Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тромбоцитарно-лейкоцитарная адгезия в норме и патологии

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Тромбоцитарно-лейкоцитарная адгезия в норме и патологии"

На правах рукописи

СОЛПОВ АЛЕКСЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ТРОМБОЦИТАРНО-ЛЕЙКОЦИТАРНАЯ АДГЕЗИЯ В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ

03.03.01 - физиология, 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

3 Гч'ДР 2015

Чита - 2015

005559647

005559647

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения РФ

Научный консультант:

Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор Витковский Юрий Антонович

Официальные оппоненты:

Савченко Андрей Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера", лаборатория клеточно-молекулярной физиологии и патологии, заведующий

Патеюк Андрей Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Забайкальский государственный университет" Минобрнауки России, научно-образовательный центр "Экология и здоровье человека", ведущий научный сотрудник

ЦырецдоржиевДоцдокДамдинович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии", лаборатория иммунобиологии стволовой клетки, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства", гор. Санкт-Петербург.

Защита состоится "16" апреля 2015 года в на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Минздрава России (адрес: 672090, г. Чита, ул. Горького 39а)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Минздрава России (адрес: 672090, г. Чита, ул. Горького 39а) и на сайте: http://chitgma.ru/nauka/ 2а8ЬсЬка-&88еПа15у?1а5к=11ет.у1е\у&1<1=11

Автореферат разослан "_"_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Д 208.118.01 д.м.н., профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. В настоящее время широко изучаются межклеточные взаимодействия, в основе которых лежат механизмы сигнализации, опосредуемые цитокинами, адгезивными молекулами и различными компонентами сосудистой стенки. Образование контактов между кровяными пластинками и лейкоцитами являются важными звеньями механизмов, обеспечивающих миграцию лейкоцитов в зону повреждения и развития там иммунных и репаративных процессов в норме и патологии (Витковский Ю. А. и соавт., 1999-2013; Shenkman В. et al., 2006, Кузник Б.И., 2012). За последние годы установлено, что тромбоциты могут взаимодействовать с нейтрофилами, эозинофилами, моноцитами, лимфоцитами и являются активными участниками в процессах межклеточного взаимодействия (Hu Н., 2010; von Brühl М. L., 2012).

Степень разработанности темы исследования. Известно, что тромбоциты являются основным пусковым механизмом для выхода лимфоцитов, а возможно, и для других типов лейкоцитов, в зону поврежденного эндотелия (Кузник Б.И., 2012; Li N., 2008). В процессе миграции за пределы сосудистого русла лейкоцит испытывает влияние системы из нескольких компонентов, в которую входят: скорость сдвига крови, тромбоциты и субэндотелиальный слой (Spectre G., 2012). Помимо сведений об адгезивных молекулах межклеточного контакта, а также роли напряжения сдвига крови во взаимодействии лейкоцитов с сосудистой стенкой, определенный интерес представляет выяснение наиболее значимых компонентов экстрацеллюлярного матрикса, обеспечивающих его связь с белыми кровяными тельцами. После травмы сосуда наступает адгезия лейкоцитов и тромбоцитов к коллагену и другим адгезивным белкам субэндотелия. Фибронектин и ламинин являются главными и наиболее постоянными адгезивными гликопротеида-ми экстрацеллюлярного матрикса. Выяснение роли этих гликопротеи-дов для адгезии тромбоцитов и лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости имеет большое значение для понимания механизмов клеточной миграции за пределы сосудистого русла.

Выявление физиологических процессов, обусловленных межклеточным взаимодействием лейкоцитов и тромбоцитов, находящихся в циркуляции и их дальнейшего продвижения в ткань, лежит в основе более глубокой оценки патофизиологических закономерностей развития различных заболеваний. В связи с этим феномен

лейкоцитарно-тромбоцитарной адгезии занимает определенное патофизиологическое значение, так как активация тромбоцитов на поврежденной поверхности сосудистой стенки может служить важным фактором для миграции белых кровяных телец в толщу сосуда и дальнейшему формированию тромба (Кигшк В.1. а!., 2014).

Ведущая роль Т-лимфоцитов в развитии патологических состояний, обусловленных их миграцией через сосудистую стенку, неоспорима и побуждает пересмотреть наши взгляды на значение взаимодействия этих клеток с тромбоцитами (Ргоз1е§агс11 е1 а1., 2013). Так, например, одним из патогенетических звеньев начальной стадии развития атеросклероза является скопление и последующая миграция Т-клеток, моноцитов, нейтрофилов и тромбоцитов в область повреждения сосудистого эндотелия. Взаимодействие лимфоцитов и моноцитов с кровяными пластинками может иметь первостепенное значение для инициации повреждения и последующего тромбообразования на поверхности атеросклеротической бляшки, поскольку кровяные пластинки при этом высвобождают ряд биологически активных соединений, способствующих экспрессии тканевого фактора эндотелиаль-ными клетками и моноцитами/макрофагами (Кузник Б.И., 2012).

Показано, что Т-лимфоциты, которые присутствуют в участке сосуда, пораженного атеросклерозом или васкулитом, находятся в активированном состоянии и экспрессируют на поверхности различные интегрины, что указывает на их способность адгезировать к молекулам в составе сосудистого экстрацеллюлярного матрикса (СИуи К.У., 2011; ТБе К., 2013). Однако каким образом эти клетки проникают из просвета сосудов в его толщу, когда они находятся в условиях потока, каков вклад различных компонентов внеклеточного матрикса в это взаимодействие и как кровяные пластинки могут участвовать в этом процессе - все еще не до конца понятно.

В предыдущих работах установлено, что лимфоциты способны вступать в контакт с тромбоцитами. Выявлено, что активация Т- и 1ЧК-лимфоцитов интерлейкином-2 усиливала образование коагрегатов (Витковский Ю.А. и соавт., 1999-2013; У И., 2008, БЬепкшап В. а1., 2006; Тве К., 2013). Доказано, что тромбоциты обеспечивают адгезию активированных С04+ лимфоцитов к внеклеточному матриксу в условиях потока и это явление связано с образованием гетеротипич-ных тромбоцитарно-лимфоцитарных коагрегатов (Бофоу А, 2006).

Вероятно, такой тип взаимодействия приводит к дальнейшей рецип-рокной активации вовлеченных в этот процесс клеток.

Обобщая все вышеизложенное, можно утверждать, что тромбоциты являются активными участниками в процессах межклеточного взаимодействия. Кровяные пластинки могут влиять на проникновение в ткани многих видов клеток посредством различных механизмов, оказывая влияние на их функцию, как в здоровом организме, так и при патологии. Исследование механизмов тромбоци-тарно-клеточных взаимодействий является перспективным для изучения физиологических состояний, патогенеза заболеваний и возможного поиска новых методов их диагностики и лечения.

Цель исследования Изучить адгезивное взаимодействие тромбоцитов с лейкоцитами и компонентами внеклеточного матрикса в норме и при патологии.

Задачи исследования

1) Изучить роль тромбоцитов в адгезии CD4+ лимфоцитов (HVST-клона) к различным компонентам экстрацеллюлярного матрикса (фибронектин, коллаген I и IV типов) в условиях статики и разных скоростях сдвига тока жидкости.

2) Выяснить значение ос4 (CD49d), а5 (CD49e) и р2-интегринов (CD 18), а также молекул CD40L (CD154), PSGL -1 (CD162) в тромбоцит-зависимой адгезии CD4+ лимфоцитов к фибронекти-ну и al-, a2- интегринов к коллагену.

3) Получить С04+-субпопуляцию свежевыделенных лимфоцитов методом иммуномагиитной сепарации и проследить влияние тромбоцитов на адгезию клеток к фибронектину в условиях статики и тока, а также оценить роль кровяных пластинок в адгезии свежевыделенных лимфоцитов к фибрину.

4) Дать сравнительную оценку адгезивных свойств фибронектина, коллагена и экстрацеллюлярного матрикса для тромбоцитов и CD4+ лимфоцитов в состоянии статики и потока.

5) Исследовать содержание и состав тромбоцитарно-лейкоцитар-ных коагрегатов, а также экспрессию Р-селектина на их поверхности у практически здоровых лиц в циркуляции в различные возрастные периоды.

6) Оценить содержание и общий состав тромбоцитарно-лейкоци-тарных коагрегатов, а также степень экспрессии Р-селектина у

больных стабильной стенокардией на фоне терапии ацетилсалициловой кислотой. 7) Описать клиническое значение теста лимфоцитарно-тромбоци-тарной адгезии при некоторых патологических состояниях (диффузный токсический зоб, сахарный диабет I типа).

Научная новизна

Впервые установлено, что тромбоциты усиливают адгезию СЭ4+ лимфоцитов (НУБТ-клона) к фибронектину в состоянии статики и, при обоюдной их активации, в условиях тока культуральной жидкости. Тромбоциты увеличивают степень адгезии лимфоцитов к коллагену I и IV типов в условиях статики. В потоке Т-лимфоциты адгезируют к коллагену I типа лишь в случае предварительного его покрытия тромбоцитами. В статических условиях на поверхности фибринового покрытия усиливается адгезия свежевыделенных лимфоцитов, находящихся в составе коагрегатов с тромбоцитами.

Впервые показано, что адгезия активированных С04+ Т-клеток к фибронектину в присутствии тромбоцитов опосредована а5-интегри-ном. Основные адгезивные мосты тромбоцитарно-лимфоцитарного взаимодействия - С040Ь (СБ 154), Р5СЬ-1 (СЭ162) и р2-интегрины (СО 18) в условиях потока обеспечивают тромбоцит-зависимую адгезию активированных Т-лимфоцитов клона к фибронектину. Добавление тромбоцитов как к интактным, так и к активированным свеже-выделенным Т-клеткам значительно увеличивает их адгезию к фибронектину в условиях статики и при токе культуральной жидкости.

Впервые обнаружено, что для стимуляции лимфоцитарно-тром-боцитарной кластеризации на адгезивной поверхности в условиях потока необходимо наличие целостного экстрацеллюлярного мат-рикса, а не отдельных его компонентов, а также требуется активированное состояние лимфоцитов и тромбоцитов.

Впервые доказано, что у практически здоровых лиц тромбоциты способны адгезировать к поверхности как ар-Т-лимфоцитов, так и на мембране минорной субпопуляции уб-Т-клеток. оф-Т-лимфоци-ты обладают значительно более выраженным адгезивным потенциалом по сравнению с у5-Т-клетками.

Впервые установлено, что в циркуляции у больных стабильной стенокардией способность адгезировать на своей поверхности тромбоциты возрастает у Т-клеток хелперов, а также в минорной субпопуляции у5-Т-лимфоцитов. Прием аспирина снижает количество коагрегатов до контрольных цифр.

