Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липоксигеназный путь метаболизма полиеновых жирных кислот в высших растениях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Липоксигеназный путь метаболизма полиеновых жирных кислот в высших растениях"

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА Й ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В.И.УЛЬЯНЭВА-ЛЕНИНА

На правах рукописи

КУРАМШИН Рустем Алисович

ЛИПОКСИГЕНАЗНЫЙ ПУТЬ МЕТАБОЛИЗМА ПОЛИЕЮВЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ

03. 00. 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 1991

Работа выполнена в лабораторий регуляторных липидов Казанского института биологии КНЦ АН СССР.

Научный руководитель - кандидат биологических наук А.Н. Гречкин

Официальные г>;шо_ненты - доктор биологических

наук, профессор А.Г. Верещагин

Ведущая организация - Институт биохимии

им. А.Н. Баха АН СССР

Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина (420008, г. Казань, ул. Ленина, 183

С диссертацией можно ознакомиться В Научной библиотеке университета.

доктор биологических наук, профессор Л. П. Хохлова

на заседаний специализ;

Защита состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализ кандидат

Гиматутдинов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Интерес, проявляемый в настоящее время к окислительному метаболизму жирных кислот в растениях, объясняется в значительной степени большими успехами, достигнутыми в исследовании простагландинов, лейкотриенов, липоксинов, ■ тром-боксанов и других оксигенированных Сао-жирных кислот, получивших групповое название "эйкозаноиды". Эти соединения синтезируются в тканях животных и относятся к классу так называемых "внутриклеточных гормонов", обладающих высокой биологической активностью.

В последнее десятилетие в литературе появились сообщения об обнаружении простагландинов и родственных им соединений в растительном царстве. Однако, значительное число сообщений подобного рода отличается недостаточностью экспериментального обоснования содержащихся в них выводов или отсутствием подтверждения.

Для оценки целесообразности поиска эйкозаноидов в растениях необходимо принимать во внимание относительную распространенность различных полиеновых жирных кислот в растительных тканях. Преобладающая часть имеющихся литературных данных свидетельствует о том, что цветковые растения не содержат арахи-доновой и эйкозапентаеновой кислот, а ив-эйкозатриеновая кислота содержится в них в очень малых количествах. В этой связи участие эйкозаноидов как класса биорегуляторов в системе эндогенной регуляции у цветковых растений представляется маловероятным.

Для растений более характерны ненасыщенные кислоты окта-деканового ряда. В настоящее время в растениях обнаружен набор ферментов, осуществляющих целый каскад реакций превращения 18--углеродных жирных кислот, приводящих к образованию широкого спектра различных оксигенированных продуктоз, в том числе таких признанных регуляторов как травматиновая и жасмоновая кислоты.

В то же время, несмотря на обилие посвященных данной теме работ, до сих пор не существует целостной картины путей метаболизма С,а-полиеновых кислот и достаточного количества данных об их роли в высших растениях. Последнее обстоятельство объясняется следующими причинами:

во-первых, большим разнообразием ферментативных систем окислительного метаболизма жирных кислот в различных видах и тканях растений, многие из которых просто не изучались;

во-вторых, некоторые из известных путей метаболизма изучены, не полностью,'и велика вероятность обнаружения новых продуктов этих метаболических путей;

в-третих, требуют объяснения механизмы образования ухе известных продуктов окислительного метаболизма жирных кислот растений;

в-четвертых, большой интерес представляет роль продуктов оксигенирования жирных кислот растений в клеточном метаболизме.

Цель и задачи исследования. Основная цель настоящего исследования заключалась в изучении путей окислительного метаболизма о!-линоленовой и линолевой кислот в различных видах высших растений. Для достижения.цели были определены следующие задачи: ~ выделение и идентификация основных метаболитов, образующихся при инкубадиях экзогенных линолевой и ct-линоленовой кислот с различными растительными объектами in vitro;

- выяснение природы ферментативных систем, контролирующих наблюдаемые метаболические превращения;

- изучение влияния различных факторов СрН, концентраций и т. п. 5 на протекание процессов метаболизма жирных кислот.

Научная новизна. 1. Впервые изучен метаболизм с(-линоленовой кислоты в клубнях картофеля. Обнаружено, что основным направлением ее метаболизма, как в присутствии частично очищенной литгоксигеназы, так и в гомогенате клубней картофеля, является .двойное диоксигенирование с образованием дигидроперокси- и гидрокси-гидропероксикислот, содержащих структуру сопряженного триёна. Выделены и идентифицированы неизвестные ранее продукты двойного гидропероксидирования - 9-оксо-16-гидроСперо)кси--10CD ,12CZ) ,14СЕ)-октадекатриеновая и 9С5>Э-гидроСперо)кси-16--оксо-ЮСЕ),12CZ),14СЕ)-октадекатриеновая кислоты.

2. В результате изучения дегидразного пути метаболизма гидроперекисей жирных кислот растений в гомогенате проростков пшеницы и в экстрактах ферментов из ацетоновых порошков льна и кукурузы были значительно дополнены представления о механизме образования ранее известных продуктов - а- и у-кетолов. Предложен и получил подтверждение электрофильный механизм гидроли-

за окисей алленов, приводящий к образованию r-кетолов. Обнаружен неизвестный ранее продукт этого метаболического пути -11-гидрокси-12-оксо-9(Z),15(Z)-октадекадиеновая кислота, образование которого так же, как и образование r-кетола, объясняется кислотным механизмом гидролиза окиси аллена.

