют индол и не способны к гидролизу жедатины. Кроме того, коринебактерии обладают высокой протеолитической активностью и отличаются от молочных пропионовых в отношении температурного оптимума (у кожных пропионовокислых бактерий 37° и классических 30°С).

На основании работ К. ван Ниля и других исследователей в седьмом издании определителя Bergey (1957) описывается 11 видов (классических) пропионовокислых бактерий. Однако, после установления высокой степени гомологии ДНК число видов сокращено до 4 (таблица 1).

В 1988 г. в род Propionibacterium под названием P. propionicum включена Arachniapropionica ранее включаемая в род Actinomyces. Эта бактерия образует нитчатые ветвистые клетки, в отличие от палочковидных клеток других пропионовокислых бактерий, что делает род Propionibacterium гетерогенным в морфологическом отношении.

В 1983 г. Л.И. Воробьева и др. предложили включить в род Propionibacterium пропионовокислые кокки, имеющие с палочковидными бактериями много общих свойств и высокую степень гомологии ДНК. Новый вид предложено называть P. coccoides, однако официального статуса вида не получил. В 2000 г. на основании методов молекулярной биологии он был включен в род Luteococcus.

Название видов и групп, принятых в Первоначальное название видов

1988 г.

Классические

Р. freudenreichii Р. freudenreichii, Р. shermanii

Р. thoenii Р. thoenii, Р. rubrum

Р. jensenii Р. jensenii, Р. zeae, Р. technicum, Р. raffinosaceum, Р. petersonii

Р. acidi-propionici Р. arabinosum. Р. pentosaceum

Р. coccoides*

Кожные Р. acnes Corynebacterium acnes

Р. avidum С. avidum

Р. granulosum Р. propionicum Р. limphophilum С. granulosum Arachnia propionica С. limphophilum

Предложен в 1983 г. (Воробьева и др., 1983), но официального статуса вида не получил. В 2000 г. после изучения кокковых пропионовокислых бактерий методами молекулярной биологии он был переименован и включен в род Luteoccus (Vorobjeva, 1999)

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Варюхина, Светлана Юрьевна

Выводы

1. Из клеток Р. freudenreichii subsp. shermanii выделен и очищен до гомогенного состояния внутриклеточный белок обладающий защитной и реативирующей активностью в отношении Е. coli, подвергнутой УФ-облучению, нагреванию, действию желчных кислот. Молекулярная масса активного белка 35.0 kDa.

2. Очищенный белок охарактеризован как цистеинсинтаза. Установлена высокая степень гомологии активного белка с цистеинсинтазами других бактерий.

3. Показана АМ-активность к.ж., «живых» и «мертвых» клеток ПКБ при изучении широкого спектра мутагенных веществ, вызывающих мутации замены пар оснований и сдвига рамки считывания у бактерий.

4. Показано, что «живые» клетки ПКБ проявляют более высокий АМ-эффект, чем «мертвые», что не исключает участия дополнительных механизмов антимутагенеза наряду с физической сорбцией.

5. Антимутагенез связан с дисмутагенной активностью бактерий, хотя не исключен механизм биоантимутагенеза.

6. Установлено, что основоной ингибитор мутаций представлен относительно термоустойчивым веществом белковой природы,.

7. Полученные результаты демонстрируют новые дополнительные свойства пропионовокислых бактерий как пробиотиков и источников антимутагенных веществ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Варюхина, Светлана Юрьевна, Москва

1. Абилев С.К. Метаболическая активация мутагенов. // ВИНИТИ, Итоги науки и техники. Сер. Общая генетика. 1986. Т.9. С. 5-96.

2. Абилев С.К., Порошенко Г.Г. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомерных свойств химических соединений. // ВИНИТИ, Итоги науки и техники. Сер. Токсикология. 1986. Т. 14. 171 с.

3. Алекперов У.К. Антимутагенез. (Теоретические и практические аспекты). М.: Наука, 1984. 220 с.

4. Алекперов У.К. Антимутагены и охрана генофонда. М.: Знание, (Новое в жизни, науке, технике). Сер. Биология. №.2. 1989. 150 с.

5. Алекперов У.К., Антимутагены и проблема защиты генетического аппарата. Баку: Элм. 1979. 100 с.

6. Алекперов У.К., Мехти-заде Э.Р. Физиология регуляции мутаганеза. Баку: Элм. 1989. 121 с.

7. Арчаков А.И. Микросомальное окисление М.: Наука, 1975. 327 с.

8. Бочков Н.П., Дурнев А.Д., Журков B.C., Малашенко A.M., Ревазова Ю.А., Середенин С.Б. Система поиска и изучения соединений с антимутагенными свойствами Методические рекомендации. // Хим.- фарм. Журн. 1992. № 9-10. С. 42-49.

