Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адгезивная способность нейтрофилов как тест специфической реакции на микробы в модельных опытах и при инфекциях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Адгезивная способность нейтрофилов как тест специфической реакции на микробы в модельных опытах и при инфекциях"

1 ® "" На правах рукописи

" 8 ОПТ 1996

Ф О Л Ь М Е Р СВЕТЛАНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

АДГЕЗИВНАЯ СПОСОБНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ КАК ТЕСТ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ НА МИКРОБЫ В МОДЕЛЬНЫХ ОПЫТАХ И ПРИ ИНФЕКЦИЯХ

03.00.07 - микробиология 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ПЕРМЬ - 1996

Работа выполнена в Пермской государственной медицинской академии

Научный руководитель - доктор медицинских наук,

профессор В.Н.Каплин

Официальные оппоненты :

доктор медицинских наук, профессор Э.С.Горовиц

доктор медицинских наук, доцент В.Ф.Кузнецов

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи

Защита диссертации состоится

«25» Сенгпл5рл 1996 г. в 40 часов

на заседании диссертационного Совета К 084.09.01 Пермской государственной медицинской академии (614000, г.Пермь, ул.Куйбышева, 39)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной медицинской академии (614000, г.Пермь, ул.Коммунистическая, 26)

Автореферат разослан " <?3" аВгс/ота. 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета канд. мед. наук, доцент

Кузяев Р.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инфекционная иммунология признает у человека и высших животных существование единственной формы специфического реагирования на микробы, проявляющейся в виде иммунной реакции. Специфические эффекты этой реакции обнаруживаются не ранее двух-трех дней от начала взаимодействия организма с антигеном [I.M. Roit, 1991].

Наряду с этим описана экстренная специфическая реакция крови, возникающая в момент контакта организма с микробами. Для нее характерно отсутствие латентного периода, а длительность реакции соответствует времени циркуляции в крови растворимых микробных субстанций [В.Н. Каплин, 1996]. Экстренная специфическая реакция крови проявляется в эффектах усиления антигенсвязывающей активности эритроцитов [В.Н.Каплин, И.П.Корюкина, В.Ф.Кузнецов, 1984], фагоцитарной активности лейкоцитов [В.Н.Каплин и соавт., 1964-1996 и др.] и адгезивной способности лимфоцитов в форме их розеткообразования [Л.П.Быкова и соавт., 1984-1991; А.С.Закс, А.А.Быкова, Т.А.Юшкова, 1986-1993; Л.А.Прасолова, 1988; Л.Г.Казанцева, 1993 и др.]. Все эти эффекты моделируются при взаимодействии in vitro крови с растворимыми субстанциями микробов [В.Н. Каплин, 1996].

Среди указанных реакций наиболее изучена экстренная фагоцитарная реакция. Ее возникновение объясняют специфическим преобразованием рецепторного аппарата нейтрофилов под влиянием микробного стимула, направленного непосредственно на фагоцитирующую клетку, что заставляет предполагать заинтерисо-ванность в этой реакции явления специфической адгезии [В.Н. Каплин, 1996]. Однако возможность формирования экстренной реакции специфической адгезии нейтрофилов на микробы не изучена и не ясны возможности применения этой реакции в иммунодиагностике инфекций. Исследование адгезии нейтрофилов сложно из-за необходимости отделения процесса поглощения объектов и большой вариабельности показателей адгезии нейтрофилов у здоровых и больных людей [И.В.Петрова, Л.Л.Васильева, 1976, 1983].

Целью работы является разработка методики определения реакции специфической адгезии нейтрофилов на микробы, изучение закономерностей формирования этой реакции в модельных опытах in vitro и возможностей ее применения в иммунодиагностике инфекций.

Задачи исследования

1. Разработать методику исследования реакции специфической адгезии нейтрофилов.

2. Исследовать закономерности формирования реакции специфической адгезии нейтрофилов на микробы при ее моделировании in vitro.

3. Изучить специфические изменения адгезивной способности нейтрофилов при туберкулезе и клещевом энцефалите.

4. Обосновать применение показателя адгезивной способности нейтрофилов в качестве диагностического теста при инфекциях.

