Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитотоксическая активность нейтрофилов IN VIVO. Механизмы регуляции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Цитотоксическая активность нейтрофилов IN VIVO. Механизмы регуляции"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

На правах рукописи

СУХАРЕВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ IN VIVO. МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ. 03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПуЩИНО-1994

Работа выполнена в Научно-производственном подразделении (НПП) " Биоцентр 11 Филиагса ордена Трудового Красного Знанени Института биоорганической химии имени М.М.Шемякина и

Ю.А.Овчинникова Российской Академии наук ( ФИБХ РАН ).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук В.Б. Садовников

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,профессор Ю.В.Евтодиенко

кандидат биологических наук, В.Г.Сафронова

Ведущая организация:

Институт Физико-химической Медицины РАМН, г.Москва.

Защита диссертации состоится часов на заседании Специализированного д.200.23.01 при Институте Биофизики Клетки ■ 142292', Московская обл., г.Пущино, ИБК РАН.

Ммлфл^ г. в &

1994 Г. Ученого совета РАН по адресу:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН. Автореферат разослан "__"______ г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук ^^]£'^т*и*Смолихина

л/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нейтрофильные гранулоциты являются вижущей силой воспаления как острого так и хронического, а в олее общем плане они - ключевые эффекторы гомеостаза. Нейтрофилы оставляют первую линию защиты организма, мигрируя первыми из ровяного русла в очаг воспаления. Обладая значительным итотоксическим потенциалом, нейтрофилы разрушают в очаге оспаления как патогенные микроорганизмы так и собственные ткани, роме того, продуцируя ряд факторов и медиаторов, нейтрофилы егулируют уровень развития воспалительных реакций. Степень овлечения нейтрофилов отражает глубину патологического процесса, ак дозируя количество вводимых подкожно стимуляторов, ейтрофилов можно получить весь спектр интенсивности

оспалительного процесса, от заметного лишь на гистологическом ровне до значительного некроза тканей. Воспалительные реакции рганизма, несмотря на большой интерес к данной проблеме со ремен древней Греции, остаются по сих пор одной из острейших роблем современной медицины. Так по признанию американских рачей только респираторный дистресс-синдром ( воспалительная еакция, вызванная внутрисосудистой активацией нейтрофилов, ледствием чего является повреждение легочного эндотелия и отек егких) ежегодно уносит около 80000 жизней.

Цель работы. Работа является частью комплексного исследования роводимого в НПП " Биоцентр " ФИБХ РАН по влиянию факторов икроокружения на функциональную активность клеток иммунной истемы в норме и патологии. Цель настоящей работы заключалась: в азработке модели воспалительной реакции для изучения итотоксической активности нейтрофилов in vivo в очаге зспаления; в непосредственном изучении цитотоксической ктивности нейтрофилов in vivo; в изучении предпологаемых эханизмов ингибирования и инволюции воспалительных реакций на ровне нейтрофилов. Для этого планировалось разработать эдификацию воспалительной реакции, индуцированной инъекцией ямозана в перитонеальную полость, позволяющей оценивать уровень тготоксичности нейтрофилов в очаге воспаления. Изучить: 1Тотоксическую активность нейтрофилов in vivo; влияни?"известных теивоспалительных препаратов на цитотоксическую активность гйтрофилов; влияние факторов сыворотки крови на функциональную

активность нейтрофилов; влияние температуры как наиболее характерного симптома воспалительных реакций на функциональную активность нейтрофилов из очага воспаления; процессы нормальной гибели нейтрофилов в очаге воспаления.

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработанная модификация воспалительной реакции позволила впервые измерить цитотоксическую активность нейтрофилов in vivo. На данной модели были изучены некоторые параметры цитотоксической активности: кинетика лизиса клеток, возникновение цитотоксической активности при индукции воспалительной реакции и др. Данная модель может использо-ваться для скрининга антивоспалительных препаратов, позволяет оценить влияние препарата на цитотоксическую активность нейтрофилов in vivo. Показано, что факторы сыворотки крови и сывороточный альбумин ингибирует функциональную активность нейтрофилов, предложен возможный механизм. Показано, что в очаге воспаления in vivo и in vitro при инкубации клеток при повышенной температуре у нейтрофилов развивается тепловой шок, который значительно ингибирует функциональную активность клеток. Обнаружено, что при миграции в очаг воспаления у нейтрофилов активируется программа клеточной гибели, приводящая к разрушению ДНК и затем к гибели клеток.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены: на научных семинарах Филиала Института

биоорганической химии им. М.М. Шемякина и отдела Иммунологии ИБХ РАН; на I-Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989); Международном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты биотехнологии лабораторных животных" ( Пущино 1990); международном семинаре по прикладной биотехнологии( Пущино 1993).