3. Обнаружено свойство липоксигеназ диоксигенировать субстраты с ЗСZ)-бутен-1-онил функцией вместо обычной l(Z),4(Z)r пентадиенильной. Впервые обнаружены и идентифицированы продукты гидропероксидирования о(-кетолов.\ 9-гидроперокси-12-оксо-13--гидрокси-1ОС D-октадеценовая, 9-гидроперокси-12-оксо-13-гидр--окси-Ю(Е),15(Z)-октадекадиеновая и 9-гидрокси-10-оксо-13-ги-дроперокси-11С£),15CZ) -октадекадиеновая кислоты. Практическая ценность результатов. Работа имеет практический интерес, так как известно, что ряд оксигенированных жирных кислот, выделенных из растительных тканей, обладают биологической активностью и участвуют в защите растений от паразитов и регуляции метаболизма растений. Кроме того, некоторые продукты окислительной деградации жирных кислот растений обладают даже в небольших концентрациях сильным запахом и вкусом, и их присутствие часто нежелательно в пищевых продуктах. Не исключено, что обнаруженные нами метаболиты также могут вносить вклад во вкусовые качества пищи.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на итоговых научных конференциях КНЦ АН СССР (Казань, 1988-1991), 1-ом Всесоюзном рабочем совещании по растительным липидам (Казань,. 1989), 8-ом (Будапешт, 1988) и 9-ом (Уай, Англия, 1990) Международных симпозиумах по биохимии растительных липидов, на научных семинарах в Делийском университете и Университете Джава-харлала Неру (Дели, Индия, 1990), 1-ой Всесоюзной конференции по биохимии и физиологии растительных липидов (Казань, 1991). Публикации. Основное содержание работы отражено в 5 опубликованных работах. Одна работа находится в печати. Обьем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, содержащих: I - обзор литературы; II - описание объектов и методов; III - результаты исследования и их обсуждение^ также заключения и выводов. Работа изложена на 162 страницах, содержит 35 рисунков, 7 таблиц и 1 приложение. Список цитируемой литературы содержит 177 источников. .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В опытах по изучению метаболизма сх-линоленовой и линоле-вой кислот использовались гомогенаты клубней и'листьев карто-• феля, гомогенаты листьев пшеницы и луковиц тюльпана. Определение эндогенного уровня оксигенированных жирных кислот проводилось на ростках клубней картофеля. В качестве препаратов фер-' ментов применялись частично очищенная липоксигеназа клубней картофеля и экстракты ферментов из ацетоновых (гексановых) порошков семян льна, кукурузы, пшеницы и риса в буферном растворе. В ряде экспериментов была использована высокоочищенная соевая липоксигеназа.

Для инкубации экзогенных [I-14С]линолевой и [1-14С]лино-' леновой кислот или [1ЧС]оксигенированных жирных кислот вещест-. ва растворялись в небольших количествах этилового спирта (кон* центрация спирта в среде не превышала 0,1 °Л~) и вносились в го-могенат или раствор фермента при перемешивании. Для препарат тивных экспериментов готовился раствор солей Ыа жирных кислот в присутствии детергента Твйн-20. При необходимости создания аэробных условий через среду инкубации продувался чистый кис. лород:

После подютсления реакционной смеси уксусной кислотой продукты экстрагировались этилформиатом или этилацетатом. Экстракт концентрировался на роторном испарителе и анализировался обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖЮ с использованием линейного градиента. Радиоактивность в элюате детектировалась проточным счетчиком радиоактивности. После сбора с обращеннофазовой колонки отдельные компоненты окончательно очищались на колонках с нормальной фазой в изократических условиях с использованием смеси растворителей гексан - изопропанол - уксусная кислота.

Количество гидропероксидных групп в липоксигеназных продуктах определялось колориметрическим измерением свободного йода, образующегося при реакции иодида калия с раствором анализируемого образца. Стабилизация очищение метаболитов, содержащих в своей структуре гидропероксидные группы, осуществлялась добавлением избытка ЫаВН4 в изопропаноле. Для определения количества двойных связей соединения гидрировались на

катализаторе Pt/Al203.

УФ спектры (190-370 нм) соединений регистрировались в потоке при ВЭЖХ анализе с использованием детектора с диодной матрицей RSD 2140 (Швеция) или на УФ спектрофотометре Specord М-40 (ГДР) после очистки методом ВЭЖХ. Масс-спектры химической ионизации очищенных метаболитов были получены на масс-спектрометре Finnigan МАТ 212 (ФРГ), а масс-спектры электронного удара (70 eV) высокого разрешения - на приборе МХ-1310 (СССР). Использовался только прямой ввод- образца без предварительной дериватизации. В отдельных случаях масс-спектры химической ионизации и электронного удара регистрировались на приборе Hitachi М80 (Япония). 'Н-ЯМР спектры (250 МГц, CD3CN. CDC13) были получены с помощью спектрометра Bruker VM-250 (ФРГ).

II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Липоксигеназный путь метаболизма с(-линоленовой кислоты в клубнях картофеля.

Лейкотриены и липоксины - высокоактивные продукты липо-ксигеназного пути окисления С20-полиеновых жирных кислот в тканях животных содержат в своей структуре сопряженные триено-вые и тетраеновке хромофоры.

В работе Шимизу с соавторами [Shimizu et al, 1984] была обнаружена способность липоксигеназы из клубней картофеля превращать арахидоновую кислоту в лейкотриены А+ и В+. В то же время, картофель, как и другие цветковые растения, не содержит арахидоновой кислоты, метаболического предшественника эйкоза-ноидов. Можно предположить, что лейкотриенподобные соединения могут образовываться в результате действия картофельной липоксигеназы на о£-линоленовую кислоту, содержащую три двойных связи. Для проверки этого предположения нами было проведено исследование оксигенирования меченого ос-линолената частично очищенным препаратом липоксигеназы и гомогенатом клубней картофеля.