Научная новизна

Разработана методика исследования реакции специфической адгезии нейтрофилов на микробы, обладающая высокой чувствительностью, специфичностью и позволяющая использовать единый унифицированный количественный критерий реакции;

- впервые исследованы in vitro закономерности формирования реакции специфической адгезии нейтрофилов на растворимые микробные субстанции;

- установлена независимость экстренной реакции специфической адгезии нейтрофилов от антителообразования и неантигенная природа этой реакции;

- установлено, что механизм реакции специфической адгезии нейтрофилов на микробы связан со специфическим преобразованием рецепторного аппарата нейтрофилов;

впервые изучена реакция специфической адгезии нейтрофилов у больных туберкулезом и клещевым энцефалитом, установлена возможность ее формирования в ранней стадии инфекций, высокая специфичность и чувствительность.

Практическая ценность и внедрение. Разработан новый универсальный диагностический тест при инфекциях, расширяющий сферу иммунодиагностики инфекционной патологии. Показана высокая чувствительность и специфичность реакции специфической адгезии нейтрофилов, возможность унификации ее оценки и применения в ранней диагностике инфекций. По материалам исследования подана заявка на изобретение "Способ иммунодиагностики инфекций" и подготовлены методические рекомендации, которые используются в учебном процессе кафедры детских инфекций ПГМА.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Методика исследования специфической адгезивной способности нейтрофилов.

2. Экстренная реакция специфической адгезии нейтрофилов при моделировании in vitro.

3. Диагностический критерий реакции специфической адгезии нейтрофилов.

4. Реакция специфической адгезии нейтрофилов у больных туберкулезом и клещевым энцефалитом и возможность ее эффективного определения в ранней стадии инфекции.

5. Механизм формирования реакции специфической адгезии, нейтрофилов.

Апробация работы. Работа выполнена на кафедре патологической физиологии ПГМА и является фрагментом комплексной темы "Разработка новых методов иммунологического исследования и ранняя иммунологическая диагностика инфекций и деструктивных процессов во внутренних органах" (Ы госрегистрации 01820080720).

Материалы работы доложены на кафедре патологической физиологии ПГМА (1995) и на научной сессии ПГМА (1996). Диссертация апробирована на совместном заседании кафедр микробиологии и патологической физиологии ПГМА (1996).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 4 работы.

Объем работы. Диссертация изложена на 123 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиографический указатель включает ссылки на работы 156 отечественных и 40 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 5 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены с лейкоцитарной взвесью крови 19 доноров. Кровь забирали из локтевой вены на Пермской областной станции переливания крови.

Исследования специфической адгезии нейтрофилов проведены у 37 взрослых больных с различными по течению и тяжести формами туберкулеза легких, находившихся на лечении в Пермском областном противотуберкулезном диспансере. У 11 человек диагноз был подтвержден бактериологическим исследованием, которое было проведено на базе центральной лаборатории Пермского областного объединения фтизиопульмонологии. У остальных больных диагноз туберкулеза был поставлен на основании кли-нико-рентгенологического исследования. Контрольные исследования проведены у 29 доноров.

Специфическая адгезия нейтрофилов исследована также у 32 детей с диагнозом клещевого энцефалита (КЭ) и с подозрением на КЭ. Все дети проходили обследование и стационарное лечение на базе 9-й детской клинической больницы г. Перми. У16 детей диагноз КЭ был установлен на основаниии клинико-серологи-ческого исследования и определения вирусофорности клещей. Остальные дети имели стертую клиническую форму заболевания, не подтвержденную серологически. Контрольные исследования проведены у 16 человек; в их числе были три здоровых ребенка, три ребенка с ОРВИ, один больной скарлатиной и 9 доноров.

Исследования вирусофорности клещей и серологические исследования проведены на базе областной вирусологической ла-

боратории центра санэпиднадзора г. Перми. Антитела к вирусу клещевого энцефалита определяли в РТГА [D.Clarke, I.Casals, 1958, Б.Ф. Семенов, А.М.Резепова, 1962] и непрямым твердофазным иммуноферментным методом [О.В. Наволокин и соавт., 1986]. Определение вирусофорности клещей проводили прямым иммуноферментным методом [С.Я. Гайдамович и соавт., 1986].

