Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов"

На правах рукописи

МИЛЛЕР АННА ВИКТОРОВНА

Механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2004

Работа выполнена в Путинском государственном университете на базе Института биофизики клетки РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук В.Г. Сафронова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор В.П. Зинченко

кандидат биологических наук Т.В. Сирота

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится « /£ч> 2004г. в Х^часов на заседании

диссертационного совета Д 002.38.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

1 &0&Z

zld 065*1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы) участвуют во врожденном иммунном ответе и обеспечивают первую линию защиты организма от вторгшихся бактерий Миграция нейтрофилов в очаг острого воспаления происходит в градиенте хемотаксических факторов, таких как N-формил-Мет-Лей-Фен (ФМЛФ). Связывание хемотаксического пептида ФМЛФ со своим рецептором, сопряженным с гетер отримерным G белком, запускает каскад внутриклеточных процессов, с последующим развитием респираторного взрыва Респираторный, или дыхательный, взрыв нейтрофилов представляет собой массированный выброс активных форм кислорода при усиленном потреблении кислорода и глюкозы. За его развитие ответственен мембранный фермент NADPH оксидаза, осуществляющий перенос электронов от внутриклеточного NADPH на молекулу экзогенного кислорода [McPhail et al, 1984] Активация фермента приводит к падению концентрации NADPH в клетке, что активирует окисление глюкозы через гексозо-монофосфатный шунт (ГМШ) - основной поставщик NADPH в нейтрофилах [Nessel et al., 1998]. При этом может утилизироваться глюкоза из внеклеточной среды и/или глюкоза, запасенная в клетке [Тал et al., 1998] Известно, что передача сигнала от рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу идет по фосфоинозитидиому пути с участием фосфолипазы С (ФЛС), инозигол-1,4,5-трисфосфата, Са2+ и протеинкиназы С [по Thelen et al., 1993]. Кроме того, было показано участие каскада мигоген-активируемых протеинкиназ (MAPKs) [Rane et al., 1997] и фосфотидилинозитол-3-киназы (ФИЗК) [Ward et al., 2000].

Многими авторами разрабатывается концепция активации нейтрофилов как двухступенчатого процесса [Thelen et al., 1993; Doerfler et al., 1994; Coffer et al., 1998]. Сначала нейтрофилы взаимодействуют с агентами, которые не активируют клетку, а переводят ее в состояние готовности к ответу [Hallett & Lloyds, 1997] Затем уже подготовленный нейтрофил получает соответствующий стимул, что приводит его к полностью активированному состоянию. Процесс, при котором предварительная обработка клетки агентом приводит к последующему усилению ответа на активацию, называют праймированием (от англ. "priming" - подготовка). В настоящее время интенсивно изучается праймирование функций нейтрофилов цитокинами, хемотаксическими

факторами, метаболическими регу цу^аи^д вщими. через рецепторы,

библиотека I С.Лоербург I 1

МОбРК I

принадлежащие к разным семействам [Hallett & Lloyds, 1997] Сами праймирующие агенты не вызывают изменений функций нейтрофилов, в том числе респираторного взрыва, но их предварительное воздействие приводит к усилению ответа на активацию В зависимости от рецептора, через который действует праймирующий агент, могут реализоваться разные механизмы праймирования нейтрофилов: изменения в уровне экспрессии адгезивных молекул на поверхности клетки; освобождение содержимого гранул, полимеризация актина; фосфорилирование; синтез белка de novo; модуляция [Са2Чцит; активация фосфолипаз; образование биоактивных липидов [Swain et al., 2002] Показано, что при праймировании активность различных протеинкиназ, в том числе MAPKs и тирозиновых киназ может увеличиваться в несколько раз [McLeish et al., 1998].

Одним из механизмов праймирования является усиление фосфорилирования белков по остаткам тирозина. Запуск тирозинового фосфорилирования осуществляется через рецепторы, обладающие своей собственной тирозинкиназной активностью, к ним относят рецептор инсулина Изменения в регуляции инсулином активности нейтрофилов видны, в основном, по многочисленным нарушениям, возникающим при диабете и развивающимся, скорее, вследствие отсутствия действия инсулина, чем из-за его влияния [Ortmeyer & Mohsenin, 1996]. Данные о праймирующем действии инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов отсутствуют.

Известно, что праймирование нейтрофилов бактериальным липополисахаридом (ЛПС), основным рецептором которого на нейтрофилах считается CD 14, гликозилфосфатидилинозитол-связанный гликопротеин [Wright et al, 1990; Ulevitch & Tobias, 1995], сопровождается усилением респираторного взрыва [Guthrie et al, 1984] Однако последовательность внутриклеточных событий после связывания ЛПС нейтрофилами неизвестна, как и характер взаимодействия сигнальных систем рецепторов ЛПС и формилированных пептидов в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов

Изучение внутриклеточных сигнальных систем, вовлеченных в праймирование, может помочь разъяснить механизмы, которыми регулируются специфические функции нейтрофилов, и развить терапевтические стратегии против чрезмерной цитотоксичности нейтрофилов

Цели и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в

исследовании механизмов праймирующего действия инсулина и ЛПС и участия

глюкозы в респираторном взрыве нейтрофилов. 2

Были поставлены следующие задачи:

- исследовать вклад компонентов каскада митоген-активируемых протеинкиназ, фосфолипаз и фосфатидилинозитол-3-киназы в механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов инсулином,

- исследовать вклад компонентов каскада митоген-активируемых протеинкиназ и фосфолипаз в механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов липополисахаридом;

- сравнить вклад исследуемых сигнальных систем митоген-активируемых протеинкиназ и фосфолипаз в действие инсулина и липополисахарида на респираторный взрыв, вызванный ФМЛФ в низких и высоких концентрациях;

- оценить роль метаболизма глюкозы в усиление респираторного взрыва при праймировании агентами разной природы (иономицина, инсулина и ЛПС)

Научная новизна работы. Впервые исследован вклад р38 МАРК и MEK/ERK1/2, ферментов гидролиза фосфолипидов, фосфатидилинозитол-3-киназы, в отдельные механизмы праймирования инсулином и липополисахаридом респираторного взрыва нейтрофилов, вызванного хемотаксическим пептидом ФМЛФ. Утилизация внутриклеточной глюкозы в нейтрофилах при развитии респираторного взрыва происходит с участием кальций-зависимых процессов.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты раскрывают некоторые аспекты функционирования нейтрофилов на уровне внутриклеточной сигнализации, а также позволят предложить новые терапевтические стратегии при лечении воспалений и могут использоваться при прогнозировании течения многих заболеваний

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 4-7 Пущинских конференциях молодых ученых (Пущино, 2000-2003), На XIII и XTV зимних международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 20012002), на конференциях "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000); «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000), Ежегодных научных конференциях ИБК РАН (Пущино, 2001-2002); Forum of Young Scientists Protein Structure-Function Trafficking and Signalling, satellite meeting of the 27th FEBS/PABMB (Португалия, 2001), 46 Annual Meeting of the Biophysical Society (США, 2002); Third International Conference on Signal

Transduction (Хорватия, 2002), The 7th International Union Biochemistry and Molecular Biology Conference "Receptor-ligand interactions" (Норвегия, 2002), FEBS Special Meeting on Signal Transduction (Бельгия, 2003)

Структура и объем диссертации. Диссертация включает в себя введение, обзор литературы, описания материалов и методов, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий.. ссылок. Работа изложена на .. страницах и содержит рисунков и .таблиц