Радиохроматографический анализ продуктов реакции показал, что инкубации экзогенной ос-линоленовой кислоты с гомогенатом и с частично очищенным ферментом приводили к образованию одних и тех же продуктов. Кроме основного продукта инкубации - 9(S)--гидроперокси-10(£),12(;?),15(2)-октадекатриеновдй кислоты (9--ГП0Т) - наблюдалось образование более полярных продуктов

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ (МИН) ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ (МИН)

Рис. 1. Обраденнофазовый радио-ВЭЖХ анализ продуктов окисления [1-14С]линоленовой кислоты липоксигеназой клубней картофеля. CA) Раднохроматограмма продуктов. СБ) УФ хроматограмма при 235 и 310 ни. СВ) -УФ хроматограмма при 280 нм. (Г) ОФ-ВЭЖХ анализ Сдетектирование при 280 нм) соединения 1.4., полученного восстановлением продуктов 1.1 и 1.2 боргидридом Na.

(ряс. 1а). Наше внимание привлекла группа пиков со временем удерживания 33-36 мин, доминирующая в хроматограмме 280 нм (рис. 1вЭ.

Два главных компонента этой труппы С1.1 и 1.2 с R^ - 33 и 36 мин соответственно) имели УФ спектр с xKJlIC 267 нм и двумя плечами при 259 и 279 нм. Небольшой пик 1.3, злюирующийся между компонентами 1.1 и 1.2 Свремя удерживания около 34,5 мин., рис. 16), имел меньшую экстинкцию при 280 нм, но доминировал в

УФ хроматограмме 310 нм Срис. 16).

Соединения 1.1 и 1.2 оказались крайне нестабильными и легко разрушались при хранении или в ионном источнике масс-спектрометра. Это заставило нас предположить, что они могут содержать в своей структуре гидропероксидную группу, поэтому компоненты 1.1 и 1.2 после сбора с обращеннофазовой колонки■ восстанавливались ИаВН4. Восстановление как 1.1, так и 1.2 приводило к образование продукта 1.4 Срис. 1г и рис. 1в). После очистки нормальнофазовой ВЭЖХ структура соединения 1.4 исследовалась с применением масс-спектрометрии ХИ и ЭУ, УФ и 'Н-ЯМР спектроскопии, что позволило идентифицировать это соединение как 9,16-дигидрокси-10(£),12(2),14(£)-октадекатриеновую кислоту (9,16-диГОТ). Колориметрическое определение свободного йода, освобождающегося в результате окислительно - восстановительной реакции иодида К с активным кислородом, показало, что продукты 1.1 и 1.2 содержат одну и две гидропероксидные группы соответственно. Таким образом, метаболит 1.2 представляет собой ЭСБ),16-дигидроперокси-10СЕ),12(2),14(£)-октадекатриено-вую кислоту (9,16-диГПОТ), а продукт 1.1 - смесь двух позиционных изомеров, 9(5)-гидрокси-16-гидроперокси-10(£),12(2), 14(£)-октадекатриеновой и 9С5)-гидроперокси-16-гидрокси-10(Е), 12(2),14(Е)-октадекатриеновой кислот (9,16-диГ(П)0Т) (рис. 2).

Доказательства, подтверждавшие идентификации и путь образования продуктов 1.1 и 1.2, были получены в экспериментах по метаболизации [I-14С]9-ГП0Т и [1-1ЧС39-гидроксиоктадекатриено-вой (9-ГОТ) кислот с участием картофельной липоксигеназы. При инкубации картофельной липоксигеназы с [I-1 ЛС]9-ГП0Т метка эффективно включалась в продукты 1.1 и 1.2. В отличие от 9-ГПОТ скорость диоксигенирования 9-ГОТ в гомогенате клубней картофеля была очень мала, а при использовании очищенного фермента приближалась к нулю.В то же время добавление небольших количеств 13-гидроперекиси линолевой кислоты приводило :с интенсивному диоксигенированию 9-ГОТ, причем скорость реакции возрастала пропорционально количеству добавленной 13-гидропероксиоктаде-кадиеновой кислоты С13-ГП0Д). Помимо основного продукта - 9--гидрокси-16-гидроперокси-10(Е), 12С2), 14(Е)-октадекатриеновой кислоты (1.1), образовывалось небольшое количество метаболита 1.3 с х>41с 308 нм, образования диГПОТ (1.2) не наблюдалось.

Лишь следовые количества метаболитов с * 239, 268,5 и

R, о

-соон

соон

ООН(С)Н)

1.2.1

1 1 ГК»=аН; Кг=ОС 'LR.^ooh; R,= (

1.2,

2=оон = он

R»= R,= OOH

1.4, R.'R^OH

оан(ан)

саон

о

1.2.2

Рис. 2. Структурные формулы продуктов двойного диоксиге-ннрования о(-линоленовой кислоты.

279 ни, характерными для структуры Е,Е,Е триена, были обнаружены при ВЭЖХ анализе на нормальной фазе. Метаболиты с X„SKC 270-271 ни, характерным для Z,Е,Е триенов, не были обнаружены

среди продуктов реакции. Скорость образования продуктов двой-*

кого диоксигенирования находилась в прямой зависимости от концентрации кислорода в среде. Даже при замене кислорода возду-1 xoii для аэрации инкубационной среды выход этих продуктов заметно уменьшался.

