Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние оксида азота на иммунитет и гемостаз в норме и при некоторых патологических состояниях

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние оксида азота на иммунитет и гемостаз в норме и при некоторых патологических состояниях"

¡Се ссо^ь ши ы

На правах рукописи

Клименко Оксана Валерьевна

ВЛИЯНИЕ ОКСИДА АЗОТА НА ИММУНИТЕТ И ГЕМОСТАЗ В НОРМЕ И ПРИ НЕКОТОРЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ

03.00.13 - Физиология

14.00.16 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ЧИТА - 2002

Работа выполнена в ГОУ Читинская государственная медицинская академия

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, Витковскни

Юрий Антонович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

кандидат медицинских наук

Степанов Александр Валентинович

Маринин Владимир Владимирович

Ведущая организация: Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии МЗ РФ (г. Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится «_

2002 г. в

часов на заседании диссертационного совета Д. 2СГ8. 118. 01 при ГОУ Читинская государственная медицинская академия (672090, г. Чита, ул. Горького, 39а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ Читинская государственная медицинская академия по адресу: 672090 г. Чита, ул. Горького, 39а.

Автореферат разослан » ¿¿¿ЯЛ72002 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д. 208. 118. 01, кандидат медицинских наук, доцент

'"""Кузьмина О.В.

РОССИЙСКАЯ

"ОПУДЛРСТВЕННАЯ библиотека

2092———

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время внимание исследователей привлекают биологические свойства оксида азота. Несмотря на многочисленные работы но изучению влияния N0 на физиологические функции организма и выяснению его роли в патогенезе заболеваний, до сих пор не существует четких представлений о значении этой молекулы в рефляции защитных систем организма (Проскуряков СЛ., и др., 2000; Akaike Т., et ai., 2001; Саго A.A., et al., 2001.). Известно, что иммунитет, гемостаз и неспецифическая резистентность организма составляют единую интегральную клеточно-гуморальную систему, связующим звеном в которой выступают цитокины. Показано, что при многих заболеваниях, в том числе и воспалительных, на фоне повышения продукции интер-лсйкинов одновременно изменяется течение иммунных реакций и гемостаза (Кузник Б.И. и соавт., 1988 - 2002; Витковский Ю.А. исоавт., 1995-2002). Однако за последние годы появились сведения о том, что такие цитокины, как ИФ-у, ИФ-а, ИЛ-lß, ИЛ-4 и другие, являясь модуляторами воспалительных реакций, потенциируют синтез индуцнбельной формы TslO-сиитазы, и, тем самым, стимулируют продукцию NO (Nathan С., 2002; Xu L. et al., 1999,2001). Некоторые из них, например, ИФ-ß, селективно снижают активность синтазы окиси азота (Ниа L.L. et al., 1998,2000; Van Der Meide Р.Н., 2000).

Несмотря на разрозненные сведения, до сих пор не существует четких представлений о клеточно-опосредованном влиянии оксида азота на механизмы гемостаза. Так, изучено и обосновано ингибирующее влияние NO на агрегацию тромбоцитов (Sabetkar М.., at al., 2001.). Однако становиться нерешенным вопрос, почему при атеросклерозе на фоне высокого содержания оксида азота развиваются нарушения циркуляции крови, а также выявляются изменения со стороны иммунной системы (Tarkowski Е. et al., 2000; Castillo J. et al., 2000.). При онкологических заболеваниях, несмотря на высокую концентрацию N0, утрачивается способность опухолевых клеток к апоптозу и очень рано проявляются иммунные и гемостатические реакции, во-многом определяющие особенности опухолевого роста (Tarkowski Е. et al., 2000; Castillo J. et al., 2000; Maeda H„ 2001.).

Поскольку любые отклонения в продукции оксида азота, в частности, нарушения функциональной интеграции эндотелия, макрофагов, лимфоцитов, гранулоцитов и других компонентов, включенных в механизмы биомодуляции, биоамплификации, биоаттенуации или функциональной интеграции сосудисто-тромбоцитарного звена, свертывания крови и фибрино-лиза могут индуцировать состояние гиперкоагуляции и целый спектр тром-ботических или геморрагических осложнений, то становится понятным важность комплексного изучения этих реакций в норме и патологии. В связи с вышеизложенным выявление роли оксида азота в регуляции систем иммунитета и гемостаза является актуальным в теоретическом и практическом отношениях.

Цель исследования

Исследовать роль оксида азота в регуляции иммунитета и гемостаза в норме и при некоторых патологических состояниях.