По материалам работы опубликовано 4 печатных работы, в настоящее время две работы готовятся к печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах и состоит из следующих разделов: введение,

литературный обзор, экспериментальная часть, обсуждение

результатов, выводы и список цитированной литературы, включающий 204 работ. Диссертация содержит 2 таблицы и 14 рисунков.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В обзоре литературы проанализированы имеющиеся сведения о биологии нейтрофильных гранулоцитов и их роли в воспалительных реакциях.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (Материалы и методы).

Животные. В работе использовали безмикробных (SPF-статуса) аутбредных мышей NMRI. средний вес экспериментальных животных составлял 20-25 грамм.

Выделение перитонеальных и кровяных нейтрофилов. Мышей забивали декапитацией, перитонеальную полость промывали физиологическим раствором. Смыв собирали шприцем, переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 400 g в течении 10 мин. Клетки наслаивали на фиколл-верографин и центрифугировали в течении 30 мин. В осадке нейтрофилы составляли 95%. Для выделения нейтрофилов из периферической крови ее собирали шприцем под наркозом из сердца животного. Далее нейтрофилы выделяли с использованием декстрана Т500 и фиколл-верографина по стандартной методике.

Моделирование воспалительной реакции. В перитонеальную полость мыши инъецировали 0.1 мл суспензии эимозана (5 мг/мл ).

Измерение продукции 02~. Продукцию о2~ нейтрофилами определяли по описанной нами ранее методике (Смирнов, 1989) с использованием нитросинего тетразолия.

Оценка цитотоксического действия перитонеальных клеток in vitro. Уровень лизиса эритроцитов определяли по выходу в раствор гемоглобина. Кратко: фагоциты выделяли из перитонеальной полости через 12- 14 часов после индукции воспалительного процесса. Реакцию проводили при 38°С. Каждая проба общим объемом 200 нкл содержала 50 млн. эритроцитов и 2 млн. перитонеальных клеток. После 45 минут инкубации клетки осаждали центрифугированием. Концентрацию гемоглобина в супернатанте определяли по оптической плотности раствора при длине волны 405410 нм.

Оценка цитотоксического действия перитонеальных клеток in vivo. После индукции воспаления аккумулированные в перитонеальной полости клетки стимулировали инъекцией в полость 1 мкг/мышь РМА. Одновременно в перитонеальную полость вводили клетки-мишени -сингенные эритроциты (в дозе 400 млн на мышь). Через 20 минут мышей забивали декапитацией и промывали перитонеальную полость

каждой 2 ил раствора Дульбекко в течение 2-3 минут. Сиывы собирали шприцом, переносили в пробирку и центрифугировали при 400g в течение 10 минут для осаждения клеток. Оптическую плотность супернатанта измеряли при длине волны 410 им для оценки количества вышедшего в раствор гемоглобина.

Удаление жирных кислот из препаратов коммерческого альбумина. Удаление жирных кислот из коммерческих препаратов альбумина проводили по описанному R. Chen методу, путем инкубации препаратов при pH 3 с активированным углем ( Norit A,"Fluka").

Изучение биосинтеза белка в перитонеальных нейтрофилах. Клетки через определенные интервалы выделяли из перитонеальной полости (как было указано выше) и инкубировали в течении часа при 37°С в среде RPMI с 3 53-метионином (4 МБк/мл уд. активность 10 ПБк/моль). Клеточные белки разделяли электрофорезом в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецил-сульфата натрия (ДДС-Na) по системе Laemli . Для выявления вновь синтезируемых белков с гелей делали радиоавтографы.

Определение процента фрагментации ДНК клеток. Определение процента фрагментации ДНК проводили по методике описанной Colotta. Процент фрагментации ДНК вычисляется как соотношение высоко- и низко-молекулярной ДНК в клетках.