Список сокращений: ФМЛФ - N-формнл-Мет-Лей-Фен; АФК - активные формы кислорода, ХЛ - люминол-зависимая хемшпоминесценция; ЛГТС - липопо.тасахарид; [СаЧ кгт - концентрация свободного Са2+ в цитозоле; ПКС - протеинкиназа С; MAPKs - мигоген-ахгавируемые протеинкиназы (mitogen-activated protein kinases), ERK Vz или p44/42 ERK-киназы, регулируемые внеклеточным сигналом (extracellular signal-regulated kinases) через предшественников - мигогеи-экстраклеточные киназы (МЕК), NADPH никотинамкцадсницдинуклеотидфосфат восстановленный; ФИЗК - фосфащдилинозитол-3-киназа, ФМА - форбол 12-миристат 13-ацетат, ФЛС, ФЛО - фосфолипазы, цФЛАг и сФЛА2 -цитоплазматическая и секретируемая ФЛА2, соответственно.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена на нейгрофилах мышей аутбредной линии NMRI, полученных из лаборатории биологического тестирования филиала Института биоорганической химии им акад. М М Шемякина и акад. Ю А Овчинникова Нейтрофилы инкубировали в течение 20 мин при 37°С с праймирующими агентами (1 нМ инсулином или 10 нг/мл липополисахаридом из Е. coli) и/или с ингибиторами, при совместной добавке вещества добавляли с интервалом 1 мин, затем активировали 0,1-50 цМ ФМЛФ Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и иммуноблоттинг с использованием моноклональных мышиных антител к дифосфорилированной форме р38 МАРК (р38 МАРК, клон p38-TY, Sigma, USA), проводили по стандартному методу [Laemmli, 1970, Sambrook et al, 1989]. Для исследования роли глюкозы в усилении респираторного взрыва клетки праймировали иономицином (0,01-1 |iM) в среде с 5 мМ D-глюкозой или 5 мМ 2-дезокси-Л-глюкозой в течение 5 мин при 37°С, затем активировали 1 |хМ ФМА Продукцию АФК оценивали методом люминол-зависимой хемилюминесценции. Суммарную продукцию АФК рассчитывали как площадь под кривой зависимости интенсивности хемилюминесценции от времени. Эффекты праймирующих агентов или ингибиторов оценивали по отношению

продукции АФК обработанных и интактных клеток за 5 мин от момента подачи ФМА или за 1 мин с момента подачи ФМЛФ. Продукция АФК интактных нейгрофилов была принята за 100%. Статистический анализ результатов проводили с использованием ^критерия Сгьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Активация респираторного взрыва, вызванного ФМЛФ в различных концентрациях

Поскольку нейтрофилы мигрируют в диапазоне увеличивающейся концентрации агонисга, ранее нами была исследована зависимость интенсивности респираторного взрыва от концентрации ФМЛФ перитонеальных нейгрофилов мышей линии ЫММ из конвенциональных условий, которая представляет собой кривую с насыщением [ОаЬс1ои!кЬакоуа л а1, 2003]. Полумаксимальная доза составляла около 2 цМ, в диапазоне концентраций ФМЛФ 10-50 рМ наблюдалось плато Мы активировали нейтрофилы в концентрации 1 цМ ФМЛФ, близкой к пороговой, и в концентрации 50 рМ, как насыщающей

Считается, что в покоящихся нейтрофилах КАОРН оксидаза, определяющая выход активных форм кислорода (АФК), находится в неактивном состоянии. Для активации NADPH оксидазы необходимо фосфорилирование ее субъединиц и последующая сборка комплекса из нескольких специфических цитоплазматических и мембранных белков.

С помощью мечения 32Р нейгрофилов нами были исследованы различия в фосфоршшровании клеточных белков при активации ФМЛФ в различных концентрациях Было обнаружено, что уровень фосфорилирования белков увеличивался при активации клеток 0,1 и 50 цМ ФМЛФ (табл. 1). Таблица 1. Включение 32Р в низкомолекулярные белки нейгрофилов в ответ на добавку ФМЛФ в разных концентрациях

-----ФМЛФ в

Белки Без ФМЛФ ФМЛФ

' ФМЛФ 0,1 дМ 50 цМ концентрации 0,1 цМ

16 кДа +__+__+++ приводил к

20 кДа + + +++ , ^ ^ гсДв-------- фосфорилированию белков

32 кДа + + ++ с массой 28 и 40 кДа, но не

34 кДа__-__-__++ у белков с массой 16, 20 и

40 кДа - + ++ „„ „

---- 32 кДа.

Белки Без ФМЛФ ФМЛФ

ФМЛФ 0,1 дМ 50 цМ

16 кДа + + +++

20 кДа + + +++

28 кДа - + +

32 кДа + + ++

34 кДа - - ++

40 кДа - + ++

ФМЛФ в концентрации 50 рМ вызывал увеличение включения радиоактивной метки в низкомолекулярные белки, за исключением белка с массой 28 кДа.

На основании полученных экспериментов было высказано предположение, что обнаруженное усиление фосфолирования белков с массой 40 кДа в ответ на 50 (дМ ФМЛФ происходит за счет вовлечения ферментов каскада МАРКз, белков с массой 44/42 кДа (р44/42 ЕЯК/МЕК 1/2) и 38 кДа (р38 МАРК) Киназы активируются в ответ на различные стимулы, включая факторы роста (через рецепгоры-тирозиновые киназы), цитокины, ЛПС, и подразделяются на три семейства ЕЮС - киназы, регулируемые внеклеточным сигналом, ЖК - с-1ип амино-терминальная киназа и р38 МАРК [МсЬ^Ь е! а1, 1998, Мск ег а1., 1999] Известно, что активация рецептора ФМЛФ может приводить к стимуляции последовательного фосфорилирования МАРКв через р21 гав/КаР-1 путь в нейтрофилах [РШшдег е1 а1., 1996].

2. МАРК5 в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов

Мы сравнили действие ингибиторов МАРКв на продукцию АФК в нейтрофилах, активированных ФМЛФ в концентрациях 1 и 50 цМ. Ингибирование мкгоген-акгивируемой протеинкиназы р38 с помощью 1 цМ БВ 203580 приводило к подавлению на 41±6% (и=11) ответа на 1 цМ ФМЛФ и усилению на 23±5% («=13) ответа на 50 цМ ФМЛФ. Действие 50 цМ РБ 09805?, специфического ингибитора МЕК 1/2, активирующей р44/42 ЕЮС [А^б! е1 а1, 1995], также приводило к изменению интенсивности респираторного взрыва и зависело от концентрации ФМЛФ. РО 09805? (50 цМ) ослаблял на 51 ±7% (л=5) ответ нейтрофилов на 1 цМ ФМЛФ и усиливал на 11±2% (л=9) ответ на 50 цМ ФМЛФ Можно заключить, что МЕК 1/2 и р38 МАРК действуют по принципу положительной связи в передаче сигнала с рецептора на ИАОРН-оксидазу при действии ФМЛФ в малых концентрациях и по принципу отрицательной связи при действии ФМЛФ в высоких концентрациях.

Результаты иммуноблотпшга с использованием специфических антител к дифосфорилированной форме р38 МАРК также показали, что наблюдалось значительное усиление активации р38 МАРК после стимуляции 50 цМ ФМЛФ в течение 1 мин (рис 1).

б

р38 МАРК

Контроль 50рМ ФМЛФ

Рис. 1 Иммуноанализ эффекта 50 цМ ФМЛФ на фосфорилирование р38 МАРК по треониновым и тирозиновым остаткам белков в нейгтрофилах.

Известно, что праймирование сопровождается усиленным фосфорилированием внутриклеточных белков по тирозиновым, сериновым и треониновым остаткам Ранее нами было показано, что одним из механизмов праймирования респираторного взрыва нейтрофилов является тирозиновое фосфорилирование [Габдулхакова, 2000] Для праймирования инсулином нейтрофилов важен активный статус тирозиновых протеинкиназ [Сафронова и

Мы предположили, что одним из механизмов праймирования является активация митоген-активируемых протеинкиназ, активность которых может регулироваться фосфорилированием по тирозиновым, сериновым или треониновым остаткам [Suzuki et al., 1999]. 2.1. Участие р38 МАРК и р44/42 ERK в действии инсулина

Ранее нами было показано, что действие инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный ФМЛФ, зависел от сочетания концентраций инсулина и хемотаксического пептида [Сафронова и др., 2001] Инсулин не изменял продукцию АФК.

