Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль фосфорилирования в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль фосфорилирования в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов"

РГ8 ОД

На правах рукописи

ГА БДУЛХА КО В А АИДА ГАБДРАХМАНОВНА

РОЛЬ ФОСФОРНЛИРОВАНИЯ В АКТИВАЦИИ И ИРАЙМИРОВАНИИ РЕСПИРАТОРНОГО ВЗРЫВА НЕЙТРОФИЛОВ

Биофизика 03.00.02.

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Пущино 1999

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Сафронова В.Г.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Новосёлов В.И.

Кандидат биологических наук Щипакина Т.Г.

Ведущая организация - Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

Защита состоится 2000 года в "час

на заседании Диссертационного совета Д 200.23.01 по защите диссертаций по специальности "биофизика" при Институте биофизики клетки РАН, г. Пущино.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу:

142292, г. Пущино Московской области, ИБК РАН. Автореферат разослан г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук , 'Т.И. Смолихина

I I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Генерация активных форм кислорода является одной из основных цитотоксических функций нейтрофилов, обеспечивающих наиболее быстрые защитные реакции организма против инфекций. Респираторный взрыв происходит в результате фосфорилирования и сборки компонентов NADPH оксидазного комплекса. Нейтрофилы способны воспринимать множество сигналов и отвечать на них разнообразными реакциями, в основе чего лежит многообразие типов рецепторов на мембране и сложность внутриклеточной сигнальной системы. В результате интенсивных исследований внутриклеточной сигнализации в нейтрофилах становятся понятными механизмы развития реакций на такие физиологические стимулы, как иммунные комплексы [Watson & Edwards, 1998], цитокины [Ahlers et al., 1994; Kitagawa et al., 1996; Waterman et al., 1996;], ростовые факторы [Foltz et al., 1997], хемотаксические пептиды [McColl et al., 1990; Thelen et al., 1993], однако, нет четкого представления о последовательности проведения сигнала от рецептора к эффекторным молекулам.

Нейтрофил в организме, как правило, подвергается параллельному и/или последовательному воздействию интермедиатов, его активация чаще всего происходит на фоне измененного, "праймированного", состояния. Праймирующий стимул вызывает метаболическую перестройку, не приводящую к активации клетки, следствием его влияния является усиление ответа на последующую активацию. Представление о механизме праймирования респираторного взрыва нейтрофилов в настоящее время находится в стадии формирования. По литературным данным можно выделить 5 возможных механизмов: синтез белка de novo, усиление экспрессии плазматических мембранных рецепторов, модуляция уровня [Са2+]цит, модуляция активности фосфолипаз, тирозиновое фосфорилирование [Hallett & Lloyds, 1997]. Авторы рассматривают каждый механизм как самодостаточный для реализации праймирования. Мы предполагаем, что праймирование реализуется в результате перекрестного взаимодействии сигнальных путей, задействованных в праймировании и активации NADPH оксидазы. Предположение о перекрестном взаимодействии тирозинового и серин/треонинового фосфорилирования при праймировании респираторного взрыва нейтрофилов кажется нам наиболее привлекательным [Hallett & Lloyds, 1997]. В пользу этого механизма говорит то, что 1) воздействие на нейтрофилы факторов роста [McColl et al., 1991] и цитокинов [Akimaru et al., 1992; Minakami et al., 1993 Ahlers et al., 1994; Foltz et al., 1996] приводит к фосфорилированию по тирозину некоторых сигнальных ключевых молекул; 2) многие

праймирующие агенты не способны вызывать повышение уровня [Са2+]цит; 3) процессы синтеза белка, экспрессии плазматтеских мембранных рецепторов и модуляции активности фосфолипаз, вероятнее всего, являются вторичными событиями по отношению к фосфорилированию.

Ввиду сложности регуляции функций нейтрофила интересны причины возникновения нарушений при развитии патологий, когда избыточная дегрануляция и усиленная генерация АФК могут привести к поражению тканей и усилению патологического процесса. В последнее время появляется все больше работ с комплексным подходом к исследованию праймирования респираторного взрыва нейтрофилов, однако, обнаруживаются противоречивые данные, возможно, обусловленные различиями экспериментальных условий. Изучение эффектов физиологических медиаторов на функционирование нейтрофилов, в частности, инсулина, это малоисследованная область, связанная с актуальной проблемой дисфункции нейтрофилов при патологиях.

Цель и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании взаимодействия сигнальных путей, участвующих в опосредованных рецепторами процессах активации и праймирования респираторного взрыва нейтрофилов.

В соответствии с целыо работы были поставлены следующие задачи:

экспериментально подобрать оптимальные условия для исследования усиленного ответа перитонеальных нейтрофилов мыши на хемотаксический пептид Ы-формш-метиошш-лейцил-фенилалан.чн (ФМЛФ). Исследовать зависимость модулирующего действия инсулина, липополисахарида и ФМЛФ в низких концентрациях от времени и температуры преинкубации, от генотипа и условий содержания животных, от сочетания концентраций активирующего и праймирующего агентов;

провести сравнительный анализ действия ингибиторов на респираторный взрыв нейтрофилов при его активации ФМЛФ в низких и высоких концентрациях;

- установить специфичность действия инсулина на нейтрофилы и основные внутриклеточные мишени его праймирующего действия;

- определить роль тирозиновых киназ и фосфатаз в праймировании респираторного взрыва нейтрофилов инсулином, липополисахаридом и ФМЛФ в низкой концентрации;

Научная новизна. Впервые установлена связь гетерогенности физиологического ответа нейтрофилов с дивергенцией и перекрестным взаимодействием сигнальных путей. Впервые показана генетическая детерминированность реакции нейтрофилов на праймирование. Показана роль тирозиновых киназ и фосфатаз, обнаружено, что тирозиновые

киназы и фосфатазы вовлечены в активацию респираторного взрыва хемотаксическим пептидом и его модуляцию инсулином, липополисахаридом и ФМЛФ в низкой концентрации.

Научно-практическая ценность. Результаты работы вносят существенный вклад в понимание вопроса о вариабельности действия модулирующих факторов на функциональный ответ нейтрофилов. В методическом плане полученные результаты дают возможность оптимального выбора условий для наблюдения эффектов праймирующих агентов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на I - III Пущинских конференциях молодых ученых (Пущино, 1997-98); на конференциях: "Фундаментальные науки и альтернативная медицина" (Пущино, 1997); "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998); на отчетной годичной научной конференции ИБК РАН (Пущино,

1998); "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'99" (Санкт-Петербург,

1999), 25th Silver Jubilee FEBS Meeting (Дания, 1998); 43d Annual Meeting of the Biophysical Society (США, 1999); FASEB Meetings (США, 1998-99); международной летней школе "Molecular Mechanisms of Signal Transduction" (Греция, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 4 статьи и 1 статья в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на ¿/^'страницах, включает .'ff?рисунков; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных экспериментальных данных и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего fS^cunov..

Список сокращений. ФМЛФ - N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин, АФК - активные формы кислорода, ХЛ - шомшгал-зависимая хемишоминесценция, ФМА - форбол 12-миристат 13-ацетат, ЛПС - липополисахарид, ДАТ - диацилглицерол, ПКС - протеинкиназа С, IGF-1 - инсулино-подобный фактор роста-1, MAPKs - митоген-активируемые протеинкиназы (mitogen activated protein kinases), ERKs -киназы, регулируемые внеклеточным сигналом (extracellular signal regulated kinases), NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на перитонеальных вызванных нейтрофилах мышей линий NMRI, BALB/c и C57BL, содержащихся в условиях барьерной или конвенциональной зон вивария. Продукцию АФК оценивали методом люминол-зависимой хемилюминесценции.

Измерение [Са2+]цит проводили спектрофлуориметрически с помощью внутриклеточного ион-селективного зонда Fura-2AM [Tsien et al., 1982].

20

Время, мин

Рис. 1. Кинетика хемилюминесцентного ответа на 50 |дМ ФМЛФ интактных (1) и праймированных 1нМ инсулином (2) нейтрофилов. Стрелки указывают момент подачи праймирующего и активирующего агентов.

Праймирование проводили одним из следующих агентов: ФМЛФ (1-10 нМ); липополисахаридом из Е. coli (0.1-1000 нг/мл); инсулином (0.01-100 нМ). Инкубация с праймирующим агентом длилась 20 мин при 37°С, затем клетки активировали ФМЛФ (0.1-50 (iM).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На цитоплазматической мембране 1 нейтрофилов имеется множество рецепторов, связывание с которыми соответствующих лигандов не активирует клетки, но изменяет последующий ответ на активирующий агент. Модифицирующее воздействие может приводить к усилению или ослаблению ответа. "Праймированием" (от "priming"), как правило, называют действие, приводящее к усилению ответа (рис. 1 ).

