Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адгезия и синтез лейкотриенов при взаимодействии нейтрофилов с эндотелием, коллагеном, фибронектином

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Пушкарева, Марина Александровна, Москва

У / О'

/

МОСКОВСКИМ ОРДЕНА В.И. ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ

РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.152.1

ПУШКАРЕВА Марина Александровна

АДГЕЗИЯ И СИНТЕЗ ЛЕЙКОТРИЕНОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ НЕЙТРОФИЛОВ С ЭНДОТЕЛИЕМ, КОЛЛАГЕНОМ, ФИБРОНЕКТИНОМ.

03.00.04. БИОХИМИЯ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель к.х.н., в.н.с. Г.Ф. Судьина

Москва - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Ферменты синтеза лейкотриенов 8

1.1.1. Физиологическая значимость лейкотриенов 8

1.1.2. Ферменты освобождения арахидоновой

кислоты - фосфолипазы 11

1.1.3. Общая характеристика липоксигеназ 13

1.1.4. Другие ферменты, участвующие в синтезе лейкотриенов 16

1.2. Регуляция активности 5-липоксигеназы в нейтрофилах 19

1.2.1. Активация кальцием и АТФ 20

1.2.2. Транслокация 5-липоксигеназы из цитозоля к

мембране при активации 21

1.2.3. Другие стимулирующие факторы

5-липоксигеназы 21

1.2.4. Активация 5-липоксигеназы малыми концентрациями пероксидов 23

1.3. Межклеточная кооперация в синтезе лейкотриенов 25

1.4. Адгезионные взаимодействия нейтрофилов с эндотелием

и другими биологическими поверхностями 28

1.4.1. Адгезионные взаимодействия между клетками 30

1.4.2. Адгезионные рецепторы 30

1.4.3. Адгезионные взаимодействия между нейтрофилами и эндотелием 38

1.4.4. Взаимодействие нейтрофилов с компонентами экстраклеточного матрикса 41

1.5. Влияние адгезии на системы передачи сигнала в нейтрофилах 44

1.6. Регуляция адгезионных взаимодействий и синтеза лейкотриенов под действием АТФ и продуктов его гидролиза 48

1.6.1. Роль АТФ при адгезии нейтрофилов 48

1.6.2. Влияние продуктов гидролиза АТФ на адгезию нейтрофилов 50

1.6.3. Передача сигналов в нейтрофилах посредством АТФ 55

1.7. Агенты, используемые в работе 57

1.7.1. Сурамин и Reactive blue 2 (RB2) 57

1.7.2. Jasplakinolide 60 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 61 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 68

3.1. Введение 68

3.2. Адгезия нйтрофилов к разным биологическим

поверхностям 71

3.3. Роль АТФ и экто-АТФазы в адгезии нейтрофилов к разным поверхностям 74 3.3.1. Действие ингибиторов АТФаз и АТФ на адгезию нейтрофилов 76

3.3.2. Гидролиз экстраклеточного АТФ при адгезии

нейтрофилов 79

3.3.3. Секреция АТФ нейтрофилами при контакте с различными поверхностями 82

3.3.4. Влияние продуктов гидролиза АТФ на процесс адгезии нейтрофилов к биологическим поверхностям 83

3.4. Влияние адгезии нейтрофилов к разным биологическим

поверхностям на синтез лейкотриенов 88

3.4.1. Эффект сурамина на синтез лейкотриенов при взаимодействии нейтрофилов с разными биологическими поверхностями 89

3.4.2. Снижение эффекта сурамина при добавлении Jasplakinolide и декстран-сульфата 93

3.4.3. Эффект сурамина на высвобождение арахидоновой кислоты и 5-липоксигеназных метаболитов 99

3.4.4. Эффект экзогенной арахидоновой кислоты на биосинтез лейкотриенов при взаимодействии нейтрофилов с разными поверхностями 105

ВЫВОДЫ 108

Список литературы 109

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА арахидоновая кислота, 5,8,11,14-цис-