Адгезивную способность нейтрофилов исследовали по оригинальной методике, в основе которой лежит разработанный В.Н.Каплиным и соавт. [1991] принцип исследования фагоцитарной активности лейкоцитов с одновременным определением фагоцитоза специфического и неспецифического объектов в одной пробе крови и с оценкой реакции по соотношению величин поглощения этих объектов у больного в сопоставлении с их соотношением у одновременно исследуемых одного-двух контрольных лиц.

В качестве объектов адгезии использовали коммерческие сухие антигенные (Аг) эритроцитарные (Э) диагностикумы из туберкулезного фосфатида (Э с ФАг) и шигелл Зонне (Э с Аг S.sonnei) Санкт-Петербургского НИИВС и иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум к антигену вируса КЭ Томского НИИВС. При исследовании реакции специфической адгезии (РСА) нейтрофилов на вакцину БЦЖ и при диагностике туберкулеза использовали два вида диагностикумов, содержащих специфическую субстанцию бактерий. Для определения специфической реакции, связанной с образованием иммунных опсонинов, применяли эритроциты, содержащие антиген, а для определения реакции в начальном периоде инфекции - эритроциты со сложным комплексом антигена и антитела (Ат). Приготовление этих диагностикумов производили путем присоединения к антигенному диаг-ностикуму иммунной сыворотки и последующего присоединения надосадочной жидкости (НЖ) бактериальных диагностикумов. В этих диагностикумах кнаружи обращены неантигепные детерминанты туберкулезного ФАг и липополисахаридов (ЛПС) шигелл Зонне [В.Н.Каплин, 1991]. Сложные комплексные диагностикумы обозначались как Э с Аг+Ат+ФАг БЦЖ и Э с Аг+Ат+ЛПС S. sonnei. При исследовании реакции специфической адгезии нейтрофилов на вирус клещевого энцефалита и при диагностике КЭ использовали только комплексный диагностикум (Э с Ат+Аг КЭ), приготовленный путем присоединения к иммуноглобулиново-му эритроцитарному диагностикуму Аг вируса клещевого энцефалита [Л.П.Быкова, 1988].

При исследовании адгезивной способности нейтрофилов кровь забирали из локтевой вены в объеме 0,4 мл и помещали ее в полиэтиленовые пробирки для микропроб однократного применения с заранее внесенным туда стерильным раствором глюгици-ра. Кровь отстаивали в течение 30-40 минут и отсасывали плазму с лейкоцитами. Для наведения реакции специфической адгезии in vitro брали из лейкоцитарной взвеси донора две пробы по 10

мкл и вносили их в лунки микропланшета для РГА. Затем в первую пробу (стимулированную) вносили 5 мкл бактериального раствора (надосадочной жидкости вакцины БЦЖ активностью в РТПГА 0,01АЕ или раствора Аг вируса КЭ активностью в РПГА с иммуноглобулиновым ЭД 0,1 АЕ), а во вторую пробу (контрольную) добавляли 5 мкл физраствора. Смесь лейкоцитарной взвеси с микробной субстанцией выдерживали 20-30 минут при комнатной температуре. Затем в каждую пробу добавляли по 10 мкл смеси взвесей специфического- и контрольного объектов в концентрации 100 млн/мл и после 2-5-минутной экспозиции при комнатной температуре готовили мазки, фиксировали их и окрашивали по методу Романовского-Гимзы. В мазках производили сопряженный подсчет адгезии обоих объектов, учитывая суммарное количество адгезированных объектов каждого вида, процент розеткообразуюгцих клеток и количество объектов адгезированных розеткообразующими нейтрофилами (РОН), и нейтрофила-ми, адгезировавшими один-два объекта.

Реакцию специфической адгезии нейтрофилов оценивали по соотношению адгезии специфического (сп) и неспецифического (несп) объектов в контрольной (к) и стимулированной (с) пробах. Для количественной оценки РСА нейтрофилов рассчитывали индекс специфической адгезии (ИСА) по формуле:

с к

РОНсп/РОНсп х 100 % ИСА =-----------------------------

РОНнесп/РОНнесп х 100 %

По такой же формуле рассчитывали ИСА при уровне адгезии одни-два объекта на нейтрофил.

У больных (б) адгезию исследовали по такой же методике, но с одновременным определением показателей у одного-двух доноров (д). По результатам исследования рассчитывали ИСА:

б б РОНсп/РОНнесп ИСА =---------------------

POHcn/POHLn

Основанием для расчета ИСА служит наличие корреляционной связи между величинами адгезивной способности нейтрофилов к специфическим и неспецифическим (контрольным) объектам у доноров. Контрольные величины ИСА находятся в пределах 0,40-1,80. Выход за пределы этого индекса является альтернативным признаком специфической реакции на микробы.

Полученные данные обработаны методом вариационной статистики [Л.С.Каминский, 1964; Е.В. Монцевичуте-Эрингене, 1964] и по непараметрическим критериям [Е.В.Гублер, 1978].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Новые методические подходы к определению адгезивной способности нейтрофилов

Исследования адгезивной способности нейтрофилов выявили крайнюю вариабельность показателей адгезии у здоровых людей. Особенно резко она выражена в популяции РОН. Значительны также колебания величин показателя среди нейтрофилов, адгези-ровавших один-два объекта. В связи с этим трудно выявить специфическое изменение адгезии по абсолютной величине показателя.

Вместе с тем абсолютные величины адгезии разнородных объектов хорошо коррелируют как у РОН, так и у нейтрофилов с низким уровнем адгезии. Расчет коэффициента корреляции адгезии разнородных объектов для РОН составляет 0,9 (р < 0,01). Для нейтрофилов с уровнем адгезии один-два объекта величина коэффициента корреляции также значительна, в среднем - 0,7. Эта закономерность дала возможность нового подхода к оценке адгезивной способности нейтрофилов по соотношению адгезии разных объектов, которое колеблется значительно меньше, чем абсолютные значения адгезии (рис. 1).

Рис.1. Соотношение адгезии РОН объектов с Йг+Ат+ФАГ БЦЖ (1), с туберкулезным Аг (2) и с Ар З.Боппе! (3) у здоровых людей.

По оси ординат - велзгаина адгезии объектов в процентах от ее средней величины, по оси абцисс - индивидуальные пробы.Здесь, как на рисунке 2, цифры над доказателям ироб обозначает величину ИСА.

При большом размахе абсолютных величин адгезии, отношение адгезии разных объектов колеблется в небольших пределах, что позволяет использовать количественный критерий реакции в форме ИСА, выражающего отношение уровней адгезии различных объектов. В исследованиях у доноров было установлено, что величина ИСА в отношении РОН колеблется в пределах от 0,40 до 1,80, а в отношении нейтрофилов с низким уровнем адгезии -от 0,61 до 1,28. Эта величины индекса были взяты в качестве контрольных при определении индуцированной in vitro РСА нейтрофилов и у больных инфекциями.

Реакция специфической адгезии нейтрофилов па вакцину БЦЖ и па вирус клещевого энцефалита в модельных опытах in vitro

После стимуляции лейкоцитарной взвеси доноров надосадоч-ной жидкостью вакцины БЦЖ выявлено усиление адгезии РОН специфического объекта с комплексом Аг+Ат+ФАг БЦЖ и одновременное снижение адгезии неспецифического объекта, содержащего комплекс Аг+Ат+ЛПС S. sonnei (табл. 1). Реакция выявилась уже через 2 минуты после начала контакта стимулированных лейкоцитов с объектами адгезии. Сопоставление показателей реакции по абсолютной величине адгезии и по ИСА показывает значительно более выраженную реакцию при оценке по индексу. Эта реакция выявляется как при учете процента РОН, так и суммы адгезированных ими объектов. В частности, величина адгезии специфического объекта возросла в 3,2 раза как при оценке по проценту РОН, так и по сумме адгезированных объектов. В то же время средняя величина ИСА по сравнению с контрольной выросла в 15,4 раза для суммы объектов, адгезированных РОН, и в 13,7 для их процента. Между обоими величинами индекса выявлена очень тесная корреляция (г= 0,97; р < 0,01), что дает основание к использованию только одного показателя. Преимущество следует отдать расчету ИСА по сумме адгезированных РОН объектов, что доказывается сревнением величин ИСА в индивидуальных пробах. В 7 пробах из 8 индекс при расчете суммы адгезированных объектов был выше, чем по проценту РОН (Т = 4; р < 0,05). Установленная закономерность формирования РСА нейтрофилов отмечена только в отношении РОН. При адгезии 1-2 объектов нет достоверного повышения адгезии специфического объекта, а адгезия неспецифического объекта далее незначительно возросла (табл. 1). Соответственно величина ИСА не вышла за пределы контрольного значения, что говорит об отсутствии реакции.

При исследовании РСА нейтрофилов по соотношению адгезии двух специфических объектов разнородной структуры установлено усиление у РОН адгезии объекта с комплексом Аг+Ат+ФАг БЦЖ и выраженное снижение адгезии объекта, содержащего туберкулезный Аг (табл. 2). Как и в предыдущем исследовании, не выявляется реакция в отношении нейтрофилов с

Таблица 1

Адгезивная способность нейтрофилов после контакта in vitro лейкоцитарной взвеси доноров с надосадочной жидкостью вакцины БЦЖ активностью 0,01 АЕ/мл [п=8]

(в числителе - абсолютная величина адгезии, в знаменателе - процент РОН)

Показатели адгезии ИСА при уровне

Объект РОН, % и сумма адге-зированных объектов Сумма адгезии при величине адгезии 1-2 объекта ■ адгезии на нейтрофил

адгезии Контрольная проба Стимулированная проба Разница, % и m разностное Контроль - ная проба Стимулированная проба Разница, % и m разностное РОН 1-2 объекта

Э с Аг+Ат+ 17 (6-28) 54 (36-63)* 318; га-4 74 86 116; 15(6-44)* 1,2

ФАг БЦЖ 5(2-7) 15(10-18)* 300; ш-1 (60-108) (62-105) m - 5 14(6-35)* (0,9-1,8) [0]

Э с Аг+Ат+ 43 (17-58) 12(9-21)* 28; га-4 73 78 106; Lа J [8]

ЛПС S.sonnei 12 (5-14) 4(2-7)* 33; ш-1 (59-85) (64-80) ш - 4

Примечание. * - р < 0,01 в сравнении с показателями контрольных проб. Здесь, как и в последующих таблицах, средняя величина ИСА рассчитана по сумме индивидуальных показателей. В квадратных скобках указано число положительных результатов.

Таблица 2

Адгезивная способность нейтрофилов после контакта in vitro лейкоцитарной взвеси доноров с надосадочной жидкостью вакцины БЦЖ активностью 0,01 АЕ/мл (п=11)

Объект адгезии Сумма адгезированных объектов при величине адгезии на нейтрофил ИСА при уровне адгезии на нейтрофил

РОК 1-2 объекта

Контрольная проба Стимулированная проба Разница, % и m разностное Контрольная проба Стимулированная проба Разница, % и m разностное РОН 1-2 объекта

Э с Аг+Ат+ 50 94* 188; 55 59 107; 22,3* 0,9

ФАг БЦЖ (3-131) (31-160) m - 3 (17-86) (19-145) ш - 5 (2-145) (0,4-1,8)

[ 11 ] [ 0 ]

Э с тубер- 71 3 4* 48; 62 69 111;

кулезным Аг (17-108 (3-74) ш - 4 (25-72) (20-170) m - 6

уровнем адгезии 1-2 объекта. На основании этого исследования был сделан вывод о наличии в ФАг, кроме антигенных детерминант, специфических структур неантигенной природы, индуцирующих РСА нейтрофилов.

В процессе исследования обнаружен еще один интересный факт, заключающийся в том, что сумма средних величин адгезии специфического и неспецифического объектов у РОН в контрольной и стимулированной пробах практически не изменилась (табл. 2). Так, в контрольной пробе она составила 121 (50+71), а после стимуляции - 128 (94+34). Эти данные указывают на неизменность общего потенциала розеткообразующей способности нейтрофилов и только на его перераспределение с возрастанием доли адгезии специфического объекта за счет соответствующего уменьшения доли адгезии контрольного объекта.

Формирование РСА нейтрофилов на вирус КЭ происходило по тем же закономерностям, что и в исследованиях с вакциной БЦЖ. После контакта лейкоцитарной взвеси доноров с раствором вируса КЭ наблюдалось достоверное повышение адгезии РОН специфического объекта с комплексом Ат+Аг КЭ (Т = 0; р < 0,01) с одновременным достоверным снижением адгезии неспецифического объекта Аг+Ат+ФАг БЦЖ (Т = 1; р < 0,05). При уровне адгезии 1-2 объектов на нейтрофил реакция не обнаружена. Как и в предыдущих исследованиях подтвержден факт неизменности суммы величин адгезии специфического и неспецифического объектов у РОН до и после стимуляции раствором Аг вируса КЭ. В опытах со стимуляцией раствором Аг вируса КЭ также обнаружена более высокая реакция при учете количества адгезирован-ных объектов в сравнении с процентом РОН (Т = 1; р < 0,05). Учет процента адгезии не позволяет дифференцировать РОН по уровню адгезии, что моясет иметь существенное значение для оценки РСА нейтрофилов. При абсолютном высоком уровне адгезии нейтрофилы с адгезией трех объектов не всегда являются истинными РОК. Их образование может происходить в связи с усилением неспецифической способности к адгезии, определяемой физико-химическими механизмами этого процесса. Особенно важно указанное обстоятельство в условиях инфекции, когда уровень адгезии модулируется разнообразными факторами.

При изучении условий, влияющих на интенсивность РСА, установлено, что уровень реакции находится в обратной зависимости от температуры и времени экспозиции (г = - 0,97; р < 0,01). Оптимальными условиями определения реакции являются контакт взвеси лейкоцитов и объектов адгезии в течение 2-5 мин при комнатной температуре. При этих условиях практически отсутствует фагоцитоз, который существенно ухудшает оценку реакции.

При анализе процесса специфической адгезии нейтрофилов определяли взаимное пространственное расположение объектов

на мембране нейтрофилов. При этом выделяли две группы ней-трофилов: 1) . с тесным расположением объектов на мембране клетки, когда объекты прилегали к друг другу вплотную или с минимальным расстоянием между ними; 2) с расположением объектов на значительном расстоянии друг от друга, в том числе с расположением объектов на разных полюсах клетки. Этот анализ произведен в отношении нейтрофилов, адгезировавших по 2 и 3 объекта каждого вида. РОН с тесным расположением объектов обозначены как "истинные", а РОН с разрозненным расположением объектов как "ложные". При стимуляции достоверно возрастало количество "истинных" специфических РОН (Т=0; р < 0,01) и отсутствовали изменения количества "ложных" РОН. В отношении неспецифического объекта наблюдалась обратная тенденция: снижение числа неспецифических РОН после стимуляции, особенно в отношении "истинных" РОН. Расчет индекса для РОН разной специфичности подтвердил обоснованность такого вывода.

При учете клеток с адгезией двух объектов обнаружена еще одна форма специфического реагирования. При стимуляции достоверно возрастало количество клеток с расположенными попарно специфическими объектами (Т=0; р < 0,01) и одновременно снижалось количество клеток со специфическими объектами, расположенными разрозненно (Т=0; р < 0,01). В результате этого величина ИСА значительно возросла. Если сравнить количество нейтрофилов, адгезировавших специфические объекты с разным расположением в контрольной и стимулированной пробах, то в их сумме разницы нет. В отношении неспецифических объектов при таком уровне адгезии не наблюдалось разницы как в сумме нейтрофилов, адгезировавших неспецифические объекты, так и в расположении объектов на мембране нейтрофилов до и после стимуляции.

Реакция специфической адгезии нейтрофилов при туберкулезе

При формировании РСА нейтрофилов у больных туберкулезом отмечено умеренное повышение адгезии РОН специфического объекта с комплексом Аг+Ат+ФАг БЦЖ и выраженное снижение адгезии неспецифического объекта с комплексом Аг+Ат+ЛПС Б. Боппе! (р < 0,01 в сравнении с показателями в контрольной группе) (рис. 2). Это создало большой разрыв в уровнях адгезии специфического и неспецифического объектов и возможность получения положительного результата даже при самых низких уровнях адгезии специфического объекта.

Рис.2. Соотношение уровней адгезии эритроцитов с комплексом Аг+Ат+ФАг БЦЖ ( сплошная ЛИНИЯ ) И эритроцитов С АГ З.БОГШе! ( штриховая линия ) у РОН при одновременном исследовании доноров и больных туберкулезом. Адгезия каждого объекта представлена в процентах к ее средней величине у доноров.

По оси ординат - величины адгезии РОН в процентах, по оси абцксс - номера

проб.