1. Праймирование респираторного взрыва нейтрофилов через рецепторы разного типа.

Предобработка нейтрофилов инсулином, ЛПС и ФМЛФ в низкой концентрации не приводила к изменению уровня спонтанной ХЛ, но последующая активация вызывала усиленный ответ клеток. Для сравнения механизмов праймирования нами были выбраны агенты, действующие через разные типы рецепторов. Существуют данные о праймировании респираторного взрыва нейтрофилов ЛПС и ФМЛФ. ЛПС опосредует свое действие на нейтрофилы через рецептор CD 14, который является гликофосфоинозитид-связанным белком [Surette et al., 1996]. Механизм передачи сигнала с рецептора внутрь клетки до сих пор не ясен. Рецептор ФМЛФ относят к классу рецепторов, имеющих 7 трансмембранных сегментов [Thelen et al., 1993]. Рецептор инсулина является тирозиновой киназой [Kahn & White, 1988], которая активируется в результате связывания агониста с рецептором, что

приводит к автофосфорилированию Р-субъединицы рецептора. На нейтрофилах довольно хорошо изучены структура и функции рецептора ФМЛФ [Tennenberg et al., 1988; Felther et al., 1989] и убедительно показана специфичность действия ЛПС [Nick et al., 1996]. Механизмы действия инсулина на нейтрофилы изучены слабо, данные о праймировании инсулином респираторного взрыва отсутствуют. Вопрос о наличии инсулинового рецептора и специфического связывания инсулина нейтрофилами остается спорным, к тому же, имеется возможность связывания инсулина рецепторами IGF-1 [Gutierrez et al., 1995]. Мы провели эксперименты по оценке параметров связывания инсулина перитонеальными нейтрофилами мыши.

1.1. Связывание инсулина с нейтрофилами было изучено с применением |251-инсулина. Было обнаружено, что связывание 1251-инсулина является высоко специфичным и протекает по кинетике с насыщением (рис.2А).

А

ом

0,005

Инсулин, ( Мх 10"' )

В,(Мх10")

Рис. 2. Специфическое связывание I-инсулина с нейтрофилами мыши (А) и его анализ в координатах Скэтчарда (Б).

Анализ специфического связывания 1-инсулина с нейтрофилами в координатах Скэтчарда [Бса^Иагс!, 1949] показал, что на поверхности этих клеток имеется два сайта связывания лиганда (рис. 2Б). При температуре 37°С были определены Кл=(5.0±0.32)х10"п М и К<12=(2.11± 0.87)х10"9 М, при 30°С К(Л=(4.81±0.46)х 10'" М и Ка2=(1.78±0.94)х10'9 М (п=4 для каждой серии опытов). Различия между соответствующими константами при 30°С и 37°С недостоверны. Таким образом, праймирование респираторного взрыва нейтрофилов инсулином, как ЛПС и ФМЛФ, опосредуется специфическим связыванием.

1.2. Определение условий для наблюдения усиленного респираторного взрыва нейтрофилов, вызванного ФМЛФ. В отличие от инсулина, праймирующее действие ЛПС и ФМЛФ известно и частично

исследовано, поэтому основное внимание было сконцентрировано на действии инсулина и его сравнении с действием ЛПС и ФМЛФ. Данные по действию инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов противоречивы [Fu et al., 1991; Jin et al., 1993; Spagnoli et al., 1995; Oldenborg, 1999], поэтому для исследования механизма усиливающего действия инсулина было необходимо определить условия, обеспечивающие воспроизводимость результатов.

1.2.1. Зависимость действия праймирующих агентов от температуры и времени преинкубации. Параметры связывания инсулина и его эффекты на функции клеток зависят от температуры [Fussganger et al., 1976; Gupta et al., 1987]. В наших опытах при температурах 22°С и 30°С инсулин не изменял ответ на 50 рМ ФМЛФ, тогда как при 37°С значительно усиливал его (рис. ЗА).

140

130

£ 120 X

•в- по •о-П

100 90 80

22° С 30° С 37° С 0 10 20 30 40 50 60

Время преинкубации, мин

Рис. 3. Модулирующее действие 1 нМ инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный 50 рМ ФМЛФ, зависит от температуры (А) и времени преинкубации (Б). Указаны средние значения эффекта ± стандартная ошибка и количество экспериментов. * - Р>0.95.

Как и в случае инсулина, праймирующий эффект 10 нг/мл ЛПС наблюдался при 37°С (32±9%) и отсутствовал при 30°С (-3±5%). При инкубации клеток с 10 нМ ФМЛФ праймирование было эффективнее при 20°С, чем при 37°С (21.5±8.7% и 10+11%, соответственно). Далее все эксперименты, проводили при 37°С.

Некоторые авторы отмечают изменения параметров связывания инсулина, направления и величины его эффекта на функции клеток или тканей в зависимости от времени его действия [Sager et al., 1990; Накипова и др., 1997]. По нашим данным усиливающее действие инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов (50 рМ ФМЛФ) начинает развиваться не менее чем через 15 мин преинкубации, максимальный эффект (28±6%) достигается через 20 мин, после чего происходит спад

эффекта (рис. ЗБ). При использовании в качестве праймирующего агента 10 нМ ФМЛФ усиление продукции АФК наблюдали через 5 мин с постепенным снижением эффекта при увеличении продолжительности инкубации. Возможно, что праймирование обеспечивается различными механизмами, которые реачизуются в узких временных рамках. Одним из первых событий в клетке при воздействии является фосфорилирование, которое запускает последующие процессы: метаболизм фосфолипидов, синтез белка, экспрессию мембранных рецепторов. Для сравнительного анализа механизмов действия используемых праймирующих агентов как оптимальное было выбрано время преинкубации 20 минут.

1.2.2. Роль генотипа и феиотипа в прагшироватш респираторного взрыва пейтрофичов была показана на нейтрофилах мышей двух инбредных линий ВАЬВ/с и С57ВЬ и одной аутбредной линии ЫМШ. По биохимическим маркерам для мышей линий ВАЬВ/с и С57ВЬ наблюдается сходство только на 42%. В нейтрофилах животных исследованных линий, содержащихся в барьерных и конвенциональных условиях, ответ на ФМЛФ возникал в диапазоне концентраций 0.1-50 цМ и зависел от концентрации ФМЛФ (таблица 1).

По характеристикам ответа на ФМЛФ гомозиготная линия С57ВЬ демонстрирует наибольшую устойчивость. На другой гомозиготной линии ВАЬВ/с, напротив, обнаружены наиболее значительные изменения ответа на ФМЛФ при адаптации к конвенциональным условиям. Для NN1111 следует отметить промежуточные уровни интенсивности ответов нейтрофилов мышей из барьерной зоны и понижение пороговой концентрации ФМЛФ при переходе в конвенциональные условия.

Таблица 1. Изменение суммарной продукции АФК в ответ на ФМЛФ нейтрофилов мышей линий ВАЬВ/с, ЫМШ и С57ВЦ содержащихся в условиях барьерной или конвенциональной (открытой) зон вивария._

Условия Барьерные Конвенциональные

[ФМЛФ], |дМ 0.1 1 5 10 50 0.1 1 5 10 50

ВАЬВ/с 1.64 4.44 29.37* 33.47* 29.24* 0.16 1.27 4.11 6.97 5.25

± 8ЕМ 0.37 1.24 3.85 5.28 3.91 0.03 0.42 0.64 0.92 0.99

п 9 12 15 12 17 14 22 28 24 15

ЫМЮ 0.02 1.53 15.03 19.54 18.32* 0.39 2.13 4.51 6.34 4.30

± 8ЕМ 0.02 0.47 4.62 4.80 3.47 0.03 0.33 0.55 1.18 1.18

п 5 9 10 10 12 7 8 11 10 5

С57ВЬ 0.62 2.07 7.31 10.71 6.71 0.11 0.49 3.64 4.56 3.18

± 8ЕМ 0.12 0.72 2.45 2.58 1.66 0.04 0.09 0.81 1.15 0.50

п 7 7 7 8 8 5 4 5 5 5

Примечание: * - достоверные разлтия между соответствующими ответами нейтрофилов мышей из барьерной и конвенциональной зон вивария, Р '0.95.

[ФМЛФ], мкМ

Рис. 4. Зависимости эффекта праймирования 10 нг/мл липополисахаридом от активирующей концентрации ФМЛФ нейтрофилов мышей, содержащихся в барьерных (А) или конвенциональных (Б) условиях: —О— ЫММ, —п— ВАЬВ/с, С57ВЬ.

Для праймированных клеток обнаружены следующие закономерности: 1) эффект праймирования в одинаковых условиях отличался у разных линий мышей (рис. 4Б), что говорит о его генетической зависимости; 2) эффект праймирования различался у мышей, содержавшихся в условиях барьерной и конвенциональной зон (рис. 4), что указывает на то, что реакция на праймирование формируется при условии наличия патогенной микрофлоры в среде обитания; 3) каждый праймирующий агент характеризуется определенной зависимостью эффекта от концентрации ФМЛФ (рис. 4Б).

1.2.3. Концентрационные зависимости праймирующего эффекта инсулина. Как было показано в предыдущем разделе, модулирующий эффект инсулина и ЛПС зависит от концентрации ФМЛФ (рис. 4). Кроме того, мы обнаружили, что модуляция ФМЧФ вызванного респираторного взрыва происходит при варьировании концентраций праймирующих агентов инсулина, ЛПС и ФМЛФ в подпороговой концентрации.

40

30

•е-

-е-Г>

-10

ю

о

Рис. 5. Модулирующее действие инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный хемотаксическим пептидом ФМЛФ. Столбики отражают средние значения эффекта, N=109.

Анализ полученных данных показывает, что в зависимости от условий эксперимента одни и те же вещества при действии на нейтрофилы могут, как усиливать, так и подавлять вызванный ФМЛФ респираторный взрыв или же не изменять его (рис. 5). По-видимому, в зависимости от условий (разных концентраций праймирующего и активирующего агентов) активируются альтернативные сигнальные пути, как инсулина, так и ФМЛФ. При активации праймированных клеток происходит сопряжение путей сигнализации, задействованных в праймировании и активации. По-видимому, при активации праймированных нейтрофилов это сопряжение (или перекрестное взаимодействие) путей сигнализации ФМЛФ и праймирующего агента в регуляции активности ЫАОРН оксидазы может происходить в разных точках, в результате чего мы наблюдаем модуляцию респираторного взрыва. При варьировании условий праймирования нейтрофилов (температуры и продолжительности, генотипических и фенотипических особенностей животных) сопряжение сигнальных путей также, вероятно, варьирует. Это может быть, в частности, следствием гетерогенности связывания используемых лигандов и дивергенции сигнальных путей [Уи-ката1а е1 а1., 1999]. -

Исследование сигнальных путей, ответственных за активацию респираторного взрыва, мы провели с использованием блокаторов.

2. Дивергенция и перекрестное взаимодействие сигнальных путей в активации и праймнрованни респираторного взрыва.

2.1. Сравнительный анализ действия ингибиторов на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный ФМЛФ. Из

литературных данных известно, что действие ФМЛФ приводит к фосфорилированию и активации МАРКиназ и ЕЛКиназ, а также протеинкиназы С, зависимой от Са2+ и ДАТ [Grinstein & Furuya, 1992; Thelen et al„ 1993; Torres et al., 1993; el Benna et al„ 1994; Zu et al., 1996; Downey et al., 1998; Zhang et al., 1998; Yagisawa et al., 1999]. Ho, поскольку (а) функциональный ответ нейтрофилов строго зависит от концентрации хемотаксического пептида [Snyderman & Pike, 1984], (б) связывание ФМЛФ гетерогенно [Radel et al., 1991], (в) модулирующее действие праймирующих агентов зависит от концентрации ФМЛФ, то, по-видимому, рецепторы с различным сродством к ФМЛФ задействуют разные сигнальные пути. С помощью ингибиторов мы провели исследование сигнальных систем, которые, возможно, участвуют в передаче сигнала от высоко- и низкоаффинных сайтов связывания ФМЛФ. Были использованы: тирфостин 51, специфический блокатор тирозиновых киназ; ортованадат натрия, блокатор тирозиновых фосфатаз; пирофосфат, неспецифический блокатор фосфатаз; цитохалазин В, ингибитор полимеризации актина; Н-7, блокатор серин/треониновых киназ; W-7, блокатор Са2+-кальмодулин-зависимой киназы.

Таблица 2. Модуляция вызванного ФМЛФ респираторного

взрыва нейтрофилов блокаторами и праймирующими агентами.

Концентрация ФМЛФ

Блокаторы 0.1 - 1 цМ 50 цМ

Тирфостин 51 ( 5 цМ) Полное подавление 1 63 ± 6%

Ортованадат (0.1 мМ) 4- 23 ± 17% Т 32 ± 4%

Пирофосфат (1 мМ) 4- 55 ±15% Т 62 ±16%

Цитохалазин В (1 |.iM) Т 91 ± 14% Т 40 ± 4%

W-7 (10 цМ) Т 272+115% Т 14 ±1%

Н-7 (10 цМ) 4- 40 ± 7% Нет эффекта

Н-7 (100 цМ) ■1 50+10% 1 50 ± 4%

Праймирующие агенты 1 цМ 50 цМ

Инсулин (1 нМ) Нет эффекта Т 28 ± 6%

ЛПС (Юнг/мл) Нет эффекта Т 32 ± 9%

ФМЛФ (10 нМ) Нет эффекта Т 11±3%

Стрелки указывают направление модулирующего действия (Т - усиление, ■I - подавление). Приведены усредненные значения по результатам 5-16 независимых экспериментов.

Тирфостин 51 вызывал подавление ответа на 50 рМ ФМЛФ на 63± 6% и полное подавление ответа на 1 цМ ФМЛФ (таблица 2). На основании наших результатов при использовании №-7 и Н-7 в концентрации 10 рМ мы можем предположить, что вклад Са2+-кальмодулин зависимой киназы, протеинкиназы С, цАМФ- и цГМФ-зависимых киназ в респираторный взрыв нейтрофилов изменяется при увеличении концентрации ФМЛФ. По-видимому, причиной разной чувствительности к тирфостину может быть уменьшение степени участия тирозиновых киназ в ответе с повышением концентрации ФМЛФ или дивергенция сигнальных путей на начальных этапах сигнализации ФМЛФ рецептора. Известно, что рецептор ФМЛФ в результате связывания с лигандом способен активировать либо гетеротримерные ГТФ-связывающие белки, либо так называемые малые в-белки, активация которых опосредуется тирозиновым фосфоршшрованием [ТЬе1еп е( а1., 1993; У1гката1а е1 а1., 1999]. Мы можем предположить, что рецептор ФМЛФ в состоянии высокого сродства к лиганду опосредует свое действие только через малые О-белки.

1 мМ пирофосфат и 0.1 мМ ортованадат усиливали вызванную 50 рМ ФМЛФ продукцию АФК, эффекты были значительны для обоих блокаторов (таблица 2). Причем, пирофосфат оказывал приблизительно в два раза .более сильное действие, что говорит о том, что около половины общего эффекта фосфатаз обеспечивается тирозиновыми фосфатазами. В случае малых доз ФМЛФ (0.1 рМ) пирофосфат и ортованадат вызывали подавление респираторного взрыва, что было совершенно неожиданным результатом (таблица 2). В данном случае эффект пирофосфата был в два раза больше, чем ортованадата. Общеизвестно влияние ортованадата на Ыа+,К+-АТФазу. Однако, существует несколько причин рассматривать эффекты ортованадата на вызванный ФМЛФ респираторный взрыв как результат блокады тирозиновых киназ: (а) влияние на Ма+,К+-АТФазу опосредовано блокадой дефосфорилирования а-субъедшшцы по Туг 10 [ТегаНе с( а1., 1999]; (б) по нашим результатам эффект ортованадата был одинаковым в бескалиевой и К+-содержащей среде; (в) для развития ответа на ФМЛФ существенным моментом является вход в клетку, а не его отток [БЬа'ай е1 а1., 1990]; (г) оуабаин в отличие от ортованадата и пирофосфата вызывал усиление продукции АФК при всех концентрациях ФМЛФ.

Вероятно, что тирозиновые киназы являются положительными регуляторами функции ИАБРН оксидазы при низких и высоких концентрациях ФМЛФ, тогда как роль фосфатаз, в том числе тирозиновых, не так однозначна. В случае низких концентраций ФМЛФ действие фосфатаз может быть направлено на ферменты, имеющие отрицательное регуляторное действие на ИАБРН оксидазу, тогда как при высокой концентрации ФМЛФ фосфатазы снижают активность

ферментов с положительным регуляторным действием на NADPH оксидазу.

Рецепторы, сигнальные и эффекторные молекулы (например, ПКС и щггозольные компоненты НАДФН оксидазы) ассоциированы с белками цитоскелета [Thelen et al., 1993]. Мы обнаружили, что 1 цМ цитохалазин В почти в два раза усиливал продукцию АФК нейтрофилами в области низких концентраций ФМЛФ (1 цМ). При использовании 50 р.М ФМЛФ его эффект был слабее более чем в два раза. Как известно, низкие концентрации ФМЛФ вызывают двигательные реакции нейтрофила, тогда как высокие - респираторный взрыв и секреторную дегрануляцию [Snyderman & Pike, 1984]. Больший эффект цитохалазина В на низкой концентрации ФМЛФ показывает, что в данном случае задействуется путь сигнализации, обеспечивающий преимущественно двигательные реакции. Это также подтверждает предположение о дивергенции сигнализации ФМЛФ рецептора.

Таким образом, наибольший вклад в вызванный ФМЛФ респираторный взрыв вносят тирозиновые киназы. Наблюдаемые особенности действия использованных ингибиторов (такие как направление и величина эффектов) могут быть объяснены вовлечением альтернативных путей в активацию нейтрофилов ФМЛФ в низкой и высокой концентрациях и ролью блокируемой системы. Вероятно, характер действия праймирующих агентов является также проявлением дивергенции путей сигнализации рецептора ФМЛФ (таблица 2).

2.2. Механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов.

В зависимости от типа праймирующего агента, как уже упоминалось, могут реализоваться разные механизмы праймирования [Hallett & Lloyds, 1997]. Мы проверили роль отдельных механизмов в праймировании респираторного взрыва нейтрофилов.

2.2.1. Исследование роли [Са2+]цит. Ранее мы показали, что для усиления кальциевыми ионофорами продукции АФК при активации нейтрофилов ФМА необходимы вход кальция и образование арахидоновой кислоты [Аловская, 1998; Дедкова и др., 1999]. В отличие от ФМА хемотаксический пептид вызывает дозо-зависимое повышение [Са2^]щ,т. Предобработка клеток 1 нМ инсулином не приводила к изменению исходного уровня [Са2+]ц„т, который составлял 120±5 нМ (п=22). Последующая активация ФМЛФ предобработанных инсулином клеток не приводила к достоверному изменению уровня [Са2+]Ц1ГГ во всем диапазоне концентраций ФМЛФ по сравнению с интактными клетками (таблица 3). Таким образом, наблюдаемое нами усиление респираторного взрыва при действии инсулина вызвано не повышением [Са2+]ц„.

Таблица 3. Изменение [Са2+]цит в интактных и предобработагашх 1 нМ инсулином нейтрофилах в ответ на стимуляцию ФМЛФ.

[ФМЛФ], цМ

0.01 0.1 1 5 10 50

Интактные клетки [Са ]цит, нМ, 188^3 244,1 536,9 687,8 1024,2 1424,4

±SEM 1,6 23,3 43,2 97,3 64,3 193,8

N 2 3 7 3 9 5

Клетки, предобрабо-танные 1 нМ инсулином [Са ]щ,т, нМ, 165,1 274,5 523,2 710,2 882,8 1367,7

+SEM 24,1 43,6 35,7 189,3 206,1 153,5

N 2 3 4 3 5 6

2.2.2. Роль синтеза белка de novo в прайлтровании респираторного взрыва нейтрофилов была изучена с применением циклогексимида, блокатора синтеза белка (рис. 6).

Рис. 6. Действие циклогексимида на вызванный 50 цМ ФМЛФ респираторный взрыв нейтрофилов. Показаны эффекты 10 цг/мл циклогексимида (Ц), 1 нМ инсулина (И) и 1 нМ инсулина на фоне 10 цг/мл циклогексимида (Ц+И). Приведены средние значения эффекта по результатам 25 независимых экспериментов. За 100% принят ответ интакных клеток.

На фоне 10 рг/мл циклогексимида инсулин увеличивал ответ на 50 цМ ФМЛФ. Однако, праймирующий эффект инсулина был вдвое меньше, чем при действии инсулина на интактные клетки, возможно, из-за частичной блокады сигнальных путей инсулина. Маловероятно, что наблюдаемая модуляция праймирующего эффекта инсулина связана с влиянием циклогексимида на Р-субъединицу инсулинового рецептора, так как в этом случае можно было ожидать усиление эффектов инсулина на фоне циклогексимида [Knutson, 1991]. Возможно, эффект 1шсулина связан с синтезом коротко живущих быстро синтезируемых белков [Stringer, 1995].

2.3. Сравнительный анализ действия ингибиторов на вызванный ФМЛФ респираторный взрыв нейтрофилов при праГшировании инсулином, липополисахаридом и ФМЛФ.

Мы считаем, что первичным и универсальным процессом в праГшировании респираторного взрыва нейтрофилов является тирозиновое фосфорилирование. В пользу этого механизма говорит то, что при праймировании агентами различной природы на разных этапах передачи сигнала происходит фосфорилирование определенных ключевых ферментов по тирозину [McCool et al., 1991; Akimaru et al., 1992; Minakami et al., 1993; Yuo et al., 1993; Fialkovv et al., 1994; Nakashima et al., 1994; Fouda et al., 1995; Waterman et al., 1996; Fernandez & Suchard, 1998; Watson & Edwards, 1998; Yagisawa et al., 1999; Yan & Novak, 1999]. В частности, при добавлении ЛПС и ФМЛФ происходит тирозиновое фосфорилирование МАРКиназ, ЕЯКиназ [Grinstein & Furuya, 1992; Weinstein et al., 1992; Torres et al., 1993; Dusi et al., 1994; Rane et al., 1997; Takemura et al., 1997; Downey et al., 1998; Zhang et al., 1998].

В аспекте нашей работы особое внимание привлекает роль тирозинового фосфорилирования в регуляции активности NADPH оксидазы. Несмотря на наличие потенциальных сайтов, до сих пор не обнаружено фосфорилирование компонентов NADPH оксидазы по тирозину. Однако, для многих агентов, которые активируют NADPH оксидазу нейтрофилов и запускают продукцию АФК, показано увеличение общего фосфорилирования по тирозину в клетке [Dusi et al., 1994; Downey et al., 1998; Yagisawa et al., 1999;]. Различные ингибиторы и активаторы тирозиновых протеинкиназ влияют на активацию оксидазы: ингибиторы тирозиновых киназ уменьшают количество тирозинового фосфорилирования в клетке и генерацию супероксида, вызванную ФМЛФ. Напротив, ингибирование фосфотирозинфосфатаз приводит к аккумуляции белков, фосфорилированных по тирозин)', и усиленному потреблению кислорода [Li et al., 1996]. Во многих клетках, в том числе и в нейтрофилах, обнаружены тирозиновые киназы Pyk2, Lyn, Syk и src-киназы, которые, возможно, также участвуют в регуляции активности NADPH оксидазы [Fernandez & Suchard, 1998; Yan & Novak, 1999]. Киназы, осуществляющие дополнительное фосфорилирование оксидазы при праймировании, не идентифицированы, считается, что могут быть вовлечены МАРКиназы и ЕЯКиназы. Далее мы провели исследование роли тирозиновых киназ и фосфатаз в усилении респираторного взрыва нейтрофилов, праймированных инсулином, липополисахаридом и ФМЛФ.

2.3.1. Праймирование инсулином: роль тирозиновых киназ и фосфатаз. Существующие представления о механизмах праймирования дыхательного взрыва нейтрофилов, а также о структуре и функциях инсулинового рецептора, позволили нам предположить, что в

праймировании инсулином дыхательного взрыва могут быть вовлечены тирозиновые киназы [Уп-катак1 е1 а1., 1999]. Мы проверили это предположение, блокируя тирозиновые киназы тирфостином 51.

Как было показано, инсулин не влиял на уровень спонтанной оксидазной активности нейтрофилов, но модулировал ответ на ФМЛФ (рис.1). Для анализа праймирующего действия инсулина были выбраны две концентрации ФМЛФ, для одной из которых (50 рМ) наблюдалось усиливающее действие 1 нМ инсулина, для другой (5 рМ) - оно

5 рМ тнрфостин 51 существенно ингибировал ответ нейтрофилов на ФМЛФ в обоих случаях, при этом эффект блокатора был близким по величине (рис. 7, Т). На фоне тирфостина 51 действие инсулина приводило к еще большему ингибированшо ответа на ФМЛФ, однако эффект достоверно не отличался от действия одного блокатора для обеих концентраций ФМЛФ (рис. 7, Т+И). Поэтому можно говорить об отсутствии действия инсулина на фоне блокатора тирозиновых киназ, что подтверждает значение тирозиновых киназ в системе сигнализации инсулина в нейтрофилах. На фоне инсулина эффект тирфостина уменьшался при использовании 50 рМ ФМЛФ, для которой наблюдалось праймирующее действие инсулина (рис. 7, И+Т, светлый столбик). Это могло происходить вследствие быстрой активации инсулином путей сигнализации, независимых от тирозинового фосфорилирования и необходимых для активации клетки хемотаксическим пептидом. Мы не обнаружили подобного явления при активации нейтрофилов 5 рМ ФМЛФ, при которой отсутствует праймирующее действие инсулина (рис. 7, И+Т, темный столбик). Из чего можно заключить, что в формировании ответа на ФМЛФ участвуют разные пути сигнализации. Вероятно, праймирование инсулином вызванного ФМЛФ респираторного взрыва запускается тирозиновым фосфорилированием и реализуется при его

отсутствовало (рис. 7, И).

Рис. 7. Действие тирфостина 51 на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный 5 рМ

№Т

Показаны эффекты 5 рМ тирфостина (Т), 1 нМ инсулина на фоне 5 рМ тирфостина (Т+И), 1 нМ инсулина (И) и 5 р М тирфостина на фоне 1 нМ инсулина (И+Т). Приведены средние значения эффектов по результатам 26 независимых экспериментов. За 100% принят ответ интактных клеток.

( 1 ) и 50 рМ ( □ ) ФМЛФ.

участии и участии путей сигнализации, независимых от тирозинового фосфорилирования.

При- блокаде серин/треонинового фосфорилирования Н-7 и праймирующее действие инсулина, также как ЛПС и ФМЛФ, сохранялось или появлялась тенденция к его усилению. По-видимому, вклад сигнальных систем, блокируемых Н-7 и \У-7, в праймирование респираторного взрыва незначителен.

Дополнительное усиленное фосфорилирование в клетке при праймировании может быть результатом как повышения активности протеинкиназ, так и снижением активности протеинфосфатаз, которые также участвуют в сигнализации инсулина [1л е1 а1., 1996]. Протеинтирозиновое фосфорилирование представляет баланс активностей киназ и фосфатаз [Опз\уо1с1-Ргеппег е1 а1., 1993; 8а1пе1 й а1., 1996]. Роль фосфатаз в праймировании респираторного взрыва нейтрофилов была оценена с применением ортованадата натрия (рис. 8), и пирофосфата натрия.

Предварительная обработка нейтрофилов 0.1 мМ ортованадатом приводила к усилению респираторного взрыва в ответ на 50 ЦМ ФМЛФ на 59±12%(п=8).

Время, мин

Рис. 8. Эффект ортованадата на респираторный взрыв нейтрофилов. Показаны ответы на 50 цМ ФМЛФ интактных клеток (1) и клеток, предварительно обработанных 1 нМ инсулином

(2); 0.1 мМ ортованадатом

(3); 1 нМ инсулином на фоне 0.1 мМ ортованадата (4) и 0.1 мМ ортованадат на фоне 1 нМ инсулина (5).

Добавление инсулина на фоне ортованадата усиливало эффект до 69± 12% (п=8), но не достоверно. При применении ортованадата после инсулина наблюдалось близкое к аддитивному действие веществ, однако, отличие от эффекта ортованадата не было достоверным. Таким образом, вклад тирозиновых протеинфосфатаз в праймирование респираторного взрыва инсулином незначителен, либо в нейтрофилах, как в адипоцитах и гепатоцитах, инсулин активирует тирозиновые фосфатазы с разнонаправленным действием [Уиката1а е1 а1., 1999]. Маловероятно,

что в данном случае ортованадат проявлял себя как блокатор Са2+-АТФазы, так как в наших опытах праймнрующее действие инсулина не вызывало модуляции [Са2+]цнт при активации клеток 50 р.М ФМЛФ (таблица 3). Кроме того, блокаторы Са2+-АТФаз сами вызывают генерацию АФК [Nakao et al., 1998], что не наблюдалось для ортованадата.

1 мМ пирофосфат усиливал ответ на 50 |iM ФМЛФ на 62±16% (п=7). Инсулин (1 нМ) на его фоне потенциировал ответ до 83±15% (п=7), но различия между эффектами не достоверны, как и в случае обратной последовательности добавления веществ. По-видимому, фосфатазы осуществляют основной отрицательный контроль при активации клеток ФМЛФ, но их роль в праймировании инсулином респираторного взрыва незначительна.

2.3.2. Роль цитоскелета в праймировании. Известно, что инсулин вызывает реорганизацию актиновых филаментов [Wang et al., 1998]. На фоне цитохалазина В 1 нМ инсулин не изменял респираторный взрыв, вызванный 50 ¡aM ФМЛФ. Эффект цитохалазина В составлял 40±4%, при совместном действии с инсулином - 47±5% (п=12). Это дает основание считать, что для реализации праймирующего действия инсулина необходима интактная сеть актиновых филаментов.

2.3.3. Исследование роли тирозиновых киназ и фосфатаз в праймировании липополисахаридом. Блокада тирозинового фосфорилирования 5 цМ тирфостином 51 приводила, как уже упоминалось, к значительному ингибированию ответа на 50 |iM ФМЛФ (таблица 2). Добавление ЛПС (10 нг/мл) на фоне тирфостина не изменяло эффекта тирфостина, т.е. тирфостин предотвращал действие ЛПС, как и инсулина. При обратной последовательности наблюдалась тенденция к ослаблению эффекта тирфостина, но различия с эффектом самого тирфостина не были достоверными. Возможно, что праймирующее действие ЛПС происходит с частичным вовлечением других сигнальных путей, запускаемых на ранних этапах активации рецептора ЛПС и связанных с фосфорилированием по тирозиновым остаткам.

При действии 10 нг/мл ЛПС в сочетании с 0.1 мМ ортованадатом или 1 мМ пирофосфатом было обнаружено усиление ответа на ФМЛФ по сравнению с ответом на фоне одного блокатора. Уровень праймирования ЛПС достоверно сохранялся при добавлении обоих блокаторов на фоне ЛПС, также как и при добавлении ЛПС на фоне пирофосфата. При добавлении ЛПС на фоне ортованадата наблюдалось достоверное усиление ответа на ФМЛФ: от 31+6% при действии самого блокатора до 56+8% при совместном действии (п=8).

2.4.2. Роль тирозиновых киназ и фосфатаз в праймировании респираторного взрыва хемотаксическим пептидом ФМЛФ. Блокада

тирозинового фосфорилирования 5 мкМ тирфостином 51 значительно ингибировала ответ на 50 цМ ФМЛФ (рис. 9А).

Т Т+Ф Ф Ф+Т

О О+Ф Ф Ф+О

Рис. 9. Действие тирфостина 51 (А) и ортованадата (Б) на вызванный 50 |оМ ФМЛФ респираторный взрыв нейтрофилов. Показаны эффекты 5 рМ тирфостина 51 (Т) и 0.1 мМ ортованадата (О); 10 нМ ФМЛФ на фоне блокаторов (Т+Ф и О+Ф); 10 нМ ФМЛФ (Ф); блокаторов на фоне 10 нМ ФМЛФ (Ф+Т и Ф+О). Приведены средние значения эффектов по результатам 8-11 независимых экспериментов. За 100% принят ответ интактных клеток.

Добавление 10 нМ ФМЛФ как на фоне блокатора, так и при обратной последовательности не приводила к модификации эффекта тирфостина, что однозначно может указывать на важность тирозинового фосфорилирования в праймировании респираторного взрыва нейтрофилов ФМЛФ в низкой концентрации. Четко разделить происходит ли это на начальных или более поздних этапах сигнализации на основании наших результатов сложно.

Праймирующее действие ФМЛФ практически не зависело от последовательности подачи агентов и сохранялось на фоне ортованадата и пирофосфата (рис. 9Б). В опытах с 1 мМ пирофосфатом на фоне 10 нМ ФМЛФ наблюдалась тенденция к его усилению: от 52±14% при действии самого пирофосфата до 77±5% при совместном действии (п=5).

Таким образом, в реализации праймирующего действия агентов, действующих через рецепторы различных классов, участвуют тирозиновые киназы. Процессы связывания лиганда с рецептором и передачи сигнала от рецептора внутрь клетки происходят довольно быстро. Если предположить, что тирозиновое фосфорилирование осуществляется в основном на начальных этапах передачи сигнала, то, подавая праймирующие агенты на фоне блокады тирозиновых киназ, мы предотвращаем переход сигнала в клетку. Изменив последовательность

подачи блокатора и праймирующего агента, мы можем разделить вклад тирозиновых киназ на начальных и более поздних этапах сигнализации. Инсулин и ЛПС, по-видимому, активируют некоторые дополнительные пути, независимые от тирозинового фосфоршшрования на начальной стадии передачи сигнала; тогда как сигнализация с рецептора ФМЛФ при праймировашш реализуется в большей степени за счет тирозинового фосфорилирования. Основываясь на полученных результатах, мы предполагаем, что в праймировашш ЛПС более существенно участие тирозиновых фосфатаз, а в праймировашш ФМЛФ - серин-треониновых фосфатаз.

Выводы:

1. Модуляция респираторного взрыва нейтрофилов, вызванного N-формил-метионил-лейцил-фенилаланином (ФМЛФ), зависит от температуры и времени преинкубации с праймирующим агентом, генотипа и условий содержания животных, сочетания концентраций праймирующего и активирующего агентов.

2. Модулирующее действие инсулина на вызванный ФМЛФ респираторный взрыв нейтрофилов опосредовано специфическим связыванием.

3. С помощью ингибиторного анализа показана дивергенция сигнальных путей рецептора ФМЛФ.

4. Существенный вклад в реализацию вызванного ФМЛФ респираторного взрыва и его праймирование вносят тирозиновые киназы.

5. Показано, что вклад протеинфосфатаз в праймирование респираторного взрыва нейтрофилов инсулином незначителен; в праймировашш ЛПС существенно участие тирозиновых фосфатаз, в праймировашш ФМЛФ - серин/треониновых фосфатаз.

6. Праймирование респираторного взрыва нейтрофилов является результатом перекрестного взаимодействия сигнальных путей рецепторов ФМЛФ и праймирующего агента, происходящего с участием тирозинового и серин/треонинового фосфорилирования и дефосфорилирования.

Список публикаций

1. Safronova V.G., Alovskaya A.A., Gabdulhakova A.G., Dedkova E.N., Zinchenko V.P., Chemeris N.K. Priming mechanism of calcium ionophores in activation of neutrophil respiratory burst. 41st Annual Meeting of the Biophysical Society, USA. Biophys. J. 1997. 72(2):A296(W-Pos274)

2. Габдулхакова А.Г., Аловская A.A., Дедкова E.H. Элементы механизма синергической активации респираторного взрыва нейтрофилов. II

открытая городская научная конференция молодых ученых. Пущино. 1997. С. 96.

3. Габдулхакова А.Г., Аловская А.А., Сафронова В.Г., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. ЭМИ КВЧ и "прайминг" нейтрофилов. 1 Международный симпозиум "Фундаментальные науки и альтернативная медицина". Пущино. 1997. С. 53.

4. Сафронова В.Г., Гапеев А.Б., Аловская А.А., Габдулхакова А.Г., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Миллиметровые волны ингибируют синергический эффект кальциевого ионофора А23187 и форболового эфира в активации респираторного взрыва нейтрофилов. Биофизика. 1997. Т. 42. Вып. 6. С. 1267-1273.

5. Габдулхакова А.Г. Праймированный нейтрофил как модель для исследования биологических эффектов ЭМИ КВЧ. Ш конференция молодых ученых. Пущино. 1998. С. 108.

6. Дедкова Е.Н., Аловская А.А., Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г., Зинченко В.П. Са2+-ионофоры в праймировании и активации клеток. Ш конференция молодых ученых. Пущино. 1998. С. 111.

7. Safronova V.G., Gabdulkhakova A.G., Alovskaya А.А., Dedkova E.N., Zinchenko V.P., Chemeris N.K.. Role Extracellular Calcium in Priming of Neutrophil Respiratory Burst by Calcium Ionophore. 42nd Annual Meeting of the Biophysical Society, USA. Biophys. J. 1998. 74(2):A92(M-Pos286).

8. Safronova V.G., Gabdulhakova A.G., Alovskaya A.A., Dedkova E.N., Gapeyev A.B., Chemeris N.K., Fesenko E.E.. Physiological state of neutrophils determinates biological effects of EHF EMF. FASEB Meeting, USA. FASEB J. 1998. 12(4):A379(2203).

9. Dedkova E.N., Gabdulhakova A.G., Alovskaya A.A., Safronova V.G. Zinchenko V.P. Calcium ionophores in cell activation and priming. 25th Silver Jubilee FEBS Meeting. Copenhagen, Denmark. 1998. P6.51. P. 91.

10. Gabdulhakova A.G., Safronova V.G. Genetic determination of neutrophil ptiming 25th Silver Jubilee FEBS Meeting. Copenhagen, Denmark. 1998. P6.53. P. 92.

11. Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г. Праймирование fMLP-вызванного респираторного ответа нейтрофилов агентами различной природы Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". Пущино. 1998. С. 9-12.

12. Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г. Особенности праймирования fMLP-вызванного респираторного ответа нейтрофилов мыши через рецепторы разного типа. Отчетная конференция ИБК РАН. 1998.

13. Аловская А.А., Габдулхакова А.Г., Гапеев А.Б., Дедкова Е.Н., Сафронова В.Г., Фесенко Е.Е., Чемерис Н.К. Биологический эффект ЭМИ КВЧ определяется функциональным статусом клеток. Вестник новых медицинских технологий. 1998. Т. V. № 2. С. 11-15.

14. Дедкова Е.Н., Аловская А.А., Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г., Зинченко В.П. Усиливающее действие кальциевых иоиофоров на вызванный форболовым эфиром респираторный взрыв в нейтрофилах. Биохимия. 1999. Т. 64. № 7. С. 941-948.

15. Gabdoulkhakova A.G., Safronova V.G. The fMLP-induced neutrophil respiratory burst: priming and effect of EHF EMR. 43rd Annual Meeting of the Biophysical Society, USA. Biophys. J. 1999. 76(1):A224.

16. Safronova V.G., Gabdoulkhakova A.G. Insulin in priming of fMLP-induced respiratory burst of mouse polymorphonuclear leukocytes (PMNs). FASEB Meeting, USA. FASEB J. 1999. 13(4):A76(113.2)..

17. Аловская А.А., Габдулхакова А.Г., Дедкова E.H., Сафронова В.Г. Механизмы регуляции метаболизма нейтрофилов при действии ЭМИ КВЧ в зависимости от функционального статуса. Мед. Иммунол. 1999. Т. 1. № 3-4. С. 7.

18. Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г., Садовников В.Б. Функциональное проявление генотипических и фенотипических особенностей животных в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов. Мед. Иммунол. 1999. Т. 1. № 3-4. С. 11.

17. Gabdoulkhakova A.G., Safronova V.G. The role of tyrosine phosphorylation in priming and activation of the fMLP-induced respiratory burst of polymorphonuclear leukocytes (PMNs). International Summer School on "Molecular Mechanisms of Signal Transduction". Island of Spetses, Greece. 1999. P. 21.

18. Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г., Садовников В.Б. Роль генотипа в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов. Доклады Российской Академии Наук. 1999. (В печати).

Научное издание

Автореферат А.Г.Габдулхаковой

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции ОК-005-93, том 2; 953000 - книги и брошюры.

Подписано в печать 24.12.99 г. Заказ 8527Р. Тираж 100 экз. Усл.печ.л. 1,25.

Отпечатано с оригииала-макета в Отделе научно-технической информации Путинского научного центра РАН.

142292, г.Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Габдулхакова, Аида Габрахмановна

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1.Нейтрофил и его функция в организме.

1.1.1. Основные реакции нейтрофила.

1.1.2. Хемотаксические агенты.

1.1.3. Рецепторы нейтрофшое.

1.1.4. Различные состояния нейтрофшое в организме: покой, праймироеание, активация и гиперактивация.

1.1.5. Изменение функций нейтрофила при патологиях.

1.2. Молекулярные основы респираторного взрыва.

1.2.1. Компоненты ЫАОРН оксидазы, образование активных форм кислорода.

1.2.2. Цитохром в558.

1.2.3. Цитозолъные факторыр47рЬш ир67рНох.

1.2.4. О-белки, входящие в состав МАВРН оксидазы.

1.3. Активация респираторного взрыва нейтрофилов хемотаксическим пептидом ФМЛФ.

1.3.1. "Классическая " последовательность передачи сигнала.

1.3.2. Роль фосфорилирования в передача сигнала.

1.4. Праймироеание респираторного взрыва физиологическими агентами.

1.4.1. Рецепторы исследуемых праймирующих агентов.

1.4.2. Механизмы праймирования.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы.,.,.,,.,.,

2.2. Биологический объект.

2.3. Регистрация хемилюминесценции.

2.4. Специфическое связывание125 1-инсулипа.

2.5. Измерение /Са ]цит.

2.6. Обработка результатов.

Глава3. Результаты исследований.

3.1. Активация и праймирование респираторного взрыва нейтрофилов, вызванного хемотаксическим пептидом ФМЛФ.

3.1.1. Праймирование респираторного взрыва нейтрофилов, активируемого ФМЛФ, через рецепторы разного типа.

3.1.2. Специфичность связывания 125 1-инсулина.

3.2. Определение условий для наблюдения усиленного респираторного взрыва нейтрофилов, вызванного ФМЛФ.

3.2.1. Зависимость модулирующего действия праймирующш агентов от температуры преинкубацж.

3.2.2. Зависимость модулирующего эффекта праймирующш агентов от времени прешкубацж.

3.2.3. Роль генотипа и фенотипа в праймировании респираторного взрыва нейтрофилов.

3.2.4. Концентрационные зависимости праймирующего эффекта инсулина.

3.3. Сравнительный анализ действия ингибиторов на респираторный взрыв нейтрофилов> вызванный ФМЛФ.

3.3.1. Действие ингибиторов на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный ФМЛФ в низких концентрациях.

3.3.2. Особенности действие ингибиторов на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный ФМЛФ в высокой концентрации,,

3.4. Механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов

3.4.1. Исследование роли [Са ]цит.

3.4.2. Роль синтеза белка de novo в праймиротнии респираторного взрыва нейтрофилов.

3.5. Сравнительный анализ действия ингибиторов на вызванный ФМЛФ респираторный взрыв нейтрофилов при праймировании инсулином, липополисахаридом и ФМЛФ.

3.5.1. Праймированиереспираторного взрыва нейтрофилов инсулином: роль тирозиновых киназ и фосфатаз.

3.5.2. Роль цитоскелета в праймировании.

3.5.3. Исследование роли тирозиновых киназ и фосфатаз в праймировании липополисахаридом.

3.5.4. Роль тирозиновых киназ и фосфатаз в праймирования респираторного взрыва нейтрофилов ФМЛФ в подпороговой концентрации.

Глава 4. Обсуждение результатов.

4.1. Роль фосфорилирования в активации респираторного взрыва.

4.2. Роль фосфорилирования в праймировании.

4.3. Вариабельность праймирования респираторного взрыва.

4.4. Дивергенция и перекрестное взаимодействие путей активации ФМЛФ и праймирующих агентов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль фосфорилирования в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов"

Актуальность проблемы. Генерация активных форм кислорода является одной из основных цитотоксических функции нейтрофилов, обеспечивающих наиболее быстрые защитные реакции организма против инфекции. Респираторный взрыв происходит в результате фосфорилирования и сборки компонентов NADPH оксидазного комплекса. Нейтрофилы способны воспринимать множество сигналов и отвечать на них разнообразными реакциями, в основе чего лежит многообразие типов рецепторов на мембране и сложность внутриклеточной сигнальной системы. В результате интенсивных исследовании внутриклеточной сигнализации в нейтрофилах становятся понятными механизмы развития реакций на такие физиологические стимулы, как иммунные комплексы [Watson F., Edwards S.W., 1998], цитокины [Ahlers A, et al,, 1994; Kitagawa S, et al,, 1996; Waterman W,H, et al,, 1996;], ростовые факторы [Foltz I.N. et al,, 1997].; хемотаксические пептиды [McColl S,R, et al,, 1990; Thelen M, et al,, 1993].- однако, нет четкого представления о последовательности проведения сигнала от рецептора к эффекторным молекулам,

Нейтрофил в организме, как правило, подвергается параллельному и/или последовательному воздействию интермедиатов, его активация чаще всего происходит на фоне измененного, "праймированпого", состояния, Праймирующий стимул вызывает метаболическую перестройку, не приводящую к активации клетки, следствием его влияния является усиление ответа на последующую активацию. Представление о механизме праймирования респираторного взрыва нейтрофилов в настоящее время находится в стадии формирования. По литературным данным можно выделить 5 возможных механизмов: синтез белка de novo, усиление экспрессии плазматических мембранных рецепторов, модушнщя уровня [Ca модуляция активности фосфолипаз, тирозиновое 5 фосфорилирование [Hallett М.В., Lloyds D.? 1997], Авторы рассматривают каждый механизм как самодостаточный для реализации праймирования. Мы предполагаем, что праймирование реализуется в результате перекрестного взаимодействии сигнальных путей, задействованных в праймировании и активащш NADPH оксидазы, Предположение о перекрестном взаимодействии тирозинового и серин/треонинового фосфорилирования при праймировании респираторного взрыва нейтрофилов кажется нам наиболее привлекательным [Hallett М,В,,, Lloyds D,? 1997], В пользу этого механизма говорит то, что 1) воздействие на нейтрофилы факторов роста [McColl S,R, et al.5 1991] и цитокинов [Akimaru К, et al., 1992: Minakami К, et al., 1993 Ahlers A, et al., 1994: Foltz I.N. et al.,, 1997] приводит к фосфорилированию по тирозину некоторых сигнальных ключевых молекул: 2) многие праймирующие агенты не способны вызывать повышение уровня [Са2*]^; 3) процессы синтеза белка, экспрессии плазматических мембранных рецепторов и модуляции активности фосфолипаз, вероятнее всего, являются вторичными событиями по отношению к фосфорилированию.

Ввиду сложности регуляции функций нейтрофила интересны причины возникновения нарушений в его регуляции при развитии патологий,, когда избыточные дегрануляция и продукция активных форм кислорода ведут к поражению тканей и углублению патологического процесса. В последнее время появляется все больше работ с комплексным подходом к исследованию праймирования респираторного взрыва нейтрофилов,, однако, обнаруживаются противоречивые данные,, возможно,, обусловленные различиями экспериментальных условий. Изучение эффектов физиологических медиаторов на функционирование нейтрофилов,, в частности, инсулина, это малоисследованная область, связанная с актуальной проблемой дисфункции нейтрофилов при патологиях.

Цель и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании взаимодействия сигнальных путей, участвующих в опосредованных рецепторами активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов, и роль фосфорилирования в этих процессах,

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи; экспериментально подобрать оптимальные условия для исследования усиленного ответа перитонеальных нейтрофилов мыши на хемотаксический пептид М-формил-метиоиил-дейцил-фенилаланин (ФМЛФ), Исследовать зависимость модулирующего действия инсулина,-липополисахарида и ФМЛФ в низких концентрациях от времени и температуры преинкубации, от генотипа и условий содержания животных, от сочетания концентраций активирующего и праймирующего агентов:

- провести сравнительный анализ действия ингибиторов на респираторный взрыв нейтрофилов при его активации ФМЛФ в низких и высоких концентрациях;

- установить специфичность действия инсулина на нейтрофилы и основные внутриклеточные мишени его праймирующего действия;

- определить роль тирозиновых киназ и фосфатаз в праймировании респираторного взрыва нейтрофилов инсулином, липополисахаридом и ФМЛФ в низкой концентрации;

Научная новизна. Впервые установлена связь гетерогенности физиологического ответа нейтрофилов с дивергенцией и перекрестным взаимодействием сигнальных путей. Впервые показана генетическая детерминированность реакции нейтрофилов на праймирование. Показана роль тирозиновых киназ и фосфатаз,, обнаружено, что тирозиновые киназы и фосфатазы участвуют в активации респираторного взрыва хемотаксическим пептидом и его модуляции инсулином, липополисахаридом и ФМЛФ в низкой концентрации.

Научно-практическая ценность. Результаты работы вносят существенный вклад в понимание вопроса о вариабельности действия модулирующих факторов на функциональный ответ нейтрофилов, В методическом плане полученные результаты дают возможность оптимального выбора условий для наблюдения эффектов праймирующих агентов,

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на I - III Путинских конференциях молодых ученых (Пущино, 1997-98); на конференциях: 11 Фундаментальные науки и альтернативная медицина11 (Пущино, 1997); "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998); на отчетной годичной научной конференции ИБК РАН (Пущино,

1998); 11 Дни иммунологии в Санкт-Петербурге^11 (Санкт-Петербург^

1999); 25th Silver Jubilee FEBS Meeting (Дания, 1998); 43d Annual Meeting of the Biophysical Society (США, 1999); FASEB Meetings (США, 1998-99); международной летней школе "Molecular Mechanisms of Signal Transduction11 (Греция, 1999),

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 4 статьи (1 статья в печати).

Список сокращений. ФМЛФ = N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; АФК = активные формы кислорода; ХЛ = люминол-зависимая хемилюминесцекция; ЛПС - липополисахарид; [Са2+]пит = концентрация свободного цитозольного кальция; ДА Г - диацилглицерол; ПКС, ПКА - протеинкиназы С и А, соответственно; IGF-1 - инсулино-подобный фактор роста-1; МАРКиназы - митоген-активируемые протеинкиназы (mitogen-activated protein kinases); ERKs- киназы, регулируемые внеклеточным сигналом (extracellular signal-regulated kinases); NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; GM-CSF - гранулоцит-макрофагколониестимулирующий фактор; G-CSF - гранулоцит8 колониестимулирующий фактор; GAP - белок,, активирующий ГТФазу (GTPase- activating protein): ÍI -3, IL-8 - интерлейкины; TNF-a - фактор некроза опухолей-a (tumor necrosis factor-a), Р13-киназа фосфатидилинозитол-3-киназа,, IPj - инозитол 1 ?455-трифосфат; ФАТ -фактор активации тромбоцитов, ФМА = форбол 12-миристат 13-ацетат: ФЛС, ФЛЛ2, ФЛО - фосфолипазы; АЦ - аденилатциклаза.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Габдулхакова, Аида Габрахмановна

Выводы:

1, Модуляция респираторного взрыва нейтрофилов, вызванного М-формил-метионил-лейцил-фенилаланином (ФМЛФ), зависит от температуры и времени преинкубации с праймирующим агентом, генотипа и условий содержания животных, сочетания концентраций праймирующего и активирующего агентов.

2, Модулирующее действие инсулина на вызванный ФМЛФ респираторный взрыв нейтрофилов опосредовано специфическим связыванием.

3, С помощью ингибиторного анализа показана дивергенция сигнальных путей рецептора ФМЛФ.

4, Существенный вклад в реализацию вызванного ФМЛФ респираторного взрыва и его праймирование вносят тирозиновые киназы.

5, Показано, что вклад протеинфосфатаз в праймирование респираторного взрыва нейтрофилов инсулином незначителен; в праймировании ЛПС существенно участие тирозиновых фосфатаз, в праймировании ФМЛФ -серин/треониновых фосфатаз,

6, Праймирование респираторного взрыва нейтрофилов является результатом перекрестного взаимодействия сигнальных путей рецепторов ФМЛФ и праймирующего агента, происходящего с участием тирозинового и серин/треонинового фосфорилирования и дефосфорилирования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Габдулхакова, Аида Габрахмановна, Пущино

1.А,, Габдулхакова А.Г,, Дедкова Е,Н,, Сафронова В,Г, 11 Мед. Иммунол., 1999, т. 1, с. 7.3, Аловская А.А. / Исследование роли ионов

2. Foltz I,N.j Lee J,C, Young P.R., Schrader J.W, / Hemopoietic growth factors with the exception of interleukin-4 activate the p38 mitogen-activated protein kinase pathway. 11 J. Biol. Chem. 1997. 272(6): 3296-3301,

3. Fouda S.I., Molski T.F., Ashour M.S., Sha'afi R.I. / Effect of lipopolysaccharide on mitogen-activated protein kinases and cytosolic phospholipase A2.11 Biochem. J. 1995. 308(3):815-822.

4. Fruhwirth M., Ruedl C, Ellemunter H,5 Bock G., Wolf H. / Flow-cytometric evaluation of oxidative burst in phagocytic cells of children with cystic fibrosis. //Int. Arch. Allergy Immunol. 1998. 117(4):270-275.

5. Fu Y.-K., Arkins S., Wang B.S., Kelley K.W. / A novel role of growth hormone and insulin-like growth factor-1. Priming neutrophils for superoxide anion secretion. //J. Immunol. 1991. 146(5): 1602-1608.

6. Fuchs A., Dagher M.C. / Activation of the CVgenerating NADPH oxidase in a semi recombinant cell-free system, assessment of the function of Rac in the activation process. 11 Eur. J. Biochem. 1994. 224:587-595.

7. Hall A. / The cellular functions of small OTP-binding proteins. // Science, 1990. 249:635-640.

8. Hallett M.B., Lloyds D, / The molecular and ionic signaling of neutrophils, //Landes Bioscience, Austin, Texas. USA. 1997, 211 p,

9. Hallett M.B., Lloyds D, / Neutrophil priming: the cellular signals that say 'amber' but not 1green\ // Immunology Today. 1995.16(6):264-268,

10. Harvath L, Leonard EJ / Two neutrophil populations in human blood with different chemotactic activity: separation and chemotactic binding. // Infect. Immun. 1982. 36:443-448.

11. Haydek JM, Keshavarzian A / Circulating neutrophils from patients with ulcerative colitis have a normal respiratory burst. // Inflammation. 1995. 19(6):701-15.

12. Her JH, Lakhani S5 Zu K5 Vila J, Dent P5 Sturgill TW5 Weber MJ / Dual phosphorylation and autophosphorylation in mitogen-activated protein (MAP) kinase activation. //Biochem. J. 1993. 296(1): 25-31.

13. Hirano T. I Molecular basis underluing functional pleotropy of cytokines and growth factors. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. 260:303-308.

14. Hoffman J.F., Keil M.L., Riccobene T.A., Omann G.M., Linderman J J. / Interconverting receptor states at 4 degrees for neutrophil N-formyl peptide receptor. //Biochemistry. 1996. 35(40):!3047-55.

15. Hu T.H., Bei L., Qian Z.M., Shen X. / Intracellular free calcium regulates the onset of the respiratory burst of human neutrophils activated by phorbol myristate acetate. //Cell Signal. 1999. ll(5):355-60.

16. Huang C.-K. / Protein kinases in neutrophils: a review. // Membrane Biochemistry. 1989. 8:61-79.

17. Hughes D.A., Smith G.C., Davidson J.E., Murphy A.V., Beattie T.J. / The neutrophil oxidative burst in diarrhaea-associated haemolytic uraemic syndrome. //Pediatr. Nephrol. 1996. 10(4):445-7.

18. Hurst JK, Loehr T.M, Curnutte J.T., Rosen H. / Resonance Raman and electron paramagnetic resonance structural investigations of neutrophil cytochrome b558. //J. Biol. Chem. 1991. 266:1627-1634.

19. Iyer S.S., Pearson D.W. I Evidance for a readily dissoable complex of p47phox and p67phox in cytosol of unstimulated human neutrophils. 11 J. Biol. Chem. 1994. 269: 22405-22411.

20. Iacono V.J., Singh S., Golub L.M., Ramamurthy N.S., Kaslick R. / In vivo assay of crevicular leukocyte migration. Its development and potential applications. //J. Periodontol. 1985.56(11):56-62.

21. Ye R.D., Quehenberger O., Thomas K.M., Navarro J., Cavanagh S.L., Prossnitz E.R., Cochrane C.G. / The rabbit neutrophil N-formyl peptide receptor. cDNA cloning, expression, and structure/function implications. 11 J. Immunol. 1993.150(4): 1383-94,

22. Zhang H., Garlichs C.D., Mugge A., Daniel W.G, / Involvement of tyrosine kinases, Ca2+ and PKC in activation of mitogen=activated protein (MAP) kinase in human polymorphonuclear neutrophils. If J. Physiol. (Lond). 1998. 513(2):359-67.

23. Zu Y.L., Ai Y., Gilchrist A., Labadia M.E., Sha'afi R.I,, Huang C.K. / Activation of MAP kinase-activated protein kinase 2 in human neutrophils after phorbol ester or fMLP peptide stimulation. // Blood. 1996. 87 (12): 5287-5296.

24. The Committee on standardized genetic nomenclature for mice. Standardized nomenclature for inbred strains of mice. Second listing. Cancer Research. 1960. 20(2): 145-169.1. Благодарности