Фракция 1.3 с УФ спектром, имеющим 308 нм, при

очистке норыальнофазовой ВЭЖХ разделилась на два компонента -

1.2.1 (главный, й¿-42 мин) и 1.2.2 (минорный, f^-35 мин). Соединения имели идентичные УФ спектры с 302 нм. Восстановление 1.2.1 и 1.2.2 NaBH^ приводило к образованию продукта 1.2.3 с 259, 267, 279 нм, характерными для структуры сопряженного триена E-Z-E типа. Гипсохромный сдвиг максимума УФ поглощения соединений 1.2.1 и 1.2.2 в неполярном растворителе 302 нм) по сравнение с полярным а*®?® 308

МАКС I в 2 С

нм), а-также изменение спектра после восстановления NaBH^ позволяет заключить, что триеновая система соединений 1.2.1 и

1.2.2 сопряжена с карбонильной группой. Гидрирование 1.2.1 и 1.2.2 на платиновом катализаторе без предварительного восстановления НаВН4 приводило к образованию кетолов 1.2.4 и 1.2.5 соответственно. На основании данных масс-спектрометрии ХИ и ЭУ соединение 1.2.4 было идентифицировано как 9-оксо-16-гидрокси-октадекановая, а соединение 1.2.5 как 9-гидрокси-16-оксоокта-декановая кислоты. Таким образом, соединение 1.2.1 представляет собой 9-оксо-1'6-гидро(перо)кси-10(Е), 12(Z), 14(Е)-октаде-

катриеновую, а соединение 1.2.2 как 9-гидро(перо)кси-16-оксо--10(E),12CZ),14(E)-октадекатриеновую кислоты (рис. 2). Было показано, что образование оксотриенолов может происходить двум различными путями, а именно: дегидратацией 9,16-диГ(П)0Т и оксигенированием 9-кетооктадекатриеновой кислоты (9-КОТ).

На хроматограмме, изображенной на рис. 1а, помимо продуктов двойного диоксигенирования (1.1, 1.2, 1.3); 9-ГПОТ и остатка кислоты присутствуют также пики с временами удерживания 16 ш (С) и 41 мин (Ю. Соединение "С" было идентифицировано как 9-оксононановая кислота. Очевидно, ее образование объясняется активностью гидропероксидлиазы, имеющейся в небольшом количестве в клубнях картофеля, либо гидролизом колнеленовой кислоты, обнаруженной Галлиардом [Galliard, Phillips, 1973]. Соединение "Д" нами не идентифицировалось. Оба продукта в отличие от продуктов двойного гидропероксидирования образовывались также и из линолевой кислоты.

Изменение рН среды от кислых к нейтральным значениям практически не оказывало влияния на состав и соотношение образующихся продуктов. При сравнении скоростей липоксигеназного ок-сигенирования й-линоленовой кислоты и 9-ГПОТ картофельной лн-поксигеназой было установлено, что скорость первичного гидропероксидирования о(-линоленовой кислоты в 7 раз превышает скорость ее вторичного гидропероксидирования. При инкубации лино-лената с гомогенатом молодых . листьев картофеля образования продуктов двойного гидропероксидирования не наблюдалось. Попытки обнаружить эндогенный фонд продуктов, содержащих хромофор сопряженного триера в молодых ростках клубней картофеля, не привели к положительному результату. Для изучения влияния поранения на содержание продуктов оксигенирования линолевой и линоленовой кислот анализировался состав экстрактов срезов клубня картофеля, которые были зафиксированы через 10, 20, 40 и 70 мин. после повреждения. На основании полученных хромато-грамм и молярных коэффициентов УФ поглощения были рассчитаны концентрации продуктов в молях на грамм веса пораненного клубня. Максимальные количества 9-ГПОТ, 9-гидропероксиоктадекади-еновой кислоты С9-ГП0Д) и 9,16-диГ(Ш0Т через 70 мин после поранения составили 1 х 10~а, 1,32 х 10~в и 5,8 у. 10~10 моль/г соответственно.

В клубнях картофеля содержится очень активная липоксиге-

наза, специфичная к положение С-9 линолевой и с(-линоленовой кислот [Galliard, Chan, 1980]. Наш было установлено, что в результате инкубации оС-линолената с препаратами липоксигеназы клубней картофеля кроме 9-ГП0Т образуются также полярные продукты включения кислорода по положениям С-9 и С-16, обладающие характерным для триенового хромофора УФ спектром с \лгс 267 нм. Идентификация методами масс-спектрометрии, 'Н-ЯМР спектроскопии, УФ спектрофотометрии и колориметрии показала, что эти продукты образуются в результате липоксигеназной реакции двойного гидропероксидирования at-линолевой кислоты по положениям С-9 и С-16 и представляют собой следующий набор продуктов: 9CS),16-дигидроперокси-ЮСЕ),12CZ),14(E)-октадекатриеновая, 9С S)-гидрокси~16-гидроперокси-10(Е),12С Z),14( Е)-октадекатриеновая и 9(5)-гидроперокси-16~гидрокси-10(Е),12CZ),14С£)-октадекатриеновая кислоты. Кроме того, были обнаружены продукты, образующиеся в результате дегидратации гидропероксидных групп, это 9-оксо-16-гидро(перо)кси-10(Е),12CZ),14(E)-октадекатриеновая и 9(5)-гидро(перо)кси-16-окса-10(Е),12(Z),14(E)-октадекатриеновая кислоты - два последних соединения были обнаружены впервые Срис. .23. Все перечисленные продукты образовывались также при инкубации 9-ГПОТ с липоксигеназой клубней картофеля, а инкубация 9-ГОТ приводила к образованию '9-гидрокси-16-гидро-nepoKCH-10(£),12(Z),14(E)-октадекатриеновой кислоты только в присутствии небольших количеств 13-ГП0Д, необходимых для активации фермента. Отсутствие продуктов липоксигеназного окисления при .использовании в качестве субстрата 9-ГОТ может быть объяснено неспособностью первоначально образующейся 16-гидро-перокси-9-гидроксикислоты активировать липоксигеназу, находящуюся в нативной форме.

Во фракции моногидроперекисей о(-линолената наш не было обнаружено ни 16-, ни каких-либо других позиционнь-х изомеров, кроме 9-ГП0Т. По-видимому, возможность оксигенирования 9--ГШ)0Т по положению С-16 объясняется отсутствием прохирально-го центра С-11 и изменением ориентации субстрата в ферменте таким образом, что становится возможным отрыв водорода от метилена С-14 и присоединение кислорода по С-16.