Задачи исследования

1. Изучить влияние оксида азота на агрегацию тромбоцитов, свертывание крови и фибринолиз в опытах in vitro.

2. Определить эффекты цитокинов ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНОа, ИФа, И Фу, на продукцию оксида азота клетками периферической цельной крови.

3. Исследовать влияние N0 на экспрессию тканевого фактора моноцитами периферической крови и его действие на лимфоцитарно-тромбоцитар-ную адгезию.

4. Определить концентрацию оксида азота у здоровых людей в возрастном аспекте и выяснить его уровень у молодых женщин в связи с различными фазами менструального цикла.

5. Исследовать влияние курения на продукцию оксида азота у молодых мужчин.

6. Исследовать продукцию оксида азота, уровень цитокинов и экспрессию тканевого фактора в крови больных атеросклерозом, вирусным гепатитом С и раком гортани.

7. Изучить уровень оксида азота и цитокинов в цереброспинальной жидкости детей с разными формами менингита.

Научная новизна

Впервые установлено, что оксид азота, угнетает клеточно-опосредованную прокоагулянтную активность крови за счет торможения агрегации тромбоцитов и снижения экспрессии тканевого фактора, тормозит лимфоцитарно-тромбоци-тарную адгезию.

Впервые показано, что присутствие в окружающей среде ИЛ-1(3, ИЛ-8, ИЛ-10 и ИФу приводит к повышению, а ИЛ-4 и ИФа - к снижению продукции оксида азота лейкоцитами крови. Отмечена зависимость между фазой менструального цикла и продукцией оксида азота у здоровых женщин. Выяснено, что уровень оксида азота у мужчин увеличивается пропорционально стажу табакокурения.

Впервые комплексно оценена продукция оксида азота, уровень провоспа-лительных цитокинов крови и экспрессия тканевого фактора у пациентов с острым проявлением атеросклероза (инсульт), вирусного гепатита С и рака гортани. Показано, что оксид азота появляется в цереброспинальной жидкости у детей в острый период гнойного и серозного менингита и зависит от присутствия про-воспалительных цитокинов ИЛ-ip, ИЛ-8, ФНОа.

Практическая значимость работы

Определение продукции оксида азота у пациентов носит диагностическую,

В исследованиях в качестве испытуемых принимали участие здоровые люди: 55 человек обоего пола в возрасте от 30 до 70 лет, 85 человек - в возрасте от 19 до 29 лет, 36 человек - от 5 до 18 лет.

Нами наблюдались 4 группы больных. Первая группа включала 70 человек в возрасте от 55 до 92 лет, у которых диагностирован атеросклроз сосудов головного мозга. Из них 30 человек находились в состоянии острого ишемического инсульта, 10 человек - в раннем восстановительном периоде, 20 - в позднем восстановительном и 10 человек - в периоде остаточных проявлений.

Вторую группу составили 25 больных вирусным гепатитом С в возрасте от 19 до 26 лет, у 12 из которых диагностирован гепатит в активной фазе, у 13 - в неактивной.

В третью группу входили 88 больных раком гортани Т; Т3 Т4 стадии в возрасте от 35 до 75 лет (3 человека с Т2 стадией, 38 человека с Т3 стадией, 27 человек с Т4 стадией процесса), у 38 из них в комплексном лечении применялся рекомбинантный ИЛ-2 - ронколейкин". У всех больных диагноз злокачественной опухоли был подтвержден гистологическими исследованиями, биопсийиого и операционного материала.

Четвертая группа включала 36 детей с менингитами от 1 года до 14 лет. Из них у 8 человек диагностирован гнойный менингит в острой стадии заболевания, сопровождавшийся тяжелым течением, у 6 детей с гнойным менингитом обнаружена острая стадия процесса и среднетяжелое течение, у 5 детей установлена стадия рсконвалесценции. У 6 детей диагностирован острый серозный менингит с тяжелым течением, у 5 человек - острый серозный менингит со средней степенью тяжести, у 6 детей — заболевание в период выздоровления.

Объектами изучения были цельная кровь, плазма, цереброспинальная жидкость и сыворотка.

Методы исследования

Определение N0. Для исследования оксида азота за основу был взят модифицированный метод спектрофотометрического определения нитритов Грисса-Илосвая (Уильяме У.Дж., 1982).