9. Воробьева^ Л.И., Голозубова Г.А. Каталаза пропионовокислых бактерий. // Прикладная биохимия и микробиология. 1968. Т. 4. С. 654-658.

10. Воробьева Л.И., Турова Т.П., Краева Н.И., Алексеева М.А. Пропионовокислые кокки и их таксономические положение. // Микробиология. 1983. Т. 52. С. 465-471.

11. И.Воробьева Л.И., Чердынцева Т. А., Воробьева Н.В. Антимутагенность пропионовокислых бактерий. // Тез. Докл. Всес. Коорд. Совещания «Генетические последствия загрязнений окружающей среды мутагенными факторами». Самарканд. 1990.

12. Воробьева Л.И., Чердынцева Т.А., Воробьева Н.В., Абилев С.К. Антимутагенность пропионовокислых бактерий. // Микробиология. 1991. Т. 60. Вып. 6.С. 83-89.

13. Воробьева Л.И., Алтухова Е.А., Наумова Е.С., Абилев С.К. Десмутагенное действие культуральной жидкости, полученной в результате пропионовокислого брожения. // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 6. С. 1093-1098.

14. Н.Воробьева Л.И., Никитенко Г.В., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. Реактивация инактивированных ультрафиолетовым светом Escherichia coli клеточнымиэкстрактами пропиоиовокислых бактерий. // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 6. С. 1135-1143.

15. Воробьева Л.И., Чердынцева Т.А., Абилев С.К. Антимутагенное действие бактерий против мутагенеза, индуцируемого 4-нитрохинолин-1-оксидом у Salmonella typhimurium. II Микробиология. 1995. Т. 64. № 2. С. 228-233.

16. П.Воробьева Л.И., Чердынцева Т.А., Абилев С.К. Антимутагенное действие культуральной жидкости бакутерий на мутагенез у штаммов Salmonella typhimurium, индуцированный 2-нитрофлуореном. // Генетика. 1995. Т. 31. № 7. С. 901-910.

17. Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии. М.: Изд-во МГУ, 1995.280 с.

18. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. Внеклеточный белок пропиоиовокислых бактерий ингибирует индуцируемые мутации у штаммов Salmonella typhimurium. II Микробиология. 2001. Т.70. № 1. С. 39-44.

19. Воробьева Л.И., Абилев С.К. Антимутагенне свойства бактерий (Обзор). // Прикладная биохимия и микробиология . 2002. Т. 38. № 2. С. 115-127.

20. Гусев М.В., Миннева Л.А. Микробиология — М.: Изд-во МГУ, 1992. 448 с.

21. Дол сон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: «Мир», 1991:536 с.

22. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Фармакологические проблемы поиска и применения антимутагенов. // Вестник РАМН. 1993. № 1. С. 19-31.

23. ЗасухинаТ.Д., Синелыцикова Т.А. Мутагенез, антимутагенез, репарация ДНК. // Вестник РАМН. 1993. № 1. С. 9-20.

24. Зинченко A.A., Воробьева Л.И., Гордеева Е.А., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М., Нокель E.A. Выделение и очистка протекторного белка из клеток Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. II Микробиология. 1998. Т. 67. № 4. С. 527-531.

25. Николаев Ю.А. Защитное влияние тетрециклинустойчивого штамма Escherichia coli на рост тетрациклинустойчивого штамма в присутствии тетрациклина при совместном культивировании. // Микробиология. 1996. Т. 65. С. 745-748.

26. Новиков B.C. Программированная клеточная гибель. М.: Изд-во «Наука», 1996. 186 с.

27. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Изд-во «Наука», 1981. 274 с.

28. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: хроматография. М.: Изд-во «Наука», 1984. 287 с.

29. Островский Д.Н. Новые участники окислительного стресса у бактерий. // Успехи биологической химии. 1997. Т. 37. С. 147-169.

30. Порошенко Г.Г., Абилев С.К. Антропогенные мутагены и природные антимутагены. // ВИНИТИ, Итоги науки и техники. Сер. Общая генетика. 1988. Т.12. 205 с.

31. Танирбергенов Т.Б., Абилев С.К. Штаммы Salmonella typhimurium, используемые при изучении мутагенов окружающей среды. // Цитология и генетика. 1989. Т. 23. №6, С. 47-63.

32. Тимаков В.Д., Левашов B.C., Борисов Л.Б. Микробиология: Учебник. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина. 1993. 365 с.