Электрофорез ДНК. Тотальную ДНК выделяли общепринятым способом:экстракцией смесью фенол:хлороформ с последующей обработкой РНК-азой. Электрофорез проводили в 1% агарозе, содержащей бромистый этидий ( 1 мкг/мл) в 40 мм трис-ацетатном буфере, содержащем 1 мМ EDTA pH 8.0.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

А. ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ.

Цитотоксическая активность нейтрофилов in vitro. В предварительных исследованиях изучалась цитотоксическая активность и продукция 02~ отдельными фракциями перитонеальных клеток in vitro. Перитонеальные клетки выделяли через 12-14 часов после индукции воспалительной реакции и пропускали через фиколл-верографин с плотностью 1.086. В супернатанте более 90 процентов составляли макрофаги и лимфоциты, в осадке около 90% были нейтрофилы. Результаты представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, основными клетками, продуцирующими 02~ при стимуляции РМА, в перитонеальной полости через 12-14 часов после индукции

оспаления являются нейтрофилы. Они же обеспечивают основной иэис эритроцитов в данной системе.

Цитотоксическая активность нейтрофилов in vivo при ксперинентальном воспалении.

Кинетика лизиса эритроцитов в перитонеальной полости мыши, ереэ 12-14 часов после индукции воспалительной реакции в еритонеальную полость мышей вводили сингенные эритроциты (400 лн./мышъ) с опсонизированным зимозаном или без него. Через азличные промежутки времени мышей забивали декапитацией, и ценивали уровень лизиса инъецированных эритроцитов. Данные кспериментов представлены на рис.1. Показано, что основной лизис ритроцитов происходит в течение первых 20 минут. При инъекции ритроцитов без опсонизированого зимозана лизиса практически не аблюдается. Инкубация эритроцитов с опсонизированным зимозаном n vitro также не приводила к лизису клеток (данные не редставлены).

Таблица 1. Продукция 02~ и цитотоксическая активность in vitro аэличных популяций клеток перитонеальной полости через 12 - 14 асов после индукции воспалительной реакции при стимуляции РМА.

Фракция клеток РМА 100 нг/мл Продукция 02~ нмоль/мин 10® Кол-во лизированных эритроцитов, X 10б

Лимф,Макроф + 31+4 3.0 + 0.4

Лимф,Макроф - 2.5 + 0.4 0.7 + 0.4

Нейтрофилы + 105 + 12 13 + 2

Нейтрофилы - 13+3 1.4 + 0.5

Рис.1 Кинетика лизиса сингенных эритроцитов в перитонеаль-ной юлости мыши. В перитонеальную полость инъецировали 400 млн. -■иигенных эритроцитов с 1 мг опсонизированного эияозана (-Х-) и >ез (Ч>);

количество лизировянных эритроцитов, млн.

т

т

80

во

20

40

о

х—X

25

О

5

10

15

20

ВРЕМЯ ИНКУБАЦИИ. МИН.

Возникновение цитотоксической активности при воспалительной реакции. Изучали изменения в качественном составе популяции перитонеальных клеток и уровня цитотоксической активности клеток перитонеальной полости после индукции воспалительной реакции. Через различные промежутки времени после индукции воспалительной реакции в перитонеальную полость мышей вводили 1 мг опсонизированного зимозана и 400 млн сингенных эритроцитов в 0.5 мл раствора Дульбекко. Через 20 минут мышей забивали декапитацией и оценивали уровень лизиса эритроцитов. Как видно из графика (рис 2) , уже через 2-3 часа после индукции воспалительной реакции в перитонеальную полость начинают мигрировать из кровеносного русла нейтрофильные гранулоциты. Е это же время появляется цитотоксическая активность клеток перитонеальной полости, выражающаяся в усилении лизиса сингенньга эритроцитов. Максимальное количество нейтрофилов наблюдаете? через 12-14 часов после индукции воспалительной реакции. Практически одновременно достигается и максимальный уровень цитотоксической активности.

Рис 2. Изменения в составе популяции перитонеальных клеток ( количество клеток отложено по левой оси: -¿^-нейтрофилы, -+-

макрофаги ) и возникновение цитотоксической активности (-О-] после индукции воспалительной реакции.

КОЛИЧЕСТВО КЛЕТОК В ПЕРИТОНЕЯЛЬИОЙ ПОЛОСТИ. МЛН. _ _

КОЛИЧЕСТВО ЛИОИРОВЯННЫХ

эритроцитов, или.

100

40

so

80

20

О

ВРЕМЯ ПОСЛЕ HHa'JKUUH ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ. ЧАСЫ.

Влияние нестероидных противовоспалительных препаратов на: цитотоксическую активность перитонеальных клеток in vivo, миграцию к очагу воспаления и продукцию 02~ in vitro. Препараты вводили per os в виде суспензии или раствора в 30 мкл дистиллированной воды. Контрольные мыши получали дистиллированную воду. Каждый препарат давали мышам по следующей схеме: за 12 часов до индукции воспалительной реакции; за 2 часа до индукции воспалительной реакции; за 2 часа до оценки функциональной активности перитонеальных клеток, в следующих дозах: аспирин - 142 мг/кг, ортофен - 8.5 мг/кг, бутадион - 17 кг/кг. Через 12 часов после индукции воспалительной реакции оценивали следующие параметры : цитотоксическую активность in vivo , количество клеток в очаге воспаления и продукцию о2~ клетками in vitro. Данные представлены в таблице 2. Все проверяемые препараты ингибируют цитотоксическую активность перитонеальных клеток. Наибольший эффект ингибирования

наблюдался в случае применения ортофена. Миграцию клеток к очагу воспаления оценивали по общему количеству клеток в

перитонеальной полости после индукции воспалительной реакции.

Таблица 2. Влияние противовоспалительных препаратов на: цитотоксическую активность, миграцию к очагу воспаления и

продукцию 02" перитонеальныии клетками после индукции воспалительной реакции

Препарат Цитотоксичекая активность % Количество клеток/мышь Продукция 02-in vitro, %

Аспирин Бутадион Ортофен 100 + 24 56 + 18 38+10 * 25+13 * 12 + 2 11 + 2 8.5 + 1.0 10.5 + 1.5 100 + 15 87 + 17 102 + 15 65 + 9 *

* - р > 0.05

Б.РЕГУЛЯЦИЯ ЦИТ0Т0КСИЧЕСК0Й АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ.

Влияние сыворотки крови на цитотоксическую активность перитонеальных нейтрофилов in vitro. Перитонеальные нейтрофилы инкубировали с сингенными эритроцитами в среде с различной концентрацией сыворотки. Нейтрофилы стимулировали

опсонизированным зимозаном, хемотаксическим пептидом и форбол киристат-ацетатом и инкубировали в течении 30 минут при 37°С при слабом покачивании. Через 30 минут оценивали лизис эритроцитов по выходу гемоглобина в раствор. Результаты представлены на рис. 3. Наблюдается значительное ингибироваие цитотоксической активности нейтрофилов при стимуляции с РИА и fMLP. При стимуляции зимозаном малые концентрации сыворотки усиливают лизис эритроцитов, большие ( свыше 10%) ингибируют.

Рис.3 Ингибирование сывороткой крови цитотоксической активности перитонеальных нейтрофилов мыши in vitro при стимуляции: - Ч— fMLP; - - форбол миристат ацетатом; "И" опсонизированным зиноэанок.

ИНГИбИРОВЯННЕ ЦИТОТОКСНЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ. X

КОНЦЕНТРАЦИЯ СЫВОРОТКИ, %

Влияние альбумина на продукцию супероксид анион-радикала кислорода перитонеальными нейтрофилами. Предварительное изучение ингибитора функциональной активности нейтрофилов показало, что ингибитор при ионообменной хроматографии имеет сходные характеристики с сывороточным альбумином. Сывороточный альбумин фирмы "SIGMA" был дополнительно обезжирен путем инкубации в кислой среде с активированным углем. Часть обезжиренного альбумина была насыщена стеариновой кислотой, которая сама по себе никак не влияла на функциональную активность перитонеальных нейтрофилов. Перитонеальные нейтрофилы стимулировали различными' стимуляторами в среде с обезжиренным и насыщенным стеариновой кислотой альбумином. Результаты продукции о2~ нейтрофилами в данных средах представлены на рисунке 4. Как видно из графиков при стимуляции каждым из этих стимуляторов обезжиренный альбумин ингибирует продукцию 02~ нейтрофилами. Уровень ингибирования во всех случаях значительно ниже при инкубировании клеток в среде с альбумином, насыщенным стеариновой кислотой. Максимальное ингибирование обезжиренным альбумином функциональной активности клеток достигается при стимуляции клеток форболовыми эфирами.

Рис.4 Влияние альбумина (А- без альбумина, В- альбумина свободного от жирных кислот, С- альбумина, насыщенного стеариновой кислотой) на продукцию 02~ перитонеальными

нейтрофилами мыши in vitro при стимуляции: форболовым эфиром(100 нг/мл), зимозаном(100 мкг/мл), и fMLP( 10-6 M)

ПРОДУКЦИЯ 0~ НЕЙТРОФНЛЯМИ

У.

Влияние повышенной температуры на функциональную активность перитонеальных нейтрофилов. Нейтрофилы инкубировали в среде при повышенных температурах в течение разных временных интервалов. Затем клетки стимулировали форболовым эфиром (РМА) в

концентрации 100 нг/мл и определяли продукцию 02~ по восстановлению нитросинего тетразолия. Данные представлены на рисунке 5. Как видно из графика, уже при температуре 39°С наблюдается тенденция к снижению функциональной активности клеток. При температуре 43°С после 20 минут инкубации остаточная активность клеток составляет менее 20% от контроля.

Рис.5 Влияние инкубации перитонеальных вызванных нейтрофилов мыши при повышенной температуре в течении указанного по оси X времени на продукцию супероксид анион-радикала кислорода при стимуляции форболовым эфиром(100 нг/мл)

продукция С>2 НЕЙТРООНЛЙМИ.

X

время инкубации. мин.

Рис. N 6 нейтрофилов.

Тепловой шок А) при

инкубации в течении 15 иин при указанной температуре

В) tn vivo через 20 минут после инициации острой воспалительной реакции (Стрелкой указан HSP-70)

43 41 39 37 20 мин Контроль -А. В

Влияние температуры на изменения в биосинтезе белка в перитонеальных нейтрофилах in vitro. Перитснеальные нейтрофилы инкубировали в среде при определенной температуре в течении 15 минут. Затем температуру опускали до физиологической (37°С) и добавляли в среду метионин-353. Инкубировали в течение часа. После этого клеточные белки разделяли методом SDS фореза в ПААГ.

На рис.6А представлен автограф данного геля. Как видно из рисунка, первые изненения в биосинтезе белка можно обнаружить уже при температуре 3 9°С. При температурах 41°С и 43°С четко регистрируется явление теплового шока, сущность которого заключается в снижении общего биосинтеза белка и усилении синтеза белков теплового шока. В данном случае резко усиливается биосинтез белка теплового шока с массой 70 кда (HSP-70).

Изменения в биосинтезе белка нейтрофилами в очаге воспаления in vivo. Через 12-14 часов после индукции воспалительной реакции в перитонеальную полость иньецировали стимуляторы нейтрофилов, моделируя острую воспалительную реакцию. Через 20 минут мышей забивали декапитацией и выделяли клетки из перитонеальной полости. Нейтрофилы выделяли центрифугированием на фиколл-верографине в течение 15 мин. Затем клетки в течение часа инкубировали в среде с метионином-353. Клеточные белки разделяли методом SDS-фореза в ПААГ. На рис. 6В представлен радиоавтограф данного геля. Как видно из рисунка, через 20 минут после инъекции стимуляторов кислородного метаболизма фагоцитов появляются первые полосы БТШ-70, которых нет в контроле, что свидетельствует о развитии теплового шока у клеток. Однако при стимулировании клеток теми же стимуляторами in vitro изменений в процессе биосинтеза белка не наблюдалось (данные не представлены )•

Активация программы клеточной гибели в перитонеальных нейтрофилах при воспалительных реакциях. Изучение

ультраструктуры нейтрофилов из очага воспаления позволило предположить, что элиминация клеток из очага воспаления осуществляется путем активации в клетках программы клеточной гибели. На рисунке 7 представлена ультраструктура нейтрофилов из перитонеальной полости через 3 и 18 часов после индукции воспалительной реакции. Изменения в ультраструктуре нейтрофилов в ходе воспалительного процесса (повышение вакуолизации цитоплазмы, уменьшение ядра, повышение процента конденсированного хроматина в ядре) позволяет сделать предположение о активации программы клеточной гибели.