Очевидно, образование продуктов двойного диоксигенирова-ния должно происходить во всех растительных объектах, содержащих 9-липоксигеназу. Инкубация <Х-линоленовой кислоты с экстра-

ктом ферментов из ацетонового порошка семян риса и пшеницы действительно приводили к образованию продуктов с х-|!акс 267 нм. В случае инкубации ri-линолената с гомогенатом луковиц тюльпана продуктов двойного диоксигенирования не было обнаружено. Луковицы тюльпана содержат достаточно активную гидропе-роксиддегкдразу, и поэтому вся образующаяся 9-ГПОТ очень быстро превращается в ос- и у-кетолы. Таким образом, необходимым условием для образования продуктов двойного диоксигенирования в растительных тканях, помимо актийности 9-липоксигеназы, является отсутствие или низкая активность путей метаболизации 9--ГПОТ. Клубни картофеля относятся, очевидно, именно к таким тканям растений. Низкая- активность ферментативных путей метаболизма гидроперекисей в картофеле подтверждается тем, что при инкубации линолевой кислоты, которая не может гидропероксиди-роваться вторично, основная часть метки оставалась в пике моногидроперекиси .

Уровень продуктов моно- и дигидропероксидирования линолевой и .линоленовой кислот в срезах клубней картофеля резко возрастал с увеличением времени, прошедшего после поранения клубня. Такая стимуляция может объясняться несколькими причинами: 1) усилением гидролиза свободных жирных кислот из сложных ли-пидов в результате вызванного повреждением клетки освобождения липаз из клеточных органелл, в которых они находились до повреждения, или в результате активации гидролитических ферментов в ответ на стресс; 2) увеличением скорости липоксигеназного окисления жирных кислот в результате происходящего при разрушении тканей нарушения раздельной внутриклеточной компартмен-тации липоксигеназ и их субстратов, линолевой и линоленовой кислот; 3D облегчением контакта с кислородом воздуха.

Структурное сходство идентифицированных метаболитов с лейкотриенами и родственными биорегуляторами, образующимися по липоксигеназному пути в животных, позволяет предположить, что жирные кислоты, содержащие сопряженный триеновый фрагмент, могут играть роль регуляторов и в растениях.

2. Метаболизм гидроперекисей линолевой и л-линоленовой кислот по гидропероксиддегидразному пути.

При-изучении метаболизма о!-линоленовой кислоты в гомоге-нате молодых проростков пшеницы нами не было обнаружено проду-

*

ш и \ с I S

. ш и \ с I

S

О 10 20 ЗО 40 50 бО 70 ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ(МИН)

Рис. 3. Обращеннофазовый радиа-ВЭЖХ анализ продуктов инкубации [1-14С]13-ГП0Т с гомогенатом проростков пшеницы. Инкуба-•ция проводилась при рН (А) 7,4 и СБ) 5,8. Пик "а" соответствует 13-ГПОТ, "б" - 12-оксо-10,15Сг)-фитодиеновой кислоте, "в" -оНсётолу и "г" - 7-кетолу.

ктов с \лке 267 нм, характерным длл структуры сопряженного триена, в то же время наше внимание было привлечено явной зависимостью образования практически всех обнаруженных продуктов от рН Срис. 3).

Помимо главных продуктов метаболизации [1-14С]13-гидро-пероксиоктадекатриеновой кислоты С13-ГПОТ) в препаратах гидро-пероксиддегидразы, - 12-оксо-10,1SCZ)-фитодиеновой (12-оксо--ФДК), 12-оксо-13-гидрокси-9(2),15(Z)-октадекадиеновой С12ДЗ-

R в 5

и/ . (N Г а

К J L J и L 1л •

1 1 ■ Б 2.1 \ Г в г ■ 1 1 5

. лЛ У J L- А А

-о(-кетол) и 9-гидрокси-12-оксо-10(Е),15(2)-октадекадиеновой (9,12-г-кетол) кислот при ВЭЖХ анализе наблюдалось образование неизвестного ранее полярного продукта со временем удерживания на ОФ-ВЭЖХ около 31 мин (рис. 3, пики б, в, г и 2.1). [1-14С]~ 13-ГПОД также служила субстратом для гидропероксиддегидразы, но при этом не образовывалось циклического продукта.

Как видно из приведенных хроматограмм (рис. 3), при переходе к слабокислым условиям инкубации включение метки в 12,13--о(-кетол и 12-оксо-ФДК уменьшалось* а выход 9,12-г-кетола и продукта 2.1, напротив, увеличивался.

Максимум УФ поглощения С* 228 нм) и форма первой производной УФ спектра указывали на то, что соединение 2.1 содержит сопряженный оксоеновый хромофор. Восстановление кислоты 2.1 боргидридом Иа приводило к образованию соединения 2.1.1 с х«»°с нм' Изменение УФ спектра может быть объяснено только восстановлением оксогруппы, находящейся в оксоеновом сопряжении, до гидроксильной группы. Реакция кислоты 2.1.1 с тетра-ацетатом свинца приводила к образованию меченого продукта 2.1.2, идентифицированного как 9-гидрокси-12-оксо-10(Ю-доде-ценовая кислота. Эти данные в совокупности с результатам! масс-спектрометрии ЭУ и ХИ, данных 'Н-ЯМР спектроскопии и йо-дометрического анализа позволяют приписать соединениям 2.1.1 и 2.1 структуры 9,12,13-тригидрокси-10(Е),15(2)-октадекадиеновой и 9-гидроперокси-12-оксо-13-гидрокси-10(£) ,15(2)-октадекадие-новой кислот соответственно (рис. 4). Соединение, идентичное 2.1, было получено в результате инкубации о(-кетола с экстрактом ферментов из ацетонового порошка семян льна, гомогенатом проростков пшеницы и липоксигеназой клубней картофеля.