33. Фонштейн Л.М., Калинина Л. М., Полухина Г.Н. Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на Salmonella. (Методическое указание) М. 1977. 52 с.

34. Шарма А. Химический мутагенез. // Современные достижения молекулярной биологии хромосом и клеток. Алма-ата: «Наука», 1989. 217 с.

35. Шигаева М.Х., Ахматулина Н.Б., Абилев С.К. Мутагены и комутагены окружающей среды. Алма-ата: «Гылым», 1994. 255 с.

36. Шигаева М.Х., Ахматулина Н.Б. Современные тенденции к проблеме поиска антимутагенов. // Изв. АН КазССР. Сер. Биол. 1988. № 5. С. 3-21.

37. Abdelali H., Cassand P., Soussottee V., Koch-Bocabeille В., Narbounee J.B. // Mut. Res. 1995. V. 331. № 1. P. 133-141.

38. Ames B.N. Dietary carcinogens and anticarcinogens. Oxygen radicals and degerative diseases. // Science. 1983. V. 221. C. 1256-1264.

39. Ames B.N., McCann J., Yamasaki E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenecity test. // Mut. Res. 1975. V. 31. P. 347-364.

40. Bala S., Grover I.S. Antimutagenic activity of some citrus fruits in Salmonella typhimurium. II Mut. Res. 1989. V. 222. P. 141-148.

41. Bearson S., Bearson B., Foster J. W. Acid stress responses in enterobacteria. // FEMS Microbiology Lett. 1997. V. 147. P. 173-180.

42. Benkirane R., Marcelo G. Gottschalk, Dubreuin D. Identificaition of a Streptococcus sius 60-kDa heat-shock protein usibg Western blotting. // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 153. P. 379-385.

43. Deegenaars L., Watson K. Stress protein and stress tolerance in an Antarctic, psychrophilic yeast, Candida psychrophila. II FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 151. P. 191-196.

44. De Flora S. and Ramel C. Mechanisms of inhibitors of mutagenesis and carcinogenesis. Classification and overview. // Mut. Res., 1988. V. 202. P. 285-306.

45. Goldin B.R., Gorbach S.L. Effect of Lactobacillus acidophilus dietary supplements on 1,2-dimethylhydrochloride-induced intenstinal cancer in rats. // J. Natl. Cancer Inst. 1980. V. 64. P. 263-266.

46. Farr S.B., Kogoma T. Oxidative stress responces in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. II Microbiol. Rev. 1991. V. 55. P. 561-585.

47. Hayatsu H., Arimoto S., Negishi T. Dietary inhibitors of mutagenesis and carcinogenesis. // Mut. Res. 1988. V. 202. P. 429-446.

48. Heller C.S. and Sevag M.G. Prevention of the emergence of drug resistance in bacteria by acridines, phenothiazines and dibenzocycloheptenes. // Appl. Microbiol. 1966. V. 14. P. 879-884.

49. Hochstein P., Atallah A.S. The nature of oxidants and antioxidant system in the inhibition of mutation and cancer. // Mut. Res. 1988. V. 202. P. 363-375.

50. Hocman G. Chemoprevention of cancer: selenium. // Int. J. Biochem. 1988. V. 20. № 2. P. 123-132.

51. Hoffman P., Houston L. and Butter C. Legionella pneumophila htp AB heat shock operon: nucleotide sequence and expression of the 60-kDa antigen in L. pneumophila-infected Hela cells. // Infect. Immun. 1990. V. 58. P. 3380-3387.

52. Hosoda M., Hoshimito M., Morita H., Chiba M., Hosono A. J. // Dairy Sci. 1992. V. 75. №4. P. 976-981.

53. Hosono M., Sagae S., Tokita F. // Milchwissenschaft. 1986. V. 41. № 3. P. 142-144.

54. Kempf E.P.W., Bremer E. OpuA, an osmoticaly regulated binding protein-dependent transport system for the osmoprotectant glycine betaine in Bacillus subtilis. II J. Biol. Chem. 1995.V. 270. P. 16701-16713.

55. Kets Edwin P.W., Jan A.M. de Bont. Effect of carnitines on Lactobacillus plantarum subjected to osmotic stress. // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 146. P. 323-330.

56. Kuroda Yu., Inoue T. Antimutaganasis by factors affecting DNA repair in bacteria. // Mut. Res. 1988. V. 292. P. 387-391.

57. Lankaputhra W.E.V., Shah N.P. Antimutagenic properties of probiotic bacteria and of organic acids. // Mut. Res. 1988. V. 397. № 2. P. 169-182.

58. Missiakas D., Raina S. Protein misfolding in the cell envelope of E. coli: new signaling pathways. //Trends inbiochem. Sciences. 1997. V. 22. P. 59-63.