Впервые выявлено, что в общем кровотоке у пациентов со стабильной стенокардией в сравнении с контрольной группой, степень экспрессии Р-селектина возрастает в составе Т-клеточно-тромбоци-тарных агрегатов, которая особенно выражена для уб-Т-лимфоцитов. Прием аспирина снижает экспрессию Р-селектина, и полностью тормозит образование уб-Т-лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов. Доказано, что именно Р-селеетин-обусловленный адгезивный мост играет ключевую роль для формирования тромбоцитарно-уб-Т-лим-фоцитарных коагрегатов, а аспирин нарушает это взаимодействие.

Теоретическая и практическая значимость Полученные сведения о роли тромбоцитов и различных компонентов экстрацеллюлярного матрикса в адгезии лимфоцитов, а также информация об адгезивных молекулах, принимающих участие в этом виде межклеточного взаимодействия, раскрывают новые возможности для изучения механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

Внедрение метода оценки межклеточного взаимодействия в циркуляции с использованием проточной цитометрии расширяет возможности для дальнейшего изучения тонких механизмов межклеточных контактов и позволяет по-новому взглянуть на многие физиологические и патологические процессы, протекающие в организме человека.

На основании исследований, разработанный и предложенный нами тест оценки лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, позволяет оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток, эффективность иммуномодулирующей терапии, проследить течение и прогноз заболевания.

Положения, выносимые на защиту

1. Тромбоциты в состоянии статики и в условиях тока культураль-ной жидкости усиливают адгезию С04+ лимфоцитов к фибро-нектину и коллагену. В статических условиях на поверхности фиб-ринового покрытия усиливается адгезия свежевыделенных лимфоцитов, находящихся в состоянии коагрегации с тромбоцитами.

2. Адгезия активированных СЭ4+-Т-клеток к фибронектину в присутствии тромбоцитов опосредована а5-интегрином. Основные адгезивные мосты тромбоцитарно-лимфоцитарного взаимодействия - СБ40Ь (СО 154), РБвИ (СО 162) и (32-интегрины (СО 18) - обеспечивают тромбоцит-зависимую адгезию активированных 'Г-лимфоцитов клона к фибронектину в условиях потока. В

условиях статики адгезия этих форменных элементов крови к коллагену I типа опосредована al-, и а2-интегринами.

3. Активация С04+-Т-лимфоцитов и тромбоцитов в условиях потока приводит к лимофцитарно-тромбоцитарной кластеризации на поверхности целостного экстрацеллюлярного матрикса, что является ведущим фактором для клеточной адгезии к поверхности смоделированной сосудистой стенки в состоянии повреждения.

4. В общем кровотоке у здоровых лиц тромбоциты способны вступать во взаимодействие практически со всеми типами лейкоцитов. Степень адгезии зависит от функционального состояния тромбоцитов и экспрессии адгезивных молекул (Р-селектина). Количество лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов и стенень экспрессии адгезивных молекул увеличивается с возрастом.

5. У больных стабильной стенокардией возрастает способность тромбоцитов вступать в контактное взаимодействие с лейкоцитами за счет моноцитов и нейтрофилов, при этом в клеточно-тромбоцитар-ную адгезию вовлекаются дополнительные субпопуляции лимфоцитов (Т-хелперы и yS-T-лимфоциты). Аспирин ингибирует рост числа коагрегатов и экспрессию Р-селектина в их составе.

Внедрение результатов исследования Результаты исследования механизмов тромбоцитарно-лейкоцитар-ной адгезии внедрены в соответствующих разделах в учебный процесс на кафедрах нормальной и патологической физиологии ГБОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия.

Апробация диссертации Материалы диссертации доложены на: XIX, XX, XXIV Конгрессах Международного общества по тромбозу и гемостазу - ISTH (Сидней, Австралия; Тель-Авив, Израиль; Амстердам, Нидерланды 2005 - 2013). На Международном симпозиуме "Platelets 2006" ! (Ma'ale Hachamisha, Israel), на The 4th Asian-Pacific Congress on Thrombosis and Haemostasis (Китай, Суджоу 2006). На XXII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова. - Москва-Волгоград, 2013. На Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 55-летию Читинской государственной медицинской академии. - Чита, 2008 г. На Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Чита, 2010). На XXXIII World Congress of the International Society of Hematology (Иерусалим, Израиль, 2010), на 22nd ICT (Ницца, Франция, 2012). На XXII

Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова.- Москва-Волгоград, 2013. НаВсероссийиской научно-практической конференции с международным участием (Чита, 2013 г). На 23rd International Congress on Thrombosis, MLTD (Валенция, Испания, 2014).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 4 статьи в зарубежных журналах, включенных в систему цитирования Web of Science и Science Citation Index Expanded, 14 статей, не входящих в перечень журналов, рекомендованных ВАК, 25 тезисов в сборниках международных, российских, краевых научных конференций, конгрессов и съездов, оформлено два патента на изобретения.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 233 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения, выводов и указателя литературы, включающего 336 работ, из них - 61 отечественных и 275 зарубежных авторов, иллюстрирована 12 таблицами и 28 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили: цельная кровь здоровых доноров в возрасте 18-35 лет (468 образцов). Культивируемые лимфоциты здоровых доноров (196 образцов). Очищенные тромбоциты здоровых доноров (125 образцов). Коллаген, фибронектин и фибриноген на поверхности культуральных планшетов, экстрацеллю-лярный матрикс. Культивируемые клетки линии CD4+ (HVST-трансформированный клон). Цельная кровь больных стабильной стенокардией, сахарным диабетом, диффузно-токсическим зобом, острой пневмонией и др. (224 образца).

Определение показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии Свежую гепаринизированную кровь обследуемых больных наслаивали на градиент урографин-фикол (плотность 1,077) и выделяли лимфоциты как описано выше. Собирали интерфазное кольцо, содержащие клетки и кровяные пластинки, однократно промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) и центрифугировали при 1000

об/мин в течение 3-4 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок микроскопировали в камере Горяева. Подсчитывали число лим-фоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на 100 клеток. Степень адгезии определяли как число кровяных пластинок, адгезирован-ных на поверхности одного лимфоцита.

Проведение CPA (Cone and Plaíe(Iet) Analyzer) анализа Исследования проводились с использованием CPA-анализа -оригинального метода оценки адгезии и агрегации тромбоцитов, предложенного D. Varón и соавт. (1997). Для экспериментов применялся CPA-анализатор (Cone and Piate(let) Analyzer) - новый прибор для анализа адгезивных и агрегационных свойств форменных элементов крови (Naphtali S, Israel).

Суспензия CD4+ лимфоцитов в среде RPMI (160 мкл) и взвесь гель-фильтрованных тромбоцитов (40 мкл) помещалась на ЕСМ покрытые четырехлуночные планшеты и инкубировалась в течение 30 мин при 37°С в условиях статики или в условиях тока культуральной жидкости. В ячейку пластикового планшета помещался свободно вращающийся, тефлоновый конус, специально сконструированный для данной системы (Varón D, 1997). На приборе, в зависимости от поставленных задач, задавалась требуемая скорость вращения или скорость сдвига (от 200 до 1000 s-1). Соотношение лимфоцитов и тромбоцитов во всех экспериментах соответствовало физиологическим (1:50). После инкубации ячейки промывались PBS и окрашивались по May-Grunwald. Подсчет числа адгезированных лимфоцитов осуществлялся на 1 мм2 с помощью инвертного светового микроскопа (Olympus, Tokyo, Japan) подключенного к компьютерной системе анализа изображения (Galai, Migdal Haemek, Israel).

Метод иммуномагнитного разделения клеток Предварительно выделялся пул лимфоцитов из крови доноров на градиенте HISTOPAQUE®-1077 (плотность 1,077±0,001 г/мл). Затем лимфоциты CD4+ метились специфичными магнитными частицами CD4 MicroBeads. В качестве метки использовались магнитные гранулы конъюгированные с моноклональными антителами против CD4 антигена человека (мышиные IgGl; клон: М-Т321, Miltenyi Biotec, Germany). После этого, клеточная суспензия помещалась в магнитное поле MACS сепаратора в специальной разделительной колонке.

Клеточная линия (клон лимфоцитов CD4+) В опытах использовались клетки долгоживущей линии лимфо-

цитов CD4+ (любезно предоставленные I Bank, медицинский центр Шеба, Израиль). Получение Herpesvirus saimirí (HVS) инфицированного клона описано ранее. С этой целью фитогемагглютинин-стимулированные клетки инфицировались HVS группы С. HVS-кло-нировались путем посева периферических лимфоцитов из крови доноров. Данная клеточная линия обладала стабильными феноти-пическими характеристиками лимфоцитов CD4 К Рост культуры осуществлялся в стерильных условиях при постоянной температуре в пределах 37°С, при содержании 5% С02 в атмосфере и определенной влажности. Для длительного поддержания роста данной культуры требовалось внесение интерлейкина-2.

Приготовление гель-фильтрованных тромбоцитов Получение чистой суспензии тромбоцитов проводилось методом гель-фильтрации (Walsh Р., 1977). Локтевую вену донора пунктировали широкой иглой и набирали кровь в центрифужные полистироловые пробирки (Vacuet®) содержащие цитрат натрия. Богатая тромбоцитами плазма помещалась в специальные гелевые разделительные колонки (ADIAgel, American Diagnostica INC.). Взвесь кровяных пластинок отмывалась PBS (pH - 7,4) и использовалась в экспериментах.

Проведение FACS-аналнза

В исследовании использовались кроличьи моноклональные анти-Ts 2/7 (IgGl; Endogen, Woburn, MA), CD49b, CD49d и CD49e антитела. Среднее количество клеток, к которым добавлялись антитела в равном объеме составляло 1-2x10s. Далее клетки инкубировались в течение 30 мин при 4°С и дважды отмывались PBS, pH 7,4, содержащего 1% телячьей сыворотки. Затем добавлялись вторые мышиные антитела IgG класса, часть из которых была мечена FITC, часть фикоэритрином (РЕ). Внесение данных антител описано ранее. Оценка экспрессии клеточных рецепторов осуществлялась на FACS-анализаторе (Becton-Dickinson FACS 440), FC 500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Оценка содержания лейкоци-тарно-тромбоцитарных коагрегатов в цельной крови осуществлялась по методу предложенному N. Li (1999).

Приготовление планшетов покрытых ЕСМ, коллагеном или фибронектином Пластиковые 4-х-луночные культуральные планшеты (Nunc, Germany) предварительно покрывались экстрацеллюлярным мат-

риксом (ЕСМ) по методу предложенному Gospodarowicz et al (1980). Корнеальный эндотелий быка выращивался на поверхности планшет в течение нескольких недель в присутствии 4% Dextran Т-40 (Sigma, St. Louis, МО). Затем клетки удалялись с помощью Triton Х-100 и раствором 0,1 M NH4OH с последующей интенсивной отмывкой дистиллированной водой. На месте роста клеток оставался ЕСМ, который в дальнейшем использовался в опытах. Для покрытия коллагеном и фибронектином на дно помещались соответствующие адгезивные вещества и инкубировались в течение суток (Shenkmann В, 2004 - 2006).

Исследование адгезии лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов к фибрину В опытах использовали кровь здоровых лиц. Отмывку лимфоцитов осуществляли на градиенте фиколл-урографин (1,076), после чего производили подсчет лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов по методике предложенной Ю.А. Витковским и соавт. (1999). Адгезию ЛТК изучали на предложенной нами модели, где в качестве адгезивной поверхности использовали миллипорные фильтры покрытые фибрином (Солпов A.B., 2007).

Сканирующая электронная микроскопия После проведения CPA анализа лунки планшетов промывались PBS, в результате чего на поверхности плат оставались только ад-гезированные лимфоциты и тромбоциты. Далее клетки фиксировались метанолом в течение нескольких минут. Перед окрашиванием лунки снова промывались PBS. Далее добавлялся раствор таниновой кислоты на один час. Лунки трижды промывались PBS, после чего на один час добавляли по 500 ml 0s04. После очередной отмывки PBS осуществлялась дегидратация этанолом, а затем фреоном с возрастающей концентрацией (от 50-100%). После просушки препараты заливались эпоксидной смолой и микроскопи-ровались в сканирующем электронном микроскопе. Исследования проводились на базе Бар-Иланского университета, Израиль Клиническая характеристика обследованных больных. В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964).

В качестве патофизиологической модели ангиопатии в данное

исследование для оценки лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в цельной крови (по методу Витковского Ю.А., и соавт, 1999) были включены больные сахарным диабетом первого (СД1) и второго типов (СД2). Средний возраст больных СД1 составил 53,0 ± 6, а СД2 - 55,0 ± 7 года. Всего под нашим наблюдением находились 2 группы пациентов, включавшие 88 человек: 45 с СД1 и 43 с СД2. Все больные имели множественные осложнения, такие как диабетическая ретинопатия, полинейропатия, нефропатия. Больные с не-фропатией на стадии хронической болезни почек и наличием хронических болезней печени в данное исследование включены не были. Все пациенты с СД2 имели инсулинозависимость. Как видно из представленной клинической характеристики, группы больных были практически равноценными. В качестве контроля обследовано 69 относительно здоровых людей. Всеми пациентами подписано информированное согласие на участие в исследовании.

Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия оценивалась в цельной крови у больных диффузно-токсическим зобом (ДТЗ), что служило патофизиологической моделью воспалительной реакции аутоиммунного характера. Для этого нами обследованы больные, госпитализированные для операции: 101 женщина и 49 мужчин от 17 лет до 61 года с диагнозом ДТЗ. Учитывали данные пациентов с зобом И-1У степени с показаниями к оперативному вмешательству (тяжелая форма заболевания, рецидивирующее течение на фоне длительной тиреостатической терапии и лекарственная непереносимость мерказолила). У 73 из них диагностирован ДТЗ средней степени тяжести, у 25 - тяжелая форма. Размеры зоба оценивали пальпаторно, объем - с помощью УЗИ и компьютерной томографии. Пациенты получали обычное лечение: 1% раствор Люголя (30 капель 3 раза в день в течение 7 дней перед операцией); кардиоме-таболики (рибоксин 2%, 5 мл внутривенно, раствор КС1 4%, 20 мл + 5% раствор глюкозы, 400 мл внутривенно капельно); нозепам 0,01 - 1 табл. на ночь; мерказолил (прекращали за 3 суток до операции и не назначали при непереносимости); преднизолон (только пациентам с тяжелой формой тиреотоксикоза перед операцией).

Моделью хронического воспалительного процесса сосудистой стенки пораженной атеросклерозом служила группа больных стабильной стенокардией II и III функционального класса. Диагноз формулировался на основании клинических признаков и инструментальном

исследовании. Пациенты получали традиционную терапию, которая в качестве дезагреганта включала аспирин (75 п^). Часть больных по ряду причин не применяли аспирин и какие-либо другие ингибиторы функций тромбоцитов. Поэтому больные были разделены нами на получавших (24 человека) и не получавших аспирин (21 человек). Критериями исключения служили острые воспалительные состояния у пациентов, системные заболевания, онкологические заболевания, сахарный диабет. Контрольной группой служили сопоставимые по возрасту и полу лица, у которых исключался прием алкоголя и курение (38 человек).

Для оценки ЛТА при остром воспалении нами исследовались больные бактериальной пневмонией. Обследовано 59 больных вне-больничной пневмонией мужского пола в возрасте от 18 до 21 лет. Наблюдаемые больные были распределены на пять клинических групп, идентичных по возрасту, полу, стадии, тяжести патологического процесса: 1 группа - контрольная группа с легким течением пневмонии; 2 группа (контроль-1) - больные с тяжелым лечением пневмонии; 3 группа (контроль-2) - больные с тяжелым течением пневмонии, без иммунотерапии; 4 группа - больные с тяжелым течением пневмонии, получавшие тимапин; 5 группа - больные с тяжелым течением пневмонии, получавшие ронколейкин. Первую клиническую группу составили больные с односторонним поражением не более одного сегмента легкого без каких-либо осложнений.

У всех пациентов последующих четырех клинических групп пневмония осложнилась дыхательной недостаточностью, инфекци-онно-токсическим шоком и инфекционно-токсической нефропати-ей. На этом фоне у части больных выявлялся плеврит, перикардит, миокардит, а также деструкция легочной ткани. Указанные осложнения носили комплексный характер и значительно ухудшали течение заболевания.

В качестве отдельной группы (группа 4) для исследования лим-фоцитарно-тромбоцитарной адгезии наблюдались больные, которым на фоне стандартной терапии применяли известный иммуномодуля-тор тималин по 10 мг внутримышечно, I раз в сутки в течение 5 дней.

Больным опытной группы (группа 5) наряду со стандартным лечением, включающим антибиотикотерапию, дезинтоксикацион-ную терапию, десенсибилизирующую терапию и др. применяли ронколейкин®. Препарат назначали в разовой дозе 500000 ЕД в 400 мл

0,9% раствора хлорида натрия, медленно, внутривенно, капельно. Ронколейкин вводили после исследования системы иммунитета под контролем теста лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.

Полученные данные сравнивались с результатами исследований, проведенных на 120 здоровых донорах в возрасте ог 18 до 40 лет.

Статистическая обработка материала

Статистическую обработку полученного материала проводили с использованием пакетов SigmaPlot 7.0., STATISTICA 10 для Windows. Часть исследований подчинялись нормальному закону распределения, в этом случае рассчитывали t- критерий Стьюдента и стандартное отклонение (±SD). В случае, если изучаемые показатели не подчинялись закону нормального распределения, применяли непараметрические методы: сравнение независимых выборок с помощью U-критерия Манна-Уитни и Вилкоксона для парных признаков, а также с помощью критерия Колмогорова, описательная статистика изучаемых параметров представлена медианой и меж-квартильным интервалом (25-го; 75-го перцентилей). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Роль тромбоцитов и некоторых адгезивных молекул в контактном взаимодействии лимфоцитов с различными компонентами экстрацеллюлярного матрикса

Исследования проводились на поверхности, покрытой экстра-целлюлярным матриксом (ЕСМ), моделирующей участок поврежденного сосуда. При этом создавались условия тока культураль-ной жидкости, соответствующим физиологическим.

Установлено, что активация Т-лимфоцитов вела к увеличению количества адгезированных клеток, как в состоянии статики, так и в условиях тока (в 2,6 ив 1,4 раза соответственно). При отсутствии кровяных пластинок, по сравнению с состоянием статики, в условиях тока адгезия Т-лимфоцитов снижалась в 5 раз (р<0,001).

Внесение гель-фильтрированных тромбоцитов в условиях статики не изменяло число адгезированных Т- лимфоцитов, однако в условиях тока, тромбоциты повышали адгезию Т-лимфоцитов в контроле в 16,2 раза (р<0,001). Это увеличение наблюдалось за счет образования лимфоцитарно-тромбоцитарных кластеров на

поверхности ЕСМ. Кластеры наблюдались как в световом микроскопе, так и при использовании метода сканирующей электронной микроскопии. При добавлении РМА число адгезированных лимфоцитов возрастало в 18 раз (р<0,001), причем большая часть клеток наблюдалась в составе кластеров.

Полученные данные доказывают, что дополнительная активация РМА увеличивает степень адгезии Т-лимфонитов к ЕСМ. Присутствие тромбоцитов усиливает адгезию CD4+ лимфоцитов к ЕСМ в условиях тока, но не статики. Кроме того, лимфоциты и тромбоциты в условиях тока способны образовывать совместные скопления - кластеры.

Установлено, что в состоянии статики, по сравнению с контролем, адгезия лимфоцитов CD4+ к ЕСМ покрытому бедной тромбоцитами плазмой возрастала в 2,3 раза. Покрытие ЕСМ богатой тромбоцитами плазмой повышало количество Т-лимфоцитов в несколько меньшей степени (в 1,6 раза). Однако, в состоянии тока, тромбоциты усиливали адгезию Т-клеток в 3,3 раза. При этом на ЕСМ покрытом бедной тромбоцитами плазме достоверного увеличения числа адгезированных клеток не наблюдалось.

Эти результаты доказывают, что для образования лимфоцитар-но-тромбоцитарных кластеров'кровяные пластинки предварительно должны находится в состоянии суспензии с Т-лимфоцитами. Кроме того, эти данные еще раз подтверждают сведения о том, что тромбоциты способствуют адгезии тромбоцитов в условиях тока, но не статики.

Выявлено, что без тромбоцитов отсутствовала адгезия интак-тных и PMA-активированных свежевыделенных лимфоцитов, как в условиях статики, так и в состоянии тока. Внесение в исследуемую систему тромбоцитов в условиях статики не изменяло количества приклеившихся Т-лимфоцитов. Однако в условиях тока присутствие кровяных пластинок значительно увеличивало число адгезированных лимфоцитов. В состоянии тока, по сравнению с условиями статики, количество адгезированных тромбоцитов увеличивалось в 55 раз. Этот факт можно объяснить низкой адгезией лимфоцитов в состоянии статики и формированием кластеров в условиях тока. Добавление РМА к смеси лимфоцитов и тромбоцитов в условиях тока количественно увеличивало степень адгезии Т-лимфоцитов в 1,8 раза по сравнению с нестимулированными клетками.

1. Роль тромбоцитов в адгезии лимфоцитов CD4+ к фиб-ронектину в условиях статики

Нами обнаружено, что в случае инкубации CD4+ лимфоцитов в лунках покрытых фибронектином в условиях статики 38±10 клеток/мм2 адгезировали к их поверхности. Однако, в случае если эти клетки подвергались активации путем внесения РМА (1цМ) непосредственно в лунки, то наблюдалось их значительное увеличение на поверхности, (до 157±25 клеток/мм2). В противоположность к этому, добавление к клеткам PGE1 (100 ng/mL) и IBMX (0,5 шМ) -веществ, которые увеличивают содержание внутриклеточного циклического AMP, резко снижало адгезию Т-клеток до 13 клеток/мм2. При отсутствии РМА, добавление к клеткам гель-фильтрованных тромбоцитов вызывало увеличение числа адгезированных лимфоцитов до 163±39 клеток/мм2. Однако, одновременная стимуляция клеток и кровяных пластинок РМА, вызывала рост количества прикрепившихся Т-клеток до 453±109 клеток/мм2.

2. Адгезия лимфоцитов CD4+ к фибронектину в условиях тока

С помощью CPA-анализатора также оценивалась адгезия HVST Т-клеток к поверхности лунок, покрытых фибронектином в условиях тока жидкости с напряжением сдвига 200 s-1, что эквивалентно венозному кровотоку. В противоположность результатам, описанным выше в условиях статики, в условиях тока почти не наблюдалась адгезия как интактных, так и PMA-активированных Т-кле-ток. Внесение в систему тромбоцитов вызывало адгезию лимфоцитов также на достаточно низком уровне (9±3 клеток/мм2). Однако, значительное увеличение адгезивных свойств клеток наблюдалось при активации как тромбоцитов, так и лимфоцитов РМА, так количество приклеившихся клеток к поверхности лунок составило 39±7 клеток/мм2. Предварительное внесение специфических анти-CD3+ антител, способных также стимулировать Т-клетки приводило к увеличению степени адгезии последних (12±клеток/мм2), что указывает на важность функционального состояния не только тромбоцитов, но и лимфоцитов в осуществлении тромбоцит-зависимого контактного взаимодействия с адгезивным субстратом.

Увеличение напряжения сдвига снижало степень адгезии Т-кле-ток к фибронектину(11±5 и 3±1 клеток/мм2 при 400 и 800 s-1, соответственно). Эти результаты указывают на то, что тромбоциты на

фибронектиновой поверхности способны трансформировать неадгезивный тип клеток в адгезивный фенотип в условиях тока куль-туральной жидкости, но этот адгезивный потенциал, обеспечивающий способность противостоять силе напряжения сдвига, раскрывается только при дополнительной стимуляции клеток и тромбоцитов.

3. Адгезия лимфоцитов CD4 + к поверхности, покрытой фибронектином, предварительно обработанной бедной тромбоцитами плазмы (РРР) и богатой тромбоцитами плазмой (PRP)

С помощью Image Analyzer обнаружено, что PRP пре-инкуби-рованные лунки почти на 15% от площади поверхности было покрыты тромбоцитами. PBS и РРР обработанные лунки были использованы в качестве контроля. В опыте в исследуемые ячейки планшетов помещались Т-клетки. В условиях статики адгезия Т-клеток была фактически одинаковой в пластинах предварительно обработанных PBS , РРР и PRP (32 ±13, 32 ± 8 и 30 ± 9/mm2 соответственно), это говорит о том, что ни компоненты плазмы фиксированные на поверхности, ни сами иммобилизированные тромбоциты не увеличивали адгезии. В противоположность этому, в условиях тока (200s -1), адгезия несколько увеличилась под влиянием РРР и существенно возрастала на поверхности предварительно покрытой PRP: 3 ±1, 8 ±3, и 23 ±10 клеток/мм2 адгезированных с использованием PBS, РРР и PRP соответственно. Полученные данные указывают на то, что в отличие от тромбоцитов, добавленных в суспензии, иммобилизированные кровяные пластинки не влияют на адгезию лимфоцитов к поверхности планшета в условиях статики. Однако, при наличии фиксированных тромбоцитов на поверхности покрытой фибронектином в условиях потока жидкости, число адгезированных Т-клеток значительно увеличивается

4. Роль а4 (CD49) и а5 (CD49e) интегринов в тромбоцит-зависимой адгезии лимфоцитов CD4 к фибронектину

Способность Т-клеток адгезировать к фибронектину может зависеть от двух фибронектин-связывающих интегринов: а4 (CD49d) и а5 (CD49e). Для того чтобы исследовать который из этих интегринов играет большую роль в Т-клеточном взаимодействии, клетки предварительно инкубировались с блокирующими антитела против «4 и /или а5 интегринов. После отмывки от антител, Т- клетки смешивали с тромбоцитами, помещали на покрытые фибронекти-

ном планшеты, и в последующем к клеточно-тромбоцитарной суспензии добавляли РМА для их обоюдной активации. Обнаружено, что в условиях статики блокада а4 интегрина не вызывала изменений в адгезивных свойствах лимфоцитов в сравнении с Ig G контролем. Однако, преинкубация Т-клеток с анти- а5 антителами ин-гибировала адгезию клеток на 89 ± 3 %. Более того, сочетанная блокада а4 и а5 интегринов снижала адгезивную способность лимфоцитов на 91± 2 %. Обнаружено, что в условиях тока жидкости ингибирование составило 15 ± 12 %, 86 ± 4 % и 76 ± 6 % при использовании анти- а4, анти- а5 и оба антитела, соответственно. Полученные результаты позволяют утверждать, что тромбоцит-зависимая адгезия активированных Т-клеток к фибронектину в большей степени опосредована а5 интегрином. Эффект же блокады а4 интегринов проявляется лишь в незначительной степени в условиях потока.

5. Роль CD40L (CD154), PSGL-1 (CD162) и сй-интегринов (CD 18) в тромбоцит-зависимой Т-клеточной CD4+ адгезии к фибронектину

Для того чтобы исследовать относительный вклад мостов CD40L -CD40, PSGL -1- Р-селектина и LFA-1/ICAM-2 в Т-кле гоч-но-тромбоцитарной адгезии к фибронектину, HVS трансформированные Т- клетки, предварительно активированные РМА, инкубировали с МонАт против CD40L, PSGL -1 и CD18, также добавлялись тромбоциты, дополнительная доза РМА и полученная клеточная суспензия помещалась в лунки покрытые фибронектином. Степень экспрессии CD40L и PSGL-1 на поверхности РМА- активированных Т-клеток была доказана проточной цитометрией (данные не показаны). Результаты, показанные на Рис. 7, демонстрируют ингибирование клеточной адгезии при статическом состоянии на 13 ± 9, 13 ± 8, 29± 20% с использованием анти- CD40L, анти- PSGL -1 и анти-С018 антител, соответственно^ Примечательно, что в условиях потока внесение МонАт против CD40L, PSGL-1, CD40L плюс PSGL-1, или против CD 18 отдельно, вызывало гораздо более выраженное торможение адгезии Т-клеток к фибронектину (60 ±10 , 60 ±20 , 83 ±10, 79 ±7%, соответственно). Полученные результаты показывают, что в условиях тока, адгезия Т- клеток к фибронектину значительно зависит от молекулярного взаимодействия рецептор-лиганд, существующего между тромбоцитами и Т-клет-

ками. Определенный вклад в межклеточное контактное взаимодействие с поверхностью субстрата вносят основные адгезивные мосты: PSGL-1 -Р-селектин; CD40-CD40L и с участием LFA-1 со стороны лимфоцитов и ICAM-2 со стороны тромбоцитов.

6. Роль тромбоцитов в адгезии лимфоцитов CD4+ к коллагену

В следующей серии экспериментов мы предположили, что коллаген как компонент экстрацеллюлярного матрикса также вносит свой определенный вклад в опосредованный тромбоцитами контакт Т-клеток с субэндотелиальной выстилкой. В случае если поверхность эндотелиальной выстилки повреждена, имеется эрозия или разрыв атеросклеротической бляшки, обнажается высокотромбо-генный участок сосудистой стенки, в составе которого помимо фибронектина особую роль играет коллаген. Именно тромбоциты восполняют в таком случае недостающие адгезивные свойства лимфоцитов для их адгезии и последующей трансмиграции в пораженные участки сосудистого русла. В связи с вышесказанным, представляет особый интерес изучение влияния коллагена на адгезию CD4+ лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов в условиях статики и тока. Для решения этой задачи, лунки планшетов предварительно покрывали коллагенами I и IV типов. В систему в условиях статики и тока культуральной жидкости вносили HVST лимфоциты CD4+ на фоне тромбоцитов и без них.

Обнаружено, что в условиях статики наблюдалась хорошая адгезия отмытых тромбоцитов и Т-лимфоцитов к коллагенам I и IV типов. Добавление тромбоцитов к пулу лимфоцитов увеличивало количество приклеившихся клеток в 1,5-2 раза. В контроле (поверхность была покрыта 1% BSA) наблюдалась очень низкая адгезия Т-лимфоцитов (5-10% от общего числа лимфоцитов в опытах) (Рис. 3.8.). В условиях тока (скорость сдвига 200 s-1) отмечалась адгезия лишь единичных Т-клеток и тромбоцитов к коллагену I типа. Такая картина наблюдалась как при отдельной инкубации тромбоцитов и лимфоцитов, так и в их смеси.

7. Участие al, а2 интегрипов в адгезии лимфоцитов CD4+ к коллагену на поверхности предварительно покрытой тромбоцитами

Для выяснения участия рецепторов участвующих во взаимодействии тромбоцитов и лимфоцитов с коллагеном проводилась бло-

кировка центральных интегриновых рецепторов. Предварительное внесение антител против поверхностных интегринов (анти-al или анти-а2) в суспензию Т-лимфоцитов и тромбоцитов снижало количество адгезированных Т-клеток в сравнении с контролем на 30 и 40% соответственно. Одновременное использование обоих антител вызывало уменьшение количества адгезированных лимфоцитов на 80 %.

8. Сравнительная оценка адгезии лимфоцитов CD4+ клона в присутствии тромбоцитов к фибронектину, коллагену и экстрацеллюлярному матриксу

Таким образом, максимальный вклад в статических условиях вносит фибронектин. Интересен тот факт, что ни в контроле, ни при стимуляции РМА, присутствие тромбоцитов не влияло на адгезию лимфоцитов на поверхности целостного ЕСМ.

Обнаружено, что в условиях потока (200 s-1) в контроле и при внесении РМА без тромбоцитов наблюдается адгезия лишь единичных Т-лимфоцитов. Только присутствие тромбоцитов обеспечивает адгезию мононуклеаров к фибронектину, однако их присутствие в клеточной суспензии на поверхности покрытой коллагеном не изменяло адгезивных свойств лимфоцитов. Заслуживает внимания тот факт, что в присутствии тромбоцитов количество адгезированных лимфоцитов CD4+ на поверхности покрытой целостным ЕСМ превышает цифры адгезии клеток без тромбоцитов в 10 -12 раз, причем при микроскопии поверхности магрикса выявлены крупные клеточно-тромбоцитарные скопления - кластеры. Описанное нами явление мы обозначили как тромбоцитарно-лимфоцитар-ная кластеризация. Именно на поверхности целостного ЕСМ в присутствии лимфоцитов тромбоциты способны к кластеризации. Кластеризация тромбоцитов и лимфоцитов -важный триггерный фактор для лимфоцитарной адгезии к поврежденной сосудистой поверхности, где присутствует целостный внеклеточный матрикс, в условиях соответствующих кровотоку.

9. Роль тромбоцитов в адгезии нормальных свежевыделен-ных лимфоцитов к фибрину

Установлено, что после инкубации тромбоцитов и лимфоцитов на поверхности фильтров с фибрином их количество в суспензии снижалось практически в 2,5 раза в сравнении с фильтрами, пропитанными NaCL 0,9% или бедной тромбоцитами плазмой. При этом

снижалось как среднее количество тромбоцитов на один лимфоцит, так и общее число лимфоцитов (р<0,05). Снижение их количества в суспензии указывает на адгезию лимфоцитов в составе ко-агрегатов с тромбоцитами к фибриновому покрытию. Таким образом, лимфоциты способны контактировать с фибрином, находясь в составе лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов, причем ведущее значение имеет наличие самого фибрина, а не плазмы.

Тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия в норме 1. Взаимодейстие тромбоцитов с различными видами лейкоцитов

Известно, что тромбоциты способны вступать в контактные взаимодействия с различными видами лейкоцитов. В начальной серии экспериментов мы оценивали содержание лейкоцитарно-тром-боцитарных коагрегатов в циркулирующей крови практически здоровых лиц в двух возрастных группах.

[В] C045-ECD / CD41-PC7 105 ;D1 : 0,00%

г-и

CL

^ 10>-о

■_) :__

"D3 : Ода

1С 10' 102 101

C045-ECD

Рис. 1. Адгезивное взаимодействие лейкоцитов и тромбоцитов в циркуляции у практически здоровых лиц 18-25 лет. Число лейкоцитарно-тромбоци-гарных коагрегатов (Me [25-й; 75-й]) составило 5,49% [4.96; 6,40] в общем пуле лейкоцитов (квадрат D2).

Обнаружено, что у практически здоровых доноров 18-25 лет, тромбоциты способны вступать в контактное взаимодействие со многими видами лейкоцитов. Так в процентном отношении количество тромбоцитарно-клеточных агрегатов составило (Me [25-й; 75-й]): в общем пуле лейкоцитов (PLC) 5,49% [4,96; 6,40] (Рис. 1.);

02 : 5,74%!

в общем пуле гранулоцитов (PGC) 4,36% [3,83; 4,41], причем среди этих клеток на долю нейтрофилов (PNC) приходилось 88,75% [69,09; 93,04]. Среди моноцитов (РМС) 15,01% [10,16; 39,68] клеток вступали в контакт с тромбоцитами, среди лимфоцитов (PLymphC) 2,87% [2,45; 3,37] находились в клеточно-тромбоцитарном адгезивном контакте (Рис. 2.). Полученные нами данные согласуются с некоторыми работами других исследователей (Michelson A. Ian D. et al, 2001; Nailin Li, № 200).

Установлено, что у практически здоровых лиц в группе 45-55 лет адгезия тромбоцитов наблюдалась с теми же видами лейкоцитов, однако в сравнении с 18-25 летними донорами наблюдалось увеличение степени общих лейкоцитарно-тромбоцитарных коагре-гатов (PLC) в 1,8 раза (р=0,02), и рост количества PGC в 2,1 раза (р=0,01).

2. Взаимодействие тромбоцитов с различными субпопуляциями лимфоцитов

Нами выявлено, что содержание клеточно-тромбоцитарных агрегатов среди различных субпопуляций лимфоцитов практически здоровых добровольцев также имеет свои особенности: так, это взаимодействие более свойственно Т-лимфоцитам, нежели В-клет-кам. Среди лимфоцитов в составе лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов преобладали Т-лимфоциты (66,54% [63,94; 72,15]), В-лим-фоциты задействованы в этот тип межклеточного контакта в гораздо меньшей степени (6,59% [5,86; 9,05]). Полученные с помощью проточной цитометрии данные подтверждают установленные нами ранее факты участия именно Т-лимфоцитов в лимфоцитарно-тормбоцитарной адгезии (Витковский Ю.А, 1999). Для выявления участия Т-клеток несущих различные типы TCR в контакте с тромбоцитами, перед цитометрическим исследованием в исследуемые образцы добавляли меченые красителями антитела против ар и у5 TCR. Обнаружено, что в большей степени в адгезивное взаимодействие с тромбоцитами вступают оф Т-клетки, однако уо Т-лимфоциты также адгезируют на своей поверхности кровяные пластинки (79,88% [76,47; 85.01] и 5,09% [3,55; 7,90] соответственно). Учитывая, что в периферической циркуляции науб Т-клетки приходится всего 3-5%, наши данные указывают, что практически все они вступают в контактное взаимодействие с тромбоцитами.

юч.

to1-

[G] CD14-PC5 / CD41-PC7

S

о

'О1-;

I0P

10'

CD14-PC5

[G] CD3-PC5 / CD41-PC7

!Н1 : .0,00% Н2 :15,235»

ИЗ: !о,оо* Н4 : 84,773Г£

;Н1 : Н2 2,4136

:о,оож

НЗ : Н4 97,59« .

£0,0056 'мНг

10>

UÜJTVJ

А Б

Рис. 2. Адгезивное взаимодействие моноцитов и тромбоцитов (А), а также лимфоцитов и тромбоцитов (Б) в циркуляции у практически здоровых лиц 18-25 лет. Число моноцитарно-тромбоцитарных коагрегатов (Ме [25-й; 75-й]) составило 15,01 % [10,16; 39,68] среди всех моноцитов (квадратН2).

В связи с вышесказанным, нам представляются возможными следующие мосты между тромбоцитами и лимфоцитами (Таб. 1.).

Таблица 1

Структура лимфоцитарно-тромбоцитарных "мостов"

Тромбоциты Лиганды Лимфоциты

allb/ß3 ф«брИН01€И aMß2 (Мас-1)

a2/ß 1 юллаген а I/'p 1, a2/pi

«5/ßl фгоронскпш a4/ßl, а5/р 1

CD40/CD40L - CDMLCDiO

P-selectin - PSGL-1

аПЬ/'рЗ Фибриноген (?) 1С AM- i

В следующей серии экспериментов мы изучали экспрессию лиганда тромбоцитарно-лейкоцитарного взаимодействия - Р-селек-тина в составе изучаемых лейкоцитарно-тромбоцитарных конъю-гатов, полученных непосредственно из циркуляции. Известно, что эта адгезивная молекула появляется на поверхности тромбоцитов

в момент их активации источником которой служат a-гранулы. Установлено, что практически во всех исследуемых типах клеточно-тромбоцитарных агрегатов в той или иной степени экспрессирова-на молекула Р-селектина. Выявлено что в общем пуле лейкоцитар-но-тромбоцитарных агрегатов у 18-25 летних доноров Р-селектин представлен в 12,75% [8,94; 14,26], среди PLymphC в 0,98% [0,41; 1,14], в составе РМС - 3,60% [1,76; 11,48], на тромбоцитарной поверхности PNC - 3,74% [0,72; 5,11].

Тромбоцитарпо-лейкоцитарные взаимодействия при некоторых патологических сотояниях

Аспирин ингибирует циклооксигеназу-1 тромбоцитов и тем самым угнетает синтез основного эндогенного индуктора функции кровяных пластинок - громбоксана А2. На модели стабильной стенокардии в условиях in vivo мы исследовали влияние аспирина на содержание лейкоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов в циркуляции у больных лиц. По показаниям, таким больным назначается аспирин в стандартной дозировке (75 mg), однако не все из них принимали этот препарат. Поэтому мы разделили исследуемые группы на принимавших и не принимавших этот препарат.

При изучении содержания тромбоцитарно-лейкоцитарных коагрегатов у больных стабильной стенокардией II и III функциональных классов, выявлено увеличение числа коагрегатов практически во всех видах исследуемых клеточно-тромбоцитарных коныога-тов кроме общего пула лимфоцитов. Среди PNC в сравнении с контрольной группой рост наблюдался на 3,1% (р=0,011), у PGC на 59,5% (р=0,043), у РМС на 50,5% (р—0,011), PLC возрастали на 54,3% (р=0,045).

Исследуемые показатели в группе больных, получавших в качестве дезагреганта аспирин, были снижены в сравнении с группой пациентов его не принимавших. Так, количество PNC снижалось на 4,85% (р=0,018), число PGC падало на 53,67% (р=0,025), падение уровня РМС составило 37,5% (р=0,034), показатели PLC снизились на 31,3% (р=0,013). Таким образом, аспирин возвращал повышенные показатели лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов к уровню контрольной группы. Обнаружено, что у больных стенокардией экспрессия Р-селектина возрастала в составе Т-клеточ-но-тромбоцитарных агрегатов, особенно высока в сравнении с кон-

тролем у Т-лимфоцитов у5 (в 2,75 раза, р=0,045; и в 5,1 раза р=0,002 соответственно). Интересен тот факт, что именно у8 Т-лимфоци-ты обладают значительной реактивностью и способностью взаимодействовать с Р-селектином. Также выявлено, что у больных принимавших аспирин количество Р-селектина, как и само наличие РТсе^ёТсЯС падает фактически до ноля (Рис. 3).

и критерий Ма«па-Уит«»1 Медоама Прямоуголен*»-. 25&>-?5ло Отрезок Рагуах без вмбр

2 до

с

I 35 <>

I

С-

8 25

I 20

§

0

8 «

С-

1 6 * 0

-5

"«Э "контроль" й уэ "без аспирина"1

р=0 он

р-0.002

а

р=0 00.1

: ас-ири-а

I РТ-евВ»ОР-»Г I РТ-сеПч<ЯсС!С Р «I

Рис. 3. Экспрессия Р-селектина в составе тромбоцитарно-Т-клеточных коагрегатов у больных стабильной стенокардией на фоне приема аспирина.

Мы использовали тест лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии для динамического наблюдения больных, получавших ронколейкин. В результате исследований установлено, что изменение лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии может служить критерием длительности цитокинотерапии.

Предыдущими исследованиями (Витковский Ю.А. и соавт., 2000-2006) показано, что повышение количества лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов длится на протяжении определенного времени, после чего следует снижение кривой адгезии. Именно начало снижения числа коагрегатов явилось сигналом для прекращения введения ронколейкина больным острой пневмонией (Рис. 4). Мы считаем, что в этой точке достигнуто терапевтическое дей-

ствие препарата и дальнейшее его введение не целесообразно. Это связано с тем, что активация лимфоцитов достигла максимума, после чего наступило понижение экспрессии рецепторов на поверхности клеток и происходит усиленная их миграция в ткани [Виков-ский Ю.А., 2009).

% Л ТА

40

35 30

V , &

Количество гнъекцкй

Контроль

■ Больные

Рис. 4. Влияние ронколейкина на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию у больных пневмонией (резко сниженный исходный уровень) (М±8Б).

* - р<0,05 по отношению к первой инъекции: #- р<0,01 по отношению ко второй инъекции; &- р<0,01 по отношению к третьей инъекции; А - р<0,00! по отношению к контролю (практически здоровые лица).

Одной из задач наших исследований явилось изучение лимфо-цитарно-тромбоцитарной адгезия у больных с диффузно-токсичес-ким зобом (ДТЗ) который служил патофизиологической моделью аутоиммунного воспаления. Известно, что степень лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии зависит от функционального состояния лимфоцитов и кровяных пластинок, расчёты велись следующим образом: нами определялось не только процентное и абсолютное содержание ЛТА, но и ЛТИ, а также общее количество тромбоцитов, связанных с лимфоцитами (Таб. 2.).

Таблица 2

Состояние лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у больных ДТЗ (М±БО)

Исследуемые показатели Контроль (здоровые) Больные

Лимфоциты, мкл 2348 77 20841492

ЛТА, % 14,11+1,1 5,7±4,2*

ЛТА/мкл 331,8 21,2 103,7 ±48,6*

ЛТИ 5,4 0,5 2,8±1,3*

ЛТА - лимфоцитарно-тромбоцитарные агрегаты, ЛТИ - лимфоиитарно-тромбоцитарный индекс. * - Р<0,05.

Из представленных данных следует, что при ДТЗ наблюдается значительное снижение абсолютного и относительного числа ЛТА и лимфоцитарно-тромбоцитарного индекса (ЛТИ).

Всё это свидетельствует о том, что при ДТЗ существуют более серьёзные изменения со стороны иммунитета и гемостаза, чем это может показаться на первый взгляд при изучении иммунограм-мы, коагулограммы, а также агрегационной активности тромбоцитов. Более того, оказалось, что чем тяжелее протекает заболевание, и чем выше содержание гормонов щитовидной железы, тем меньшее число лимфоцитов способно присоединять к себе тромбоциты.

Более тщательный анализ показал, что изменения ЛТА при ДТЗ носят неоднородный характер. Так, у 7 больных тест ЛТА оказался резко повышенным и составил 22,7±3,8, тогда как у 24 человек он был снижен и равнялся 3,3±2,9. Разумеется, такие же изменения касались и других показателей ЛТА. Как же могут быть расценены эти данные?

Известно, что ДТЗ является аутоиммунным процессом, и все основные реакции клеточного и гуморального иммунитета в основном протекают в тканях. Из полученных нами данных невольно возникает предположение, что при ДТЗ изменения ЛТА носят двухфазный характер: вначале число агрегатов повышается, как это имеет место у больных с лёгкой степенью заболевания, а затем (преимущественно у больных с тяжёлым и осложнённым течением болезни) снижается.

Не вызывает никакого сомнения, что при ДТЗ непосредственно в щитовидной железе возникает нарушение целости и функциональной активности эндотелия, благодаря чему затрудняется экспрессия большинства адгезивных молекул. В результате этого нарушается кооперация и миграция клеток в зоне повреждения.

Следовательно, уменьшение числа JITA, связанное с их уходом из кровотока в ткани при ДТЗ, является явно неблагоприятной реакцией, усиливающей аутоиммунные процессы. Вот почему одной из задач при лечении ДТЗ является нормализация функций иммунной системы, в том числе воздействие на процессы, направленные на нормализацию лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.

Полученные данные свидетельствуют о том, что исследование J1TA становится особенно ценным при одновременном определении показателей клеточного иммунитета. В подобных ситуациях ЛТА помогает более точно оценить те сдвиги, которые возникают в иммунитете, и сделать заключение о необходимости применения иммуномодулирующей терапии.

В качестве патофизиологической модели ангиопатии для оценки лимфоцитарно-тромбоцшарной адгезии в цельной крови (по методу Витковского Ю.А., и соавт, 1999) были включены больные сахарным диабетом первого (СД1) и второго типов (СД2). Как видно из представленных данных, показатели ЛТА и ЛТИ у больных СД1 практически не отличаются от нормы, в то время как у больных СД2 относительное и абсолютное содержание ЛТА резко снижено (Рис. 5). Кроме того, у больных СД2 намечается тенденция к уменьшению ЛТИ. Вместе с тем, кажущаяся благополучная картина ЛТА и ЛТИ при СД1 является обманчивой. При более детальном анализе выяснено, что если СД1 протекает без осложнений, то количество ЛТА резко возрастает. Если сахарный диабет осложняется нефропатией, нейропатией или ретинопатией, а также поражениями сердечно-сосудистой Системы, то количество коаг-регатов снижается. Чем больше осложнений и чем тяжелее они протекают, тем меньше образуется ЛТА'. Представленные сведения позволяют нам высказать мнение, что снижение числа ЛТА служит объективным показателем, отражающим несостоятельность иммунной системы при СД1 и СД2 (Кузник Б.И., 2012).

Контроль СД1 СД2

Рис. 5. Состояние лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у больных сахарным диабетом I и Л типов, М±8Э.

Таким образом, лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезия является объективным показателем, отражающим как состояние иммунитета. так и гемостаза. При диффузном токсическом зобе ЛТА носит двухфазный характер: наряду с повышением наблюдается значительное снижение теста. Он позволяет оценить тяжесть течения заболевания и характеризует стабилизацию патологического процесса. При декомпенсированной форме сахарного диабета I типа ЛТА может значительно повышаться (1 стадия) или снижаться (2 стадия). Чем тяжелее протекает диабет, тем меньше в крови лимфоцитов, способных присоединять тромбоциты. Тест ЛТА позволяет контролировать иммуннокоррегирующую терапию и указывает на момент отмены препарата (ронколейкина®).

ВЫВОДЫ

1. Тромбоциты усиливают адгезию СБ4+ лимфоцитов (НУ8Т-кло-на) к фибронектину в состоянии статики и, лишь при обоюдной их активации в условиях тока культуральной жидкости. По мере роста скорости сдвига число контактирующих клеток уменьшается. Тромбоциты в условиях статики увеличивают степень адгезии лимфоцитов к коллагену I и IV типов. В потоке наблюдается адгезия Т-лимфоцитов к коллагену I типа лишь в случае предварительного его покрытия тромбоцитами, без кровяных плас-

тинок прикрепление клеток отсутствует. В потоке жидкости на поверхности, покрытой коллагеном I типа, только при наличии в суспензии тромбоцитов адгезируют единичные Т-лимфоциты, контакт же клеток с коллагеном IV типа не происходит. При токе культуральной жидкости как на фибронектине, так и на коллагене, адгезируют одиночные клеточно-тромбоцитарные агрегаты и отсутствуют лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры.

2. Адгезия активированных Т-клеток к фибронектину в присутствии тромбоцитов опосредована а5-интегрином. Ингибирующее влияние антител против интегринов на адгезию Т-лимфоцитов в большей степени проявляется в условиях статики, чем в потоке. Основные адгезивные мосты тромбоцитарно-лимфоцитарного взаимодействия CD40L (CD154), PSGL-1 (CD162) и р2-интегрины (CD 18) обеспечивают тромбоцит-зависимую адгезию активированных Т-лимфоцитов клона к фибронектину в условиях потока. В статических условиях отдельная и комбинированная блокада al-, и а2- интегринов снижает адгезию CD4+- лимфоцитов к коллагену I типа (на 30%, 40% и 80% соответственно).

3. При отсутствии тромбоцитов свежевыделенные из кровотока CD4+ лимфоциты проявляют очень низкую адгезию к фибронектину как в условиях статики, так и в состоянии потока, даже с предварительно стимулированными Т-клетками. Добавление тромбоцитов к интактным и активированным свежевыделенным Т-клеткам значительно повышает их способность адгезировать к фибронектину в условиях статики и тока культуральной жидкости. В статических условиях на поверхности фибринового покрытия усиливается адгезия свежевыделенных лимфоцитов, агрегированных с тромбоцитами.

4. В условиях статики внесение тромбоцитов увеличивает адгезию CD4+ лимфоцитов на фибронектине и коллагене I типа, но не на ЕСМ. Добавление РМА усиливает эту способность для фиб-ронектина и коллагена. В условиях потока, соответствующему венозному кровотоку, адгезия CD4+ лимфоцитов на фибронектине возможна лишь в присутствии кровяных пластинок и при условии одновременной их активации РМА. Однако в условиях тока культуральной жидкости наличие тромбоцитов в системе усиливает адгезию лимфоцитов лишь на поверхности, покрытой ЕСМ.

Этот эффект обусловлен явлением лимфоцитарно-тромбоцитар-ной кластеризации.

5. У практически здоровых доноров в различные возрастные периоды в циркуляции кровяные пластинки образуют коагрегаты со всеми типами лейкоцитов. В наибольшей степени этой способностью обладают моноциты, а наименьшей - лимфоциты. С возрастом (45-55 лет) в сравнении с более молодыми донорами (18-25 лет) увеличивается общее количество лейкоцитарно-тромбоцитарных, и, в частности, гранулоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов. В составе практически всех лейкоцитарно-пластиночных коагрегатов на поверхности тромбоцитов в разной степени экспрессирован Р-селектин. С возрастом степень экспрессии Р-селектина на кровяных пластинках увеличивается в составе коагрегатов с нейтро-филами и лимфоцитами, а также в общем пуле лейкоцитов.

6. В общем пуле циркулирующих лимфоцитов, полученных у практически здоровых лиц разных возрастных групп, в составе кле-точно-пластиночных коагрегатов преобладают Т-клетки (СЭЗ+) в сравнении с В-лимфоцитами (СО 19+). Тромбоциты способны адгезировать к поверхности, как сф-Т-лимфоцитов, так и на мембране минорной субпопуляции у8 Т-клеток. Т-лимфоциты несущие ар- молекулы на своей поверхности обладают'значительно более выражением адгезивным потенциалом по сравнению с у5-Т-клеткамИ.

7. У больных стабильной стенокардией увеличено общее число лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов, что обусловлено усилением адгезивных свойств нейтрофилов в общем пуле грануло-цитов и ростом чИсла моноцитарно-тромбоцитарных агрегатов. У таких пациентов повышается экспрессия Р-селектина в общем пуле лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов й среди ней-трофильно-тромбоцитарных комплексов. Терапия ацетилсалициловой кислотой приводит к снижению числа клеточно-тромбо-цитрных коагрегатов до показателей контрольной группы и значительно ингибирует экспрессию Р-селектина на поверхности кровяных пластинок в составе моноцитарно- и нейтрофильно-тромбоцитарных агрегатов, н не проявляет своего эффекта в общем пуле лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов.

8. Среди Т-клеток хелперов и в минорной субпопуляции уб-Т-лим-

фоцитов больных стабильной стенокардией, возрастает способность адгезировать на своей поверхности тромбоциты, тогда как для других видов лимфоцитов она не изменяется. У этих пациентов в составе Т-клеточно-тромбоцитарных агрегатов, особенно образующихся с уб-Т-лимфоцитами, экспрессия Р-селектина возрастает но сравнению с контролем. Прием аспирина снижает экспрессию Р-селектина, уменьшает общее количество лимфоцитарно-пластиночных коагрегатов до контрольных цифр, и полностью тормозит образование уб-Т-лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов.

9. Тест лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА) является объективным показателем, отражающим как состояние иммунитета, так и гемостаза при патологических состояниях. При диффузном токсическом зобе, сахарном диабете I типа в зависимости ог клинического течения заболевания, ЛТА носит двухфазный характер: наряду с повышением наблюдается значительное снижение теста. Тест ЛТА позволяет оценить тяжесть течения болезни и характеризует стабилизацию патологического процесса.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Влияние интерлейкинов 1Ь, 2, 10 и 16 на взаимодействие лимфо-цитарно-тромбоцитарных агрегатов с экстрацеллюлярным мат-риксом / Ю.А. Витковский, Ю.А. [и др.] // Иммунология. -2006. - Т. 27, № 3. - С. 141-143. (соавторы: A.B. Солпов, Б.З Шенкман).

2. Витковский, Ю.А. Патогенетическое значение лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии / Ю.А. Витковский, Б.И. Кузник, А. В. Солпов // Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 5. - С. 745753.

3. Влияние вилона на состояние иммунитета и лимфоцитарно- тром-боцитарную адгезию у больных сахарным диабетом типа 1 / Б.И. Кузник [и др.] // Иммунология. - 2007. - Т. 28, № 5. - С. 290 - 296. (соавторы: Ю.А. Витковский, H.H. Ключерева, A.B. Солпов)

4. Состояние иммунитета и лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии при раке гортани / Ю.А. Витковский [и др.] // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 6. - С. 653-659. (соавторы: Л.В. Ильиных, Б.И. Кузник, A.B. Солпов и др.)

5. Агрегационная способность тромбоцитов и эндотелиальная дис-

функция у больных с острым отравлением уксусной кислотой /

A.B. Говорин [и др.] // Дальневосточный медицинский журнал.

- 2007. - № 3. - С. 42 - 44.

6. Шаповалов, К.Г. Содержание цитокинов в жидкости пузырей, крови и субпопуляции лимфоцитов при местной холодовой травме / К.Г. Шаповалов [и др.]7/ Иммунология. - 2008. - № 3. - С. 170 - 172. (соавторы: В.А. Иванов, М.И. Михайличенко, A.B. Солпов и др.).

7. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия и содержание D-диме-ров у больных с острым отравлением уксусной кислотой / А.

B. Говорин [и др.] // Анестезиология и реаниматология. - 2008.

- № 3. - С. 69 - 71. (соавторы: Ю.А. Витковский, Е.А. Руцкина, A.B. Солпов и др.).

8. Состояние иммунитета и лимфоцитарно- тромбоцитрной адгезии при пневмонии / Ю.А. Витковский [и др.] // Терапевтический архив. - 2009. - Т. 81, № 3. - С. 40 - 43. (соавторы: Ю.В. Голодных, Б.И. Кузник, A.B. Солпов и др.).

9. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у больных с перелома-

ми длинных трубчатых костей и хроничееким остеомиелитом / A.M. Мироманов [и др.] // Дальневосточный медицинский журнал. - 2009. - № 1. - С. 29 - 32. (соавторы: A.B. Солпов, H.A. Мироманова, и др.).

10. Состояние иммунитета и лимфоцитарно- тромбоцитарной адгезии при диффузном токсическом зобе / Б.И. Кузник [и др.] // Медицинская иммунология. - 2010. - Т. 12, № 1-2. - С. 22 - 25. (соавторы: Ю.А. Витковский, О.В. Гвоздева, А:В. Солпов и др.).

11. Гергесова, Е.Е. Агрегация тромбоцитов, лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия и группы крови ABO у больных гриппом A(H1N1) [Электронный ресурс] / Е.Е. Гергесова, Ю.А. Витковский, A.B. Солпов И Забайкальский медицинский вестник. -2011. - № 1. - С. 4-9. - Режим доступа: 1. http://medacadem. chita.ru/zmv. (11. 10. 2014).

12. Агрегационная способность тромбоцитов, лимфоцитарно- тром-боцитарная адгезия и содержание D-димеров у больных с острым отравлением уксусной кислотой / Н.А. Соколова [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - № 7. - С. 3335. (соавторы: Ю.А. Витковский, Е.А. Руцкина, А.В. Солпов и ДР-)

13. Прогностическое значение показателей, предшествующих эк-зотоксическому шоку у больных с острым отравлением уксусной кислотой / Н.А. Соколова [и др.] // Клиническая медицина. -2011. -№ 4. - С. 51-53. (соавторы: Е.А. Руцкина, А.В. Солпов, и др.)

14. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия и содержание D-димеров у больных после острого отравления уксусной кислотой / Н.А. Соколова [и др.] // Российские медицинские вести. - 2011. - T. XVI, № 1. - С. 57-61. (соавторы: Е.А. Руцкина, Ю.А. Витковский, А.В. Солпов и др.)

15. Агрегационная активность форменных элементов крови у больных сахарным диабетом 1 и 2 типа / Б.И. Кузник [и др.] // Сахарный диабет. - 2012. - N 2. - С. 49-53. (соавторы: Ю.А. Витковский, М.Ю. Захарова, А.В. Солпов и др.)

16. Любин, А.В. Агрегация тромбоцитов и лимфоцитарно- тромбо-цитарная адгезия при электротравме в эксперименте / А.В. Любин, А.В. Солпов, К.Г. Шаповалов // Дальневосточный медицинский журнал. - 2012. - № 1. - С. 112-115.

17. Лейкоцитарно-тромбоцитарно-эритроцитарные взаимоотношения в различных бассейнах сосудистого русла у больных хронической формой ИБС [Электронный ресурс] / Б.И. Кузник [и др.] // Забайкальский медицинский вестник. - 2012. - № 2. - С. 92 - 100. - Режим доступа http://medacadem.chita.ru/zmv (14. 11. 2014) (соавторы: Д.Е. Порушничак, Е.Б. Порушничак, А.В. Солпов)

Статьи, опубликованные в зарубежных изданиях, включенных в систему цитирования Web uf Science и Science Citation Index Expanded:

18. Platelets enhance CD4+ lymphocyte adhésion to extracellular matrix under flow conditions: Rôle of platelet aggregation, integrins, and

non- integrin receptors / A. Solpov [et. al.] // Thrombosis and Haemostasis. - 2006. - № 95. - P. 815-821. - ISSN: 0002-9629 (coauthors : B. Shenkman, Yu. Vitkovsky)

19. CD4+ lymphocytes require platelet for adhesion to immobilized fibronectin in flow: Role of pi (CD29), p2 (CD18) related integrins and non- integrin receptors / B. Shenkman [et. al.] // Cellular Immunology. - 2006. - № 242 (1). - P. 52-59. - ISSN: 0008-8749. (coauthors : G. Brill, A.Solpov).

20. Status of platelet-lymphocyte aggregation in circulating blood of patients with type 1 diabetes with and without diabetic nephropathy / Yu.Vitkovsky [et. al.] // IMAJ The Israel Medical Association Journal. - 2008. - Vol. 10, № 10. - P. 691-694. - ISSN: 1565-1088. (coauthors : B. Kuznik, A. Solpov, E. Magen).

21. Kuznik, B.I. Lymphocyte-Platelet Crosstalk in Graves' Disease / B.I. Kuznik [et.al.] // American Journal of the Medical Sciences -2014. - Vol. 347, № 3. - P. 20-210. - ISSN: 0002-9629. (coauthors : Y.A. Vitkovsky, О. V. Gvozdeva, A.V. Solpov et. al.).

Печатные работы, опубликованные в прочих изданиях:

22. Витковский, Ю.А. Взаимодействие лейкоцитов и тромбоцитов с эндотелием и ДВС-синдром / Ю.А. Витковский, Б.И. Кузник, А.В. Солпов // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2006. - № 1. - С. 15-28.

23. Clinical significance of lymphocyteplatelet interaction / Solpov A. [et. al.] // Platelets 2006 Symposium. May, 11-14.2006. - Ma'le Hachamisha, Israel. - P. 172. (coauthors : Zerebcova S.V., Lychanov I.D и др.)

24. Influence of strength training on lymphocyte-platelet adhesion and platelet aggregation / I.R. Topolev [et. al.] // Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis. Proceeding and Abstracts from the 19th International Congress on Thrombosis ( Tel-Aviv, Israel, May 14-18, 2006). - 2006. - Abstract No 1034. - P. A29 (coauthors : A.V Solpov, Gaidin S.D и др.)

25. Hemostatic changes in leukocytes in hemoblastosis / Yu. A. Vitkovsky

[et. al.] // Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis. Proceeding and Abstracts from the 19th International Congress on Thrombosis (Tel-Aviv, Israel, May 14-18, 2006). - Tel-Aviv, 2006. -

Abstract No 1070. - P. A21 (coauthors : O.N. Egorova,A.V. Solpov).

26. Vitkovsky, Yu. Mechanisms of the lymphocyte-platelet adhesion / Yu. Vitkovsky, A. Solpov, B. Shenkman // The 4th Asian-Pacific Congress on Thrombosis and Haemostasis ( September 21 -23,2006).

- 2006, Suzhou, China. - P. 5-39.

27. Effects of strength training on lymphocyte-platelet adhesion. The 4th Asian-Pacific Congress on Thrombosis and Haemostasis. / Topolev I. fet.al.] // The 4th Asian-Pacific Congress on Thrombosis and Haemostasis ( September 21-23, 2006). - 2006, Suzhou, China.

- P7-1., P. 206. (соавторы Solpov А. и др.)

28. Состояние лимфоцитариотромбоцитарной адгезии при различных заболеваниях / Ю.А. Витковский / [и др.] / Аллергология н иммнуология. - 2006. - Т. 7, № 3. - С. 436. (соавторы: И.Д. Ли-ханов, Н.Н. Ключерева, А.В. Солпов и др.)

29. Кузник, Б.И. Адгезивные молекулы и лейкоцитарно-тромбоци-тарные взаимодействия / Б.И. Кузник, Ю.А. Витковский, А.В. Солпов // Вестник гематологии. - 2006. - Т. II, № 2. - С. 42-55.

30. Lymphocyte-platelet adhesion in patients with angina pectoris / S.V. Zherebcova [et. al.] // Journal of Thrombosis and Haemostasis. -2007. - Vol. 5, Suppl. 2. - P. - W-299 (coauthors : A.V. Govorin, A.V. Solpov).

31. Solpov, A. Role of collagen in platelet-depended CD4+ T cell adhesion / A. Solpov, B. Shenkman, Y.A. Vitkovsky // Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2007. - Vol.5, Suppl. 2. - P.-W-300.

32. Clinical use of test of lymphocyte-platelet adhesion / B.I. Kuznik [et. al.] // Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2007. - Vol. 5, Suppl. 2. - P.-W-303 (coauthors : E.E. Gergesova, N.I. Goryayev, AV Solpov).

33. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у больных стенокардией / С.В. Жеребцов /[и др.] / Медицинская иммунология. - 2007.

- № 2-3. - С. 330. (соавторы: А.В. Говорил, А.В. Солпов..)

34. Влияние вилона на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз и лим-фоцитарно-тромбоцитарную адгезию при сахарном диабете I типа / Б.И. Кузник [и др.] // Тромбоз, гемостаз и реология. -2007. - №3. - С. 19-26. (соавторы: Ю.А. Витковский, Н.Н. Ключерева, А.В. Солпов..)

35. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия как объективный по-

казатель иммунитета и гемостаза / Ю.А. Витковский [и др.] // Вестник гематологии. - 2007. - Т. 3, № 2. - С. 70. (соавторы: A.B. Солпов, И.Г. Богданов и др.)

36. Витковский, Ю.А. Итоги 10-летнего исследования механизмов лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии / Ю.А. Витковский, Б.И. Кузник, A.B. Солпов // Забайкальский медицинский вестник. -2008. -№ 3. - С. 30-35

37. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз и лимфоцитарно-тромбо-цитарная адгезия в различных отделах сосудистого русла у больных с ишемической болезнью сердца [Электронный ресурс] / Е.Б. Порушничак [и др.] // Конгресс по иммунореабили-тации. - Дубай, 2008. - Режим доступа: www.isir.ru 16/02/08. (соавторы: Ю.А. Витковский, A.B. Говорин, A.B. Солпов и др.)

38. Состояние иммунитета, гемостаза, процессов ПОЛ и лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии при диффузном токсическом зобе / Б.И. Кузник [и др.] // Тромбоз, гемостаз и реология. -2008. - № 2. - С. 27-38. (соавторы: А.Ш. Бышевский, Ю.А. Витковский, A.B. Солпов.)

39. Иммунитет, гемостаз, и лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбо-цитарные взаимодействия / Б.И. Кузник [и др.] // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2, № 2-3. - С. 179. (соавторы: Ю.А. Витковский, О.В. Гвоздева, A.B. Солпов и др.)

40. Свертываемость артериальной и венозной крови и лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у больных ИБС / Б.И. Кузник [и др.] / / Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (11), № 2-3. - С. 322. (соавторы: Ю.А. Витковский, A.B. Говорин, A.B. Солпов и др.)

41. Состояние лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у больных с переломами длинных трубчатых костей / Мироманов A.M. [и др.] // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: материалы Всероссийской научно-практической конференции, Чита, 1-2 октября. 2008 г.). - Чита, 2008 . - С. 197 - 198. (соавторы: Мироманова H.A., Солпов А.В и др.)

42. Витковский, Ю.А. Результаты 10-летнего исследования механизмов лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии / Ю.А. Витковский, A.B. Солпов, Б.И. Кузник // Клиническая гемостазио-логия и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: мате-

риалы IV Всерос. конф. с междунар. участием (Москва, 4-6 февр. 2009 г.). - М., 2009. - С. 95-97.

43. Состояние тромбоцитарного гемостаза и свертывающая активность крови, взятой из различных бассейнов сосудистого русла / Е.Б. Порушничак [и др.] // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: материалы IV Всерос. конф. с междунар. участием (Москва, 4-6 февр. 2009 г.). - М., 2009. - С. 401-402. (соавторы: Т.В. Савельева, О.С. Роднина, А.В. Солпов и др.)

44. Система гемостаза, лейкоцитарно-тромбоцитарные взаимоотношения, белки острой фазы воспаления и цитокины у больных с различными формами ишемической болезни сердца / Ю.А. Витковский [и др.] // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2009. - № 1. - С. 49-63. (соавторы: Б.И. Кузник, А.В. Говорин, А.В. Солпов и др.)

45. Состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, лейкоцитар-но-эритроцитарно-тромбоцитарных взаимоотношений и свертываемости крови, взятой из различных бассейнов сосудистого русла у больных ИБС / Б.И. Кузник [и др.] // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2009. - № 2 (37). - С. 49-63. (соавторы: Витковский, Е.Б. Порушничак, А.В. Солпов и др.)

46. Сравнительная характеристика состояния иммунитета и гемостаза при сахарном диабете 1 и 2 типов / М.Ю. Захарова / [и др.] / Тромбоз, гемостаз и реология. - 2009. - №4 (40). - С. 3347. (соавторы: Н.Н. Ключерева, Ю.А. Витковский, А.В. Солпов и др.)

47. Шуняева, Е.В. Особенности лабораторных показателей у больных гриппом A (H1N1) в Забайкалье / Е.В. Шуняева, А.В. Солпов, Л.Б. Кижло // Итоги эпидемии гриппа A (H1N1): материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием (Чита, 2627 окт. 2010 г.). - Чита, 2010. - С.141-143.

48. Solpov, A. Lymphocyte-platelet adhesion in A (H1N1) infected patients / A. Solpov, N. Gergesova, N. Strambovskaya // XXXIII World Congress of the International Society of Hematology (Jerusalem, October, 10-13 2010). - Jerusalem, Israel, 2010. P- 203.

49. Особенности клиники и лабораторных показателей пандемического гриппа (H1N1) в Забайкальском крае / Е.В. Шуняева [и

др.] //Дальневосточный журнал инфекционной патологии. -2010.

- № 17. - С. 11-14. (соавторы: H.H. Ключерева, Ю.А. Витковс-кий, A.B. Солпов и др.)

50. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия и содержание D-диме-ров у больных после острого отравления уксусной кислотой / H.A. Соколова [и др.] // Российские медицинские вести. - 2011.

- T. XVI, № 1. - С. 57-61. (соавторы: Е.А. Руцкина, Ю.А. Вит-ковский, A.B. Солпов..)

51. Пустотина, З.М. Изменение лимфоцитарно-тромбоцитарной ад-

гезии у женщин с хирургической менопаузой в зависимости от особенностей микроциркуляции / З.М. Пустотина, Н.В. Ларё-ва, A.B. Солпов // Актуальные вопросы кардиологии. Кардиология на перекрестке наук: тез. док. II междунар. конгр. совместно с V междунар. симпозиумом по эхокардиографии и сосудистому ультразвуку, XVIII ежегодной науч.-практ. конф. -Тюмень, 2011. - С. 261.

52. Состояние иммунитета, гемостаза и лимфоцитарно-тромбоци-тарно-эритроцитарных взаимоотноше-ний при диффузном токсическом зобе / Б.И. Кузник [и др.] // Гемостазиология. - 2012.

- № 1. - С. 3-14. (соавторы: Ю.А. Витковский, О.В. Гвоздева, A.B. Солпов и др.)

53. Состояние лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у больных ишемической болезнью сердца / Б.И. Кузник [и др.] // Гемостазиология. - 2012. - № 1. - С. 15-18. (соавторы: Д.Е. Порушни-чак, Е.Б. Порушничак, A.B. Солпов)

54. Состояние лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у больных ишемической болезнью сердца / Б.И. Кузник [и др.] // Гемостазиология. - 2012. - № 1. - С. 15-18. (соавторы: Д.Е. Порушничак, Е.Б. Порушничак, A.B. Солпов)

55. Solpov, A. The participation of gamma/delta and alfa/betta T-lymphocytes in coagregates forming with platelets / A. Solpov, Yu.Vitkovsky, P.Tereshkov // Thrombosis research : abstr. of the 22nd ICT (Nice, France, 6-9 October 2012). - Nice, 2012. - CO 177.

56. Романюк, C.B. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у больных со стенокардией и острым коронарным синдромом [Электронный ресурс] / C.B. Романюк, Ю.А. Витковский, A.B. Солпов // Современные научные исследования и инновации. - Но-

ябр., 2012. - Режим доступа: URL. http://web.snauka.ru/issues/ 2012/11/18607

57. Кузник, Б.И. Лейкоцитарио-тромбоцитарно-эритроцитарные взаимоотношения в различных бассейнах сосудистого русла у больных хронической формой ИБС / Б.И. Кузник, Ю.А. Вит-ковский, A.B. Солпов // Забайкальский медицинский вестник. -2012. -№ 2. - С. 92-100.

58. The participation of gamma/delta and alfa/beta T- lymphocytes in coagregates forming with platelets in patients with coronary artery disease / M. Avetisyan [et. al.] /7 EPosters Thrombosis and Haemostasis. - 2013. - Suppl. - Abstr. PO 369. (coauthors : A. Solpov и др.).

59. Витковский, Ю.А. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия в норме и патологии / Ю.А. Витковский, A.B. Солпов, М.А. Аветисян // Тез. док. XXII съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - М. ; Волгоград, 2013. - С. 102-103.

60. Солпов, A.B. Участие гамма/дельта и альфа/бета Т-лимфоци-тов в формировании коагрегатов с тромбоцитами / А.В Солпов, Ю.А. Витковский, П.П. Терешков // Материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием (Чита, 17-18 окт. 2013 г.). - Чита, 2013. - Т. 2., С. 167.

61. Пат. № 2385459, Российская Федерация, МПК: G 01 N 33 49, G 01 N 33 5. Способ прогнозирования развития экзотоксического шока при остром отравлении уксусной кислотой / Е.А. Руцки-на, A.B. Говорин, H.A. Соколова, A.B. Солпов, Ю.А. Витковский ; Заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия. - № 2008103633; за-явл. 30.01.2008; опубл. 27.03.2010, Бюл. №9., 5 с.

62. Пат. № 2354974, Российская Федерация, МПК: G 01 N 33 53. Способ прогнозирования тяжести интоксикации у больных с местной холодовой травмой / К.Г. Шаповалов, Ю.А. Витковский, A.B. Солпов, В.А. Иванов; Заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия. - №2008101150; заявл. 29.10.2008; опубл. 10.05.2009, Бюл. №13., 6 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

JITA - лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия

ДТЗ - диффузно-токсический зоб

СД - сахарный диабет

ЛТИ - лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс

ADP - АДФ

CD - кластер дифференцировки клеток

CD 40L - лиганд CD40

ЕСМ - экстрацеллюлярный матрикс

HSP - белки теплового шока

HVST - культивируемая линия Т-лимфоцитов,

инфицированная вирусом герпеса.

ICAM-1 - молекула межклеточной адгезии-1

IFN - интерферон

IL - интерлейкин

oxLDL - окисленные липопротеины низкой плотности

PAF - фактор, активирующий тромбоциты

РМА - форбол-12-миристат 13-ацетата

PSGL - Р-селектин-гликопротеиновый лиганд

TNF - фактор некроза опухолей

Интегрины:

а р - VLA-1 (very late adhesion 1- молекула очень поздней адгезии-1) а У - VLA-2 (very late adhesion 2 - молекула очень поздней адгезии-2) aV - VLA-4 (very late adhesion 3 - молекула очень поздней адгезии-4) aV - VLA-5 (very late adhesion 4 - молекула очень поздней адгезии-5) ар- GPIIb/IIIa (гликопротеиновые рецепторы на тромбоците)

Лицензия ИД № 03 077 от 23.10.00. Подписано в печать 04.02.2015. Бумага офсетная. Формат 60 х 84 '/|6. Усл.печл - 2,0 Тираж 100. Заказ № 13/2015.

Отпечатано в редакционно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39 а.