Оценка лимфоцнтарио-тромбоцитариом адгезии. Определение показателя лимфоцнтарно-тромбоцитарной адгезии проводили по методу, предложенному Ю.А.Витковским и соавт. (1999). Свежую, гепаринизированную кровь обследуемых больных наслаивали на градиент урографин-фикол (плотность 1,077) и выделяли лимфоциты как описано выше. Собирали интерфазное кольцо, содержащие клетки и кровяные пластинки, однократно промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) и центрифугировали при 1 ООО об/мин в течение 3-4 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок микроскопировали в камере Горяева. Подсчитывали число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагре-

прогностическую значимость и может быть использовано для оценки правильности и эффективности проводимого лечения.

Внедрение в .практику Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс и используются при чтении лекций и проведении занятий на кафедрах патологической и нормальной физиологии.

Апробация основных положений работы Материалы представлены на XVIII конгрессе Международного общества по тромбозу и гемостазу (Париж, Фракция, 2001), на II конгрессе по биологии и химии оксида азота (Прага, Чехия, 2002), XVIII Международном конгрессе по тромбозу (Болонья, Италия, 2002).

Объем it структура диссертации Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами и 19 рисунками. Работа состоит из введения, --

обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и s

списка литературы, включающего 165 источников (19 отечественных и 146 \

зарубежных). i

Положения, выносимые на защиту

1. Оксид азота in vitro тормозит агрегацию тромбоцитов, реакцию лимфо-цитарно-тромбоцитарного розеткообразования, угнетает клеточно-опос-редованную прокоагулянтную активность крови за счет уменьшения экспрессии тканевого фактора моноцитами и увеличивает фибринолнти- __

ческие свойства цельной крови. Присутствие в окружающей среде ИЛ-

1Р, ИЛ-8, ИЛ-10 и ИФу приводит к повышению продукции оксида азота лейкоцитами крови. Внесение же ИЛ-4 и ИФсх вызывает противоположный эффект - торможение секреции NO.

2. У здоровых женщин концентрация NO зависит от фазы менструально-овариального цикла: в секреторную фазу и во время менструации - увеличивается, а в фазу пролиферации - уменьшается. У мужчин табакокурение способствует продукции оксида азота и его уровень пропорционален стажу курения.

3. Повышение содержания оксида азота при атеросклерозе, гепатите С, раке гортани и менингите зависит от стадии болезни и сопровождается повышенным содержанием провоспалительных цитокинов и экспрессией тканевого фактора.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе со здоровыми и больными людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964,2000 ред.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние NO на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз. В опытах in vitro установлено, что оксид азота полностью ингибирует агрегацию тромбоцитов сразу же после введения L-арпшина. При этом на агрегатограмме не наступает волна агрегации тромбоцитов при добавлении малых доз АДФ и тормозится реакция высвобождения под влиянием средних доз АДФ.

Влияние NO на свертывание крови. Учитывая, что мишенью для оксида азота являются лейкоциты, в частности моноциты, экспрессирующие тканевой фактор, мы исследовали влияние оксида азота на свертывание плазмы, полученной после инкубации цельной крови с L-аргинином и в присутствии бактериального ЛПС. Кроме этого мы наблюдали совместное действие L-аргинина и ЛПС.

Установлено, что внесение L-аргинина в нестимулированную цельную кровь здоровых доноров не изменяет прокоагулянтную активность плазмы в тестах времени рекальцификации, протромбиновом, тромбиновом времени и АЧ'ГВ (Р>0,05).

Выяснено, что после активации цельной крови бактериальным ЛПС, известным стимулятором экспрессии тканевого фактора, изменяются практически все показатели свертывания. Так, время рекальцификации составило 102,1 ± 3,0 сек, в то время как в контроле оного находилось на уровне 153,1 ± 2,4 сек (Р<0,001). При этом показатель экспрессии тканевого фактора достигал 33,2 £ 2,8 %. Одновременно с этим укорачивались протромби-новое время до 8,1 ± 0,1 сек против 12,1 ± 0,1 сек в контроле (Р<0,001), АЧТВ - до 19,6 ± 0,2 сек против 26,1 ± 0,4 сек в контроле (Р<0,001), тромбиновое время - до 14,3 ± 0,2 сек против 16,2 £ 0,2 сек (Р<0,001). Предварительное внесение L-аргинина в цельную кровь полностью отменяло действие про-дигиозана. Время рекальцификации увеличивалось до 244,5 ± 8,1 сек, в то время как в контроле оно находилось на уровне 153,1 ± 2,4 сек. При этом показатель экспрессии тканевого фактора принимал отрицательные значения и достигал -59,8 ± 4,8 %. Одновременно с этим удлинялись протромби-новое время до 16,1 ± 0,2 сек против 12,1 ± 0,1 сек в контроле (Р<0,001), АЧТВ - до 31,1 ± 0,2 сек против 26,1 ± 0,4 сек в контроле (Р<0,001), тромбиновое время - до 17,3 ± 0,2 сек против 16,2 ± 0,2 сек (Р<0,001).