Рис. 2. Респираторный взрыв, вызванный 1 цМ ФМЛФ (а) и 50 цМ ФМЛФ (б), в ингакгных (1) и праймированных 1 нМ инсулином (2) нейтрофилах. Стрелки указывают момент подачи активирующего агента.

При активации респираторного взрыва 1 рМ ФМЛФ, усиливающего действия инсулина не было обнаружено (рис. 2, а), тогда как ответ на 50 цМ ФМЛФ был значительно усилен (рис. 2, б).

др., 2001].

2 о :

в р • м я. мин

2 О

Время мин

Ингибирование р38 МАРК отменяло действие инсулина на респираторный взрыв нейгрофилов, вызванный 50 цМ ФМЛФ. При подаче ЭВ 203580 на фоне инсулина наблюдалось ослабление эффекта инсулина в ответ на 50 цМ ФМЛФ (рис. 3, а).

Ине SB Инс Р D

Рис 3 Эффект 1 рМ SB 203580 (а) и 50 рМ PD 098059 (б) при действии 1 нМ инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный 1 (^Р ) и 50 (Щ^) (хМ ФМЛФ. Указаны различия между группами: *р < 0.05; **р < 0.01

При совместном действии ингибитора р38 МАРК и инсулина наблюдается подавление респираторного взрыва, по сравнению с действием только ингибитора или праймирующего агента, в ответ на 1 цМ ФМЛФ (рис.3,а) Таким образом установлено, что праймирующее действие инсулина опосредуется через р38 МАРК, которая вовлечена в передачу сигнала от инсулина независимо от концентрации ФМЛФ, используемой для активации респираторного взрыва нейтрофилов.

Предобработка клеток 50 цМ PD 09805?, ингибитора МЕК, не отменяла эффект инсулина при активации 50 цМ ФМЛФ (рис 3, б). При обратной последовательности подачи веществ мы наблюдали их аддитивное действие МЕК и, вероятно, р44/42 ERK слабо вовлечены в праймирование инсулином при активации респираторного взрыва, вызванного 50 рМ ФМЛФ. Полученные результаты согласуются с сообщениями, в которых было показано, что активация респираторного взрыва ФМЛФ не зависела от р44/42 ERK [Coffer et al., 1998; Mollapour et al, 2001] Однако, инсулин, по-видимому, частично опосредует свое действие через р44/42 ERK на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный 1 цМ ФМЛФ ERK действуют по принципу положительной связи в передаче сигнала при активации ФМЛФ в малых концентрациях и слабо вовлекаются в праймирование инсулином при активации 8

ФМЛФ в высоких концентрациях.

2 2. Участие р38 МАРК в действии ЛПС на респираторный взрыв нейтрофилов

ЛПС в концентрации 10 нг/мл не вызывал респираторный взрыв нейтрофилов [Gabdoulkhakova et al, 2003], но приводил к усилению на 18±3% (л=40) вызванного 50 цМ ФМЛФ респираторного взрыва, и ослаблению на 20±9% (и=25) - при активации 1 цМ ФМЛФ.

Ингибирование р38 МАРК с помощью 1 цМ SB 203580 отменяло действие ЛПС Наблюдалось также подавление респираторного взрыва при подаче ингибитора на фоне ЛПС по сравнению с эффектами отдельно ингибитора и праймирующего агента при активации 1 и 50 цМ ФМЛФ (рис 4)

Рис. 4 Эффект 1 цМ SB 203380 на респираторный взрыв нейтрофилов при

праймировании 10 нг/ыл ЛПС. Показаны средние значения по результатам 5-13 независимых экспериментов. За 100% принят ответ ингастяых клеток, вызванный 1 (П ) и 50 (^) (jM ФМЛФ. Указаны различия между группами: * р < 005,** р<001,***р<0 001

р38 МАРК вовлечена в регуляцию респираторного взрыва нейтрофилов при праймировании ЛПС и активации 1 и 50 цМ ФМЛФ.

Полученные результаты дают основание сделать вывод, что активация р38 МАРК является одним из механизмов праймирования инсулином и ЛПС респираторного взрыва нейтрофилов.

Праймирование нейтрофилов реализуется также через активацию

фосфолипаз и образование биоактивных липидов [Swain et al, 2002] Так при

праймировании цитокинами, факторами роста или воспалительными

медиаторами активность фосфолипаз Аг, С и Д может увеличиться в несколько

раз [Roberts et al, 1996, Bauldry et al., 1997; Seeds et al., 1998; Niwa et al, 2000]

Основная роль ФЛАг заключается в высвобождении арахидоновой кислоты (АК)

из фосфолипидов мембраны с образованием биологически активных

эйкозаноидов, таких как лейкотриены, интерлейкины и простагландины под

действием эпокси-, липокси- и циклооксигеназ [Billah et al, 1989; Serhan et al,

9

эйкозаноидов, таких как лейкотриены, интерлейкины и простагландины, под действием эпокси-, липокси- и циклооксигеназ [Biilah et al., 1989; Serhan et al, 1996] Мы исследовали вклад отдельных фосфолипаз и ферментов, расщепляющих АК, в праймирование респираторного взрыва. 3. Действие фосфолипаз при активации и праймировании инсулином и ЛПС респираторного взрыва нейтрофилов

Ингибирование цФЛА2 10 цМ дексаметазоном [Сох, 1995], сФЛАг 1 цМ 4-бромофенацил бромидом [Fujita et al, 1996], ФЛС 10 рМ неомицином [Nakashima et al., 1988] и циклооксигеназы 10 рМ индометацином [Kozak et al, 1998] приводило к уменьшению продукции АФК в ответ на ФМЛФ в низких концентрациях (0,1 - 1 рМ) и усиливало ответ на 50 рМ ФМЛФ (таблица 2).

Действие ингибиторов ФЛД 0 1 % этанола [Rubin & Rand, 1994] и эпоксигеназы 10 цМ проадифена [Rastaldo et al., 2001] увеличивало активность NADPH оксидазы в ответ на ФМЛФ во всем диапазоне используемых концентраций

Таблица 2. Действие ингибиторов ферментов гидролиза фосфолипидов на вызванный ФМЛФ респираторный взрыв нейтрофилов

Ферменты метаболизма фосфолипидов Специфические ингибиторы ферментов метаболизма фосфолипидов Ковцеитрация ФМЛФ

1 цМ 50 цМ

цФЛА2 Дексаметазон, 10 цМ 82 ± 9 я = 9 U0±6*s л = 14

сФЛАз 4-БФБ", 1 цМ 74 ±3 п- 11 118 ±6*** п = 6

ФЛС Неоыицин, 10 рМ 89 + 7 п-4 115 ±7»** л = 17

ФЛД Этанол, 0.1 % 113 ±5 я -9 121 ±4** л -9

Циклооксигеназа Индометацин, 10 цМ 67 ±7 я-9 114 ±5**» л = 7

Эпоксигеназа Проаднфен, 10 цМ 204 ±33 л = 5 252 ±21** я - 12

Примечания " здесь и далее показан эффект ингибитора в процентах, рассчитанный как

отношение продукции АФК нейтрофилами, обработанными ингибитором, к продукции АФК

интактных клеток, принятой за 100%; 4 различия в эффектах ингибиторов на респираторный

взрыв, вызванный ФМЛФ в концентрациях 1 и 50 цМ, *р < 0 05, ** р < 0.01, ***р < 0 001," 4- I

БФБ - 4-бромофенацил бромид,

Полученные результаты дают основание считать, что продукты гидролиза фосфолипидов фосфолипазами (цФЛАз, сФЛАг, ФЛС) участвуют в регуляции ИМ)РН оксидазы, повышая ее активность при действии ФМЛФ в низких

Ю

концентрациях и понижая активность - в высоких Продукты гидролиза фосфолипидов ФЛД и расщепления АК эпоксигеназой, вероятно, приводят к понижению активности КАОРН оксидазы при действии ФМЛФ в низких и высоких концентрациях.

Поскольку некоторые изоформы фосфолипаз могут активироваться тирозиновыми киназами, было высказано предположение, что праймирующий эффект инсулина может реализоваться через механизм усиления гидролиза фосфолипидов

Рис. 5, а-г Действие инсулина на вызванную 50 цМ ФМЛФ продукцию АФК клеток,

обработанных ингибиторами. В каждом случае ответ клеток, обработанных ингибитором, принят за 100%, наличие вещества в среде инкубации клеток ♦ + - показано «+»; и -

+ + число независимых * ' * изменений,*-р<0.05. 17 14 9 9

Дексаметаэон, 10 мМ Индометацин, 10 рМ Неомицин, 10 рМ Этанол, 01 % Инсулин, 1 нМ

Ингибирование ФЛС, ФЛД и циклооксигеназы отменяло усиливающее действие 1 нМ инсулина на клетки, активированные 50 цМ ФМЛФ (рис 5, а-г) Более того, при совместном применении инсулина и дексаметазона наблюдалось уменьшение интенсивности респираторного взрыва (рис. 5, а).

Результаты дают основания считать, что эти ферменты могут быть вовлечены в премирование инсулином респираторного взрыва, вызванного 50 цМ ФМЛФ

При активации 1 рМ ФМЛФ обработанных 1 нМ инсулином клеток, ингибирование ФЛС и циклооксигеназы приводило к понижению респираторного взрыва по сравнению с ответом клеток, обработанных одним из ингибиторов, в то время как ингибирование цФЛА2 и ФЛД не изменяло эффект инсулина (рис. 6, а-г).

Возможно, ФЛС и циклооксигеназа регулируют респираторный взрыв нейтрофилов в присутствии инсулина по принципу положительной связи, в то время как ФЛД и цФЛА2 не вовлечены в действие инсулина при активации клеток ФМЛФ в низких концентрациях

Дмсаметаэон, 10 Индомвтацин, 10 рМ Неомицин, 10 рМ Этанол, 01 % Инсулин, 1 нМ

Рис. 6, (а-г). Действие инсулина на вызванную 1 цМ ФМЛФ

продукцию АФК клеток,

предварительно обработанных ингибиторами * -р<0.05.

Далее было проведено сравнение совместного действия ЛПС и ингибиторов метаболизма фосфолипидов при активации респираторного взрыва 1 и 50 рМ ФМЛФ Ингибирование цФЛАг, ФЛС и ФЛД отменяло усиливающее действие 10 нг/мл ЛПС на респираторный взрыв, вызванный 50 цМ ФМЛФ (рис 7, а-г)

Рис. 7, а-г. Действие шшополисахарида из Ecoh (ЛПС) на вызванную S0 цМ ФМЛФ продукцию АФК клеток,

обработанных ингибиторами. В каждом случае ответ клеток,

обработанных только ингибитором, принят

за 100%; л - число

I.

Деюаметаэон, 10 |jM Индомелции, 10 |>М Неомицин, 10 рМ Этанол, 0 1 % ЛПС, 10 нг/мл

измерений. *-р<0.01.

14 11

Данные дают основание считать, что фосфолипазы играют важную роль в действии ЛПС на оксидазную активность нейтрофилов и могут осуществлять положительную регуляцию при активации 50 цМ ФМЛФ. Индомегацин при совместном действии с ЛПС увеличивал продукцию АФК нейтрофилами в ответ на 50 цМ ФМЛФ (рис. 7, б). Циклоо ксигеназа и ее продукты слабо вовлечены в праймирование ЛПС вызванного 50 цМ ФМЛФ респираторного взрыва.

ЛПС в концентрации 10 нг/мл вызывал ослабление респираторного взрыва

нейтрофилов на 20±9% (и=25) при активации 1 цМ ФМЛФ Ингибирование

циклооксигеназы и ФЛД приводило к подавлению ответа на 1 цМ ФМЛФ при 12

действии ЛПС (рис. 8, б и г). По-видимому, циклооксигеназа и ФЛД слабо вовлечены в действие ЛПС на оксидазную активность нейтрофилов, вызванную 1 рМ ФМЛФ При ингибировании цФЛАг не наблюдалось изменений в действии ЛПС (рис. 8, а).

Рис. 8, а-г. Действие ЛПС на вызванную 1 fiM ФМЛФ

продукцию АФК клеток, обработанных ингибиторами В каждом случае ответ клеток,

обработанных только

, _ .. ингибитором, приют

Декеаметазон, 10 иМ + ♦ - - - - -

Индометацин, 10 |jM - - ♦ * - - - - за 100%, л - число Неомицин, ю мм - - - - + * - - независимых Этанол, 01% - - - - - - + + измерений * р <

ЛПС, Юнг/мл - + + - + - + дд; **р<001.

цФЛАг ослабляет респираторный взрыв нейтрофилов, праймированных ЛПС и активированных 1 рМ ФМЛФ Совместное действие неомицина и ЛПС приводило к повышению респираторного взрыва по сравнению с их эффектами по отдельности в случае 1 рМ ФМЛФ (рис. 8, в) Результаты позволяют сделать вывод, что ФЛС участвует в действии ЛПС по принципу отрицательной связи

Другим важным компонентом трансдукции сигнала от рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу является ФИЗК и фосфорилированные ею липиды, преимущественно ФИ(3,4)Фг и ФИ(3,4,5)Ф3 которые активируют различные изоформы протеинкиназы С и протеинкиназу В [Toker et al, 1997; Naccache et al, 2000, Cadwallader et al, 2002] ФИ(3,4,5)ФЛ может активировать малый GTP-связанный белок р21,ас, который является необходимым компонентом НАДФН оксидазы, а также р21 -активируемую киназу, которая фосфорилирует p47ph<"! [Knaus et al., 1995].

4. Определение участия ФИЗК в действии инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов

Мы обнаружили, что действие ингибиторов ФИЗК вортманнина и LY 294002 подавляло ответ нейтрофилов на ФМЛФ С ростом концентрации хемотаксического пептида от 0,1 рМ до 50 цМ ингибирование респираторного взрыва ослаблялось от 98% до 46%, соответственно (по результатам 5-11 независимых экспериментов).

В инсулин-компетентных клетках ФИЗК ответственна за функциональную активность чувствительного к инсулину транспортера глюкозы GLUT4, осуществляя его транслокацию в плазматическую мембрану [Cheathman & Kahn, 1995] В настоящее время участие ФИЗК в транспорте глюкозы при развитии респираторного взрыва нейгрофилов не показано

На нейтрофилах нами было обнаружено, что при отсутствии экстраклеточной глюкозы ответ клеток на ФМЛФ уменьшался и эффект вортманнина отсутствовал в среде без глюкозы Следовательно, ФИЗК участвует в утилизации экстраклеточной глюкозы при развитии респираторного взрыва нейгрофилов

Следующей задачей было исследование вклада ФИЗК в усиление тироз и нового фосфорилирования как механизма праймирования инсулином респираторного взрыва нейгрофилов, вызванного ФМЛФ.

Вортманнин понижал продукцию АФК при активации 1 и 50 рМ ФМЛФ (рис 9) Более того, при активации 1 и 50 рМ ФМЛФ совместное действие инсулина и вортманнина еще более понижало респираторный взрыв нейгрофилов Это говорит о том, что ФИЗК участвует в праймировании и играет значительную роль во взаимодействии сигнальных путей рецепторов ФМЛФ и инсулина.

140

Рис. 9. Действие 1 иМ инсулина (Инс) и 0,1 |хМ вортманнина (В) на респираторный взрыв нейгрофилов, вызванный 1 и 50 цМ ФМЛФ. За 100 % принята продукция АФК интактных клеток.

Инс В В»И И + В

Мы видим значительное подавление респираторного взрыва нейтрофилов при подаче вортманнина и инсулина в различных последовательностях при действии 1 цМ ФМЛФ.

Эффекты ингибиторов ФИЗК 0,1 цМ вортманнина и 50 цМ ЬУ 294002 сохраняли свое направление при различных концентрациях ФМЛФ и при

совместном действии инсулина и ФМЛФ Это говорит о том, что ФИЗК играет ключевую роль в развитии респираторного взрыва и является одним из механизмов праймирования инсулином нейгрофилов

Взаимодействие систем транспорта глюкозы и оксидазного метаболизма, тем более с привлечением инсулина, почти не исследовано в нейтрофилах, хотя активация клеток сопровождается усиленным транспортом глюкозы и внутриклеточной активацией молекул - транспортеров глюкозы

Далее мы исследовали вовлечение метаболизма глюкозы в праймирование нейгрофилов инсулином и ЛПС.

5. Вклад глюкозы в праймирование инсулином и ЛПС респираторного взрыва нейтрофилов

В наших исследованиях эффект инсулина отсутствовал в среде без глюкозы и в среде, содержащей 5 мМ 2-дезокси-£)-глюкозу (рис 10) ЛПС сохранял свое действие в среде без глюкозы, но его эффект отсутствовал в среде с 2-дезокси-£>-глкжозой - неметаболизируемым аналогом О-глюкозы.

ЛПС оказывал свое действие на респираторный взрыв нейтрофилов независимо от наличия экстраклеточной /^-глюкозы, но при ингибировании метаболизма глюкозы в клетке ЛПС не оказывал воздействия на респираторный взрыв нейтрофилов.

Таким образом, необходимым условием праймирования является метаболизм глюкозы в клетке, что было проверено нами на модельной системе нерецепторной активации нейгрофилов, где были использованы форболовый эфир ФМА для прямой активации ПКС и кальциевый ионофор иономицин для мобилизации Са2+ из внутриклеточных депо

респираторного взрыва 1 нМ инсулином и 10 нг/мл ЛПС в средах, содержащих' Г - 5 мМ О - глюкозу; 2 - ДОГ - 5 мМ 2-дезокси-73-глюкозу, -Г - без глюкозы Респираторный взрыв активирован 50 цМ ФМЛФ

Рис. 10. Праймирование

6. Исследование вклада глюкозы в премирование кальциевым ионофором иономицином и в активацииию ФМА респираторного взрыва нейтрофилов

Окисление глюкозы через гексозо-монофосфатный шунт (ГМШ) усиливается при снижении концентрации NADPH в клетке в результате активации NADPH оксидазы. Это происходит с участием протеинкиназ, активность некоторых из них может зависеть от ионов кальция [May et al, 1985]. Одновременное увеличение внутриклеточной концентрации свободного Са2+ ([Са2+]1щт) и усиление активности протеинкиназ приводят к синергической активации NADPH оксидазы [Finkel et al., 1987, Raddassi et al., 1994] Базальиая оксидазная активность нейтрофилов в инкубационной среде, не содержащей глюкозу, и в среде с 2-ДОГ была понижена по сравнению с активностью в среде с •D-глюкозой (рис. 11, а).

i

§ 0 5 i -

I 0 2

I -

| .0

* 0 1 2 3 4 5 * 0121450

Время, мин

Рис 11. Зависимость интенсивности хемилюминесценции нейтрофилов от времени в ответ на добавку кальциевого ионофора иономицина (а) и форболового эфира ФМА (б) в средах, содержащих' 1-5 мМ £> - глюкозы; 2-5 мМ 2-ДОГ; 3 -без глюкозы Стрелкой показан момент добавления ионофора или форболового эфира.

Интенсивность ответа на 1 рМ ФМА была значительно ослаблена как в

среде без глюкозы, так и в среде с 2-ДОГ по сравнению с интенсивностью ответа

в среде, содержащей 5 мМ ¿»-глюкозу Кальциевый ионофор иономицин в

концентрации 0,5 цМ активировал оксидазную активность нейтрофилов в среде с

.О-глюкозой и в среде с 2-ДОГ (рис 11, б). Наблюдались три фазы ответа' 1)

быстрое нарастание интенсивности хемилюминесценции после добавления

иономицина в течение 30 с в обеих средах; 2) спад более чем наполовину на

второй минуте ответа в среде с /З-глюкозой и до базального уровня - на третьей

минуте ответа в среде с 2-ДОГ; 3) повторное нарастание до некоторого

стационарного уровня примерно на 5 мин в среде с Д-глюкозой и незначительное 16

увеличение в среде с 2-ДОГ (рис. 11,6). Суммарная продукция АФК в среде с 2-ДОГ была меньше за весь период регистрации ответа.

БазальныЙ уровень оксидазной активности нейтрофилов обеспечивается глюкозой, поступающей в клетку Вероятно, что в ответе на иономицин в начальной фазе респираторного взрыва используются внутриклеточные энергетические запасы, а в последующем - экстраклеточная глюкоза

6.1. Оценка вклада кальций-зависимых процессов в утилизацию глюкозы при развитии респираторного взрыва

Ответ на 1 цМ ФМА интакгных нейтрофилов клеток не отличался от ответа истощенных по кальцию клеток в среде, содержащей 5 мМ Л-глюкозы, тогда как эквимолярное замещение £>-глюкозы на 2-ДОГ приводило к значительному понижению ответа по сравнению с ответом клеток в среде, содержащей 1 мМ

Рис 12. Зависимости интенсивности хемилюминесценции истощенных по Са2* нейтрофилов от времени в ответ на активацию 1 цМ ФМА в средах. 1,2-5 мМ £> - глюкозы; 3, 4 - 5 мМ 2 -ДОГ; 5,6 - без глюкозы; 1, 3,

5 - без добавления Са2+; 2, 4,

6 - с добавлением 2 мМ Са2\ Стрелкой показан момент добавления форболового эфира

Добавление 1,5 мМ Са^ в среду инкубации истощенных по кальцию клеток приводило к возрастанию ответа почти в 3 раза, если среда содержала £>-глюкозу (рис 12, кривые 1 и 2) Другая реакция на добавление 1,5 мМ Са2+ наблюдалась в среде с 2-ДОГ- не усиление ответа, как в среде с ¿»-глюкозой, а дополнительное подавление по сравнению с ответом истощенных по Са2+ клеток (рис 12, кривые 3 я4)

Интенсивность ответа на ФМА истощенных по Са2+ клеток, содержащихся в среде без глюкозы, была значительно ниже, чем в среде с £>-глюкозой (рис 12, кривые 1 и 5), однако при добавлении 1,5 мМ Са2+, как и в среде с Д-глюкозой, развивался синергический ответ (рис 12, кривая б) Таким образом, для развития полноценного ответа на ФМА необходимо наличие глюкозы в среде инкубации и возможность утилизации внутриклеточных энергетических запасов, что требует наличия достаточного количества Са2+ внутри клетки.

Са+(рис 12, кривые I и 3)

Выводы:

1. Исследование компонентов сигнальных систем рецептора ФМЛФ при активации оксидазной активности нейтрофилов показало, что вклад компонентов сигнальных систем зависит от концентрации ФМЛФ' действие протеинкиназ р38 МАРК и р44/42 1ЖК и продуктов гидролиза фосфолипидов фосфолипазами - цФЛАг, сФЛАг, ФЛС - приводит к усилению активности КАОРН оксидазы при низких концентрациях ФМЛФ и ослаблению активности в случае 50 цМ ФМЛФ

2 ФИЗК является ключевым ферментом в передаче сигнала от рецептора ФМЛФ на КАОРН оксид азу ФИЗК усиливает оксидазную активность нейтрофилов и играет более значительную роль при низких концентрациях ФМЛФ, чем при высоких.

3 Утилизация экстраклеточной глюкозы при развитии респираторного взрыва происходит с участием ФИЗК

4 Механизмы праймирования инсулином вызванного ФМЛФ респираторного взрыва нейтрофилов включают активацию фосфолипаз -ФЛС, цФЛАг и ФЛД циклооксигеназы, р38 МАРК и ФИЗК Для усиления инсулином респираторного взрыва нейтрофилов необходимо поступление экстраклеточной глюкозы.

5 Праймирование ЛПС оксидазной активности нейтрофилов реализуется через активацию фосфолипаз (ФЛС, цФЛАг и ФЛД), р38 МАРК и зависит от метаболизма глюкозы

6 Базовый уровень продукции активных форм кислорода обеспечивается В-глюкозой из внешней среды и внутриклеточными энергетическими запасами Утилизация внутриклеточных запасов глюкозы при развитии респираторного взрыва зависит от концентрации кальция в цигозоле Для развития полноценного ответа при активации нейтрофилов необходимо поступление в клетку экстраклеточной глюкозы.

Список публикаций

1 Сафронова В Г, Габдулхакова А Г, Миллер А В , Косарев И В , Василенко Р Н. Вариабельность действия инсулина на респираторный взрыв в нейтрофилах. Роль тирозиновых киназ и фосфатаз. // Биохимия - 2001. - Т 66. - 8. - С 1036-1047. 2. Миллер А.В., Габдулхакова А.Г, Сафронова В.Г. Роль экстра- и внутриклеточной глюкозы в развитии респираторного взрыва нейтрофилов из очага острого воспаления // Биол. Мембраны -2002 -Т. 19.-3. С. 195-201.

3 Gabdoulkhakova A G, Safronova V.G., Miller A.V, Sadovnikov V B. Expression of genotypic and phenotypic features in animals during activation and priming of the neutrophil respiratory burst // Baltic J. Lab. AnimalSci. - 2003. - V 13.-2 -P. 78-85.

4 Миллер A.B., Габдулхакова А.Г., Сафронова В Г Участие ферментов гидролиза фосфолипидов в действии инсулина и липополисахарида на респираторный взрыв нейтрофилов. // Биоп. Мембраны. - 2004. - В печати.

5 Safronova V.G., Gabdoulkhakova AG., Miller A.V., Alovskaya A.A, Dedkova EN Modulation of insulin priming of the fMLP-induced respiratory burst by cycloheximide. // FASEB J - 2000 - V 14 - 4 -P442.20.

6 Сафронова В Г, Габдулхакова А.Г., Миллер А В. Инсулин как модулятор цитотоксической активности нейтрофилов // Отчетная конференция ИБК РАН, Сессия Ученого совета, 2000 г.

7. Миллер А.В, Габдулхакова А.Г, Сафронова В Г Сравнение праймирующего действия инсулина, липополисахарида и хемотаксического пептида на респираторный взрыв нейтрофилов в средах с D-глюкозой и 2-дезокси-0-глюкозой. // Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии» Тезисы - Пущино, 2000 - С. 44.

8 Миллер А.В , Габдулхакова А.Г., Сафронова В Г. Сравнение реакций нейтрофилов на активирующие агенты в среде с 2-дезокси-0-глюкозой. // Международная конференция «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода»' Тезисы. - Пущино, 2000 - С. 106-107

9 Миллер А В, Габдулхакова А Г., Сафронова В Г Праймирование оксидазной активности нейтрофилов: роль фосфолипазы А2 // ХШ зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии биотехнологии» Тезисы -М., 2001.-С.86.

10 Миллер АВ, Габдулхакова А Г. Дозо-зависимое воздействие хемотаксического пептида ФМЛФ на оксидазную активность нейтрофилов. // 5ая Пущинская конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века»: Тезисы. - Пущино, 2001 г - С 153.

11 Gabdoulkhakova A G, Miller А V, Safronova V G Insulin priming of the fMLP-induced neutrophil respiratory burst: role of ERK and p38 МАРК И 27th Meeting of the FEBS. Lisbon, Portugal. 2001. P.68 (PS3-013).

12 Gabdoulkhakova AG, Miller AV, Evdokimov VA, Safronova VG Insulin priming of the fMLP-induced neutrophil respiratory burst role of ERK and p38 МАРК II Forum of Young Scientists Protein Structure-Function Trafficking and Signalling, Satellite Meeting of the 27th FEBS/PABMB Oeiras, Portugal. 2001. P 35

13 Safronova VG, Gabdoulkhakova A.G., Miller AV, Evdokimov VA Involvement of protein kinases in insulin priming of fMLP-induced oxidase activation in neutrophils // International Symposium "Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems". Kyiv, Ukraine 2001 P. 93

14 Миллер A.B, Сафронова В.Г., Габдулхакова АГ, Авхачева НВ., Санталов Б Ф. Респираторный взрыв нейтрофилов' вовлечение фосфатидилинозитол 3-киназы в активацию хемотаксическим пептидом и праймирование инсулином // Отчетная конференция ИБК РАН, Сессия Ученого совета, 2001 г.

15. Миллер А.В., Лихачева Н.В., Чоу Г., Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г. Праймирование оксидазной активности нейтрофилов: роль фосфатидилинозитол-3-киназы. // XIV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии биотехнологии». Тезисы. - М, 2002. - С.93

16. Miller А.V., Gabdoulkhakova A.G., Safronova V.G. Dual-dealing regulation in neutrophil oxidase activity. // 46 Annual Meeting of Biophysical Society, San-Francisco, USA. Biophys. J 2002. V.82. N.l (Pt. 2). P. 220a.

17. Miller A V, Avhacheva N V, Gabdoulkhakova A G, Safronova V G MAP kinases changeover in the Lipopolysaccharide and insulin priming of the neutrophil respiratory burst. // Third International Conference on Signal Transduction Conference on Cellular Signaling Dubrovnik 2002.

18 Gabdoulkhakova AG., Miller AV, Avhacheva N.V., Evdokimov V.A, Safronova V.G Up- and down-regulation of insulin priming of the fMLP-induced neutrophil respiratory burst II The 7th International Union Biochemistry and Molecular Biology Conference "Receptor-ligand interactions". Bergen, Norway. 2002. P. A41.

19 Авхачева HB., Миллер AB, Габдулхакова АГ, Сафронова В Г, Шехтман Д.Г Регуляция респираторного взрыва нейтрофилов при сердечно-сосудистых заболеваниях. // VI Всероссийский научный форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» Мед. Иммунол,

2002 -Т 4(2) - С. 139

20. Avkhacheva N V., Miller А V., Gabdoulkhakova A G., Safronova V.G, Maltseva VN, Matveeva NK, Sukhih GT Two-faced granulocytes-defense or alarm under pathologies of reproductive system' // Physiological Society Spring Workshop "Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress". Budapest, Hungary. 2003. P3. P 20.

21 Мальцева B.H, Авхачева H.B., Миллер А В, Габдулхакова АГ. Функциональная активность нейтрофилов мышей с экспериментальной опухолью // 7ая Пущинская конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века»' Тезисы. - Пущино,

2003 г. -С. 30.

22 Maltseva VN, Avkhacheva NV, Miller A.V, Gabdoulkhakova AG, Safronova V G. Tumor process tangling signaling systems in neutrophils from inflammatory center. // FEBS Special Meeting on Signal Transduction Brussels, Belgium 2003. P 192 (PS01-0976)

Принято к исполнению 16/02/2004 Исполнено 16/02/2004

Заказ № 49 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2006-4 18062

I

л

V4;

15 млр гш

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Миллер, Анна Викторовна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Нейтрофил

1.1.1. Функции нейтрофилов

1.2. Респираторный взрыв нейтрофилов

1.2.1. NADPH оксидаза 17 1.2.1.1. Структура и функции субъединиц

NADPH оксидазы

1.3. Праймирование нейтрофилов

1.3.1. Праймирующие агенты

1.3.2. Механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов

1.4. Внутриклеточные системы, вовлеченные в передачу сигнала от рецептора ФМЛФ при развитии респираторного взрыва

1.4.1. Митоген-активируемыепротеинкиназы

1.4.2. Ферменты гидролиза фосфолипидов

1.4.3. Фосфатидилинозитол-З-киназа

1.4.4. Утилизация глюкозы при респираторном взрыве нейтрофилов

1.5. Праймирование липополисахаридом

1.6. Праймирование инсулином

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Биологический объект 46 2.2.1.1. Изоляция нейтрофилов мышей

2.2.2. ДЦС-электрофорез и иммуноблоттинг

2.2.2.1. Фосфорилирование клеточных белков

2.2.3. Регистрация хемилюминесценции

2.2.4. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты исследований

3.1. Активация респираторного взрыва ФМЛФ в различных концентрациях

3.2. MAPKs в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов

3.2.1. Участие р38 МАРК и р44/42 ERK в действии инсулина

3.2.2. Участие р38 МАРК в действии ЛПС на респираторный взрыв нейтрофилов

3.3. Действие фосфолипаз при активации и праймировании инсулином и ЛПС респираторного взрыва нейтрофилов

3.4. Определение участия ФИЗК в действии инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов

3.5. Вклад глюкозы в праймирование инсулином и ЛПС респираторного взрыва нейтрофилов

3.6. Исследование'вклада глюкозы в праймирование кальциевым ионофором иономицином и в активацииию ФМА респираторного взрыва нейтрофилов

3.6.1. Праймирование кальциевым ионофором реакции нейтрофилов на ФМА в средах с D-глюкозой и 2-ДОГ

3.6.2. Оценка вклада кальций-зависимых процессов в утилизацию глюкозы при развитии респираторного взрыва

Глава 4. Обсуждение

4.1. Роль митоген-активируемых протеинкиназ в праймировании инсулином и липополисахаридом респираторного взрыва нейтрофилов

4.2. Участие фосфолипаз в праймировании инсулином и липополисахаридом респираторного взрыва нейтрофилов

4.3. Участие фосфатидилинозитол-3-киназы в действии инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов

4.4. Вклад глюкозы в пЬраймирование кальциевым ионофором иономицином и в активацииию ФМА респираторного взрыва нейтрофилов 85 Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов"

Актуальность проблемы. Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы) участвуют во врожденном иммунном ответе и обеспечивают первую линию защиты организма от вторгшихся бактерий. Миграция нейтрофилов в очаг острого воспаления происходит в градиенте хемотаксических факторов, одним из которых является N-формил-Мет-Лей-Фен (ФМЛФ). Связывание хемотаксического пептида ФМЛФ со своим рецептором; сопряженным с гетеротримерным G-белком, запускает каскад внутриклеточных процессов с последующим развитием респираторного взрыва. Респираторный, или дыхательный, взрыв нейтрофилов представляет собой массированный выброс активных форм кислорода при усиленном потреблении кислорода и глюкозы. За его развитие ответственен мембранный фермент NADPH оксидаза, осуществляющий перенос электронов от внутриклеточного NADPH на молекулу экзогенного кислорода [McPhail et al., 1984]. Активация фермента вызывает уменьшение концентрации NADPH в клетке, что активирует окисление глюкозы через гексозо-монофосфатный шунт (ГМШ) - основной поставщик NADPH в нейтрофилах [Nessel et al., 1999]. При этом может утилизироваться глюкоза из внеклеточной среды и/или глюкоза, запасенная в клетке [Tan et al., 1998]. Известно, что передача сигнала от рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу идет по фосфоинозитидному пути с участием фосфолипазы С (ФЛС), инозитолл I

1,4,5-трисфосфата, Са и протеинкиназы С [по Thelen et al., 1993]. Кроме того, было показано участие каскада митоген-активируемых протеинкиназ (MAPKs) [Rane et al., 1997] и фосфотидилинозитол-3-киназы (ФИЗК) [Ward et al., 2000].

Многими авторами разрабатывается концепция активации нейтрофилов как двухступенчатого процесса [Thelen et al., 1993; Doerfler et 5 al., 1994; Coffer et al., 1998]. Сначала нейтрофилы взаимодействуют с агентами, которые не активируют клетку, а переводят ее в состояние готовности к ответу [Hallett & Lloyds, 1997]. Затем уже подготовленный нейтрофил получает соответствующий стимул, что приводит его к полностью активированному состоянию. Процесс, при котором предварительная обработка клетки агентом приводит к последующему усилению ответа на активацию, называют праймированием (от англ. "priming" - подготовка). В настоящее время интенсивно изучается праймирование функций нейтрофилов цитокинами, хемотаксическими факторами, метаболическими регуляторами, действующими через рецепторы, принадлежащие к разным семействам [Kurt-Jones et al., 2002; Seely et al., 2003; Dewas et al., 2003]. Сами праймирующие агенты не вызывают изменений функций нейтрофилов, в том числе респираторного взрыва, но их предварительное воздействие приводит к усилению ответа на активацию. В зависимости от рецептора, через который действует праймирующий агент, могут реализоваться разные механизмы праймирования нейтрофилов: изменения в уровне экспрессии адгезивных молекул на поверхности клетки; освобождение содержимого гранул; полимеризация актина; фосфорилирование; синтез белка de novo; модуляция [Са J^; активация фосфолипаз; образование биоактивных липидов [Swain et al., 2002]. Показано, что при праймировании активность протеинкиназ, в том числе MAPKs и тирозиновых киназ, может увеличиваться в несколько раз [McLeish et al., 1998];

Одним из механизмов праймирования является усиление фосфорилирования белков по остаткам тирозина. Запуск тирозинового фосфорилирования осуществляется через рецепторы, обладающие своей собственной тирозинкиназной активностью, к ним относят рецептор инсулина. Изменения в регуляции инсулином активности нейтрофилов видны, в основном, по многочисленным нарушениям, возникающим при б диабете и развивающимся, скорее, вследствие отсутствия действия инсулина, чем из-за его влияния [Ortmeyer & Mohsenin, 1996]. Данные о праймирующем действии инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов отсутствуют.

Известно, что праймирование нейтрофилов бактериальным липополисахаридом (ЛПС), основным рецептором которого на нейтрофилах считается CD 14, гликозилфосфатидилинозитол-связанный гликопротеин [Wright et al., 1990; Ulevitch & Tobias, 1995], сопровождается усилением респираторного взрыва [Guthrie et al., 1984]. Однако последовательность внутриклеточных событий после связывания ЛПС нейтрофилами неизвестна, как и характер взаимодействия сигнальных систем рецепторов ЛПС и формулированных пептидов в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов.

Изучение внутриклеточных сигнальных систем, вовлеченных в праймирование, поможет понять механизмы, которыми регулируются специфические функции нейтрофилов, и развить терапевтические стратегии против чрезмерной цитотоксичности нейтрофилов.

Цели и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании механизмов праймирующего действия инсулина и ЛПС и участия глюкозы в респираторном взрыве нейтрофилов.

Были поставлены следующие задачи:

- исследовать вклад компонентов каскада митоген-активируемых протеинкиназ, фосфолипаз и фосфатидилинозитол-3-киназы в механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов инсулином;

- исследовать вклад компонентов каскада митоген-активируемых протеинкиназ и фосфолипаз в механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов липополисахаридом;

- сравнить вклад исследуемых сигнальных систем митоген-активируемых протеинкиназ и фосфолипаз в действие инсулина и 7 липополисахарида на респираторный взрыв, вызванный ФМЛФ в низких и высоких концентрациях;

- оценить роль метаболизма глюкозы в усиление респираторного взрыва при праймировании агентами разной, природы (иономицина, инсулина и ЛПС).

Научная новизна работы. Впервые исследован вклад р38 МАРК, и MEK/ERK1/2, ферментов гидролиза фосфолипидов, фосфатидилинозитол

3-киназы, в отдельные механизмы праймирования инсулином и липополисахаридом респираторного взрыва нейтрофилов, вызванного хемотаксическим пептидом ФМЛФ. Показано, что утилизация внутриклеточной глюкозы в нейтрофилах при развитии респираторного взрыва происходит с участием кальций-зависимых процессов.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты раскрывают некоторые аспекты функционирования нейтрофилов на уровне внутриклеточной сигнализации, а также дают основу для новых терапевтических стратегий при лечении воспалений и могут быть использованы при прогнозировании течения многих заболеваний.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на

4-7 Пущинских конференциях молодых ученых (Пущино, 2000-2003); На XIII и XIV зимних международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической; биологии и биотехнологии" (Москва, 2001-2002); на конференциях: "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000); «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000); Ежегодных научных конференциях ИБК РАН (Пущино, 2001-2002); Forum of Young Scientists Protein Structure-Function Trafficking and Signalling, satellite meeting of the 27th FEBS/PABMB (Португалия, 2001); 46 Annual Meeting of the Biophysical Society (США, 2002); Third International Conference on Signal Transduction (Хорватия, 2002); The 7th International Union Biochemistry and Molecular 8

Biology Conference "Receptor-ligand interactions" (Норвегия, 2002); FEBS Special Meeting on Signal Transduction (Бельгия, 2003).

Список сокращений:

ФМЛФ - N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; АФК - активные формы кислорода; ХЛ - люминол-зависимая хемилюминесценция; ЛПС - липополисахарид;

Са2+]цих - концентрация свободного цитозольного кальция;

ДАГ - диацилглицерол;

ПКС - протеинкиназа С;

ПКА - протеинкиназы А;

IGF-1 - инсулино-подобный фактор роста-1;

MAPKs - митоген-активируемые протеинкиназы (mitogen-activated protein kinases);

ERKs- киназы, регулируемые внеклеточным сигналом (extracellular signal-regulated kinases);

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; GM-CSF - гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор; IL-3, IL-8 - интерлейкины;

TNF-a - фактор некроза опухолей-a (tumor necrosis factor-a),

ФИЗК - фосфатидилинозитол-3-киназа;

ФИ3 - инозитол 1,4,5-трифосфат;

ФАТ - фактор активации тромбоцитов;

ФМА-форбол 12-миристат 13-ацетат;

ФЛС - фосфолипаза С; сФЛАг- секретируемая фосфолипаза А2; цФЛА2 - цитоплазматическая фосфолипаза А2;

ФЛБ - фосфолипаза D;

GTP - гуанозин трифосфат;

АЦ - аденилатциклаза.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Миллер, Анна Викторовна

Выводы:

1. Исследование компонентов сигнальных систем рецептора ФМЛФ при активации оксидазной активности нейтрофилов показало, что вклад компонентов сигнальных систем зависит от концентрации ФМЛФ: действие протеинкиназ р38 МАРК и р44/42 ERK и продуктов гидролиза фосфолипидов фосфолипазами - цФЛА2, сФЛАг, ФЛС -приводит к усилению активности NADPH оксидазы при низких концентрациях ФМЛФ и ослаблению активности в случае 50 цМ ФМЛФ.

2. ФИЗК является ключевым ферментом в передаче сигнала от рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу. ФИЗК усиливает оксидазную активность нейтрофилов и играет более значительную роль при низких концентрациях ФМЛФ, чем при высоких.

3. Утилизация экстраклеточной глюкозы при развитии респираторного взрыва происходит с участием ФИЗК.

4. Механизмы праймирования инсулином вызванного ФМЛФ респираторного взрыва нейтрофилов включают активацию фосфолипаз - ФЛС, цФЛА2 и ФЛД, циклооксигеназы, р38 МАРК и ФИЗК. Для усиления инсулином респираторного взрыва нейтрофилов необходимо поступление экстраклеточной глюкозы.

5. Праймирование ЛПС оксидазной активности нейтрофилов реализуется через активацию фосфолипаз (ФЛС, цФЛА2 и ФЛД), р38 МАРК и зависит от метаболизма глюкозы.

6. Базовый уровень продукции активных форм кислорода обеспечивается D-глюкозой из внешней среды и внутриклеточными энергетическими запасами. Утилизация внутриклеточных запасов глюкозы при развитии респираторного взрыва зависит от концентрации кальция в цитозоле. Для развития полноценного ответа при активации нейтрофилов необходимо поступление в клетку экстраклеточной глюкозы.

90

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Миллер, Анна Викторовна, Пущино

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. / Рецепторы и внутриклеточный кальций. // Москва: Наука, 1994. 288 с.

2. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. / Хемилюминесценция клеток животных. // Итоги науки и техники. М: ВИНИТИ, 1989, т. 24, 176 с.

3. Габдулхакова А.Г. / Роль фосфорилирования в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов. // Дисс. на соискание уч. ст. канд.биол.наук. Пущино: Институт Биофизики клетки РАН. 2000. 110 с.

4. Дедкова Е.Н., Аловская А.А., Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г., Зинченко В.П. / Усиливающее действие кальциевых ионофоров на вызванный форболовым эфиром респираторный взрыв в перитонеальныйх нейтрофилах мыши. // Биохимия, 1999. Т 64. № 7. С. 77-84.

5. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. / Очерки о нейтрофиле и макрофаге. // Новосибирск: Наука. 1989. 341 с.

6. Миллер А.В., Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г. / Роль экстра- и внутриклеточной глюкозы в развитии респираторного взрыванейтрофилов из очага острого воспаления. // Биол. Мембраны. 2002. -Т. 19.-3. С. 195-201.

7. Румшинский JI.3. / Математическая обработка результатов экспериментов. // Москва: Наука. 1971. 192 с.

8. Сафронова В.Г., Габдулхакова А.Г., Миллер А.В., Косарев И.В., Василенко Р.Н. / Вариабельность действия инсулина на респираторный взрыв в нейтрофилах. Роль тирозиновых киназ и фосфатаз. // Биохимия. 2001. Т. 66, № 8. С. 840-849.

9. И. Шпаков А.О. / Структурно-функциональная характеристика гетеродимерных фосфатидил-инозитол-3-киназ и молекулярные механизмы их сопряжения с другими компонентами сигнальных систем. // Цитология. 1999. Т 41. № 11. С. 975-990.

10. Ado A.D. / Uber den Verlauf der oxydativen und glykolytischen Prozesse in der Leukocyten des entzundeten Gewebes wahrend der Phagocytise. // Z. Gen. Exp. Med. 1933. 87:473-481.

11. Adams P.D., Parker P.J. / Activation of mitogen-activated protein (MAP) kinase by a MAP kinase-kinase. // J. Biol. Chem. 1992. 267(19): 1313513137.

12. Afonso A., Macedo P.M., Ellis A.E., Silva M.T. / Glycogen granules in resting and inflammatory rainbow trout phagocytes an ultrastructural study. // Dis. Aquat. Organ. 2000. V. 42. № 2. P. 101-110.

13. Alexiewicz J.M., Kumar D., Smogorzewski M., Klin M., Massry S.G. / Polymorphonuclear leukocytes in non-insulin-dependent diabetes mellitus: abnormalities in metabolism and function. // Ann. Inter. Med. 1995. V. 123. P. 919-924.

14. Allen R.C., Loose L.D. / Phagocytic activation of a lumonol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 69. P. 245-252.

15. Alessi DR, Cuenda A, Cohen P, Dudley DT, Saltiel AR. PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 27489-94.

16. Babior B.M. / The leukocyte NADPH oxidase. // Isr. Med. Assoc. J. 2002. V. 4. P. 1023-4.

17. Babior B.M. / The respiratory burst oxidase. // Curr Opin Hematol. 1995. V. 2. P. 55-60.

18. Bajaj M., Defronzo R.A. / Metabolic and molecular basis of insulin resistance. //J. Nucl. Cardiol. 2003. V. 10. P. 311-23.

19. Bauldry S.A., Wooten R.E. / Induction of cytosolic phospholipase A2 activity by phosphatidic acid and diglycerides in permeabilized human neutrophils: interrelationship between phospholipases D and A2. // Biochem. J. 1997. V. 322. P. 353-363.

20. Becker E.L. / The short and happy life of neutrophil activation.// J. Leukoc. Biol. 1990. V. 47. P. 378-89.

21. Belvin M.P., Anderson K.V. / A conserved signaling pathway: the Drosophila toll-dorsal pathway. //Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1996. V. 12. P. 393-416.

22. Berra E., Diaz-Meco M.T., Moscat J. / The activation of p38 and apoptosis by the inhibition of Erk is antagonized by the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 10792-7.

23. Berridge M.J., Irvine R.F. / Inositol phosphates and cell signalling.// Nature. 1989. V. 341. P. 197-205.

24. Berton G. / Tyrosine kinases in neutrophils. // Curr Opin Hematol. 1999. V.6. P. 51-8.

25. Bokoch G.M., Knaus U.G. / Ras-related GTP-binding proteins and leukocyte signal transduction. // Curr. Opin. Hematol. 1994. V. 1. P. 53-60.

26. Bokoch G.M., