Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование реакции специфической адгезии лимфоцитов в модельных опытах и при инфекциях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование реакции специфической адгезии лимфоцитов в модельных опытах и при инфекциях"

На правах рукописи

_ £ и »и

0 к. I г«и

Казанцева Людмила Геннадьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕАКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АДГЕЗИИ ЛИМФОЦИТОВ В МОДЕЛЬНЫХ ОПЫТАХ И ПРИ ИНФЕКЦИЯХ

03. 00. 07. - микробиология

14. 00. 36. - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь - 1997

Работа выполнена в Пермской государственной медицинской академии

Научный руководитель -

доктор медицинских наук, профессор В.Н.Каплин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Э.С.Горовиц, доктор медицинских наук С.В.Ширшев

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Защита диссертации состоится апреля 1997 г. в /Л часов на заседании диссертационного совета К 200. 46. 01. при Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г.Пермь, ул.Голева, 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан "<¿1 " марта 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, у ^

старший научный сотрудник ^сА^сх-«-—-—И.Б.Ившипа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Экспериментальными и клиническими исследованиями, большинство из которых проводилось коллективом кафедры патофизиологии Пермской медицинской академии, было показано, что наряду с классической иммунной реакцией существует принципиально иная форма специфического реагирования - экстренные антимикробные реакции клеток крови (В.Н.Каплин, 1966-1996). К реакциям такого типа относят специфические' изменения фагоцитарной активности лейкоцитов, антиген-связывающей способности эритроцитов, бактериофиксирующей активности крови и титров антител. Эти реакции отличает быстрота возникновения - первые минуты при воспроизведении их in vitro и первые дни инфекций у людей. Длительность этих реакций ограничена временем контакта клеток крови с микробными субстанциями. Реакции индуцируются прямым действием на клетки растворимых субстанций микробов - липополисахаридов (ЛПС) и полисахаридов (ПСХ). Характерной чертой экстренной формы реагирования, проявляющейся усилением взаимодействия клеток со специфическим объектом, является одновременное угнетение реакции в отношении неспецифических объектов.

Изучение закономерностей формирования экстренно возникающих антимикробных реакций позволило создать ряд принципиально новых методических подходов к диагностике инфекций, основанных на определении и оценке реакции по соотношению ее специфического и неспецифического компонента (И.П.Корюкина, 1982, Л.В.Шалгина, Г.И.Лузина, 1987, ЛЛ.Санакоева, 1988, Л.Н.Шляпникова, 1989, А.Х.Мамунц с соавт. , 1992, В-Н.Каплин, 1996, и др.).

Значительное внимание привлекало исследование экстренной специфической реакции лимфоцитов, которая была воспроизведена в модельных опытах и выявлена в раннем периоде инфекций. Экспериментальными исследованиями на животных и клиническими наблюдениями было установлено раннее появление специфических розеткообразующих лимфоцитов (РОЛ) - спустя 30-60 мин после заражения или иммунизации лабораторных животных и в первые три дня инфекций у людей (ВЖМинаева с соавт., 1987, Л.П.Быкова, 1988, Л.А.Прасолова, 1990, А.С.Закс с соавт., 1993, и др.). Однако механизм этой реакции остается не совсем ясным.

Определение реакции специфической адгезии лимфоцитов, известной как иммунное розеткообразование (РО), используется в диагностике инфекций. Однако метод иммунного РО не стандартизован и многоэтапен. Главным фактором, снижающим его диагностическую ценность, является отсутствие унифицированного количественного критерия оценки реакции. Этим определяется актуальность настоящего исследования.

Целью работы явилось совершенствование определения реакции специфической адгезии лимфоцитов, изучение закономерностей ее формирования в модельных опытах in vitro и при инфекциях и повышение эффективности иммунодиагностики инфекций.

Задачи исследования.

1. Разработать метрд определения реакции специфической адгезии лимфоцитов и ее оценки по соотношению адгезии специфического и неспецифического объектов.

2. Изучить закономерности формирования in vitro экстренной реакции специфической адгезии лимфоцитов при взаимодействии лейкоцитарной взвеси доноров с растворимыми субстанциями микробов.

3. Изучить закономерности реакции специфической адгезии лимфоцитов в начальном периоде инфекций - туберкулеза и ши-геллеза.

4. Усовершенствовать раннюю диагностику инфекций на основе исследования реакции специфической адгезии лимфоцитов.