Таким образом, оксид азота препятствует экспрессии тканевого фактора моноцитами и, тем самым замедляет коагуляцию крови.

Обнаружено, что в б-часовой культуре цельной гепаринизированной крови концентрация NO составляла 12,5 ± 5,1 мкг/мл, в меньшей степени в сгустке - 7,3 ±1,1 мкг/мл, а в фибринолизной крови - 0,8 ± 0,01 мкг/мл.

При внесении такую кровь в избытке L-аргинина в культуре поддерживается на постоянном уровне концентрация оксида азота, независимо от состояния крови. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в жидкой,

фибринолизной крови и сгустке сохраняется постоянно высокой активность N0-синтазы. В то же время снижение уровня оксида азота в сгустке и фибринолизной крови контрольных образцов связано с потреблением эндогенного субстрата для фермента. Особенно сильно потребляется Ь-аргинин в фибринолизной крови, в меньшей степени - в сгустке.

Влияние N0 на фибрннолитичсскую активность крови. Отмечено, что при внесении Ь-аргинина в плазму не изменялось время Хагеман-зависи-мого и эуглобулинового фибринолиза. Однако повышение концентрации оксида азота в цельной крови вызывало ускорение Хагеман-зависимого фибринолиза с 24,3 ±1,1 мин (в контроле) до 19,2 ± 0,8 мин (в опыте) (Р<0,01). Подобно этому укорачивалось время лизиса эуглобулинового сгустка с 150,3 ± 8,7 мин (в контроле) до 106,5 ± 5,1 мин (в опыте) (Р<0,001).

Влияние цнтокинов на синтез N0. При исследовании 4-х часовой культуры цельной гепаринизированной крови оказалось, что цитокины неодинаково действуют на продукцию оксида азота. Максимальная концентрация оксида азота выявлена в культуре в присутствии ИЛ-8 (125,2 ± 2,1 мкг/ мл против 28,2 ± 0,5 мкг/мл - в контроле, Р<0,001). Добавление ФНОа и ИЛ-1а также увеличивало синтез оксида азота клетками периферической крови и его уровень достигал 100,1 ± 1,6 мкг/мл и 100,9 ± 1,8 мкг/мл соответственно (Р<0,001).

В меньшей степени обнаруживалось усиление продукции оксида азота при внесении в культуру ИЛ-10 и И Фу. Так, под влиянием ИЛ-10 концентрация N0 в крови достигала 36,5 ± 0,7 мкг/мл, а ИФу - 37,0 ± 0,7 мкг/мл (Р<0,001). Присутствие в культуре крови противовоспалительного ИЛ-4 и ИФа тормозило синтез N0 до уровня 18,8 ± 0,3 мкг/мл и 15,5 ± 0,2 мкг/мл соответственно (Р<0,001).

Таким образом, Т\тО-продуцирующий ответ иммунокомпетентных клеток на медиаторы иммунитета различный и не зависит от того, относится он к про- или противовоспалительным цитокинам. Выбор клетки по какому пути - усилению или торможению - пойдет продукция оксида азота зависит от присутствия того или иного цитокина, экспрессии рецепторов к этим молекулам и их плейотропного действия.

Влияние N0 на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию. Обнаружено, что в часовой культуре цельной гепаринизированной крови на фоне добавления Ь-аргинина количество лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов снижалось до 6,1 ± 0,1 % по сравнению с контрольной группой (14,4 ± 0,6 %)(Р<0,001).

Полученные данные позволяют заключить, что влиянием оксида азота резко тормозится способность лимфоцитов к взаимодействию с тромбоцитами. Присутствие оксида азота в жидкой среде организма может лежать в основе развития феномена лейкоцитарной депрессии (Витковский Ю.А. и соавт., 1997). Его

механизм связан со вторым типом МО-синтетазы, которая приводит к прямому цитотоксическому эффекту. Обнаруживаемая цитотокснчность зависит от дальнейшего пути оксида азота что, вероятно, играет ключевую роль в развитии феномена лейкоцитарной депрессии.

Таким образом, проведенные исследования в опытах т у^го показывают, что оксид азота угнетает экспрессию тканевого фактора моноцитами периферической крови, тормозит опосредуемые клетками реакции свертывания, усиливает фибринолитическую активность крови, уменьшает лим-фоцитарно-тромбоцитарную адгезию.