При инкубации [I-113-ГПОД с препаратом гидропероксиддегидразы из семян льна образовывался полярный продукт 2.2.1 228 нм), близкий по параметрам удерживания ОФ-

ВЭЖХ продукту 2.1 и идентифицированный как 9-гидроперокси-12--оксо-13-гидрокси-10(Е)-октадеценовая кислота (рис. 4).

Метаболизация [I-1ЧС]9-ГП0Т в присутствии экстракта ферментов из ацетонового порошка семян льна и кукурузы приводила к образованию 9-гидрокси-10-оксо-12(2),15(2)-октадекадиеновой кислоты (9,10-с<-кетола) и 10-оксо-13-гидрокси-11(ЕЗ,15(2)-ок-тадекадиеновой кислоты (10,13-у-кетол), а также полярного продукта 2.3.1 (\4„с228 нм). На основании данных масс-с'пектроме-

нио

ноо

соон

соон

он

2.1

он

2.2.1

но

но

соон

соон

о

ООН

2.3.1

он

2.1.1

. Рис. 4. Структурные формулы продуктов гидропероксидиро-вания а-кетолов.

•фии ХИ и ЭУ соединение 2.3.1 было идентифицировано как 9-гид-рокси-10-оксо-13-гидроперокси-11(Е),15(2)-октадекадиеновая кислота (рис. 4). Присутствие гидропероксидной функции в кислоте 2.3.1 было подтверждено йодометрическим анализом.

После двукратной очистки ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой фракция й-кетола анализировалась нормальнофазовбй ВЭЖХ. В результате, помимо основного компонента - 12,13-о£-кетола, отделились еще два пика - 2.4.1 с 230 нм и 2.4.2 с *>„.„„

В & к С н & к с

211 нм. Образование двух последних продуктов стимулировалось кислыми условиями инкубации. Данные масс-спектрометрии, УФ и 1Н-ЯМР спектроскопии позволили идентифицировать соединения 2.4.1 и 2.4.2 как 9-оксо-12,13-эпокси-10(Е),15(г)-октадекади-еновую и 11-гидрокси-12-оксо-9(2),15(2)-октадекадиеновую (11, 12-с!-кетол) кислоты.

Как уже отмечалось ранее, соотношение продуктов гидропе-роксиддегидразной реакции находилось в зависимости от рН инкубационной среды. Наше первое наблюдение, связанное с эффектом влияния рН на образование различных кетолов, было сделано в экспериментах на гомогенате молодых проростков пшеницы, обладающих высокой активностью гидропероксиддегидразы (табл.).

Как показано в таблице, включение метки в у-кетол увеличивалось при изменении рН инкубационной среды от 7,5 до 5,8, в то же время процент включения метки в о(-кетол и 12-оксо-ФДК

Превращение [I-14С]13-ГПОТ в гидропероксиддегидразные продукты в гомогенате проростков пшеницы при нейтральных и слабокислых условиях.

Субстрат

Продукт

Радиоактивность, У. от суммарной

7,5

3,8

13-ГПОТ

12-ОФДК а(-кетол

у-кетол

АКГП

24,31 63,02

8,1

4,57

75,69-

12,36 47,78

23,76

16,1

87,64

Сокращения: 12-ОФДК - 12-оксо-10,15С2Э-фитодиеновая кислота; АКГП - гидроперекись о(-кетола

Примечание. За 100'/. принято суммарное количество продуктов гидропероксиддегидразной реакции.

уменьшался. Аналогичная зависимость наблюдалась при проведении экспериментов по метаболизации [I-14С]13-ГПОТ и [1—14С]13-ГПОД с препаратами гидропероксиддегидразы из семян льна. Уменьшение выхода о(-кетола в кислых условиях связано, главным образом, с увеличением скорости его гидропероксидирования. Увеличение же выхода r-кетола, при изменении значений pH от слабощелочных до слабокислых, может быть объяснено существованием двух различных механизмов гидролиза окиси аллена.

Подтверждение существования кислого и щелочного механизмов гидролиза окиси аллена было получено в сериях экспериментов по; 1) кратковременной инкубации гидроперекисей с гидро-пероксиддегидразой и последующей фиксацией NaOH или HCl; 2) сольволизу окиси аллена чистым метанолом или смесью метанол/ уксусная кислота в соотношении 100:1 (об/об). В этих экспериментах было показано, что образование у-кетола и 11,12-о(-кето-ла (как и их простых метиловых эфиров в экспериментах по мета-нолизу) является кислотно-зависимым. Напротив, 12,13-й-кетол был единственным продуктом кратковременной инкубации в случае фиксации NaOH. Простой метиловый эфир 12,13-о!-кетола также был

практически единственным продуктом сольволиза чистым метанолом.

Дегидразный путь метаболизма гидроперекисей жирных кислот сравнительно мало изучен. Только в самое последнее время практически одновременно в работах нескольких авторов [Corey E.J. et al, 1987, Hamberg M. , 1987, Brash A. R. et al, 1987] было показано, что общим предшественником всех продуктов гидропе-роксиддегидразной реакции - 12-оксо-ФДК, а- и у-кетолов является коротко-живущая окись аллена, образующаяся при дегидратации гидроперекисей жирных кислот. Короткое время жизни окиси аллена Ct»/a~ около 30 сек. при 0°С) объясняется высокой реак-ционноспособностыэ. Одним из путей ее превращения является ферментативная или спонтанная циклизация с образованием 12-оксо-ФДК, метаболического предшественника гормона старения - жа-смоновой кислоты. Вторая основная реакция окиси аллена - ее спонтанный и протекающий с очень высокой скоростью гидролиз, в результате которого образуются ¡Х- и г-кетолы.

Помимо известных ранее продуктов гидропероксиддегидразной реакции нами был обнаружен новый продукт, образование которого также стимулировалось при кислой реакции инкубационной среды - 9-гидроперекись 12,13-оНсетола Срис. 4). Образование гидроперекисей оНсетолов наблюдалось при метаболизации линолевой и о!-ликоленовой кислот в препаратах льна, пшеницы, кукурузы, содержащих как липоксигеназную, так и гидропероксиддегидразную активности.

В результате инкубации 13-ГП линолевой и 9-ГП линоленовой кислот нами были выделены к идентифицированы 9-гидроперокси-г12-оксо-13-гидрокси-10(£)-октадеценовая и 9-гидрокси-10-оксо--13-гидроперокси-11СЕ),15С2)-октадекадиеновая кислоты, метаболическими предшественниками которых были соответствующие сх-ке-толы Срис. 4). Увеличение выхода гидроперекисей 12,13-оС-кето-лов при слабокислых условиях объясняется увеличением способности липоксигеназ атаковать С-9 положение при кислых значениях pH [Veldink et al, 1972, Gardner, 1989]. Быстрое окисление наблюдалось Также при инкубации [1 4С]12,13-о(-кетола с липокси-геназой из клубней картофеля и [14,С]9,10-л-кетола с соевой ли-поксигеназой.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что оксиге-нирование ct-кетолов представляет собой необычный тип липокси-

геназной реакции, когда аллильные кегокислоты выступают как эффективные субстраты липоксигеназ наряду с обычными метилен-разделенными полиеновыми кислотами.

Структура обнаруженных гидроперекисей оС-кетолов в общих чертах сходна со структурами тригидроксикислот, например 9,12, 13-тригидрокси-10(Е),15(2)-октадекадиеновой кислотой, обнаруженной в переступне белом (.Bryonia alba L.) [Паносян и др. , 1979] и 9,12,13-тригидрокси-10СЕ)-октадеценовой кислотой, выделенной из лука С Allium, сера L.) [-С1 ayes et al, 1986] и из клубней таро СColocasia antiquarwö [Masui et al, 1989]. Эти тригидроксикислоты проявляют простагландинподобную активность, в частности вызывают сокращение гладкой мускулатуры и аггрегацию тромбоцитов [Паносян и др. 1979, Clayes et al, 1986]. 9,12,13-Тригидрокси-10(Е)-октадеценовая кислота имеет также фунгицидную активность [Masui et al, 1989]. Подобие структур позволяет предположить, что и гидроперекиси о!-кетолов могут быть биологически активными.

На основании данныхстереохимическогоанализа ai-кетола ранее было установлено, что превращение окиси аллена в ct-кетол происходит по механизму нуклеофилького замещения Sns, который сопровождается обращением стереоконфигурации, и механизму ну-клеофильного замещения Stil . При развитии реакции по Sm механизму происходит спонтанное раскрытие оксирана в цвиттер-ион,

-ch=ch-ch=c-ch-r2 I

о

гидроксилирующийся с образованием ос-кетола, в котором С-13 является рацемическим. Оразование r-кетола, по мнению Хамберга [Hamberg, 1987], может происходить в результате перегруппировки двойных связей цвиттер-иона, за которой следует нуклеофиль-ная атака гидроксила по положению С-9.

Однако, механизм гидролиза окиси аллена, предложенный ]£амбергом, не может объяснить увеличения выхода r-кетола при кислых условиях, поэтому нами был предложен другой механизм Срис. 5). В этом случае образование у-кетола начинается не с раскрытия оксирана и последующего нуклеофильного замещения, а с электрофильнсй атаки протона по кислороду оксирана окиси ал-

R,-CH=CH-CH=C-CH-R2

V

соон

н®

соон

А

о"

о

соон

о'

соон

но®

но®

но

соон

соон

о'

о'

Рис. 5. Электрофильный механизм гидролиза окиси аллена, приводящий к образованию к- и 11,12-сс-кетолов. Инициирующей стадией является протонная атака по кислороду- оксирана.

Предполагаемый механизм гидролиза предсказывает существование нового кетола наряду с ранее известным 12,13-с(-кетолом и у-кетолом. Дело в том, что в направлении оксирана могут перемещаться я-электроны не обеих, а только ближайшей к оксирану А11 двойной связи. В этом случае будет происходить.гидроксили-рование 9(Э-карбониевого иона в положении С-11 и в результате должна образоваться 11-гидрокси-12-оксо-9(2),15(2)-октадекади-еновая кислота Срис. 5). Действительно, при разделении фракции сс-кетола на нормальной фазе был обнаружен минорный компонент, имеющий УФ спектр, сходный со спектром оС-кетола. Структура выделенного соединения исследовалась методами 'Н-ЯМР, масс-спек-троыетрии химической ионизации и электронного удара. Она полностью совпадала со структурой предполагаемого соединения и представляла собой 11,12-сС-кетол. Образование этого* продукта,

лена.

как и образование у-кетола, стимулировалось кислыми условиями инкубации, что также согласуется с предложенным механизмом гидролиза. 11,12-о(-Кетол или его аналоги, образующиеся из других жирных кислот, не были выделены и идентифицированы ранее.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При всем разнообразии путей окислительного - метаболизма свободных жирных кислот в растениях основную роль в метаболизме полиненасыщенных жирных кислот играет липоксигеназный путь, приводящий к образованию реакционноспособных гидропероксидных продуктов. Результаты, представленные в данной работе, вскрывают новые стороны липоксигеназного пути метаболизма линолевой и й-линоленовой кислот в растениях. Обнаружены новые оксигени-рованные жирные кислоты, образование которых связано с протеканием неизвестных ранее липоксигеназных реакций, в которых субстратами липоксигеназы выступают не обычные жирные кислоты, а продукты их оксигенирования - 9-гидро(перо)кси-11(Е),12(2), 15(2)-октадекатриеновая, 9-оксо-11(£),12(2),15(2)-октадекатри-еновая, 12-оксо-13-гидрокси-9(2),15(2)-октадекадиеновая, 12-оксо-13-гидрокси-9(2)-октадеценовая и 9-гидрокси-10-оксо--12(2),15(2)-октадекадиеновая кислоты.

Помимо липоксигеназ в большинстве растительных тканей присутствуют ферментативные системы дальнейшего превращения гидроперекисей жирных кислот, служащие, вероятно, для обезвреживания этих высокотоксичных продуктов, а также приводящие к образованию физиологически активных соединений. Одним из таких путей, результаты исследования которого приведены в настоящей работе, является дегидразный путь метаболизма гидроперекисей жирных кислот. Продуктами этого метаболического пути являются л- и г-кетолы, 12-оксо-ФДК, а также обнаруженные нами гидроперекиси оИсетолов и 11,12-й-кетол. Как удалось выяснить в настоящей работе, 11,12-оИсетол и г-кетол образуются в результате кислотного гидролиза окиси аллена. Обсуждение двух различных механизмов гидролиза окиси аллена так же, как идентификация нового кетола и гидроперекисей Л-кетолов, является существенным дополнением к имеющимся представлениям о гидропероксид-дегидразном пути в растениях.

ОСНОВНЫЕ-ВЫВОДЫ

1. Установлено, что основным направлением метаболизма экзогенной rt-линоленовой кислоты, как в присутствии частично очищенной липоксигеназы, так и в гомогенате клубней картофеля, является катализируемое липоксигеназой двойное диоксигенирова-ние, приводящее к образовании дигидроперокси- и гидрокси-ги-дропероксикислот.

2. Обнаружены и идентифицированы новые продукты липокси-геназной реакции двойного гидропероксидирования с(-линоленовой кислоты: 9-оксо-16-гидроСперо)кси-10(£),12(Z),14(£3-октадека-триеновая и 9-гидро(перо)кси-16-оксо-10(£),12CZ),14CD-октаде-катриеновая кислоты, и выяснен путь их образования.

3. Продукты двойного диоксигенирования отсутствуют в ростках клубней ítl vivo, однако поранение ткани приводит к резкому росту их содержания.

4. Обнаружена неизвестная способность липоксигеназ диок-сигенировать субстраты с 3( Z)-бутен-1-онильными остатками вместо обычных 1 (Z), 4 (Z)-пентадиенильных.

При инкубации экзогенных линолевой и о(-линоленовой кислот с гомогенатами листьев и экстрактами ацетоновых порошков семян растений, которые содержат активности липоксигеназы и гидро-пероксиддегидразы, образуются неизвестные ранее продукты окси-генирования d-кетолов - 9-гидроперокси-12-оксо-13-гидрокси--10СЕ)-октадеценовая, 9-гидроперокси-12-оксо-13-гирокси-10(£), 13Сг)-октадекадиеновая и 9-гидрокси-10-оксо-13-гидроперокси--11CD,15(Z)-октадекадиеновая кислоты.

5. Доказано существование двух механизмов гидролиза продукта гидропероксиддегидразной реакции - окиси аллена, приводящих к образованию разных кетолов. В отличие от оС-кетола, у--кетол образуется не по нуклеофильному, а по электрофильному механизму гидролиза окисей алленов, и вклад этого механизма возрастает при увеличении концентрации протонов в среде, т.е. при кислых значениях рН.

6. Обнаружен новый продукт дегидразного пути метаболизма гидропероксидов жирных кислот - 11-гидрокси-12-оксо-9С23, 15CZ)-октадекадиеновая кислота, образование которого так же, как и образование у-кетола, объясняется кислотным механизмом гидролиза 12,13(5)-оксидо-9С2),11,15CZ)-октадекатриеновой кис-' лоты (окиси аллена).

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЩИЕ РАБОТЫ:

1. Гречкин А. Н. , Курамшин Р. А., Ефремов Ю. Я. , Латыпов Ш. К., Сафонова Е.Ю. , Ильясов А. В. Новые продукты окисления et-линоленовой кислоты липоксигеназой из клубней картофеля. //Докл. АН СССР. 1990. Т. 314. N 5. С. 1247-1249. •

2. Grechkin A.N. , Kuramshin R. A, Safonova E. Y. , Yefremov Y. J., LatypovS. K. , Ilyasov A. V. , Tarchevsky I. A. Double hydroperoxidation of oi-linolenic acid by potato tuber lipoxygenase. //Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1081. N1. P. 79-84.

3. Tarchevsky I. A., Kuramshin R. A. , Grechkin A.N. Conversion of й-linolenate into conjugated trienes and oxotrienes by potato tuber lipoxygenase.//Plant- Lipid Biochemistry, Structure and Utilization./Eds Quinn P.J., Harwood J.L. London: Portland Press, 1990. P. 298-300.

4. Grechkin A. N. , Kuramshin R. A. , Latypov S. K. , Safonova Y. Yu. , Gafarova Т.Е. , Ilyasov A.V. Hydroperoxides of ot-ke-tols, novel products of plant lipoxygenase pathway.//Eur-op. J. Biochem. 1991. V. 199. N 2. P. 451-457.

5. Гречкин A.H., Курамшин P.А., Тарчевский И.А. Образование нового а-кетола гидропероксид-дегидразой из семян льна.// Биоорган, химия. 1991. Т. 17. N 7. С. 997-998.

6. Grechkin А. N. , Kuramshin R. А. , Safonova Y.Yu. , Latypov S.К., Ilyasov A.V. Formation of ketols from linolenic acid 13-hydroperoxide via aliéné oxide. Evidence for two distinct mechanisms of aliéné oxide hydrolysis.//Biochim. Biophys. Acta., 1991. in press.

Сдано в набор 21.11.91 г. Подписано в печать 18.11.91 I1. Форм.бум. 60 х 84 1/16. Печ.л. I. Тираж 100. Заказ 678. Бесплатно.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5