Научная новизна. На основе нового методического подхода изучены закономерности формирования in vitro экстренной реакции специфической адгезии лимфоцитор.

Установлена неантигенная природа этой реакции.

Выявлены новые закономерности формирования реакции специфической адгезии лимфоцитов при туберкулезной и шигел-лезной инфекциях.

Практическая ценность и внедрение. Разработан новый метод определения реакции специфической адгезии лимфоцитов, позволяющий унифицировать ее оценку и использовать единый диагностический критерий при разных инфекциях. Предложенный метод позволяет осуществлять эффективную диагностику туберкулеза и шигеллеза в начальном периоде заболевания.

Фрагменты исследования включены, в монографию В.Н.Каплина "Нетрадиционная иммунология инфекций" (Пермь, 1996).

По материалам работы подана заявка на изобретение "Способ иммунодиагностики инфекций" (приоритетная справка №96118905 от 23.09.96.).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Оригинальный метод исследования реакции специфической адгезии лимфоцитов с оценкой реакции по соотношению адгезии специфического и неспецифического объектов.

2. Закономерности формирования экстренной реакции специфической адгезии лимфоцитов при ее воспроизведении in vitro.

3. Закономерности формирования реакции специфической адгезии лимфоцитов в начальном периоде туберкулезной и шигел-лезной инфекций.

4. Эффективность метода определения реакции специфической адгезии лимфоцитов в ранней диагностике туберкулеза и шигеллеза.

Апробация работы. Работа выполнена на кафедре патологической физиологии Цермской медицинской академии и является частью комплексного исследования "Разработка новых методов иммунологического исследования и ранняя иммунологическая диагностика инфекций и деструктивных процессов во внутренних органах"^ госрегистрации темы 12820080720).

По материалам исследования сделаны сообщения на Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилак-тики"(Пермь, 1993), на заседании научной проблемной комиссии ПГМА "Общая и прикладная иммунология"(Пермь, 1993), на межрегиональной учебно-методической конференции "Преподавание в медицинском вузе вопросов профилактики и здоровья и его реабилитации" (Пермь, 1994), на IX иммунологической конференции ПГМА (Пермь, 1994), на конференции молодых ученых, посвященной 80-летию ПГМА (Пермь, 1996), на совместном заседании кафедр микробиологии и патофизиологии ПГМА (Пермь, 1996), на заседании лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь, 1997).

По итогам конкурса на лучшую научную работу молодых ученых Пермской медицинской академии (1996) работа отмечена дипломом III степени.

Публикации. Основные положения работы представлены в 5 научных публикациях.

Объем работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, двух глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиографический указатель включает ссылки на 162 отечественных и 54 зарубежных

источника. Работа содержит 17 таблиц, иллюстрирована 2 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАЦИЕ РАБОТЫ Материалы и методы цсследования

В модельных опытах использовали кровь 26 доноров. Забор крови осуществляли на Пермской областной станции переливания крови.

Клинические исследования проведены с кровью 31 больного в возрасте от 22 до 71 года с первичным активным туберкулезом легких. У всех больных диагноз туберкулеза был подтвержден бактериологическим методом. Исследования проводили на базе Пермского муниципального объединения "Фтизиопульмонология".

Контролем служила группа из 10 больных в возрасте от 32 до 59 лет с бронхолегочной патологией нетуберкулезной этиологии. В нее вошли 5 больных с острой пневмонией, 4 с острым бронхитом и 1 с ОРЗ. Исследования проводились на базе МСЧ №4 г.Перми.

В группу больных инфекциями вошли также 13 детей в возрасте от 1,6 до 10 лет с острым шигеллезом. У 7 из них диагноз шигеллеза Зонне был подтвержден бактериологически.

Контрольную группу составили 10 детей в возрасте от 2 до 12 лет с сальмонеллезом, энтеритом протозойной этиологии, псевдомо-ниозом, ОРВИ. Все больные находились на обследовании и лечении в ДГКБ №10 г.Перми*

Для исследования реакции специфической адгезии лимфоцитов использовали оригинальный метод, заключающийся в одновременном определении адгезии специфического и неспецифического объектов и оценке реакции по соотношению уровней адгезии двух объектов.