Для дальнейшей проверки данной гипотезы нами была изучена степень фрагментации ДНК перитонеальных клеток. Воспалительную реакцию индуцировали иньекцией зимозана в перитонеальную

I

А В

Рисунок 7. Ультраструктура нейтрофилов из очага воспаления через 3(А) и через 18(В) часов после индукции воспалительной реакции. ( N -ядро, Ъ - фагоцитированная гранула зимозана)

полость мыши. Мышей через определенные интервалы забивали декапитацией, выделяли перитонеальные клетки. Процент

фрагментации ДНК в клетках оценивали по методике, предложенной Со1о^а. Результаты представлены на рис. 8. Как видно из экспериментальных данных, практически одновременно с миграцией клеток в очаг воспаления, в клетках повышается процент низкомолекулярной или фрагментированной ДНК, что является следствием активации программы клеточной гибели. 90-95% клеток в перитонеальной полости при воспалении живые по тесту с трипановым синим. Фрагментация практически не обнаруживается в

нейтрофилах, выделенных из крови. На рис. 9 представлен электрофорез тотальной ДНК перитонеальных клеток, выделенных через указанные промежутки времени после индукции воспаления. Как видно из рисунка, уже через 4-8 часов возрастает процент

низкомолекулярной ДНК, организованной в характерные ступеньки ( ионо, ди, три, и т.д. нуклеосои).

ФРАГМЕНТАЦИЯ ДНК. X

ВРЕМЯ ПОСЛЕ ЫНДЧКЦИН ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ. ЧАСЫ

Рис. 8. изменение фрагментации ДНК перитонеальных клеток после индукции воспалительной реакции. Воспалительную реакцию индуцировали иньекцией зимозана в перитонеальную полость. Через время указанное по оси X нейтрофилы выделяли из перитонеальной полости и определяли процент фрагментации ДНК. А - процент

из периферической крови.

Рис.9. Электрофорез тотальной ДНК перитонеальных клеток. Клетки были выделены из перитонеальной полости мыши через указанное время после индукции воспалительной

реакции.

VI. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Изучение цитотоксической активности клеток в разработанной нами модели in vivo показало, что клетки, мигрирующие в перитонеальную полость обладают значительным цитотоксическик потенциалом. При инъекции в перитонеальную полость клеток-мишеней(сингенных эритроцитов) наблюдается их значительный лизис. Кинетика лизиса показывает, что основная волна лизиса заканчивается через 20 минут после стимуляции клеток, что совпадает с кинетикой продукции перекисных радикалов нейтрофилами при стимуляции in vitro. Кинетика миграции клеток в очаг воспаления показывает, что максимальный уровень цитотоксической активности в перитонеальной полости совпадает с максимальным количеством нейтрофилов в очаге воспаления. Лизиса практически не наблюдается в норме, в отсутствии нейтрофилов. Кроме того, in vitro при разделении клеточных популяций на фиколл-верографине, единственной популяцией, лизирующей эритроциты при стимуляции, была популяция перитонеалъных нейтрофилов. Таким образом, в данной системе именно нейтрофилы лизируют сингенные эритроциты в очаге воспаления. При пересчете, каждый нейтрофил лизирует до 10 сингенных эритроцитов. Эти данные показывают, что нейтрофилы являются мощными деструктивными элементами. Деструктивная активность нейтрофилов предполагалась и косвенно была показана при многих патологиях, однако до сих пор не было разработано модели воспалительной реакции, позволяющей оценивать ее. Изучение на данной модели действия некоторых препаратов, нестероидной природы (аспирин, ортофен и бутадион) показало, что все препараты ингибируют цитотоксическую активность перитонеалъных фагоцитов. Максимальное ингибирование наблюдали при применении ортофена (около 80%). Ортофен снижает удельную продукцию 02-, но практически не изменяет миграцию клеток к очагу воспаления. Механизм ингибирования сывороткой продукции перекисных радикалов перитонеальными клетками до конца не понятен. Мы тщательно проверили вероятность того, что снижение регистрируемого уровня продукции 02~ является артефактом, обусловленным взаимодействием сыворотки крови с нитросиним тетразолием. Используя в качестве источника 02~ реакцию фотолиза рибофлавина, мы показали, что сыворотка не ингибирует восстановление нитросинего тетразолия химически полученным 02~. Более того, на полярографической ячейке с электродом Кларка, регистрирующим концентрацию кислорода в среде было показано, что поглощение клетками кислорода.

используемого для генерации перекисных радикалов, ингибируется сывороткой. Таким образом, наиболее вероятно, что сыворотка оказывает воздействие непосредственно на клетки, ингибируя респираторный взрыв в ответ на стимуляцию. Для уточнения механизма действия мы использовали различные стимуляторы, активирующие клетки через различные метаболические пути. Действие всех используемых стимуляторов ингибировалось сывороткой, что свидетельствует в пользу того, что сыворотка оказывает воздействие не на рецепцию или проведение сигнала, а на эффекторное звено, и, возможно, непосредственно на активацию мембранной МАй(Р)Н-оксидазы. Предварительное выделение из сыворотки показало, что белок, ингибируюдий активность нейтрофилов, при ионообменной хроматографии и гель-фильтрации идет вместе с сывороточным альбумином. однако коммерческие препараты альбуминов не проявляли стабильной активности. Было сделано предположение, что значительную роль в данном процессе играют жирные кислоты. Дополнительное обезжиривание коммерческих препаратов подтвердило это предположение, поскольку обезжиренный альбумин ингибировал продукцию перекисных радикалов значительно сильнее, и, напротив, насыщение альбумина стеариновой кислотой снижало ингибируюиую активность препарата. Наиболее вероятно, что в основе данного механизма лежит перераспределение ненасыщенных жирных кислот ( арахидоновой и др.), образующихся в процессе активации клетки между мембраной и сывороточным альбумином. Возможность подобного перераспределения жирных кислот между мембраной и сывороточным альбумином показана на кардиомиоцитах.

Повышение температуры является характерным атрибутом всех острых воспалительных реакций. Нами показано, что in vitro при повышении температуры у нейтрофилов развивается явление теплового шока, выражающееся в замедлении процессов биосинтеза нормальных белков и усилении биосинтеза белков теплового шока. Особенно сильно усиливается биосинтез белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа. Кроме того, нами показано, что при тепловом шоке уровень продукции перекисных радикалов нейтрофилами снижается. При моделировании острой воспалительной реакции было показано, что нейтрофилы из очага воспаления находятся в состоянии теплового шока. Наиболее вероятная причина теплового шока клеток в очаге воспаления - совместное стрессовое действие перекисных радикалов и повышенной температуры.

Вероятно, основная цель развития теплового шока нейтрофилов in vivo при острых воспалительных реакциях - ограничить уровень

деструкции собственных тканей нейтрофилаии. Так, если нейтрофил, мигрируя в очаг воспаления, сталкивается с достаточным количеством перекисных радикалов и повышенной температурой, то уровень продукции перекисных радикалов данной клеткой снижается, что позволяет избежать избыточной деструкции собственных тканей при воспалительных процессах. Таким образом повышение температуры может рассматриваться как фактор ограничивающий цитотоксическую активность нейтрофилов с целью избежания значительных деструкций собственных тканей.

Следующим изученным механизмом ограничения воспалительного процесса является активация программы клеточной гибели или апоптоза. In vitro описан процесс апоптоза нейтрофилов человека, выделяемых из крови, при инкубации в питательных средах. При инкубации нейтрофилов человека через 24 часа появляются первые признаки апоптоза - фрагментация ДНК и конденсация хроматина. Однако in vivo апоптоз нейтрофилов не описан, поэтому некоторые авторы считают, что грубое выделение клеток является возможной причиной индукции апоптоза в клетках при культивировании. Наши данные показывают, что параллельно с миграцией клеток в перитонеальную полость нарастает процент фрагментации ДНК в перитонеальных клетках, достигающий максимального значения через 12 - 14 часов после инъекции. Выделение чистой популяции нейтрофилов из перитонеальных клеток с использованием фикол-верографина показало, что основная масса фрагментированной ДНК принадлежит нейтрофилам. Таким образом, одновременно с миграцией клеток из кровеносного русла активируется программа клеточной гибели, приводящая к разрушению клеточной ДНК. Гипотезу об активации программы клеточной гибели в клетках также подтверждает электрофорез тотальной ДНК перитонеальных клеток. На рисунке 9 видна характерная нуклеосомная ступенька - следствие активации Са++,Мд++-зависимой эндонуклеазы, разрушающей клеточный хроматин по межнуклеосомным сайтам. Сравнивая активацию апоптоза при воспалении с графиками возникновения цитотоксической активности in vivo (рис. N 2) , видно, что максимальный уровень цитотоксической активности совпадает с максимальным процентом фрагментации ДНК. Разрушение ДНК у клеток, мигрирующих в очаг воспаления, возможно, имеет следующий биологический смысл: в очаге воспаления клетки подвергаются мощному стрессовому воздействию, что вполне может привести к трансформации клеток. Но перерождение клеток с разрушенной ДНК невозможно.

л

Таким образом, еще одним защитным механизмом организма от избыточного разрушения тканей нейтрофилами в очаге воспаления является активация программы клеточной гибели практически одновременно с миграцией клеток в ткани. В случае, если нейтрофил контактирует со стимулятором, то реализуется его цитотоксический потенциал, в противном случае нейтрофил разрушается программой клеточной гибели с минимальными повреждниями окружающих тканей.

V. ВЫВОДЫ:

1. Разработана модель для оценки цитотоксической активности нейтрофилов in vivo, на которой показано, что нейтрофил при воспалительных процессах производит значительную деструкцию собственных тканей. Каждый нейтрофил лизирует до 10 сингенных эритроцитов.

2. Изучено влияние факторов сыворотки на функциональную активность нейтрофилов. Показано, что сыворотка ингибирует цитотоксическую активность нейтрофилов. Предложен механизм этого явления, в основе которого лежит связывание сывороточным альбумином свободных жирных кислот, образующихся при активации клеток.

3. Показано, что in vivo в очаге воспаления у нейтрофилов развивается тепловой шок. In vitro показано, что тепловой шок ингибирует продукцию перекисных радикалов перитонеальными нейтрофилами, и, следовательно, снижает цитотоксическую активность клеток.

4. Показано, что одновременно с миграцией в очаг воспаления в нейтрофилах in vivo активируется программа клеточной гибели, приводящая к разрушению клеточной ДНК и дальнейшей гибели клеток, что, вероятно, предотвращает повреждение собственных тканей нейтрофилами.

ь

По материалам диссертации опубликованы и подготовлены к печати следующие работы:

Смирнов С.В., Сухарев С. А.,Шадрин Б.П., Садовников В.Б. Ингибирование нормальной сывороткой крови восстановления

нитросинего тетразолия фагоцитирующими клетками. Иммунология . 1989 Г. N б, 35-39.

Смирнов С.В., Сухарев С. А., Дмитриева Е.С., Моргунова Л.В., Завгородний С. В, Садовников В. Б. влияние гуморального микроокружения на активность фагоцитирующих клеток. 1-й

Всесоюзный иммунологический съезд, Сочи, 15-17 нояб. 1989 (Тезисы докладов), с 103.

Сухарев С. А., Смирнов С.В., Садовников В.Б. Моделирование гуморального микроокружения при исследовании фагоцитов in vitro. Международный симпозиум "Теоретические и прикладные аспекты биотехнологии лабораторных животных" ( Пущино 1991).

S.V.Smirnov, S.A. Sukharev, E.S.Dmitrieva, L.V.Morgunova, V.B.Sadovnikov. Inhibition of Neutrophils-Mediated Lysis of syngeneic erythrocytes by components of blood serum and peritoneal fluid. Biomedical Science, 1990, v.l, 481-486.

Сухарев С.А., Смирнов С.В., Садовников В. Б. 1994. Тепловой шок нейтрофилов в очаге воспаления. Доклады РАН. Т 335 N4 стр 515-518.

Sukharev S.A., Smirnov S.V., Pleshakova O.V, Sadovnikov VB and Petrov R.V. Cytotoxicity of mouse peritoneal cells at inflammation in vivo. Scand. J. Immunol. In press.

4.10.94 г. Эак.6273Р Тир.100 экз. Уи.-иад.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН