Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная активность нейтрофилов ротовой полости человека

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональная активность нейтрофилов ротовой полости человека"



На правах рукописи

АШКИНАЗИ Владимир Израильевич

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.13 — физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород, 1998

Работа выполнена в Нижегородском научно - исследовательском институте детской гастроэнтерологии МЗ РФ

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Маянский А.Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Конторщикова К.Н. доктор биологических наук Новиков В. В.

Ведущая организация:

Казанский медицинский университет

Защита состоится " (¿ОАм/)1998 г. в /Учасов на заседании диссертационного -совета К 063. 77.13 при Нижегородском государственном университете им. Н.ИЛо-бачевского ( 603600, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета

Автореферат разослан * б£.'!ГяЯ$ 1998 г.

<г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук, доцент А/и /--Александрова И.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Изучение реактивности нейтрофилов представляет интерес с нескольких точек зрения. Во - первых, фагоциты является базовым механизмом иммунитета и его ослабление снижает резистентность к инфекционным агентам, приводя к тяжелым осложнениям. Во - вторых, подвергаясь гиперактивации в зонах воспаления, фагоциты становятся опасными для хозяина, включаясь в патогенез воспалительных осложнений. Наконец, фагоциты (прежде всего нейтрофилы) как высокореактивная категория клеток, служат чувствительным индикатором различных нарушений гомеостаза, что широко используется в качестве диагностического и прогностического критерия в клинической практике ( Маянский А. Н., Маянский Д. Н., 1989; Маян-ский Д.Н., Урсов И.Г, 1997). С этой целью предложено использовать специальные, основанные на функциональном зондировании нейтрофилов аналитические приемы, которые позволяют выявить такие изменения в организме, которые не регистрируются обычными гематологическими методами. В частности, большой интерес вызывает цитохимическая маркировка нейтрофильных гранулоцитов, с помощью которой метят многие метаболитические пути, ферментные и неферментные компоненты клеток. Значительное внимание уделяется изучению фагоцитарного статуса с помощью адгезивных реакций, теста постановления нитросинего тетразолия (НСТ-теста) и реактивной хемилю-минесценции (Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993). Сказанное в первую очередь относится к нейтрофилам крови. Вместе с тем, все более пристальное внимание уделяется изучению местных защитных реакций, что позволяет судить о механизмах формирования органной патологии ( Баженов Ю.А. и др.,1988; Салихов И.Г. и др.,1989; Бажанов H.H. и др.,1997; Власов A.B.,1997;Carlscn B.,1983;Carlson В. et al., 1983).

В условиях организма происходит непрерывный процесс эмиграции лейкоцитов из крови в ротовую полость (Ясиновский М.Я.,1931; Ясиновский М.Я. и др., 1975). Установлено, что 95-97% мигрирующих лейкоцитов составляют нейтрофилы (Робустова Т.Г. и др.. 1990; Raeste А. М.,1972). Исследованы средние колебания числа лейкоцитов в полости рта здоровых лиц; показано, что при воспалительных заболеваниях число оральных лейкоцитов увеличивается, а процент жизнеспособных клеток снижается (Макарова О.В., Пожарицкая М.М.,1990; Мельниченко Э.М, Шугля Л.В.,1993 ).

Сведения о функциональной активности нейтрофилов ротовой полости немногочисленны. Имеются данные о более высоком уровне СЗ и IgG - зависимого розеткообразования оральных нейтрофилов по сравнению с нейтрофилами крови (Sela M. N. et al., 1981); зарегистрировано ослабление адгезии оральных нейтрофилов на стекле (Sharon

и. А. а1., 1982 ). Показано наличие у нейтрофилов ротовой полости рецепторов к эритроцитам барана, мыши и клеткам пекарских дрожжей ( Робустовоа Т.Г., Лебедев К.А., 1989). АэЬкепаг! М. е1 а1. (1989; 1990) наблюдали более интенсивное связывание оральными нейтрофилами анти- СРЗ антител и противоположную картину для анти - Рс ШМ. Весьма противоречивы данные касающиеся респираторного взрыва. Так, Уататойэ М. е1 а1. (1991) сообщили о повышенной по сравнению с клетками крови продукции супероксидного радикала оральными нейтрофилами. Однако в более поздней публикации тех же авторов (УататоЬ М. е! а!., 1993) приводятся прямо противоположные данные. Обращает на себя внимание, практически полное отсутствие работ по цитохимии оральных нейтрофилов. Можно сослаться лишь на публикации, где изучались нейтрофилы ротовой полости при хроническом тонзиллите у взрослых людей (Драгомирецкий В.Д. и др., 1984; 1986; 1993; Бажора Ю.А. и др.,1991). Полностью отсутствуют исследования цитохимического статуса оральных нейтрофилов у детей при различных заболеваниях. Такие сведения могли бы оказаться полезным в педиатрии, учитывая доступность объекта и атравматич-ность процедуры исследования.

Цель работы. На основе изучения функциональных параметров нейтрофилов ротовой полости определить возможность их использования в качестве индикатора нарушений гомеостаза.

Задачи исследования:

1. Изучить функциональную активность нейтрофилов ротовой полости в сравнительном аспекте с нейтрофилами крови.

2. Установить возрастные особенности функциональных показателей оральных нейтрофилов.

3. Изучить функциональную активность нейтрофилов ротовой полости при некоторых патологических состояниях.

4. Обосновать методические подходы для клинико-диагностичекого использования оральных нейтрофилов

Научная новизна. Впервые изучена функциональная активность нейтрофилов ротовой полости здоровых взрослых и детей. Установлено, что оральные нейтрофилы отличаются от нейтрофилов крови снижением рецепторзависимых (1дО, СЗЬ и коллагензависимых) адгезивных реакций. Изучены особенности респираторного взрыва нейтрофилов ротовой полости: установлена высокая спонтанная реакция и значительное ослабление реактивности при дополнительной стимуляции в люминолзависимых хемилюминесцентных реакциях и полная ареак-тивность в НСТ - тесте. Впервые в возрастном аспекте в оральных нейтрофилах определено содержание лизосомальных катионных бел-

ков, миелопероксидазы и щелочной фосфатазы. Установлено, что ней-трофилы ротовой полости характеризуются высокой по сравнению с клетками крови активностью общей фракции лизосомальных катион-ных белков и щелочной фосфатазы и более низким уровнем миелопероксидазы. Впервые изучены цитохимические характеристики оральных нейтрофилов при ряде распространенных воспалительных заболеваний у детей - язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, остром гнойном гайморите и бронхиальной астме.

Теоретическая и практическая значимость. Разработаны методические подходы для изучения оральных нейтрофилов. Получена информация о функциональной активности нейтрофилов ротовой полости здоровых взрослых и детей в сравнительном аспекте с нейтро-филами крови. На основе ослабления индуцированных реакций люми-нолзависимой хемилюминесценции и НСТ- теста, сделан вывод о том, что слюна подавляет реактивность нейтрофилов, т.е., обладает противовоспалительным эффектом. В качестве доступных и информативных критериев, адекватно отражающих функциональное состояние оральных нейтрофилов, предложено цитохимическое выявление лизосомальных катионных белков и миелопероксидазы. Установлено, что функциональная активность нейтрофилов ротовой полости так же, как и нейтрофилов крови, меняется по ряду показателей при различных заболеваниях; при этом изменения происходящие в этих популяциях клеток нередко носят разнонаправленный характер.

Положения выносимые на защиту.

1. Эмиграция в ротовую полость и контакт со слюной оказывают влияние на функциональное состояние нейтрофилов.

2. Реактивность оральных нейтрофилов меняется при различных заболеваниях; в этом отношении они принципиально не отличаются от нейтрофилов крови.

3. Изменения оральных нейтрофилов при нарушениях гомеостаза не всегда соответствуют реактивной перестройке нейтрофилов крови; по некоторым из них они носят разнонаправленный характер.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы медицины" (Н. Новгород , 1994 ), на 1-й Российской гастроэнтерологической неделе (С-Петербург, 1995), Республиканском семинаре педиатров-гастроэнтерологов России (Н.Новгород, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Список приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок и 5 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 127 отечественных и 76 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач в сравнительном аспекте исследованы нейтрофилы крови и смывов из ротовой полости 90 здоровых людей ( 20 взрослых в возрасте 18-22 лет и 70 детей в возрасте 5-15лет, разделенных на четыре возрастные группы), 75 детей с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, 19 детей с острым гнойным гайморитом и 10 детей с бронхиальной астмой. Проведено 150 опытов по изучению рецепторзависимых адгезивных реакций, 280 анализов по оценке респираторного взрыва с помощью НСТ - теста и люминолза-висимой ХЛ, 1164 цитохимических исследований активности общей фракции лизосомальных катионных белков, миелопероксидазы и щелочной фосфатазы.

Оральные нейтрофилы получали с помощью полоскания полости рта 10 мл физиологического раствора в течение 2 мин., дважды отмывали и взвешивали в растворе Хенкса без фенолового красного в концентрации 5 х 105 кл/мл. Выделение нейтрофилов крови проводили на двойном градиенте плотности фиколл - верографина (Подосинников И.С. и др.,1981). Использовали взвесь клеток с жизнеспособностью не менее 95% ( по трипановому тесту).

Реакцию восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), проводили в спонтанном (без дополнительной стимуляции in vitro) и индуцированном вариантах (Виксман М.Е., Маянский А.Н.,1979). Результаты оценивали путем определения индекса активации нейтрофилов (ИАН), представляющего собой средний показатель активации системы фагоцитоза в пересчете на один нейтрофил. В качестве стимуляторов использовали форболмиристатацетат (ФМА) ( 10 мкг/мл), оп-сонизированный зимозан (03) (10 мг/мл) и Serrada marcescens (2 х 10э кл/мл). Зимозан опсонизировали пулом здоровой донорской сыворотки (30 мин.; 37°С) с последующим удалением нековалентно связанных компонентов путем инкубации (100°С; 15 мин.) с 2 М NaCI. 24 - часовую культуру Ser. marcescens прогревали при 100°С в течение 60 мин., трижды отмывали в физиологическом растворе и доводили до концентрации 2x109 кл/мл.

Люминолзависимую ХЛ нейтрофилов исследовали на жидкостно-стинцилляционном счетчике "БЭТА-2" (НПО "Медаппаратура", г. Киев), ( Невмятуллин А.Л.,1988 ). Для изучения индуцированной реакции в качестве стимуляторов использовали латекс (3 х 108 частиц / мл), опсо-низированный зимозан (10мг/мл), ФМА (10 мкг/мл), Staphylococcus epidermidis 178 М (109 кл/мл). 24-часовую культуру S. epidermidis трижды отмывали физиологическим раствором и доводили до концентрации 10э кл/мл. Измерение ХЛ проводили в течение 4 сек. через каждые 5 мин, и заканчивали через 15-20 мин после прохождения пика хеми-люминесценции. Результаты выражали в тыс. имп / мин. Подсчитывали индекс стимуляции нейтрофилов (ИС), который представляет собой отношение показателей индуцированной реакции к спонтанной.

Для изучения адгезии, нейтрофилы, взвешенные в растворе Хенкса (2 х 106 мл), смешивали в равных объемах (по 0,2 мл) с гранулами сорбентов (20 ООО гранул/мл) (Чеботарь И.В.,1989). В качестве сорбентов использовали сефарозу 4В ("Pharmacia", Швеция) ковалент-но связанную с агрегированным IgG человека (НИИЭМ, Н.Новгород), сефадекс G-25 ("Pharmacia", Швеция), коньюгированный с СЗЬ-фактором комплемента, цитодекс-3 (гранулы сефадекса, покрытые денатурированным коллагеном человека 1 типа) ("Sigma", США), предоставленные на кафедре микробиологии Нижегородской Медицинской Академии. Подсчитывали процент адгезированных нейтрофилов по разнице количества клеток в супернатантах опытной и контрольной проб:

(1 -- опыт ) х 100%. контроль

Цитохимическое исследование активности лизосомальных катион-ных белков (ЛКБ) в нейтрофилах проводили с помощью лизосомально-катионного теста (Пигаревский В.Е.,1988). Содержание миелоперокси-дазы (МП) оценивали с использованием метода Пигаревского В.Е. (1982). Активность щелочной фосфатазы определяли методом азосо-четания в модификации Нарциссова Р.П. (1970). Результаты учитывали путем расчета среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Для получения дополнительной информации был проведен подсчет процентного распределения нейтрофилов по интенсивности гистохимической реакции (окрашивания). В лизосомально-катионном тесте клетки с интенсивностью окрашивания 0 - 0,5 обозначали как низкоактивные, 1 - 1,5 - среднеактивные, 2 - 2,5 - 3 - высокоактивные. При оценке МП, клетки с интенсивностью окраски 0 - 1 считали низкоактивными, 2- среднеактивными, 3 - высокоактивными. При анализе ЩФ, нейтрофилы с интенсивностью окраски 0- расценивали как не имею-

щие активности, 1- низкоактивные, 2 - среднеактивные, 3 - высокоактивные.

При статистической обработке результатов использовали рекомендации Иванова Ю.И. и Погорелюка О.Н. (1990). Различия считали достоверными при Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Функциональная активность нейтрофилов ротовой полости здоровых людей.

На первом (доклиническом) этапе исследований в сравнительном аспекте проведено изучение рецепторзависимой адгезии, респираторного взрыва (в реакциях люминолзависимой хемилюминисценции и НСТ- тесте ), активности общей фракции лизосомальных катионных белков, миелопероксидазы и щелочной фосфатазы нейтрофилов ротовой полости и крови здоровых людей.

Адгезивные реакции. В реакциях 1дС-, СЗЬ- и коллаген-зависимой адгезии показатели для оральных НГ составляли: 19,19 ± 1,09%; 21,31 ± 1,42 % и 22,37 ± 1,5 %. Для нейтрофилов крови, те же показатели были достоверно выше и составляли 35,60 ± 3,24 %; 37,63 ± 3,57 % и 59,48 ± 2,68 % ( Р< 0,01 ). Ослабление адгезивной активности оральных нейтрофилов могло быть обусловлено либо процессом эмиграции из крови в ротовую полость, либо воздействием на них слюны. Для проверки второго предположения была проведена обработка НГ крови секретом ротовой полости, с последующей оценкой их способности к адгезии на используемых сорбентах. Результаты свидетельствуют, что слюна не оказывает существенного влияния на адгезивные реакции НГ: в опытах со всеми сорбентами показатели для клеток, обработанных и необработанных слюной достоверно не различались (Р > 0,05).

Наиболее общим выводом из проведенных исследований является то, что оральные нейтрофилы характеризуются снижением рецеп-торзависимых адгезизных реакций по сравнению с клетками крови. Факторы, приводящие к угнетению адгезивных реакций НГ ротовой полости, остаются невыясненными. Не исключено, что перестройка ре-цепторного аппарата нейтрофилов происходит в ходе их эмиграции из кровеносного русла.

Кислородзависимьш метаболизм Показатели спонтанного НСТ-теста с нейтрофилами крови были значительно выше, чем в клет-

ках ротовой полости, соответственно 0,10 + 0,01 и 0,03 ± 0,005 (Р<0,001). В индуцированной реакции с опсонизированным зимозаном (взаимодействие через рецепторы CR1 и CR3 для производных СЗЬ фактора комплемента (Маянский Д.Н., Урсов И.Г.,1997)), ответ оральных НГ был минимальным и находился на уровне спонтанной реакции, тогда как в опытах с НГ крови отмечалось значительное увеличение показателей восстановления HCT (0,64 + 0,062; Р< 0,001). Ответ на S.marcescens (взаимодействие через CR1 и CR3 рецепторы) (Маянский А.Н. и др., 1982) был аналогичен результатам полученным в реакциях с опсонизированным зимозаном: НГ крови отвечали выраженной стимуляцией (0,60 ± 0,046; Р<0,001), нейтрофилы ротовой полости не проявляли способности к респираторному взрыву (0,02 ± 0,011; Р > 0,05).

Исходя из наших опытов с адгезией, где было отмечено ослабление СЗЬ-зависимой адгезии оральных НГ, ареактивность к S. marcescens и опсонизированному зимозану, можно было спроецировать на снижение рецепторной функции НГ ротовой полости. Для проверки этого предположения в индуцированном HCT- тесте был использован ФМА, реактивность к которому не зависит от специфической рецепции (прямая активация протеинкиназы С (Maridonneau -Parini I. et al.,1986)). В этих опытах выявлена та же тенденция: НГ крови активно реагировали на раздражение (0,65 ± 0,053; Р< 0,001), оральные НГ не проявляли способности к усилению восстановления HCT (0,02 ± 0,004; Р>0,05). Это означало, что нарушение данной функции не было связано с восприятием стимулирующих агентов, а имело более "глубокий" механизм, затрагивающий реализацию респираторного взрыва. Представляется маловероятным, что этот дефект возникает на этапе эмиграции нейтрофилов из кровяного русла, так как экссуда-тивные НГ (например клетки "кожного окна") обладают сопоставимой с НГ крови реактивностью в НСТ-тесте (Маянский А.Н. и др., 1979; 1980). Скорее можно было предположить о негативном кондиционирующем эффекте на нейтрофилы секрета ротовой полости. Для подтверждения этого предположения были проведены опыты с НГ крови, обработанными пулом слюны здоровых доноров (30 мин,37°С). Прединкуба-ция со слюной приводила к резкому снижению чувствительности к опсонизированному зимозану, делая ее сопоставимой с показателями индуцированного НСТ-теста нейтрофилов ротовой полости - соответственно 0,043 ± 0,008 (НГ крови) и 0,03 ± 0,009 (оральные НГ; Р>0,05). Жизнеспособность клеток существенно не менялась.

Для получения дополнительной информации о функциональной активности НГ ротовой полости, мы использовали значительно более чувствительный, чем НСТ-тест, метод регистрации респираторного взрыва - люминолзависимую хемилюминесценцию (ХЛ). Установлено,

что оральные НГ характеризовались более высокой спонтанной реакцией (сХЛ), чем клетки крови, однако, различия были не достоверны-соответственно 77,25 ± 16,71 тыс. имп / мин и 56,71 ± 9,83 тыс. имп / мин; (Р>0,05). В индуцированной реакции (иХЛ), кроме опсонизиро-ванного зимозана и ФМА использовали Б. ер1с!егт1с11з шт.178 М (взаимодействие с нейтрофилами через лектинуглеводные контакты (Невмятуллин А..Л.,1988)) и латекс (взаимодействие за счет гидрофобных контактов ( Мс РИаН I. С., е1 а1.,1984 )). В опытах с НГ крови все стимуляторы вызывали выраженную реакцию: индекс стимуляции составил 22,47 ± 6,75 (опсонизированный зимозан), 17,76 ± 4,20 (Б. ер1с1егп-нс11з 178 М), 23,35 ± 4,30 (ФМА) и 27,58 ± 5,11( латекс). В аналогичных экспериментах реакция оральных нейтрофилов была выражена значительно слабее: 4,14 ± 0,59 (опсонизированный зимозан); 1,54 ± 0,21(5. ер1с1егг™с11з 178 М); 4,34 ± 0,61 (ФМА) и 2,82 ± 0,36 (латекс), (относительно НГ крови Р < 0,01- 0,001)

Для выяснения влияния слюны на показатели ХЛ, нейтрофилы изолированные из крови, инкубировали с пулом слюны (30 мин, 37°С) и после отмывания исследовали в реакции ХЛ с опсонизированным зи-мозаном. Обработка слюной достоверно усиливала сХЛ (172,67 ± 28,64 тыс. имп / мин, Р < 0,05), что можно объяснить стимулирующим воздействием бактерий и их дериватов, присутствующих в секрете ротовой полости (АгЬкепаг! М. е1 а1., 1989;1990). Напротив, в опытах с индуцированной ХЛ отмечено существенное снижение реактивности НГ крови после их прединкубации со слюной (ИС - 2,84 ± 0,35; Р<0,001). Результатом этого явилось сближение показателей индекса стимуляции нейтрофилов крови, обработанных слюной и оральных НГ ( 2,84 ± 0,35 и 4,14 ± 0,59 ; Р>0,05). Проведенные исследования позволяют придти к заключению о том, что секрет ротовой полости подавляет реактивность НГ, т.е., обладает противовоспалительным эффектом.

Результаты, полученные в опытах с индуцированной ХЛ принципиально соответствуют данным НСТ-теста. Они отражают гипореак-тивность системы респираторного взрыва оральных НГ, которая выражалась в ослаблении продукции эффекторов кислородзависимой био-цидности нейтрофилов. В обоих случаях состояние гипореактивности не было связано с нарушениями клеток на уровне рецепции стимулирующих сигналов ( наблюдалось в реакциях со всеми агентами ) и формировалось под влиянием секрета ротовой полости. Исходя из природы эффекторов восстановления НСТ и люминолзависимой ХЛ, можно думать, что дефект возникает на этапе пострецепторной трансляции стимулирующего сигнала, в частности в системе самого респираторного взрыва.

Различия между данными, полученными в опытах с оральными нейтрофилами в реакциях восстановления НСТ и ХЛ (полная ареак-

тивность в спонтанном и индуцированном НСТ -тесте и повышенные показатели спонтанной ХЛ) не являются, на наш взгляд, принципиальными и, вероятно, обусловлены техническими причинами, в частности более низкой чувствительностью НСТ - теста.

Цитохимические реакции. Проведено изучение активности ЛКБ, МП и ЩФ в НГ крови и ротовой полости здоровых людей (20 взрослых и 70 детей в возрасте 5-15 лет) (табл. 1).

ЛКБ. Активность общей фракции катионных белков в НГ ротовой полости была значительно выше, чем в клетках крови (Р< 0,001). Данные различия были обусловлены тем, что в крови преобладали сред-неактивные нейтрофилы (81%), тогда как высокоактивные клетки составляли лишь 14%. В оральных нейтрофилах отмечалось противоположное соотношение: среднеактивные НГ составляли - (9 - 14 %, в зависимости от возраста), высокоактивные - ( 86 - 90 %, также в зависимости от возраста ). Средние значения СЦК не зависели от возраста, и были лишь немного повышены у детей старшей группы (Р>0,05). Анализ процентного распределения НГ по интенсивности окрашивания не выявил в изучаемых группах значимых различий в количестве средне - и высокоактивных клеток.

ЩФ. Активность щелочной фосфатазы в нейтрофильных грану-лоцитах также достоверно увеличивалось при эмиграции из крови в ротовую полость (Р< 0,001). Это было связано с увеличением в оральных нейтрофилах числа низкоактивных клеток, на фоне снижения количества НГ с нулевой активностью. Средние значения активности щелочной фосфатазы в НГ ротовой полости не зависели от возраста, и лишь у детей старшей группы отмечалось незначительное повышение данного показателя (Р>0,05). Процентное распределение нейтрофилов по интенсивности окрашивания также не зависело от возраста.

МП. В отличие от уровня ЛКБ и ЩФ, активность миелопероксида-зы в НГ крови была достоверно выше, чем в оральных нейтрофилах (Р< 0,001). Это объяснялось тем, что в крови здоровых детей и взрослых преобладали клетки со средней и высокой активностью фермента, тогда как в ротовой полости более половины нейтрофилов проявляли слабую МП - активность, а высокоактивные клетки практически отсутствовали. Это могло быть результатом секреторной дегрануляции в процессе эмиграции нейтрофилов из сосудистого русла, или непосредственно в ротовой полости. Влияние возраста на величину СЦК выявлено только у детей старшей группы (15 лет ): МП - активность их

НГ снижалась (Р<0,01), за счет значительного увеличения в популяции оральных нейтрофилов количества слабоактивных клеток (Р< 0,01).

Таблица 1

Показатели активности ЛКБ, МП и ЩФ в нейтрофилах крови и ротовой полости здоровых детей и взрослых ( М +_т )

Группы наблюдения НГ крови НГ ротовой полости

ЛКБ ЩФ МП ЛКБ ЩФ МП

Дети 5-6 лет 2,12+ 0,03 0,79+ 0,02 1,39+ 0,02 *

Дети 7-8 лет 2,17+ 0,02 0,77+ 0,03 1,35+ 0,02

Дети 9-13 лет 1,39+ 0,01 0,35+ 0,01 2.075+ 0,02 2,16+ 0,02 0.80+ 0,02 1.37+ 0,02 *

Дети 15 лет 2,21 + 0,04 0,85+ 0,02 1,23+ 0,01

Взрослые 18-22 лет 1,40+ 0,02 0,35+ 0,03 2,06+ 0,03 2,15+ 0,03 0,80+ 0,03 1,38+ 0,02

Примечание: * - достоверность различий относительно детей в возрасте 15 лет (Р<0,01)

Наиболее общим выводом из выполненных исследований является то, что эмиграция нейтрофилов из крови в ротовую полость и пребывание их в полости рта, оказывают на клетки кондиционирующее воздействие, которое значительно влияет на их функциональное состояние. Это проявилось в снижении адгезивных реакций, ослаблении резерва реактивности (по данным НСТ- теста и ХЛ ), падении активности миелопероксидазы и одновременном увеличении активности общей фракции лизосомальных катионных белков и щелочной фосфа-тазы.

В целом, несмотря на некоторые физиологические особенности, оральные нейтрофилы можно рассматривать как достаточно активные клетки, чей потенциал увеличивается за счет значительного "представительства" в полости рта. Это вероятно позволяет играть им заметную роль в реакциях местного иммунитета.

Функциональная активность нейтрофилов ротовой полости при некоторых патологических состояниях.

Нейтрофилы рассматривают как один из важнейших эффекторных инструментов гомеостаза. Воспринимая многочисленные сигналы о дестабилизации внутренней среды, фагоциты активируют свои функции, нацеленные на ее восстановление. Это универсальный принцип, который лежит в основе всех фагоцитарных реакций, делая их индикатором нормы и патологии, благополучия или неблагополучия в организме в целом ( Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989).

На втором (клиническом) этапе исследований нами изучена реактивность НГ ротовой полости при ряде распространенных воспалительных заболеваний у детей - язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (ЯБДК), остром гнойном гайморите и бронхиальной астме. Дополнительным стимулом для этого, явились литературные данные об изменениях цитохимического и метаболитического профиля нейтрофилов крови у больных с указанной патологией, ( Шубич М.Г., Нагоев Б.С.,1980; Успенский В.М. и др.,1989; Мазинг Ю.А.,1988; Нагоев Б.С. и др.,1994; Власов А.Б.,1997; Пискунов С.З., Пискунов Г.3.,1991; Бережная Н.М.,1988). Опыты, проведенные с нейтрофилами здоровых людей, дали нам основания для использования в качестве доступных и информативных критериев цитохимические характеристики оральных нейтрофилов - ЛКБ, МП и ЩФ.

Нас интересовали два основных вопроса : во- первых, возможно ли увидеть какие-либо функциональные отклонения в оральных НГ на фоне нарушений внутренней среды организма, и , во-вторых, насколько они соответствуют реактивным сдвигам, возникающим в их циркулирующих предшественниках (НГ крови).

С этой целью в сравнительном аспекте были изучены нейтрофилы крови и ротовой полости 75 детей с ЯБДК (40 человек - в фазе обострения и 35 - в фазе клинической ремиссии), 19 детей с острым гнойным гайморитом и 10 детей с обострением бронхиальной астмы. В связи с тем, что большинство обследованных было в возрасте 10-14 лет, контрольную группу составили 23 практически здоровых ребенка 9 -13 лет. Для каждого из исследуемых показателей выводили уровень, принятый нами за условную норму. Он соответствовал значениям, которые наблюдались у подавляющего числа здоровых детей ( 87,0% -91,3 % случаев) и укладывался в интервале М ±1,5 3.

Проведено изучение функциональной активности нейтрофилов крови и ротовой полости при язвенной болезни у детей.

ЛКБ. В НГ крови на всем протяжении болезни средние показатели СЦК не зависели от фазы заболевания и были достоверно ниже, чем в контроле: фаза обострения - 1,12 ± 0,037; фаза ремиссии - 1,12 ± 0,04; контроль - 1,39 ± 0,014 (Р< 0,001). Общее число нарушений условной нормы составило 78,3 ± 6,1% (обострение ) и 88,2 ± 5,5 % ( ремиссия ); в контроле 13,0 ± 7,0 % ( Р < 0,001).

Анализ изменений показателей ЛКБ в оральных НГ, выявил иную направленность. Средний уровень СЦК имел тенденцию к повышению, хотя в масштабе объема наших исследований он достоверно не отличался от контроля: обострение - 2,23 ± 0,03; ремиссия - 2,22 ± 0,028; контроль - 2,16 ± 0,02 ( Р > 0,05 ). Отклонения от условной нормы составляли 51,3 ± 8,0 % ( ремиссия ) и 48,6 ± 8,4 % (обострение); в контроле 8,7 ± 5,9 % ( Р < 0,01).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что активность ЛКБ не зависит от фазы заболевания и остается неизменной на протяжении всего патологического процесса, как в НГ крови, так и в оральных нейтрофилах; при этом число отклонений от условной нормы в клетках крови существенно превышает аналогичные показатели в НГ ротовой полости (Р < 0,01 ).

МП. В НГ крови средний показатель в течение всего периода наблюдений был достоверно выше, чем у здоровых детей: обострение - 2,31 ± 0,035 ; ремиссия - 2,28 ± 0,044 ; контроль - 2,075 ± 0,02 (Р < 0,001). Число показателей, отличавщихся от условной нормы, составило 73,9 ± 6,5 % ( обострение ) и 76,5 ± 7,3 % (ремиссия ); в контроле 13,0 ±7,0% (Р<0,001).

Нейтрофилы ротовой полости характеризовались существенным снижением средних значений МП- активности по сравнению со здоровыми: обострение - 1,12 ± 0,034; ремиссия - 1,06 ± 0,042; контроль -1,37 ± 0,02 (Р< 0,001). Общее число нарушений составляло 82,1 ± 6,2 % (обострение) и 94,3 ± 3,9% (ремиссия); контроль 13,0 ± 7,0% (Р< 0,001).

Проведенные опыты показывают, что так же, как уровень ЛКБ, активность миелопероксидазы в НГ крови и ротовой полости не зависит от фазы заболевания и существенно не меняется на протяжении патологического процесса. Что касается отклонений от условной нормы, то в НГ ротовой полости их число превышало количество нарушений в НГ крови ( в фазу ремиссии различия достоверны ( Р< 0,05)).

ЩФ. В нейтрофилах крови больных детей средние показатели активности не зависели от фазы заболевания и соответствовали контрольным значениям: обострение - 0,33 ± 0,052; ремиссия - 0,42 ± 0,062; контроль - 0,35 + 0,010 ( Р>0,05 ). Число показателей отличав-

щихся от условной нормы, составило 95,0 ± 4,9 % (обострение) и 85,7 ± 9,4 % ( ремиссия ), у здоровых 8,7 ± 5,9 % ( Р < 0,001 ).

В оральных нейтрофилах средние значения СЦК так же, как в клетках крови, оставались неизменными на протяжении всего заболевания и соответствовали контрольным данным: обострение - 0,81 ± 0,037; ремиссия - 0,86 ± 0,033; контроль - 0,80 ± 0,020. Количество нарушений условной нормы составило 36,7 ± 8,8 % ( обострение) и 53,1 ± 8,8 % ( ремиссия ), в контроле 13,0 ± 7,0 % ( Р< 0,05 ), что было значительно ниже, чем в НГ крови, особенно в фазу обострения (Р < 0,001; для фазы ремиссии Р< 0,05). Это говорит о том, что данный показатель в оральных нейтрофилах не всегда соответствует сдвигам, возникающим в НГ крови.

Проведенные нами наблюдения подтверждают данные других авторов о реактивных сдвигах в НГ крови в ответ на нарушение гомео-стаза при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (Мазинг Ю.А., 1988; Шубич М.Г., Нагоев Б.Г.,1980; Успенский В.Н. и др., 1989; Сторо-жук П.С., Малышев Ю.П., 1990). Они были зарегистрированы для всех трех использованных нами цитохимических показателей - ЛКБ, МП и (в меньшей степени ) ЩФ. Нейтрофилы ротовой полости у больных детей наиболее значительно отличались по одному критерию - МП (82,1% -94,3 % нарушений условной нормы), тогда как по другим показателям -ЛКБ и ЩФ, нарушения условной нормы отмечались не более, чем в 50% случаев. Обращает на себя внимание разнонаправленность сдвигов по МП в оральных НГ и нейтрофилах крови - соответственно снижение и повышение активности. Это может быть результатом секреторной дегрануляции нейтрофилов, эмигрирующих в ротовую полость, которая наблюдается в норме и усиливается при ЯБДК. В пользу этого свидетельствуют и более выраженные различия между МП- активностью НГ крови и ротовой полости у больных по сравнению со здоровыми: обострение -1,19 ± 0,03; ремиссия -1,24 ± 0,036, контроль - 0,70 ± 0,02 (Р <0,001).

Проведено изучение реактивности нейтрофилов ротовой полости и крови при остром гнойном гайморите у детей.

ЛКБ. В НГ крови средний показатель был достоверно выше, чем в контроле: больные - 1,85 ± 0,10; здоровые - 1,39 ± 0,014 (Р< 0,001). Нарушения условной нормы отмечались у 16 из 19 больных (84,2 ± 8,4%), в контроле у 13,0 ±7,0% ( Р <0,001).

В НГ ротовой полости направленность сдвигов была противоположной: у больных средние показатели ЛКБ в оральных нейтрофилах были значительно ниже, чем у здоровых - соответственно 1,61 ± 0,05 и 2,16 ± 0,02 (Р< 0,001), причем у всех обследованных наблюдались зна-

чения ниже условной нормы. Это могло свидетельствовать о преобладании среди оральных НГ, "старых", уже отработавших (декатиони-зированных) клеток. Об этом говорило и то, что в препаратах мы часто наблюдали внеклеточно расположенные катионные белки.

МП. В НГ крови детей с гайморитом средний показатель СЦК был выше, чем в контроле и составлял 2,268 + 0,058 и 2,075 ± 0,020 (Р< 0,01). Отклонения от условной нормы наблюдались у 18 из 19 обследованных ( 94,7 + 5,1%), в контроле у 13,0 ±7,3% (Р< 0,001 ).

В оральных НГ также отмечалось повышение МП - активности. Средний показатель у больных детей был достоверно выше, чем у здоровых и составлял 1,70 ± 0,07; в контроле -1,37 ± 0,020 ( Р< 0,01 ). Общее число отклонений от условной нормы составило 84,2 ± 8,4 %, что было значительно выше, чем в контроле -13,0 ± 7,0 % (Р < 0,001) и не отличалось от аналогичных показателей в НГ крови ( Р> 0,05).

ЩФ. В НГ крови больных детей средний уровень активности фермента был достоверно выше, чем у здоровых - соответственно 0,76 ± 0,09 и 0,35 ± 0,01 (Р< 0,01). Общее число нарушений составляло 89,5 ± 7,03 %, в контроле 3,7 + 5,9 % ( Р< 0,001).

В оральных НГ также наблюдалось повышение средних показателей активности ЩФ, однако различия были не достоверны: больные -0,93 + 0,08; здоровые - 0,80 ± 0,02 (Р>0,05). В целом нарушения условной нормы регистрировались у 11 из 19 обследованных (57,9 ± 11,3%), в контроле - 13,0 ± 7,0% ( Р< 0,05 ). Однако, как и в случае с ЯБДК, число отклонений по щелочной фосфатазе, в оральных НГ детей с гнойным гайморитом было достоверно ниже, чем в клетках крови (Р < 0,05).

Проведенные исследования свидетельствуют о реактивных сдвигах возникающих в НГ крови и ротовой полости при остром гнойном гайморите у детей. Для клеток крови они отмечались по всем используемым нами цитохимическим показателям. НГ ротовой полости вы-раженно (сопоставимо с нейтрофилзми крови) отличались по двум критериям - активности ЛКБ и МП, причем по катионным белкам нарушения условной нормы наблюдались у всех обследованных. Обращает на себя внимание разнонаправленность сдвигов по ЛКБ в НГ крови и ротовой полости - соответственно повышение и снижение активности относительно контроля. Отклонения по МП в обоих популяциях клеток носили однонаправленный характер (повышение активности). Интересно, что в отличие от ЯБДК, где в оральных НГ наблюдалось выраженное усиление МП- секреции относительно здоровых, при остром гнойном гайморите этот процесс замедлялся. Об этом свидетельствуют и менее выраженные различия между МП - активностью нейтрофи-лов крови и ротовой полости у больных по сравнению со здоровыми -соответственно 0,568 ± 0,062 и 0,705 ± 0,02 (Р< 0,05).

В сравнительном аспекте проведено изучение нейтрофилов крови и ротовой полости при бронхиальной астме у детей.

ЛКБ. В нейтрофилах крови у больных средние значения СЦК были значительно ниже, чем в контроле - 0,99 ± 0,08 и 1,39 ± 0,014; ( Р< 0,01 ). Отклонения от условной нормы (снижение активности) наблюдались у 8 из 10 обследованных ( 80,0 ± 12,7 %).

В оральных НГ больных детей также зарегистрировано достоверное снижение средних значений ЛКБ относительно здоровых, соответственно - 1,63 ± 0,04 и 2,16 ±0,02 ( Р < 0,001 ). У всех обследованных наблюдались показатели ниже условной нормы.

МП. В НГ крови средние значения СЦК у детей с бронхиальной астмой были достоверно ниже, чем у здоровых - соответственно 1,85 ± 0,08 и 2,075 ± 0,02 ( Р<0,05 ). Нарушения условной нормы зарегистрированы у 6 обследованных (60,0 ± 15,5 % ).

В оральных нейтрофилах больных детей средние показатели значительно превышали контрольные величины - 1,75 ± 0,04; 1,37 ± 0,02 ( Р < 0,01). Это было связано с тем, что у всех обследованных отмечались значения МП, которые превосходили по величине условную норму.

ЩФ. В НГ крови больных детей выявлено повышение средних значений СЦК, однако в пределах нашей выборки они достоверно не отличались от показателей здоровых - соответственно 0,50 ± 0,14 и 0,35 ± 0,01 ( Р >0,05 ).Отклонения от условной нормы ( как в сторону снижения, так и в сторону повышения результатов) отмечены у всех обследованных.

В НГ ротовой полости средний показатель активности щелочной фосфатазы тоже достоверно не отличался от контроля и составлял : больные - 0,71 ± 0,09; здоровые - 0,80 ± 0,02 (Р >0,05). Отклонения от условной нормы зарегистрированы у 5 из 10 обследованных ( 50,0 ± 15,8 %).

Полученные результаты в целом согласуются с данными ряда авторов о реактивных сдвигах в НГ крови при аллергических состояниях, в частности при бронхиальной астме у детей (Шубич М.Г., Нагоев Б.Г.,1980; Беликова В.В.,1976; Сафронова О.Н. и др., 1975; Дубовик Н.Ф. и др.,1969; Бережная Н.М., 1988 ). Они были зарегистрированы для всех изученных нами цитохимических показателей, но в первую середь для ЛКБ и ЩФ. Нейтрофилы ротовой полости наиболее значительно отличались по двум критериям - ЛКБ и МП, причем по обоим показателям отклонения от условной нормы наблюдались в 100% случаев, что превосходит аналогичные результаты для НГ крови. Отмечалась однонаправленность сдвигов по ЛКБ - достоверное снижение активности в НГ крови и ротовой полости. Нарушения по МП носили разнонаправленный характер - соответственно падение активности в НГ

крови и повышение - в оральных НГ. Это могло быть результатом практически полного прекращения МП-секреции нейтрофилами, эмигрирующими в ротовую полость при бронхиальной астме. В пользу этого говорит и минимальная разница между показателями МП - активности НГ крови и ротовой полости у больных, относительно здоровых -соответственно 0,10 ± 0,061 и 0,705 ± 0,02 ( Р< 0,001).

На основании наших клинических наблюдений можно сделать следующие обобщения:

-- Функциональная активность оральных нейтрофилов меняется по ряду показателей при различных заболеваниях; в этом отношении они принципиально не отличаются от нейтрофилов крови.

- Изменения оральных нейтрофилов не всегда соответствуют реактивной перестройке НГ крови; по некоторым из них они носят даже разнонаправленный характер. В наших исследованиях это отчетливо проявилось при изучении активности миелопероксидазы и результатов лизосомально- катионного теста. Анализируя показатели в оральных нейтрофилах, мы обратили внимание на сходство их сдвигов при бронхиальной астме и остром гнойном гайморите у детей: в обоих случаях наблюдалось снижение уровня катионных белков и повышение активности миелопероксидазы. Это отличало данные группы больных от детей с ЯБДК, у которых на фоне значительного снижения МП - активности практически не менялось содержание Л КБ в оральных нейтрофилах.

В связи с этим представляется возможным говорить о разных ( в нашем случае двух) вариантах реагирования НГ ротовой полости, один из которых вероятно характерен для патологии респираторного тракта. О том, что это не случайно, свидетельствует дополнительная серия наших исследований по изучению цитохимических показателей оральных нейтрофилов у 15 взрослых реконвалесцентов по острой респира-торно - вирусной инфекции ( ОРВИ ). У них также отмечено снижение средних значений ЛКБ (1,72 ± 0,04) и повышение уровня МП-активности (1,71 ± 0,05), что практически соответствует результатам, полученным в группах детей с бронхиальной астмой и острым гнойным гайморитом.

~ Согласно нашим данным, для клинических исследований целесообразно использовать два цитохимических показателя оральных нейтрофилов - лизосомально- катионный тест и определение активности миелопероксидазы.

- Нарушения оральных нейтрофилов по щелочной фосфатазе не зависели от патологии и проявлялись реже (примерно в 50% случаев), чем сдвиги по ЛКБ и МП. По зтому признаку НГ ротовой полости значительно уступали по чувствительности нейтрофилам крови.

ВЫВОДЫ

1. При комплексном анализе выявлены следующие особенности функциональной активности оральных нейтрофилов относительно нейтрофилов крови: снижение 1дС-, СЗЬ- и коллагензависимой адгезии, слабая способность к восстановлению нитросинего тетразолия, усиление спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции и гипореак-тивность в реакциях индуцированной хемилюминесценции, усиление цитохимических реакций на лизосомально-катионные белки (ЛКБ) и щелочную фосфатазу (ЩФ), снижение цитохимически выявляемой миелопероксидазы (МП).

2. Обнаружена противовоспалительная активность секрета ротовой полости, которая проявлялась в ослаблении кислородзависимых реакций нейтрофилов крови, прединкубированных со слюной.

3. Оральные нейтрофилы взрослых и детей различных возрастных групп не отличаются по цитохимическим критериям (ЛКБ, ЩФ, МП), отражающим функциональное состояние клеток. Исключением были дети старшей (15 лет) возрастной группы, у которых отмечено снижение миелопероксидазной активности.

4. Функциональная перестройка оральных нейтрофилов при патологических состояниях (язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, бронхиальная астма, гайморит, острая респираторно-вирусная инфекция) соответствует общим представлениям об индикаторном значении нейтрофилов при нарушениях внутренней среды.

5. По некоторым показателям реактивные изменения нейтрофилов крови и ротовой полости носят разнонаправленный характер и отличаются при разных заболеваниях.

6. Из трех цитохимических показателей оральных нейтрофилов (ЛКБ,ЩФ,МП) наиболее универсальным индикатором патологии является активность миелопероксидазы: ее снижение (язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки) или повышение (гайморит, бронхиальная астма) отмечены у 82,1- 100% больных детей.

7. Цитохимический анализ нейтрофилов ротовой полости может быть использован для оценки состояния гомеостаза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Маянская И.В., Шабунина Е.И., Ашкинази В.И., Толкачева Н.И. Функциональное состояние нейтрофилов у детей с заболеваниями же-лудочно - кишечного тракта // Сборник работ 3-й Российской конференции "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей". - М. - 1993.-С. 21 -23.

2. Ашкинази В.И., Маянская И.В., Челышев И.В. Сравнительная характеристика адгезивных реакций нейтрофилов полости рта и крови здоровых людей // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях : Сб. научи. тр. (Тез. докл. 12-й Российской научн. конф.) / Челябинск. - 1995. -С. 10.

3. Маянская И.В., Ашкинази В.И. Модификация реакции восстановления нитросинего тетразолия (HCT) нейтрофилами крови // Кли-нич. лабор. диагностика. - 1995. - N 3. - С. 59.

4. Жукова Е.А., Шабунина Е.И., Ашкинази В.И., Маянская И.В. Особенности изменений функциональной активности нейтрофилов крови при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у детей // Материалы 1- й Российской гастроэнтерологической недели. - С - Петербург. -1995. - С. 92.

5. Ашкинази В.И., Маянская И.В., Жукова Е.А., Власов А.Б., Сиби-рякова Н.И. Сравнительная характеристика кислородзависимых и кис-лороднезависимых реакций нейтрофилов ротовой полости и периферической крови здоровых людей // Материалы 2- й Российской гастроэнтерологической недели. - М. - 1996. - С. 244 - 245.

6. Ашкинази В.И., Маянская И.В., Жукова Е.А., Толкачева Н.И. Характеристика цитохимических реакций нейтрофилов крови и ротовой полости у детей с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки // Материалы 3- й Российской гастроэнтерологической недели . - М. -1997. -С.186.

7. Ашкинази В.И., Маянская И.В., Толкачева Н.И., Жукова Е.А. Функциональные особенности нейтрофилов ротовой полости у детей с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях : Сб. научн. тр. (Тез. докл. 13-й Российской научн. конф.) / Челябинск . - 1997. - С. 8 - 9.

8. Ашкинази В.И., Маянская И.В., Жукова Е.А., Толкачева Н.И. Цитохимические показатели нейтрофилов ротовой полости у детей с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки // Сборник работ 5-й конференции "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей".-М. -1998. - С. 60 - 62.

9. Ашкинази В.И., Маянская И.В., Жукова Е.А. Кислородзависи-мый метаболизм нейтрофилолов ротовой полости при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у детей // Сборник работ 5-й конференции "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей" . -М.- 1998.-С. 62-64.

10. Маянская И.В., Ашкинази В.И., Жукова Е.А., Толкачева Н.И., Абаджиди М.А. "Способ оценки состояния здоровья ребенка" // Приоритет от 12. 09. 97.; N 97115182/14 (016301)).

Список используемых сокращений

ИС - индекс стимуляции

ЛКБ - лизосомальные катионные белки

МП - миелопероксидаза

НГ - нейтрофильные гранулоциты

НСТ -нитросиний тетразолий

03 - опсонизированный зимозан

СЦК - средний цитохимический коэффициент

ФМА - форболмиристатацетат

ХЛ - хемилюминесценция

сХЛ - спонтанная хемилюминесценция

иХЛ - индуцированная хемилюминесценция

ЩФ - щелочная фосфатаза

ЯБДК - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки

Автор выражает сердечную благодарность и признательность сотрудникам кафедры микробиологии Нижегородской государственной медицинской академии ( заведующий кафедрой - д.м.н., проф. Маян-ский А.Н. ), коллективу лаборатории клинической иммунологии Нижегородского НИИ детской гастроэнтерологии МЗ РФ ( руководитель -к.б.н. Маянская И.В.), старшему научному сотруднику клинического отдела ( руководитель - д.м.н., проф. Шабунина Е.И.) НИИ детской гастроэнтерологии к.м.н. Жуковой Е. А. за содействие в работе.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ашкинази, Владимир Израильевич, Нижний Новгород

/Ч / * ~ \ ~ '

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НИЖЕГОРОДСКИЙ НАУЧНО - ИСЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ДЕТСКОЙ ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИИ

На правах рукописи

Ашкинази Владимир Израильевич

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ ЧЕЛОВЕКА

03. 00. 13 — физиология человека и животных

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор МаянскийА.Н.

Нижний Новгород, 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................3

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Индикаторное значение фагоцитарных реакций................................8

1.2. Особенности функциональной активности нейтрофи-

лов, полученных из очагов воспаления................................................................17

1.3. Функциональное состояние нейтрофилов ротовой полости..............................................................................................................................................................................23

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................................................30

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ

РОТОВОЙ ПОЛОСТИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ................................................................41

3.1. Адгезивные реакции............................................................................................................................41

3.2. Кислородзависимый метаболизм..................................................................................46

3.2.1. НСТ-тест............................................................................................................................................46

3.2.2. Люминолзависимая хемилюминесценция................................52

3.3. Цитохимические реакции........................................................57

4. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ ПРИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ

4.1. Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки......................................68

4.2. Острый гнойный гайморит..........................................................................................................75

4.3. Бронхиальная астма..........................................................................................................................81

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................................................................................89

ВЫВОДЫ.............................................................................................................................................................................99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................................................100

ВВЕДЕНИЕ

Изучение реактивности фагоцитов представляет интерес с нескольких точек зрения. Во - первых, фагоцитоз является базисным механизмом иммунитета и его ослабление снижает резистентность к инфекционным агентам, приводя к тяжелым осложнениям. Во - вторых, подвергаясь гиперактивации в зонах воспаления, фагоциты становятся опасными для хозяина, включаясь в патогенез флогогенных осложнений. Наконец , фагоциты (прежде всего нейтрофилы ) как высокореактивная категория клеток, служат чувствительным индикатором различных нарушений гомеостаза, что давно используется в качестве диагностического и прогностического критерия в клинической практике [ 67, 73 ]. С этой целью предложено использовать, основанные на функциональном зондировании нейтрофилов ( НГ ), специальные аналитические приемы, которые позволяют выявить такие изменения в организме, которые не регистрируются обычными гематологическими методами. В частности, большой интерес вызывает цитохимическая маркировка нейтро-фильных гранулоцитов. Это связано с доступностью и чувствительностью подобных реакций, когда результаты оценивают на уровне клеток. Нейтро-фил выступает здесь исключительно как мишень, воспринимающая нарушения гомеостаза и здоровья в целом, то есть речь идет о реактивных изменениях клеток, которые возникли в организме, указывают на неблагополучие в нем, и с этой точки зрения, имеют практический интерес [ 70 ]. При помощи цитохимических реакций метят многие метаболитические пути, ферментные и неферментные компоненты нейтрофилов. Чаще всего определяют щелочную и кислую фосфатазу, миелопероксидазу, катионные белки, активные формы кислорода. Значительный интерес представляет изучение фагоцитарного статуса с помощью реактивной хемилюминесценции ( ХЛ ) - высокочувствительного метода, позволяющего выявить реактивность нейтрофилов, которая сопутствует многим заболеваниям и очевидно отражает адекватность функционального напряжения гомеостатических механизмов на

фоне воспалительных процессов. Все сказанное в первую очередь относится к нейтрофильным гранулоцитам крови. Вместе с тем, все более пристальное внимание уделяется изучению местных защитных реакций, что позволяет судить о механизмах формирования органной патологии [ 3, 4, 17, 30, 51, 88, 104, 134, 135 ].

В условиях организма происходит непрерывный процесс эмиграции лейкоцитов из крови в ротовую полость [ 126, 127 ]. Установлено, что 95 - 97 % мигрирующих лейкоцитов составляют нейтрофильные гранулоциты [ 98, 100, 176 ]. Исследованы средние колебания числа лейкоцитов в полости рта здоровых лиц ; показано, что при воспалительных заболеваниях число оральных лейкоцитов увеличивается, а процент жизнеспособных клеток снижается [ 31, 54, 75 ]. Предложен тест для специфической диагностики лекарственной аллергии, основанный на торможении естественной эмиграции лейкоцитов в ротовую полость [ 2 ].

Сведения о функциональной активности нейтрофилов ротовой полости немногочисленны. Имеются данные о более высоком уровне СЗ и 1дС- зависимого розеткообразования оральных нейтрофилов по сравнению с нейт-рофилами крови [ 184 ]. Зарегистрировано ослабление адгезии оральных нейтрофилов на стекле [ 137 ]. Показано наличие у нейтрофилов ротовой полости рецепторов к эритроцитам барана, мыши и клеткам пекарских дрожжей [ 97, 98]. АвЬкепагу М. е! а1. [130, 131 ] наблюдали более интенсивное связывание оральными нейтрофилами анти - СИЗ антител и противоположную картину для анти- Рс К III. Весьма противоречивы данные касающиеся одного из ключевых механизмов фагоцитоза - респираторного взрыва. Так УататоЬ М. et а1. [ 200 ] сообщили о повышенной по сравнению с клетками крови продукции супероксидного радикала оральными нейтрофилами. Однако в более поздней публикации тех же авторов [ 201] приводятся прямо противоположные данные. Обращает на себя внимание, практически полное отсутствие работ по цитохимии оральных нейтрофилов. Можно сослаться лишь на публикации [ 6, 25, 26, 28 ], где изучались нейтро-

филы ротовой полости при хроническом тонзиллите у взрослых людей. Полностью отсутствуют исследования функциональной активности оральных нейтрофилов у детей: как в норме, так и при различных заболеваниях, что могло бы оказаться весьма полезным в педиатрии, учитывая доступность объектами атравматичность процедуры исследования.

Цель работы

На основе изучения функциональных параметров нейтрофилов ротовой полости определить возможность их использования в качестве индикатора нарушений гомеостаза.

Задачи исследования

1. Изучить функциональную активность нейтрофилов ротовой полости в сравнительном аспекте с нейтрофилами крови.

2. Установить возрастные особенности функциональных показателей оральных нейтрофилов.

3. Изучить функциональную активность нейтрофилов ротовой полости при некоторых патологических состояниях.

4. Обосновать методические подходы для клинико - диагностического использования оральных нейтрофилов.

Научная новизна исследований

Впервые изучена функциональная активность нейтрофилов ротовой полости здоровых взрослых и детей. Установлено, что оральные нейтрофи-лы отличаются от нейтрофилов крови снижением рецепторзависимых (1д в, СЗЬ и коллагензависимых ) адгезивных реакций. Изучены особенности респираторного взрыва нейтрофилов ротовой полости: установлена высокая спонтанная реакция и значительное ослабление реактивности при дополнительной стимуляции в люминолзависимых хемилюминесцентных реакциях и полная ареактивность в тесте восстановления нитросинего тетразолия

(НСТ- тесте). Впервые в возрастном аспекте в оральных нейтрофилах определено содержание лизосомальных катионных белков, миелопероксидазы и щелочной фосфатазы. Установлено, что нейтрофилы ротовой полости характеризуются высокой по сравнению с клетками крови активностью общей фракции лизосомальных катионных белков и щелочной фосфатазы и более низким уровнем миелопероксидазы. Впервые изучены цитохимические характеристики оральных нейтрофилов при ряде распространенных воспалительных заболеваний у детей - язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, остром гнойном гайморите и бронхиальной астме.

Теоретическая и практическая значимость

Разработаны методические подходы для изучения оральных нейтрофилов. Получена информация о функциональной активности нейтрофилов ротовой полости здоровых взрослых и детей в сравнительном аспекте с нейтрофилами крови. На основе ослабления индуцированных реакций лю-минолзависимой хемилюминесценции и НСТ-теста, сделан вывод о том, что слюна подавляет реактивность нейтрофилов; т. е. обладает противовоспалительным эффектом. В качестве доступных и информативных критериев, адекватно отражающих функциональное состояние оральных нейтрофилов, предложено цитохимическое выявление лизосомальных катионных белков и миелопероксидазы. Установлено, что функциональная активность НГ ротовой полости так же, как и нейтрофилов крови, меняется по ряду показателей при различных заболеваниях; при этом изменения происходящие в этих популяциях клеток нередко носят разнонаправленный характер.

Положения, выносимые на защиту

1. Эмиграция в ротовую полость и контакт со слюной оказывают влияние на функциональное состояние нейтрофилов.

2. Реактивность оральных нейтрофилов меняется при различных заболеваниях; в этом отношении они принципиально не отличаются от нейтро-

3. Изменения оральных нейтрофилов при нарушениях гомеостаза не всегда соответствуют реактивной перестройке нейтрофилов крови; по некоторым из них они носят разнонаправленный характер.

Список сокращений

ЗФР - забуференный физиологический раствор

Л КБ - лизосомальные катионные белки

МП - миелопероксидаза

НГ - нейтрофильные гранулоциты

нет - нитросиний тетразолий

сНСТ -спонтанный НСТ-тест

иНСТ - индуцированный НСТ- тест

03 - опсонизированный зимозан

хл - хемилюминесценция

сХЛ - спонтанная хемилюминесценция

иХЛ - индуцированная хемилюминесценция

ФМА - форболмиристатацетат

ЩФ - щелочная фосфатаза

ЯБДК - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки

СО - кластеры дифференциации

Е1_АМ - эндотелиально - лейкоцитарная адгезивная молекула

1САМ - межклеточная адгезивная молекула

1БР - адгезивная молекула суперсемейства иммуноглобулинов

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Индикаторное значение фагоцитарных реакций

Нейтрофилы рассматриваются не только как инструмент противоин-фекционного иммунитета, но и как универсальный фактор гомеостаза, реагирующий на многочисленные сигналы о дестабилизации внутренней среды [ 52, 63, 67, 70, 71, 90, 117 ]. Большинство исследований по фагоцитозу выполнено на нейтрофилах крови, клетках чувствительных к эндогенным медиаторам, стремительно реагирующих на изменения внутренней среды и быстро замещающихся "пополнением" из костномозговых предшественников. Оценить индикаторные возможности НГ удается с помощью целого набора специальных аналитических приемов, основанных на оценке их функциональной активности, которые выявляют такие изменения в организме, которые не регистрируются обычными рутинными методами. Изменения нейт-рофилов крови отмечали, исследуя их адгезию и рецепцию, миграционную активность, поглотительную способность, ферментные и неферментные компоненты, кислородзависимый метаболизм [ 9, 53, 66, 69, 70, 84, 87, 90, 101, 152, 163, 171 ].

Серия работ посвящена клиническому изучению адгезивных реакций НГ [ 20, 64, 69, 71, 115, 117, 139, 156, 202 ]. Адгезия обеспечивает взаимодействие нейтрофилов с эндотелием, а следовательно, выход в экстравазаль-ное пространство и реализацию эффекторного потенциала в очаге воспаления. В последнее время эндотелию отводится важная роль в реализации адгезивного процесса [ 145 ]. В норме имеет место постоянное прилипание НГ к эндотелию посткапиллярных венул [ 72 ]. При этом нейтрофилы маргинального (пристеночного) пула осуществляют "перекатывание" ( от англ. rolling ) вдоль эндотелия. Сигналы, поступающие из очага воспаления, активируют как НГ, так и эндотелиоциты. Подобная активация приводит к усилению адгезивности обоих типов клеток [182]. Эндотелиоциты стимулируются прежде всего на участке, расположенном вблизи очага воспаления. В свою очередь, активированные нейтрофилы плотно закрепляются на таком энДбТеЛии и в дальнейшем мигрируют через стенку сосуда по хемотакси-чеЬ^оК^у градиёнту в зону повреждения [ 136, 144, 145 }.

Адгезивные реакции между нейтрофилами и эндотелиоцитами носят специфический характер и осуществляются при помощи адгезивных молекул ( адгезинов ), присутствующих на обоих типах клеток. Различают три класса адгезинов: интегрины, селектины и адгезивные молекулы суперсемейства иммуноглобулинов -1 S F ( от англ. - immynoglobuline supergene family ). Их функциональная экспрессия может меняться в ходе воспалительной реакции. Нейтрофилы располагают интегринами и селектинами, тогда как эндотелий экспрессирует селектины и ISF.

Интегрины представляют собой гетеродимерные белки, состоящие из двух единиц: а и |3. В состветствии с типом р - субъединицы различают несколько подсемейств. В осуществлении адгезии нейтрофилов к эндотелию принимают участие |32 - интегрины ( CD -18 ) с а - цепями: CD11a, CD11b, CD11c. Прикрепление активированных нейтрофилов к эндотелию опосредуется в основном, CD11b / CD18 ( Mac -1 ) [ 119, 167, 186 ], хотя CD11a / CD18 ( LFA - 1) так же могут принимать участие в адгезии [ 150, 168 ]. Роль CD11c / CD18 (р 150, 95 ) менее изучена [ 145 ]. (32 - интегрины экспрессиру-ются на поверхности нейтрофилов постоянно, однако включаются в адгезивный процесс только после активации. Через Мае - 1 нейтрофилы фагоцитируют микробы, опсонизированные СЗ - фактором комплемента, и вступают в контакт с адгезивными белками эндотелия. Благодаря LFA - 1 лейкоциты ( особенно макрофаги и лимфоциты ) получают возможность вступать в тесный контакт с клеткой - мишенью ( опухолевой клеткой или клеткой, зараженной вирусом ) и убивать ее [ 73 ].

Другой группой адгезивных молекул являются селектины, имеющие в своем составе лектиновые участки. Различают три вида селектинов: L, Р и Е. Из них только L - селектины экспрессируются на нейтрофилах, опосредуя роллинг этих клеток вдоль стенки микрососуда [ 166, 197 ]. Перемещение НГ вдоль сосудистой стенки необходимо для адгезии нейтрофилов в непосредственной близости от участка воспаления. После активации нейтрофилов хематтрактантами, НГ сбрасывают L - селектины со своей поверхности, что вероятно связано с протеолитическим расщеплением молекулы селектина [ 158, 185 ]. Р - селектины экспрессируются на поверхности эндотелиальных клеток после стимуляции эндотелиоцитов. По - видимому, Р - селектины в

кооперации с L- селекгинами определяют начальный этап закрепления НГ на эндотелии в зоне начинающегося воспаления. Последняя группа селекти-нов - Е - селектины, обнаруживается только на эндотелиоцитах. Они усиливают адгезию эндотелия к нейтрофилам, связываясь с углеводными радикалами на поверхности последних [ 36, 119, 193 ] . Из Е - селектинов нужно прежде всего упомянуть адгезивный белок ELAM - 1 ( от англ. endothelium -leukocyte adhesion molecule ). Экспрессия E - селектинов индуцируется на активированном сосудистом эндотелии хемотаксическими факторами, бактериальными эндотоксинами, цитокинами, вовлеченными в воспалительный процесс. Контр - рецепторами для них могут быть Мае -1 / CR 3 ( CD11b / CD 18) и р 150, 95/CR4(CD11c/CD 18).

Третье семейство адгезивных молекул, вовлеченных во взаимодействие НГ и эндотелия, относится к ISF. На эндотелии, в частности экспрес-сируются три разновидности ISF: ICAM - 1, ICAM - 2 и ICAM - 3 (intercellular adhesion molecule ), которые служат лигандами для (32 - интегринов нейтро-филов. Для своей активации ISF требуют большего времени, чем селектины и поэтому последними включаются в развитие воспалительной реакции.

В целом, межклеточные взаимодействия в системе НГ - эндотелий реализуемые в ходе воспаления, можно представить как каскад последовательной активации адгезивных молекул на обоих типах клеток. Нестимулирован-ные нейтрофилы взаимодействуют с эндотелием через L- селектины. В тех участках, где эндотелий уже активирован, на его поверхности появляются Р -и Е - селектины, способные вступать в более плотный контакт с углеводными радикалами и L- селекгинами на поверхности нейтрофилов. Продолжающаяся стимуляция хематтрактантами и контакт с активированным эндотелием приводят к сбрасыванию с поверхности нейтрофилов L - селектинов и функциональной перестройке (32 - интегринов НГ, которая обеспечивает прочную фиксацию клеток на активированных эндотелиоцитах, начинающих экспрессировать к тому времени ICAM - 1, ICAM - 2 и ICAM - 3 ( лиганды для CD11 / CD 18 - интегринов ).