В качестве объектов адгезии использовали эритроциты сухих коммерческих антигенных эритроцитарных диагностикумов (ЭД) для РПГА из шигелл Зонне (Аг Зон), Флекснера (Аг Фл) и туберкулезного фосфатида (Аг ТФ) (производства С.-Петербургского НИИВС). С помощью этих диагностикумов определяли иммунную реакцию. Для выявления экстренной реакции специфической адгезии лимфоцитов использовали диагностикумы с комплексом "антиген-антитело", приготовленные на основе антигенных диагно-

Автор выражает благодарность за помощь в организации клинических исследований заведующей отделением ПМО"Фтизиопульмонология" Елене Геннадьевне Новиковой, профессору Владимиру Аристарховичу Черкасову, ассистенту кафедры детских болезней ПГМА Ульяне Тарасовне Гилевой и доценту кафедры пропедевтики внутренних болезней Валентине Петровне Варгановой.

стикумов из шигелл Зонне (Аг+Ат+ЛПС Зон), Флекснера (Аг+Ат+JIIIC Фл) и туберкулезного фосфатида (Аг+Ат+ТФ). Приготовление диагностикумов с комплексом "антиген-антитело" проводили путем присоединения к антигенному ЭД соответствующей иммунной сыворотки с последующим присоединением надоса-дочной жидкости (НЖ) бактериального диагйостикума (БД) (В.Н.Каплин, 1991). С этой целью использовали БД из шигелл Зонне и Флекснера (производства Ташкентского НИИВС) и сухую вакцину БЦЖ (производства Ставропольского НИИВС).

При моделировании in vitro экстренной реакции специфической адгезии лимфоцитов лейкоцитарную взвесь доноров, полученную путем спонтанной седиментации при комнатной температуре, в объеме 10 мкл помещали в микропробирки. В пробу с индукцией реакции добавляли 1 мкл НЖ бактериального диагностикума из шигелл Зонне или вакцины БЦЖ активностью в РТПГА 0,01 АЕ/мл. В контрольную пробу вносили 1 мкл физраствора. Смесь встряхивали и инкубировали в термостате при 37°С 30 мин. Реакцию ставили в одном из двух вариантов. При одновременном исследовании адгезии специфического (соответствующего виду индуцировавшего реакцию микроба) и неспецифического ЭД в одной пробе брали смесь двух ЭД, окрашенных анилиновыми красителями в разные цвета. В этом случае к 10 мкл лейкоцитарной взвеси добавляли 10 мкл взятых в равных пропорциях разноокрашенных ЭД с концентрацией эритроцитов 100 млн/мл. При раздельном определении адгезии каждого вида диагностикума к лейкоцитарной взвеси добавляли 10 мкл ЭД с концентрацией эритроцитов 50 млн/мл. Полученную смесь встряхивали и помещали в термостат на 12 мин, после чего ее перемешивали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 1 мин. Супернатант в объеме 10 мкл удаляли, осадок осторожно ресуспендировали и готовили из него мазки. Для изготовления мазков применяли оригинальное микроустройство, позволяющее делать на одном предметном стекле 10-12 параллельных мазков размером 18x3 мм (В.Н.Каплин с соавт., 1987). Мазки фиксировали метиловым спиртом и окрашивали по Романовско-му-Гимзе. Площадь каждого мазка условно делили на три части. В сравнительно тонких участках мазка подсчитывали 200 лимфоцитов и определяли следующие показатели адгезии: общую сумму адгезии - число объектов, адгезированных 200 лимфоцитами, содержание РОЛ (за РОЛ принимали лимфоциты, адгезирующие 3 и более объекта независимо от места прикрепления последних к поверхности клетки), сумму адгезии РОЛ - число объектов, адгезированных розеткообразующими лимфоцитами, а также сумму адгезии лимфоцитами, адгезирующими 1-2 объекта (Л 1-2).

Оценку реакции проводили по индексу специфической адгезии (ИСА), представляющему собой соотношение адгезии специфи-

ческого и неспецифического объекта в пробе с индукцией и в контроле. ИСА рассчитывали отдельно по показателям общей суммы адгезии и суммы адгезии РОЛ по формуле:

ИНД ИНД

А-сп / -Анесп

ИСА =--,

Асп / -А-несп

где А™д и А„есп - показатели адгезии специфического (от) и неспецифического (несп) объектов в пробах с индукцией,

АсП и Анесп - показатели адгезии этих объектов в контрольных пробах.

В ходе исследования были установлены контрольные величины ИСА: 1,85 для индекса, рассчитанного по показателям общей суммы адгезии, и 2,17 для индекса, рассчитанного по показателям суммы адгезии РОЛ.

Другим вариантом индекса специфической адгезии был индекс, отражающий соотношение адгезии РОЛ и лимфоцитами, ад-гезирующими 1-2 объекта. Его обозначили как ИСА* и рассчитывали по формуле:

РОЛ РОЛ

АСп / Анесп ИСА* =--—— ,

Л1-2 Л1-2 ' АСп / Анесп

где А™л и ^несл ■ показатели адгезии РОЛ специфического (сп) и неспецифического (несп) объектов,

А;?п"2 и А^сп - показатели адгезии этих объектов лимфоцитами с уровнем адгезии 1-2 объекта.

Установленная в ходе исследования контрольная величина ИСА* составила 1,77.

Особенностью клинических исследований было одновременное определение реакции специфической адгезии лимфоцитов у больных инфекциями и доноров с использованием одинакового набора диагностикумов. Реакцию оценивали по индексам специфической адгезии, формулы расчета которых аналогичны представленным ранее.

Статистическую обработку материала проводили методом вариационной статистики (Е.В.Монцевичуте-Эрингене, 1964), а также по непараметрическим критериям (Е.В.Гублер, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Обоснование новых методических подходов к исследованию реакции специфической адгезии лимфоцитов

При разработке метода определения адгезивной способности лимфоцитов (АСЛ) использовали различные параметры временной экспозиции, центрифугирования, температурного режима. Однако наблюдения показали, что оптимальными являются приведенные при описании метода.

При исследовании АСЛ доноров отметили значительную вариабельность показателей адгезии в их абсолютном выражении. Наибольший диапазон колебаний наблюдали у показателей адгезии РОЛ - максимальные значения могли отличаться от минимальных в 10 и более раз. Это свидетельствовало, что оценка реакци специфической адгезии по абсолютной величине, в том числе, по содержанию РОЛ, малоинформативна.

В то же время была обнаружена высокая степень корреляции (г=0,09, р<0,01) между уровнями адгезии различных объектов. Это послужило основанием для применения нового методического подхода к оценке реакции, основанного на определении соотношения адгезии двух объектов - специфического и неспецифического. Это соотношение отражал индекс специфической адгезии. При сопоставлении показателей адгезии у пар доноров были установлены контрольные величины ИСА, превышение которых служило критерием специфической реакции.

Другим вариантом индекса специфической адгезии был индекс, отражающий соотношение адгезии РОЛ и лимфоцитов, адге-зирующих 1-2 объекта (ИСА*). Основанием для его расчета послужило установление того факта, что специфическая реакция осуществляется РОЛ, а лимфоциты с уровнем адгезии 1-2 объекта в ней практически не участвуют.

Следует отметить, что для расчета контрольных величин индексов брали только те пробы, где уровень адгезии РОЛ был не менее 10 объектов.

В процессе исследования обнаружили влияние ряда методических моментов на получаемые результаты.

Так, отметили, что уровень адгезии РОЛ находится в строгой зависимости от толщины мазка: в толстых участках мазка, где содержание лимфоцитов превышает 20 в поле зрения, уровень адгезии РОЛ в 2 раза превосходил аналогичный показатель в тонких участках (р<0,05, Т=0). При этом резко возрастала неспецифическая адгезия, что могло приводить к неправильной трактовке полу-

чаемых результатов. Во избежание этого подсчет лимфоцитов проводили только в тонких участках мазка.

Наблюдения показали, что присутствие большого количества собственных эритроцитов в лейкоцитарной взвеси резко угнетает адгезию РОЛ. Поэтому при получении лейкоцитарной взвеси обращали особое внимание на предупреждение попадания в нее эритроцитов.

В процессе исследования обнаружили, что чрезвычайно высокой адгезивной способностью обладают поврежденные лимфоциты, что, вероятно, связано с высвобождением из них при повреждении липких молекул ДНК (Дж.Клаус, 1990). Это сопровождалось значительным усилением неспецифической адгезии. Поэтому при определении специфической реакции из учета исключали адгезию поврежденными лимфоцитами.

Следует отметить, что при разработке метода исследования реакции специфической адгезии лимфоцитов старались избежать многоэтапности и максимально приблизить условия ее воспроизведения к естественным условиям организма.

Адгезивная способность лимфоцитов доноров при индукции реакции in vitro растворимой субстанцией шигелл Зонне

После контакта in vitro лейкоцитарной взвеси доноров с микроколичествами растворимой субстанции шигелл Зонне отметили повышение адгезии специфического объекта с комплексом Аг+Ат+ЛПС Зон, главным образом, у РОЛ (М±т 12+2 в контрольных пробах и 24+3 в пробах с индукцией, р<0,01) (табл.1). Что касалось лимфоцитов с уровнем адгезии 1-2 объекта, то с их стороны реакции не было (М+т 38+4 в контроле и 43+3 после индукции реакции). Одновременно выявили снижение адгезии неспецифического диагностикума из туберкулезного фосфатида, а также антигенного диагностикума из шигелл Зонне.

Интересно отметить, что сумма адгезированных объектов -специфического и неспецифического - в контрольных пробах и в пробах с индукцией оставалась неизменной. Так, если исходное суммарное значение адгезии РОЛ объекта с комплексом Аг+Ат+ЛПС Зон и диагностикума из туберкулезного фосфатида равнялось 36 (12 и 24 соответственно), то после индукции реакции оно составило 37 (24 и 13). Однако при этом изменилось соотношение уровней адгезии этих объектов в сторону повышения адгезии диагностикума с комплексом Аг+Ат+ЛПС Зон и одновременного уменьшения адгезии диагностикума из туберкулезного фосфатида. Это подтверждало необходимость оценки реакции по соотношению адгезии двух объектов, т.е. по индексу специфической адгезии.

Таблица 1

Адгезивная способность лимфоцитов доноров при индукции реакции in vitro растворимой субстанцией шигелл Зоннс (п=12) (М+ш, в скобках пределы колебаний)

Показатели Объекты адгезии

адгезии Аг+Ат-ЬЛПС Зон Аг Зон Аг ТФ

контрольная проба проба с индукцией разница в % контрольная проба проба с индукцией разница в % контрольная проба проба с индукцией разница в %

Общая сумма адгезии 52+5 (36-80) 67+6 (35-109) 129 68+8 (27-111) 55+5 (27-102) 81 63+4 (33-85) 49+3 (28-71) 78

Сумма адгезии РОЛ 12+2 (3-35) 24+3** (7-50) 195 30±3 (9-50) 11+2** (0-32) 36 24+3 (3-45) 13±3* (0-30) 56

Сумма адгезии Л 1-2 40+3 (27-60) 43+ 5 (25-64) 98 38+4 (17-69) 44+3 (31-70) 116 39+3 (21-62) 36+2 (19-49) 99

Примечание. Здесь и в следующей таблице ** - р < 0,01, * - р < 0,05 в сравнении с показателями контрольных проб.

Учет реакции по ИСА показал, что специфическая реакция имеет место даже при невысоких значениях адгезии специфического объекта, в то время как высокие абсолютные величины ACJI не являются ее достоверным признаком. При этом величина ИСА не зависит от величины адгезии в ее абсолютном выражении. Расчет ИСА позволил выявить такой вариант реакции, когда она осуществлялась только за счет снижения адгезии неспецифического объекта при сохранении на исходном уровне адгезии специфического объекта. Реакция такой направленности не доступна выявлению общепринятым способом, основанным на определении содержания специфических РОЛ.

Исследования показали, что для определения экстренной реакции лимфоцитов эффективен диагностикум с комплексом "антиген-антитело". При расчете ИСА по уровню адгезии объекта с Аг+Ат+ЛПС Зон реакцию удалось выявить в 7-и пробах, т.е. в 100% при анализе проб, где уровень адгезии РОЛ был не менее 10 объектов.

Как отмечалось ранее, специфическая реакция осуществляется РОЛ, а лимфоциты с низким уровнем адгезии в ней не участвуют. Расчет ИСА*, отражающего соотношение уровней адгезии специфического объекта с Аг+Ат+ЛПС Зон розеткообразующими лимфоцитами и лимфоцитами, адгезирующими 1-2 объекта, дал положительные результаты в 10-и пробах (83%) (М+т 3,7+0,1, р<0,01 в сравнении с показателями в контрольных пробах).

Детальный анализ полученных данных позволил выявить интересную закономерность: в тех случаях, когда число лимфоцитов, адгезирующих 3 и более объекта, было невысоким (1-3 РОЛ при подсчете 200 лимфоцитов), специфическая реакция проявлялась также у лимфоцитов с уровнем адгезии 2 объекта. И, напротив, при высоком содержании РОЛ лимфоциты, адгезирующие 3 объекта, проявляли неспецифическую активность и не могли считаться истинными РОЛ. В подобных случаях специфическая реакция осуществлялась лимфоцитами, адгезирующими 4 и более объекта.

Адгезивная способность лимфоцитов доноров при индукции реакции in vitro вакциной БЦЖ

Особенностью этой серии опытов (п=14) было использование в одной пробе двух разноокрашенных диагностикумов - специфического и неспецифического.

При анализе полученных результатов были установлены те же закономерности формирования экстренной реакции специфической адгезии лимфоцитов, что и в опытах с индукцией реакции растворимой субстанцией шигелл Зонне.

Суммарная адгезия после индукции реакции практически не изменилась. Так, адгезия РОЛ специфического и неспецифического объектов в контроле составила 26 (12 и 14), а в пробах с индукцией - 23 (15 и 8). Однако при этом произошло перераспределение общего потенциала адгезивной активности лимфоцитов, заключающееся в увеличении доли адгезии специфического объекта (65%) за счет уменьшения доли адгезии неспецифического объекта (35%). Стоит отметить, что эта закономерность была характерна только для РОЛ. Интересно, что при незначительном повышении адгезии РОЛ специфического объекта с Аг+Ат+ТФ (М±т 12+3 в контроле и 15+3 после индукции) наблюдалось выраженное угнетение неспецифической адгезии (М+ш 14+5 в контроле и 8+3 в пробах с индукцией). При расчете ИСА, отражающего соотношение адгезии РОЛ двух диагностикумов, положительные результаты получили в 10-и пробах (71%). В то же время ИСА, рассчитанный по показателям общей суммы адгезии, позволил выявить реакцию только в 3-х пробах (21%). Это подтвердило установленный ранее факт, что за развитие специфической реакции ответственны РОЛ. Индекс, отражающий соотношение адгезии РОЛ и лимфоцитов, адгезирующих 1-2 объекта, дал положительные результаты в 10-и пробах (71%). Оценка реакции по абсолютной величине, в частности, по содержанию РОЛ, была малоинформативна", положительные результаты получили менее чем в 25%.

Реакция специфической адгезии лимфоцитов у больных туберкулезом

При исследовании реакции специфической адгезии лимфоцитов у больных туберкулезом обнаружили незначительное повышение адгезии специфических объектов из туберкулезного фосфатида (Аг+Ат+ТФ и Аг ТФ) при одновременном выраженном снижении неспецифической адгезии (табл.2). Наиболее ярко эти закономерности проявлялись у РОЛ. Так, если в контрольной группе адгезия неспецифического объекта РОЛ составила 77+17, то у больных туберкулезом ее уровень был в три раза ниже (26+3). Из-за большой вариабельности абсолютных величин адгезии в исследуемой и контрольной группах дифференцировать туберкулез от неспецифической патологии на основании учета показателей АСЛ в их абсолютном выражении было сложно. В то же время анализ соотношения адгезии специфического и неспецифического объектов выявил закономерности, характерные для больных туберкулезом (рис.1). При расчете ИСА по соотношению адгезии РОЛ специфического объекта с комплексом Аг+Ат+ТФ и неспецифического шигеллезного объекта специфическая реакция была определена у 20-и больных (65%). Как показали наблюдения, она обнаружива-

Таблица 2

Адгезивная способность лимфоцитов и индексы специфической адгезии у больных туберкулезом (п=31)

(М+т, в скобках пределы колебаний)

Показатели Объекты адгезии ИСА при расчете по соотношению адгезии РОЛ и Л 1-2 объектов

адгезии Аг+Ат+ТФ Аг ТФ Аг+АТ+ЛПС Зон Аг+Ат+ТФ Аг ТФ

Общая сумма адгезии 144+13 (58-273) 106+11 (18-211) 95+7 (36-223) 3,0+0,5** [22] (0,8-11,7) 1,7+0,3** [10] (0,2-8,1)

125+11 (42-209) 87+19 (44-218) 163+18 (62-306) 0,6+0,1 (0,04-2,0) 0,4+0,1 (0,03-0,7)

Сумма адгезии РОЛ 62+9 (7-183) 35+7 (0-112) 26+3 (0-111)

51+13 (0-113) 26+9 (0-102) 77+17 (26-202)

Примечания. В числителе указаны значения показателей адгезии у больных туберкулезом, в знаменателе-контрольной группы, В квадратных скобках указано количество положительных результатов. При расчете ИСА нулевой показатель адгезии принимали за единицу. Средняя величина МСА рассчитана по сумме индивидуальных показателей.

(

лась и при невысоком уровне адгезии специфического объекта. При этом высокие величины адгезии не являлись достоверным признаком специфической реакции. Новый подход к оценке реакции, основанный на определении соотношения уровней адгезии специфического и неспецифического объектов, дал возможность обнаружить такой вариант реакции, при котором специфические изменения проявлялись только снижением адгезии неспецифического объекта. Как правило, такой вариант реаквдш не удается выявить общепринятым методом, основанном на определении взаимодействия лимфоцитов только со специфическим объектом. Исследования показали, что наиболее эффективен для определения специфической реакции лимфоцитов диагностикум с комплексом "антиген-антитело". Индекс, отражающий соотношение адгезии объекта с комплексом Аг+Ат+ТФ розеткообразующими лимфоцитами и лимфоцитами с низким уровнем адгезии, дал положительные результаты у 22 больных (71%). В то же время при расчете ИСА по показателям адгезии антигенного диагностикума из ТФ положительные результаты получили только у 10-и больных (32%). Стоит отметить, что на основании учета абсолютных величин адгезии, в частности, содержания РОЛ, реакцию обнаружили только у 6-и больных (19%). Таким образом, расчет ИСА повысил эффективность определения реакции специфической адгезии лимфоцитов более чем в три раза.

Реакция специфической адгезии лимфоцитов у больных острым шигеллезом

При исследовании АСЛ больных острым шигеллезом выявили умеренное повышение адгезии специфического объекта с комплексом Аг+Ат+ЛПС Зон, особенно, у РОЛ (М±ш 104+24 у больных шигеллезом и 70+12 в контрольной группе). При этом уровень адгезии неспецифических объектов из шигелл Флекснера у больных с бактериологически подтвержденным диагнозом шигеллеза Зонне не отличался от контроля, а в группе больных без бактериологического подтверждения этой инфекции был снижен (М+т 43+16 у больных шигеллезом и 74+11 в контроле). На основании учета показателей адгезии в их абсолютном выражении специфическую реакцию обнаружить не удавалось. Для ее определения рассчитывали ИСА. Как и в предыдущих исследованиях, наиболее информативным оказался ИСА, рассчитанный по показателям адгезии РОЛ диагностикума с комплексом Аг+Ат+ЛПС Зон. При его расчете положительные результаты были получены у 71% больных в группе с бактериологически подтвержденным диагнозом шигеллеза и у 83% больных с отрицательными результатами бактерио-

логического исследования. Расчет ИСА*, отражающего соотношение адгезии РОЛ и лимфоцитов с уровнем адгезии 1-2 объекта, выявил специфическую реакцию у 57% больных с бактериологическим подтверждением шигеллеза Зонне и у 67% в группе без бактериологического подтверждения шигеллезной инфекции.

Обобщая данные, полученные в экспериментальных и клинических исследованиях, можно сделать заключение, что лимфоциты, помимо участия в иммунной реакции, способны к экстренной специфической перестройке совей активности в ответ на прямое действие растворимых субстанций микробов. Эта форма реакции заключается в специфическом изменении их адгезивной способности.

Как показали наблюдения, для экстренной реакции специфической адгезии лимфоцитов характерны те же особенности, что и для аналогичных реакций со стороны фагоцитов и эритроцитов, а именно: быстрота возникновения, неизменность общего потенциала антимикробной активности при изменении соотношения доли специфического и неспецифического компонента реакции, эффективность для ее выявления диагностикума с комплексом "антиген-антитело".

Для объяснения механизма экстренно возникающих антимикробных реакций фагоцитов и эритроцитов В.Н.Каплиным (1996) было высказано предположение, что в их развитии принимает участие лиганд-рецепторное взаимодействие, а также матричное преобразование расположения рецепторов. По-видимому, этот же механизм лежит и в основе формирования экстренной реакции специфической адгезии лимфоцитов. Вероятно, она реализуется через молекулы клеточной адгезии ( В.А.Боценовский с соавт., 1994, Т-КишипоИ е1 а1., 1995, А.В.Александров с соавт., 1997, и др. ). Можно предположить, что подобного рода реакции могут быть воспроизведены с любыми другими клетками организма.

Однонаправленность экстренных антимикробных реакций клеток крови, проявляющаяся в снижении их способности к взаимодействию с неспецифическими объектами при одновременном усилении активности в отношении специфического объекта, дает основание предположить, что все эти реакции формируются по одному принципу и подчиняются общефизиологическим закономерностям, в частности, универсальному закону сопряженности возбуждения и торможения ( И.П.Павлов, 1949, А.А.Ухтомский, 1951, П.Ф.Здродовский, 1972). По-видимому, торможение реакции лимфоцитов в отношении неспецифических объектов носит защитно-приспособительный характер и направлено на усиление адгезии специфического объекта.

выводы

1. Оценка реакции специфического розеткообразования лимфоцитов по абсолютной величине адгезии сложна из-за большой вариабельности уровня адгезии, зависящей от индивидуальных особенностей организма и от методических моментов - толщины мазка, количества эритроцитов в лейкоцитарной взвеси, наличия поврежденных лимфоцитов.

2. Для повышения эффективности определения реакции специфической адгезии лимфоцитов разработана оригинальная методика с оценкой реакции по соотношению уровней адгезии специфического и неспецифического эритроцитарных диагностикумов. Новый методический подход дает возможность использовать унифицированный количественный критерий оценки реакции в форме индекса специфической адгезии.

3. При взаимодействии in vitro лейкоцитарной взвеси доноров с надосадочной жидкостью бактериального диагностикума из ши-гелл Зонне и вакцины БЦЖ установлено возникновение экстренной реакции специфической адгезии лимфоцитов, проявляющейся повышением адгезии специфического объекта и снижением неспецифической адгезии. При расчете индекса специфической адгезии реакция выявлена во всех исследованиях.

4. У больных с первичным активным туберкулезом легких обнаружена специфическая реакция лимфоцитов, проявляющаяся умеренным повышением адгезии специфического объекта и выраженным снижением адгезии неспецифического объекта. Реакция проявляется преимущественно в отношении объекта, содержащего комплекс "антиген-антитело" и определена у 70% больных.

5. У больных с острым шигеллезом Зонне в начальном периоде инфекции выявлена специфическая реакция лимфоцитов, проявляющаяся в разнонаправленном изменении адгезии специфического и неспецифического объектов. Реакция определена у 70% больных. Наиболее эффективен для ее выявления диагностикум с комплексом "антиген-антитело".

6. При исследовании специфической адгезии лимфоцитов выявлены две формы реакции. В начальной стадии взаимодействия с микробами реакция индуцируется прямым действием на лимфоциты растворимых микробных субстанций, а вторая форма реакции связана с иммуногенезом. Экстренная реакция специфической адгезии лимфоцитов имеет неантигенную природу и возникает в связи со специфическим преобразованием рецепторного аппарата лимфоцитов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Адгезивная способность лимфоцитов как тест специфической реакции на микробы // Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики. - Пермь, 1993. - С. 47 - 48.

2. Определение экстренных специфических антимикробных реакций лимфоцитов как метод ранней диагностики инфекций // Преподавание в медицинском вузе вопросов профилактики и здоровья и его реабилитации. - Пермь, 1994. - С. 60 - 61. ( Соавт. -Е.Г.Новикова)

3. Экстренные реакции клеток крови на микробы и практическое значение их определения // Там же. - С. 43 - 44.

4. Метод определения специфической адгезивной способности нейтрофилов и лимфоцитов. Приложение 4 // В.Н.Каплин. Нетрадиционная иммунология инфекций. - Пермь, 1996. - С. 157 - 158. (Соавт. - В.Н.Каплин, С.В.Фольмер, А.Х.Мамунц).

5. Новый подход к оценке реакции специфической адгезии лимфоцитов при инфекциях // Научно-практ. конференция молодых ученых Перм. гос. мед. академии. - Пермь, 1996. - С. 107 - 108.

Редакция "Псимсшго медицинского журнала" Тираж 100 экз.