В отношении специфического объекта с туберкулезным Аг наблюдалось небольшое снижение его адгезии, но в сочетании с выраженным достоверным снижением адгезии неспецифического объекта ИСА достигал диагностически значимых величин.

При расчете ИСА в отношении специфического объекта с инвертированным расположением детерминант ФАг у больных туберкулезом получено 84 % положительных результатов, а в отношении объекта, содержащего туберкулезный Аг, - 54 %. У части больных наблюдался выход величины ИСА в отношении последнего объекта за пределы нижней границы контрольного значения индекса. Это свидетельствовало о специфической депрессии, связанной, по-видимому, с наличием аллергии. В целом диагностически значимые изменения ИСА установлены у 92 % больных. Оценка реакции по ИСА для РОН в сравнении с оценкой по абсолютной величине адгезии увеличила число положительных результатов в 34 раза.

Из 11 больных с бактериологически подтвержденным диагнозом положительная реакция на комплексный диагностикум обнаружена у всех, а на антигенный - у 40 % больных (при сопоставлении числа диагностически значимых результатов - р < 0,01). У больных с бактериологически неподтвержденным диагнозом не было достоверной разницы в числе диагностически значимых результатов в отношении обоих специфических объектов (соответственно - 77 % и 62 %).

Реакция специфической адгезии нейтрофилов при клещевом энцефалите

При формировании РСА нейтрофилов у больных КЭ детей выявлено умеренное повышение адгезии специфического объекта и выраженное достоверное снижение адгезии неспецифического объекта (р < 0,01 в сравнении с показателями в контрольной группе).

Эта закономерность установлена как в группе с серологически подтвержденным, так и в группе с серологически неподтвержденным диагнозом КЭ (табл. 3).

Оценка реакции по абсолютной величине адгезии специфического объекта не дала положительных результатов. Однако расчет ИСА выявил положительную реакцию в ранние сроки у всех 7 больных, в поздние - у 12 из 14 больных (86 %). В целом по группе получены диагностически значимые результаты у 88 % больных. Положительная РСА нейтрофилов опередила результаты серологического исследования в среднем на две недели. Эти данные указывают на возможность эффективной ранней диагностики КЭ по РСА нейтрофилов.

При анализе результатов у больных с серологически неподтвержденным диагнозом КЭ установлено, что средние величины адгезии специфического и неспецифического объектов такие же, как в группе больных с подтвержденным диагнозом. Расчет ИСА выявил положительную реакцию у всех больных. На этом основании можно утверждать, что это также группа больных КЭ. Отсутствие у них положительной серологической реакции не является достаточным основанием для того, чтобы отвергать диагноз КЭ. Данные литературы свидетельствуют о наличии положительных специфических клеточных реакций у больных с серонега-тивными формами КЭ [В.М.Минаева, 1972]. Правомерность этого заключения подтверждена также исследованием адгезивной способности лимфоцитов, проведенным В.Н. Каплиным и А.Х.Мамунцем, которые у всех этих больных получили положительную реакцию специфического розеткообразования лимфоцитов.

Подводя итоги исследования, следует отметить, что впервые в эксперименте in vitro воспроизведена РСА нейтрофилов. Реакция имеет строго специфичный характер, проявляясь в стимуляции адгезии специфического объекта и в подавлении адгезии неспецифического объекта, и наблюдается только у РОН. Выведен унифицированный количественный критерий этой реакции в форме ИСА. Этот методический прием позволил резко повысить чувствительность реакции при сохранении высокой специфичности. Проведенные исследования у больных туберкулезом и КЭ показали, что для разных по иммунопатогенезу инфекций наблюдаются общие закономерности формирования РСА, проявляющиеся в раннем возникновении реакции и в ее двухфазном харак-

Таблица 3

Показатели адгезии РОН и ИСА у больных клещевым энцефалитом и в контрольной группе

Сумма объектов, адгезированных РОН ИСА при расчете по соотношению показателей в графах

Группа 3 с Аг + Ат + ГА КЭ Э с Аг+Ат+ЛПС Э.Боппе! 1/2 Число и % положительных

1 2 результатов

Контрольная, п=16 40±10,2 (3-197) 52±12,3 (7-190) 0,9±0,1 (0,6-1,4) 0

Больные с серологически подтвержденным диагнозом КЭ,п=16 49+8,9 (3-146) 19±2,7* (3-40) 3,6±0,4* (0,9-6,3) 14 [88%]

Больные с серологически неподтвержденным диагнозом КЭ, п-16 53±6,2 (19-107) 18±3,7* (3-46) 5,5±0,9* (2,5-13,3) 16 [100%]

СЛ

тере. Начальная фаза реакции не зависит от образования Ат, что особенно ярко выявляется при КЭ. На основании проведенных исследований РСА нейтрофилов следует рекомендовать для исследования специфической реакции на микробы и для ранней диагностики инфекций.

ВЫВОДЫ

1. Для определения реакции специфической адгезии нейтрофилов на микробы разработана оригинальная методика исследования с использованием эритроцитарных диагностикумов, содержащих антигенные и неантигенные специфические субстанции микробов, и с определением реакции по соотношению величин адгезии специфического и неспецифического объектов. Метод технически прост, специфичен, чувствителен и дает возможность использовать для оценки реакции унифицированный количественный критерий.

2. При взаимодействии in vitro лейкоцитарной взвеси доноров с микроколичествами растворимых субстанций вакцины БЦЖ и вируса клещевого энцефалита возникает экстренная реакция специфической адгезии нейтрофилов, проявляющаяся в умеренном повышении адгезии специфического объекта и выраженном снижении адгезии неспецифического объекта. Уровень реакции находится в обратной зависимости от температуры и времени экспозиции стимулированных лейкоцитов и взвеси объектов адгезии, а реакция выявляется в основном в популяции розеткообра-зующих нейтрофилов.

3. У больных туберкулезом в активной фазе процесса отмечено умеренное повышение адгезии нейтрофилами специфического объекта и выраженное снижение неспецифической адгезии. Реакция выявляется в основном в отношении специфического объекта, содержащего неантигенные детерминанты БЦЖ, и реже - в отношении объекта с туберкулезным антигеном. При бактериологически подтвержденном диагнозе туберкулеза выявлена специфическая реакция у всех больных, а в группе с бактериологически неподтвержденным диагнозом туберкулеза - у 88 % обследованных.

4. У больных клещевым энцефалитом детей с начала заболевания обнаружена реакция специфической адгезии нейтрофилов, проявляющаяся в разнонаправленном изменении адгезии специфического и неспецифического объектов. В первые дни заболевания реакция определяется у всех, а в более поздней стадии у 86 % больных. Реакция специфической адгезии нейтрофилов по срокам выявления опережает результаты серологического исследования в среднем на две недели.

5. Экстренно возникающая реакция специфической адгезии нейтрофилов имеет неантигенную природу. Формирование реакции связано со специфическим изменением пространственно-

го расположения рецепторов на мембране нейтрофила, что доказывается группированием специфических объектов на поверхности клетки и неизменностью суммарного потенциала адгезии в отношении специфического и неспецифического объектов в процессе формирования реакции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Реакция специфической адгезии нейтрофилов на микробы б модельных опытах in vitro //Пермский медицинский журнал. -

1995. - Т. XII, N 4. - С. 11-14 (Соавт,- В.Н.Каплин).

2. Адгезивная способность нейтрофилов как диагностический тест при инфекциях //Пермский медицинский журнал. -

1996. -Т. XIII, N 1.- С. 3-7 (Соавт. - В.Н.Каплин, АХМамунц).

3. Адгезивная способность нейтрофилов как тест специфической реакции на микробы // "Научная сессия 1996 г. Пермской госуд. мед. академии" (тезисы докладов). Пермь, 1996. №62 (Соавт. -В.Н.Каплин).

4. Метод определения специфической адгезивной способности нейтрофилов и лимфоцитов. Приложение 4. /В.Н.Каплин. Нетрадиционная иммунология инфекций. - Пермь, 1996. - С.157-158 (Соавт.-В.Н.Каплин, А.Х.Мамунц, Л.Г.Казанцева).

Напечатано с оригина/»-шкета. Подписано в печать 19.07.96. Формат 60x90 1/16. Усл.печп 1.0. Тираж 100 экз.

Редакция "Пермского медицинского журнала". Пермь. улЬольшевистская, В5.