эйкозатетраеновая кислота LTA4 лейкотриен A4, - 5S,6S-5(6)-okciw)-7,9-

цис-11,4-транс-эйкозатетраеновая кислота LTB4 лейкотриен В4, 58,12К-5,12-дигидрокси-6-

цис-8,10-транс- 14-цис-эйкозатетраеновая кислота 2o-OH-LTB4 20-гидрокси-лейкотриен В4

20-СООН- LTB4 20-карбокси- лейкотриен В4 5-НЕТЕ 5(8)-гидрокси-6-транс-8,11,14-цис

эйкозатетраеновая кислота 5-НРЕТЕ 5(8)-гидроперокси-6-транс-8,11,14-цис-

эйкозатетраеновая кислота 5-LO 5-липоксигеназа

ÎMLP формилметионил-лейцил-фенилаланин

АТФ аденозин-5'-трифосфат

PMNs полиморфноядерные лейкоциты

TNFa фактор некроза опухоли

PAF фактор активации тромбоцитов

EHNA эритро-9-(2-гидрокси-3-нонил)аденин

HUVEC человеческие эндотелиальные клетки из

пуповинных вен С5а компонент системы комплемента

GM-CSF колониестимулирующий фактор гранулоцитов

и макрофагов РМА форбол 12-миристат 13-ацетат

IL интерлейкин

DIDS 4,4' -диизотиоцианатостилбен-2,2' -дисульфоновая

кислота

ВВЕДЕНИЕ

Важнейшим звеном в системе защиты организма от проникновения инфекции являются клетки крови нейтрофилы. Нейтрофилы и продукты их секреции принадлежат к числу центральных участников воспаления. Они играют ключевую роль в защите организма, поглощая и разрушая чужеродные клетки и бактерий. В норме нейтрофилы находятся в неактивном, спокойном состоянии и активируются в очаге воспаления. Это связано с тем, что способность нейтрофилов к адгезии и агрегации значительно увеличивается под действием стимуляторов, генерируемых бактериями, поврежденными тканями, системой комплемента и другими фагоцитами. Сигналом для движения РМ№ к месту инфицирования или воспаления служат хемотактические факторы (С5а, ЬТВ4, ШЬР) и РАБ. Известно, что в кровеносных сосудах существует пристеночный пул нейтрофилов, находящийся в перманентном контакте со слоем эндотелия, и клетки, свободно циркулирующие в потоке. Адгезионными взаимодействиями нейтрофилов с клетками эндотелия опосредована миграция нейтрофилов к очагу воспаления. Хемотаксис и адгезия РМ№ на эндотелии сосудов представляют собой первую стадию ответа на воспалительный процесс и патогенеза сосудистых заболеваний. Существуют патологические состояния организма, когда адгезия нейтрофилов может приводить к серьезным повреждениям тканей. Например, к тяжелым последствиям приводит налипание нейтрофилов на стенки сосудов при реперфузии

после ишемии. В нейтрофилах, в основном, синтезируются два липоксигеназных метаболита: лейкотриен В4 - сильнейший хемотаттрактант, и 5-НЕТЕ. Эти агенты усиливают адгезию циркулирующих в крови гранулоцитов к стенкам сосудов, что является первым шагом к их выходу в ткань. Лейкотриены представляют собой группу физиологически активных соединений, являющихся медиаторами аллергических и воспалительных реакций, и выполняющих важные регуляторные функции в защитной системе организма. Они играют важную роль в поддержании гомеостаза в здоровом организме и в патофизиологии различных заболеваний. Исследование закономерностей образования этих веществ в клетках человеческого организма представляет существенный интерес с точки зрения медицины, так как знание этих закономерностей позволяет воздействовать на этот процесс. Нейтрофилы используют лейкотриены как средство межклеточного общения, влияя на активность других клеточных популяций: эндотелиальных клеток, макрофагов, лимфоцитов, фибробластов, опухолевых клеток. Синтез этих продуктов в больших количествах происходит в очагах воспаления. Нахождение способов подавления и активации синтеза лейкотриенов открывает новые возможности в лечении и диагностике таких заболеваний как астма, аллергия, артриты, ангина, сердечно-сосудистые заболевания, злокачественные опухоли. В синтезе лейкотриенов участвует полиферментная система. Регуляция всего процесса осуществляется, главным образом, на уровне 5-липоксигеназы - ключевого фермента в этой системе. В живой клетке

при стимуляции протекает одновременно множество процессов, прямо или опосредовано воздействующих на 5-липоксигеназу и ферменты лейкотриенового каскада. Несмотря на то, что фермент 5-ЬО из нейтрофилов выделен и охарактеризован, регуляция его активности в клетке мало изучена. В настоящее время влияние адгезионных взаимодействий на синтез лейкотриенов нейтрофилами практически не исследовано.

Целью настоящей работы является исследование роли адгезионных взаимодействий в биосинтезе лейкотриенов нейтрофилами в контакте с различными биологическими поверхностями.

Широкий спектр биологического действия лейкотриенов обусловливает актуальность исследований процессов трансформации арахидоновой кислоты, ферментов, участвующих в этих процессах, а также направленного воздействия на образование и биологические эффекты лейкотриенов. В связи с этим важно понять, как влияют межклеточные адгезионные взаимодействия и взаимодействия между клетками и экстраклеточным матриксом на биосинтез 5-липоксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты.

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ферменты синтеза лейкотриенов.

1.1.1. Физиологическая значимость лейкотриенов.

Лейкотриены - это физиологически активные производные полиненасыщенных жирных кислот (эйкозатриеновой, эйкозатетраеновой и эйкозапентаеновой), ациклические эйкозаноиды, структурная особенность которых - наличие как минимум трех сопряженных двойных связей [Samuelsson В., 1980, Malle Е., 1987]. Наиболее значимую физиологическую роль играют лейкотриены, имеющие 4 двойные связи в молекуле. В организме их предшественником является арахидоновая кислота. Схема образования лейкотриенов представлена на рисунке 1.

Лейкотриены играют важную роль в поддержании гомеостаза и в патофизиологии различных заболеваний. Лейкотриены находят почти во всех тканях организма: в крови, артериях, коже, глазах, тканях дыхательной и кровеносной системы. Большие количества лейкотриенов обнаруживаются в очагах воспаления. Повышение уровня лейкотриенов в организме связано с такими заболеваниями как астма, аллергия, артриты, ангина, сердечно-сосудистые заболевания [Marx J.L., 1982]. Лейкотриены A4, В4, С4, D4 и Е4 образуются из арахидоновой кислоты под действием фермента 5-липоксигеназы [Samuelsson В., 1980].

о

соон

ЬТА4

1Л"А4-гидролаза ОН

соон

соон

- сн2он 20-гидрокси ЬТВ4

дегидрогеназа

Фосфолипиды

фосфолипазы

СООН

Арахидоновая кислота

О,

5-липоксигеназа

5-Ш

оон У - соон

бЭ-НРЕТЕ

ЬТС^синтаза

ОБН

\2е

ч

он

-соон

20-карбокси ЬТВ4

соон

соон

он

—^^СООН

=/\=

58-НЕТЕ

у-вТР

ьтс.

CHCONHCH2COOH >ШСО(СН2)2СНСООН МН2

дипептидаза

г

ьте4

LTC4, LTD4 и LTE4 в своем составе содержат сульфидопептидную группу. Эти вещества способны сокращать гладкие мышцы дыхательного , пути, уменьшать коронарный ток крови, увеличивать проницаемость микрососудов [Vance D.E., 1996, Белова JI.A., 1997]. В организме ЬТС4 быстро превращается в LTD4 и Е4. Дальнейший метаболизм заключается в N-ацилировании LTD4 и Е4 или окислении серы в молекулах LTC4, LTD4 и Е4 [Фролов Е.П., 1984]. LTC4 и LTD4 стимулируют эндотелиальные клетки к синтезу простациклина (PGI2), PAF и к связыванию нейтрофилов [Белова JI.A., 1997].

LTB4, не содержащий в своем составе пептидного остатка, играет важную роль в воспалительных ответах. ЬТВ4 - мощный хемотактический агент лейкоцитов in vitro и in vivo, усиливает адгезию нейтрофилов к эндотелию и стимулирует миграцию лейкоцитов в ткани [Vance D.E., 1996, Белова JI.A., 1997]. Возможно это объясняется тем, что он вызывает замедление движения лейкоцитов вдоль эндотелия. Вместе с протеолитическими ферментами и кислородными радикалами, выделяемыми лейкоцитами, ЬТВ4 увеличивает проницаемость сосудов, что приводит к отеку тканей [Белова JI.A., 1997]. Кроме того, он стимулирует производство некоторых провоспалительных цитокинов и медиаторов, способных усиливать воспаление [Crooks S.W., 1998]. Синтез LTB4, катализируемый 5-липоксигеназой и ЬТА4-гидролазой увеличивается под действием медиаторов воспаления, включая эндотоксин, компоненты комплемента, фактор некроза опухоли и интерлейкины [Crooks S.W., 1998].

Действие лейкотриенов на молекулярном уровне обеспечивается взаимодействием со специфическими высокоаффинными рецепторами. В настоящее время достаточно хорошо изучен механизм действия лейкотриенов в нейтрофилах [Vance D.E., 1996].

Близка по функциям к лейкотриенам и 5-НЕТЕ. Она действует как иммуностимулятор, увеличивает адгезивность эндотелия для опухолевых клеток и нейтрофилов, усиливает свое собственное производство, модифицирует интерлейкин - зависимую активацию лимфоцитов [Lagarde М. 1989]. Известно, что лейкотриены и HETE, в основном, играют роль сигнальных веществ, усиливающих иммунный ответ. Их синтезом организм отвечает на действие различных раздражителей, осуществляет взаимодействие разных клеток в борьбе с инфекцией.

1.1.2. Ферменты освобождения арахидоновой кислоты - фосфолипазы.

В покоящейся клетке арахидоновая кислота практически не встречается в свободном виде, а находится в связанном состоянии в мембранных фосфолипидах. Для синтеза лейкотриенов используется арахидоновая кислота из фосфолипидных источников [Meade C.J., 1986, Samuelsson В., 1987 Drugs]. Высвободившаяся в результате стимуляции клеток арахидоновая кислота быстро реэтерифицируется и возвращается в фосфолипиды. При действии Са2+ - ионофора А23187 на человеческие нейтрофилы высвобождение АА происходит в значительной степени из фосфоэтаноламинов, а также из фосфатидилхолинов [Chilton F.H., 1989].

Арахидоновая кислота высвобождается под действием, главным образом, Са2+-зависимой фосфолипазы А2 (PLA2). Ингибирование фосфолипазы А2, например, аристолочевой кислотой, снижает высвобождение АА под действием А23187 на 90%, .а также снижается синтез ЬТВ4 и 5-НЕТЕ [Rosenthal M.D., 1989].

Таким образом, для появления в клетке свободного субстрата синтеза лейкотриенов - арахидоновой кислоты, также как и для включения самого синтеза требуется повышение уровня внутриклеточного Са2+. Было замечено, что нейтрофилы могут использовать для синтеза лейкотриенов и экзогенную кислоту, которая может присутствовать в ощутимых концентрациях в очагах воспаления [Hammarstrom S., 1975]. Так, например, при ишемии наблюдается аккумуляция арахидоновой кислоты вследствие повышения активности кальций - зависимых фосфолипаз, опосредуемого увеличением концентрации внутриклеточного Са2+ и ацидозом, который способствует высвобождению фосфолипаз из лизосом. При ишемии нарушается система реацилирования вследствие инактивации

лизофосфотидилхолинацилтрансферазы, в результате происходит накопление свободной арахидоновой кислоты [Меныцикова Е.Б., 1997].

Полагают, что PLA2 приводит к регуляции синтеза лейкотриенов и PAF посредством контроля за высвобождением их предшественников, арахидоновой кислоты и лизофосфатидилхолина из мембранных фосфолипидов. Результаты показали, что PLA2 играет непосредственную

роль в синтезе лейкотриенов человеческими альвеолярными макрофагами [Shamsuddin М., 1997].

1.1.3. Общая характеристика липоксигеназ.

Липоксигеназы - это диоксигеназы, которые используют в качестве субстратов полиненасыщенные жирные кислоты, содержащие по меньшей мере один 1-иис, 4-г<&с-пентадиеновый фрагмент, а именно, две цис-двойные связи, разделенные метиленовой группой. Образование продукта сопровождается смещением двойной связи и переходом ее из цис- в т/?дяс-конфигурацию. Липоксигеназы были обнаружены в различных животных тканях - в мозге, легких, печени, сосудах и других органах и тканях животных и человека [Yamamoto S., 1989], а также во многих растительных источниках: зернах злаков, ткани листьев, картофеле, кукурузе, горохе [Park Т.К., 1989]. Липоксигеназы, выделенные из растений, катализируют те же реакции стереоспецифического окисления арахидоновой кислоты, что и животные липоксигеназы. Продуктами действия этих ферментов являются вещества с ярко выраженной биологической активностью -гидроксикислоты, лейкотриены, липоксины [Gardner H.W., 1989].

Липоксигеназы содержат негемовое железо в каталитическом центре. Результаты анализа содержания железа животных липоксигеназ показали, что на моль белка приходится приблизительно 1 моль железа.

Уникальным каталитическим свойством липоксигеназ является их активация продуктом реакции - пероксидом жирной кислоты. Часто

липоксигеназная реакция начинается с лаг-периода. При добавлении пероксида в реакционную смесь лаг-период исчезает. Другое характерное свойство этих ферментов - это самоинактивация в процессе реакции [Yamamoto S., 1989, Yamamoto S., 1998].

Липоксигеназы классифицируют согласно стереоспецифическому порядковому номеру атома углерода арахидоновой кислоты, по которому происходит окисление [Porter N.A., 1980]. Наиболее распространены в

животных и растительных клетках 5-, 12- и 15-липоксигеназы.

*

12-LO впервые была обнаружена в человеческих и бычьих тромбоцитах, 15-LO и 5-LO - в кроличьих лейкоцитах. 12-LO также присутствует в эпителиальных клетках, мышиных перитонеальных макрофагах и свиных лейкоцитах, но ее нет в человеческих фагоцитах [Vance D.E., 1996, Yamamoto S., 1998]. 12-LO окисляет арахидоновую кислоту по положению С-12 с образованием 128-гидроперокси -5,8,10,14 - эйкозатетраеновой кислоты (12-НРЕТЕ). 12-LO проявляет активности как оксигеназы, так и LTA4 - синтазы.

15-LO была выделена из кроличьих и человеческих лейкоцитов, но наиболее широко изучен фермент из кроличьих ретикулоцитов. Основным продуктом окисления арахидоновой кислоты 15-липоксигеназой является 15-НРЕТЕ (158-гидроперокси-5,8,11,13 -эйкозатетраеновая кислота) и в небольших количествах образуется 12-НРЕТЕ [Yamamoto S., 1989, Yamamoto S., 1998].

Большое внимание уделяется 5-липоксигеназному пути превращения арахидоновой кислоты человеческими нейтрофилами.

Кроме арахидоновой, фермент может окислять эйкозапентаеновую и -триеновую кислоты, а также некоторые их гидроксипроизводные [Guichardant М., 1988]. Субстратом 5-липоксигеназы может служить 5-НРЕТЕ [Yamamoto S., 1989]. 5-LO - цитозольный