Содержание оксида азота в плазме здоровых людей

Для того, чтобы определить нормальные величины концентрации оксида азота мы подобрали группу людей различного возраста: 5-13 лет, 13 -

18 лет, 19 -30 лет и 31 - 55 лет. Люди более старшего возраста вошли в группу клинического наблюдения, поскольку после 55 лет практически в 100 % случаев встречается атеросклерогическое поражение сосудов, а, как известно, атеросклероз меняет показатели уровня N0.

Полученные данные свидетельствуют, что концентрация оксида азота различается в зависимости от возраста людей. Так, максимальное содержание этого соединения наблюдалось в возрасте 5-12 лет и составляло 152,0 ± 16,2 мкг/мл. Далее с увеличением возраста продукция N0 снижалась и в

19 - 30 лет достигала минимальных значений (рис. 1). Старение организма сопровождалось увеличением уровня N0.

Следующей задачей исследования было выяснить, отличаются ли показатели оксида азота у мужчин и у женщин. Оказалось, что у женщин уровень плазменного N0 был выше, чем у мужчин и зависел от фазы менструального цикла. Выявлено, что у молодых женщин в секреторную фазу уровень оксида азота находился значительно выше, чем в пролиферативную и составлял 69,1 ± 6,6 мкг/ мл против 29,4 ± 2,6 мкг/мл (Р< 0,001). Однако максимальной концентрации N0

мкг/мл

160 140 120 100 | 80 ! 60 40

1 20 О

5-12 лет 13-18 лет 19-30лет 31-45лег 46-55 лет

Возраст

Рис. 1. Содержание оксида азота в крови в возрастном аспекте

достигал в период менструации (101,5 ± 10,2 мкг/мл, Р< 0,001). Это связано, прежде всего, с интенсивными процессами апоптоза в клетках эндометрия в секреторную фазу и фазу десквамации. А хорошо известно, что индуктором апоптоза клеток является оксид азота. Развившееся вокруг зоны отторжения воспаление приводит к присоединению иммунного и гемостатического компонентов и к клеточно-опосредованной активации индуцибельной формы ЬЮ-синтазы в макрофагах. Отек вокруг зоны десквамации инициирует активацию эндотели-альной ЫО-синтазы. Все эти процессы заканчиваются усиленным синтезом этим ферментом оксида азота различными линиями клеток. В пролиферативную фазу менструального цикла, когда процессы апоптоза резко заторможены, преобладает митотическая активность клеток и усиливается ангионеогенсз, уровень N0 существенно уменьшается. Продукция оксида азота зависит от гормонального фона в данный момент времени.

Выяснено, что одним из факторов, влияющих на продукцию оксида азота, является табакокурение. При исследовании утром натощак молодых людей-курильщиков обнаружено, что концентрация оксида азота в крови соответствует уровню некурящих. Однако после выкуренной первой сигареты утром содержание N0 резко повышается. При этом мы выявили прямую зависимость уровня N0 от длительности вредной привычки. Так, при сроке курения приблизительно три года, концентрация N0 была значительно выше, чем у тех людей, которые курили меньше года. Уровень оксида азота у курильщиков повышался в среднем в 3 - 6 раз по сравнению с некурящими. Так, этот показатель у некурящих студентов составлял 28,2 ± 0,5 мкг/мл, у курящих достигал 82,1 ± 5,0 мкг/мл.

Таким образом, нормальные показатели оксида азота варьируют в больших пределах и зависят о возраста, пола и физиологической нагрузки. В связи с этим при оценке уровня N0 должны строго учитываться индивидуальные особенности состояния органов и систем.

Продукция оксида азота у больных атеросклерозом Под наблюдением находилось 40 человек обоего пола в возрасте от 56 до 92 лет, у которых клинически подтвержден диагноз атеросклеротическо-го поражения сосудов. В качестве клинической модели осложнений атеросклероза выбрано ишемическое нарушение мозгового кровообращения. Исследования проводились среди больных в периоде острого инсульта, в раннем восстановительном периоде, в позднем восстановительном периоде и в периоде остаточных явлений.

Установлено, что концентрация оксида азота в острый период болезни достигала максимальных значений у больных в возрасте до 58 лет - 379,3 ± 18,8 мкг/ мл и в возрасте старше 58 лет - 451,5 ± 25,8 мкг/мл (Р< 0,001). По мере восстановления функций в раннем периоде наступало снижение продукции оксида азота до 250,5 ± 21,9 мкг/мл и в позднем - до 170,8 ± 11,2 мкг/мл (Р<0,001). В периоде

остаточных явлений у пациентов обнаруживалась постоянно высокая концентрация N0 - 132,6 ± 10,1 мкг/мл.

Учитывая то, что оксид азота влияет на прокоагулянтные свойства клеток и система гемостаза является одной из главных патогенетических звеньев атеросклероза и его осложнений, мы изучили экспрессию тканевого фактора моноцитами периферической крови у пациентов с нарушением мозгового кровообращения как осложнения атеросклероза.

С этой целью нами проводилась оценка времени коагуляции рекаль-цифицированной цельной крови после 4-х часовой инкубации в присутствии продигиозана. В качестве контроля служила нестимулированная культура крови. Но разности времени коагуляции стимулированной и нестимулпро-ванной крови мы судили о степени экспрессии тканевого фактора.

У пациентов в возрасте до 58 лет время коагуляции при активации цельной крови продигиозаном сокращалось на 11,4 ± 2,9 % (р < 0,001), а у людей старшей группы - на 6,7 ± 1,9 % (р < 0,001). Эти изменения связаны с укорочением времени свертывания нестимулированного образца крови, свидетельствующего о развитии гиперкоагуляции у больных острым ишемичес-ким инсультом. Сокращение разницы времени свертывания между нести-мулированной и стимулированной продигиозаном кровью проявлялось на фоне высоких показателей содержания оксида азота и ИЛ-1а, ИЛ-1 [5, ИЛ-8 и ФНОа у наблюдаемых больных.

По мере развития репаративных процессов в раннем восстановительном периоде у больных разница коагуляции увеличивалась до 28,5 ± 4,5 % (р2< 0,05), а в позднем - до 35,2 ± 3,3 % (р2> 0,05). В периоде остаточных явлений у больных этот показатель составлял 39,4 ± 3,7 (рг > 0,05). При этом отмечалось снижение продукции оксида азота до уровня контрольной группы, однако его концентрация не достигала показателя здоровых людей.

Продукция оксида азота у больных вирусным гепатитом С

Нами изучено содержание оксида азота у больных с клинически и ла-бораторно подтвержденным диагнозом гепатита С. Обнаружено, что в активную фазу заболевания концентрация N0 составила 288,5 ± 16,1 мкг/мл (Р < 0,001). У пациентов, находящихся в неактивной фазе гепатита С содержание оксида азота находилось на уровне 159,2 ± 10,1 мкг/мл (Р < 0,001).

Параллельно с этим нами прослежен показатель экспрессии тканевого фактора моноцитами периферической крови и продукция провоспалительных цитокинов больных гепатитом С в зависимости от фазы патологического процесса. Выявлено, что у пациентов в активную фазу заболевания повышена экспрессия тканевого фактора, о чем свидетельствует сокращение времени коагуляции плазмы на 23,1 ±2,2 % против 44,1 ±2,5 % у здоровых (Р<0,001). В неактивной фазе болезни этот показатель составил 42,5 ± 3,2 % (Р<0,05).

Подобная динамика отмечалась и для провоспалительных цитокинов. Так,

концентрация ИЛ-1а, ИЛ-1 (3, ИЛ-8 и ФНОа резко повышалась в активную фазу гепатита С, в неактивную снижалась, однако не достигала показателей здоровых лиц (Р<0,001), подобно уровню оксида азота.

Таким образом, гепатит С у больных сопровождается гиперпродукцией оксида азота, провоспалительных. цитокинов и повышенной экспрессией тканевого фактора, зависящих от фазы заболевания.

Продукция оксида азота у больных раком гортани

Известно, что при развитии онкологического процесса атипичные клетки теряют свою способность к апоптозу, одним из главных индукторов которого является оксид азота. В связи с этим нами прослежено, как изменяется уровень N0 у больных раком гортани и какое действие на продукцию оксида азота оказывает цитокинотерапия, в частности рекомбинантный интерлейкин-2 (ронколейкин*), который используют в комплексном лечении больных.

Как показали наши исследования при развитии опухолевого процесса в гортани при Т2 стадии уровень N0 повышается до 108,4 ± 32,6 мкг/мл (р < 0,01). Однако более тяжелое течение заболевания сопровождается более значительной концентрацией МО. Так у пациентов, которым поставлен диагноз опухолевого процесса Т3 содержание оксида азота возрастает до 670,4 ± 74,5 мкг/мл (р < 0,001), а больным с размерами опухоли Т. - до 1360,5 ± 268,7 мкг/мл (р < 0,001)

У таких пациентов одновременно с уровнем N0 исследована экспрессия тканевого фактора моноцитами периферической крови. Установлено, что в стадии заболевания Т2 (0) время коагуляции при активации цельной крови продигиозаном сокращалось на 24,3 ± 2,6 % (р < 0,001), а в Т3 стадии - на 10,3 ± 3,1 (р < 0,001). Более поздние стадии рака гортани Т4 сопровождались дальнейшим уменьшением этого показателя до 7,2 ± 2,6 % (р < 0,001). Эти изменения связаны с укорочением времени свертывания нестимулиро-ванного образца крови, свидетельствующего о развитии гиперкоагуляции у больных раком гортани. Сокращение разницы времени свертывания между нестимулированной и стимулированной продигиозаном кровью проявлялось на фоне высоких показателей содержания ИЛ-1а, ИЛ-1Р, ИЛ-8 и ФНОа у наблюдаемых больных (по данным Ильиных Л.В., 2001).

Введение рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) вызывает резкое снижение уровня оксида азота. При динамическом наблюдении у пациентов основной группы, леченной ронколейкином, обнаруживалось снижение содержания оксида азота, которое проявлялось на фоне повышения лимфоцитарно-тромбоци-тарной адгезии.

Таким образом, у больных раком гортани повышается продукция оксида азота, а применение рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) у них тормозит продукцию N0 и способствует лимфоцитарно-тробоцитарной адге-

ЗИП.

Содержание оксида азота в цереброспинальной жидкости детей, больных серозным и гнойным менингитом

Следующей задачей нашего исследования было изучение концентрации N0 в ликворе детей больных менингитом.

Обнаружено, что у здоровых детей в цереброспинальной жидкости оксид азота ие выявляется.

У больных детей гнойным менингитом максимальное содержание оксида азота определялось в пробах цереброспинальной жидкости в острую фазу заболевания с тяжелым течением процесса. У таких пациентов концентрация оксида азота в крови достигала 7,4 ± 0,4 мкг/мл. При средней степени тяжести уровень оксида азота находился на уровне 4,2 ± 0,002 мкг/ мл (Р <0,001). В периоде реконвалесценции концентрация оксида азота снижалась до 0,2 ± 0,002 мкг/мл (Р < 0,001).

При тяжелом течении серозного менингита наблюдалась менее выраженная продукция оксида азота - 0,2 ± 0,02 мкг/мл (Р < 0,001). У пациентов со среднетяжелым течением его уровень составлял 0,1 ± 0,01 мкг/мл (Р < 0,001). В стадию ремиссии серозного менингита концентрация N0 была минимальной и приближалась к нормальным показателям.

Одновременно с оксидом азота нами исследовано содержание цитоки-нов у больных с гнойными и серозными менингитами. При гнойном менингите обнаружено достоверное увеличение концентрации ИЛ-1р, ИЛ-8 и ФНОа (р<0,001)- В то же время серозный менингит характеризовался статистически значимым повышением уровня ИЛ-1а и в 15 раз превосходил гнойный менингит по содержанию ИЛ-1(3, хотя в этом случае уровень ИЛ-8 был в 3 раза меньше.

Таким образом, при развитии менингитов уровень оксид азота в лик-воре является маркером не только тяжести заболевания, но и периода его течения и соответствует гиперпродукции провоспалительных цитокинов.

Резюмируя все выше изложенное, можно утверждать, что продукция оксида азота зависит от тяжести патологического процесса и повышается одновременно с экспрессией тканевого фактора, продукцией провоспалительных цитокинов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что продукция N0 сопровождается изменениями реакций иммунитета и гемостаза у здоровых людей и у больных. В свою очередь оксид азота оказывает существенное влияние на защитные системы организма в норме и при развитии патологического процесса, обуславливая характер течения заболевания. Концептуальная схема роли N0 в регуляции иммунитета и гемостаза представлена на рис. 2.

Гнс. 2. Концептуальная схема влияния оксида, азота на систему иммунитета и гемостаза.

выводы

1. Оксид азота тормозит агрегацию тромбоцитов и лимфошпарно-тромбоци-тариую адгезию, угнетает экспрессию тканевого фактора моноцитами и увеличивает фибринолитическуго активность крови.

2. ИЛ-1 (5, ИЛ-8, ИЛ-10 и И4>у повышают продукцию оксида азота лейкоцитами, ИЛ-4 и ИФа вызывает противоположный эффект.

3. У здоровых женщин концентрация N0 в секреторную фазу менструального цикла и во время менструации увеличивается, а в фазу пролиферации - уменьшается.

4. Табакокурение усиливает продукцию оксида азота у молодых мужчин. Чем продолжительнее стаж курения, тем больше содержание N0.

5. При ишемическом осложнении атеросклероза - инсульте на фоне высокого уровня провоспалительных цитокинов, сопровождающегося экспрессией тканевого фактора, продукция N0 в остром периоде резко увеличивается, а в стадию остаточных явлений - снижается.

6. У больных гепатитом С концентрация оксида азота, провоспалительных цитокинов и экспрессия тканевого фактора в крови в активную фазу резко повышается, а в неактивную — снижается, но не достигает уровня, характерного для здоровых людей.

7. У больных раком гортани на фоне повышения содержания провоспалительных цитокинов, продукция оксида азота повышается, а лимфоцитарно-тром-боцитарная адгезия тормозится. Применение рекомбинантного ИЛ-2 (ронко-лейкина) приводит к снижению продукции N0 и способствует лимфоцитар-но-тробоцитарной адгезии.

8. При гнойном менингите у детей в острый период болезни, в цереброспинальной жидкости при повышенном содержании ИЛ-1 [}, ИЛ-8 и ФНОа оксид азота выявляется в низких концентрациях. В стадию выздоровления в ликво-ре больных одновременно со снижением уровня провоспалительных цитокинов наблюдается уменьшение НО. При серозном менингите только в острый период на фоне повышенного содержания ИЛ-1 Р, ИЛ-8 и ФНОа в цереброспинальной жидкости определяется оксид азота.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В качестве дополнительного лабораторного критерия диагностики обострения заболеваний, тяжести течения и оценки эффективности проводимого лечения рекомендуется определять содержание оксида азота. При динамическом наблюдении повышение оксида азота считается признаком, ухудшающим состояние больного.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Продукция оксида азота у больных с церебро-васкулярной патологией и при

рассеянном склерозе // Актуальные вопросы прикладной медицины. Тезисы докладов научно-практической конференции.- Чита, 2001- С. 79-80.

2. Продукция оксида азота у больных опийной наркоманией и сопутствующим

гепатитом С // Актуальные вопросы прикладной медицины. Тезисы докладов научно- практической конференции,- Чита, 2001.- С. 80-81. (Соавтор: Вы-рупаев К.В.).

3. Влияние ронколейкина на продукцию провоспалительных цитокинов и про-

дукцию оксида азота у больных раком гортани // «Современные вопросы диагностики и лечения». Сб.науч.трудов. - Чита, 2001 - С.77-79 (Соавтор: Ильиных Л.В.).

4. Содержание оксида азота у больных с церебро-васкулярной патологией и при

рассеянном склерозе// Забайкальский медицинский всстник. - 2001. - № 2. -С.13.

5. Production of nitric oxide in patient with cerebrovascular disease and multiple sclerosis //

Thrombosis and Haemostasis. Suppl., 2001. - P. 275 (Соавтор: Витковский Ю.А.).

6. Влияние различных цитокинов на синтез оксида азота// Проблемы биорегули-

рующей терапии в эксперименте и клинике: Сб. науч. трудов. - Чита.- 2002. -С. 8 (Соавтор: Витковский Ю.А.).

7. Влияние оксида азота на реакцию лимфоцитарно-тромбоцитарного розетко-

образования // Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике: Сб. науч.трудов. - Чита. - 2002. - С. 9. (Соавтор: Витковский Ю.А.).

8. Исследование уровня оксида азота в цереброспинальной жидкости детей с

серозным и гнойным менингитом И Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике: Сб. науч. трудов. - Чита. - 2002. - С. 81 (Соавтор: Папава К.М.).

9. Роль оксида азота в регуляции физиологических функций М, 2002. - Деп. в

ВИНИТИ. - № 247 - В2002.

10. Cytokine effects on nitric oxide synthesis // Nitric Oxide: Biology and Chemistty. - 2002. -V.6.-N.4.-P.413.

11. 11. Cytokine effects on lymphocyte-platelet adhesion // Haemostasis. - 2002. 17й' International Congress on Thrombosis. Bologna - 2002. - P. 65 (Соавторы: Витковский Ю.А., Солпов A.B., Кузник Б.И.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ИЛ - интерлейкин

ИФ - интерферон

кД - килодальтон

ЛПС - липополисахарид

ММ - молекулярная масса

ФИО - фактор некроза опухолей

Лицензия ИД №03077 от 23.10.00. Сдано в набор 05.11.02. Подписано в печать 05.11.02. Бумага офсетная. Формат 60 х 84 '/15. Тираж 100. Заказ 592002.

Отпечатано в информационно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39а.