59. Musatov S.A., Anisimov V.N., Andre V., Vigreux C., Godard T., Gauduchon P., Sichel F. Modulatory effects of melatonin on genotoxic response of reference mutagens in the Ames test and the comet assay. // Mut. Res. 1998. V. 417. P. 75-84.

60. Novick A., Szilard L.Nature. 1952. V. 170. P. 926-928.

61. Parkinson J. Signal transduction schemes of bacteria. // Cell. 1993. V. 73. P. 857-871.

62. Pehlam H.R.B. Speculations of the functions of the major heat-shock and glucose regulated proteins. // Cell. 1986. V. 46. P. 959-961.

63. Perez Chaia A., Zarate G., Oliver G. The probiotic properties of propionibacteria. // Le lait. 1999. V. 79. P. 175-185.

64. Piper W., Peter. The heat shock and ehtanol stress responses of yeast exhibit extensive similarity and functional overlap. // FEMS. Microbiol. Lett. 1995. V. 134. P. 121-127.

65. Reddy G.V., Shahani K.M. and Baneijee M.R. Inchibitory effect of yogurt on Ehrlich ascites tumor cell proliferation. // J. Natl. Cancer Inst. 1973. V. 50. P. 815-821.

66. Rossman T.G., Goncharova E.I. // Mutation Res. 1998. V. 402. № 1. P. 103-110.

67. Rowburry R.J. Do we need to rethink our ideas on the mechanisms of indusible processes in bacteria? Scince Progress. 1998. V. 81. № 3. P. 193-204.

68. Sanders J.W., Venema G., Kok J. Environmental stress responses in Lactobacillus lactis. II FEMS Microbiol. Rev. 1999. V. 23. P. 483-501.

69. Shackelford L.A., Ramkishan R. Chandromohan B.C., Sudhahand R.P. Effect of feeding fermented milk in the incidence of chemically induced colon tumors in rats. // Nutr. Cancer. 1983. V. 5. P. 159-164.

70. Starke P.E., Farber J.L. Ferric iron and superoxide irons are required for the killing of cultured hepatocytes by hydrogen peroxide. // J. Bio. Chem. 1985. V. 260. P. 1009910104.

71. Tolker-Nielsen T., Molin S. Role of ribosome degradation in the death of heat stressed Salmonella typhimurium. // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 142. P. 155-160.

72. Totter J.R. Spontaneous cancer and its possible relationship to oxygen metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 1980. V. 77. P. 1763-1767.

73. Osawa T., Namiki M., Udake S. and Kada T. Chemical studies of antimutagens of microbial origin in: Shankel D.M., Hartman P.E., Kada T. and Hollaeder A.(Eds.) Antimutagenesis and anticaxcinogenesis: mechanisms. Plenum, New York. 1986. 573 p.

74. Vorobjeva Lena I. Propionibacteria. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. 1999. 280 P

75. Vorobjeva L. Physiological peculiarities of propionibacteria present facts and prospective applications. // Science Progress. 2000. V. 83. № 3. P. 277-301.

76. Vorobjeva L.I., Cherdinceva T.A., Abilev S.K., Vorobjeva N.V. Antimutagenesity of propionic acid bacteria.// Mut. Res. 1991. V. 251. P. 233-239.

77. Vorobjeva L., Khodjaev E., Ponomareva G., Chernyshov D., Cherdinceva T. Protective and reactivate action of bacterial peptidies in organisms inactivaited by different stress factors. II Resources, Conservation and Recycling. 1996. V. 18. P. 151-159.

78. Vorobjeva L., Zinchenko A., Khodjaev E., Ponomareva G., Gordeeva E. Isolation and some properties of the nucleoprotein complex of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii.il Le Lait. 1999. V. 79. P. 187-196.

79. Vorobjeva L.I., Iljasova O.V., Khodjaev E. Yu., Ponomareva G.M., Varioukhina S.Yu. Inhibition of induced mutagenesis in Salmonella typhimurium by the proptein of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. II Anaerobe. 2001. V. 7. P. 37-44.

80. Whitaker R.D. and Batt C.A. Characterization of the heat shock response in Lactococcus lactis subsp. lactis. //Appl. Envirom. Microbiol. 1991. V. 57. P. 1408-1412.

81. Wang Y.M., Howell S.K., Kimball J.C., Tsai C.C., Sato J. and Gleiser C.A. In: Gleiser C.A., Arnnott M.S., van Eys J. and Wang Y.M. (Eds). Molecular Interrelations of Nutrition and Cancer. Raven Press, New York. 1982. P. 369-379.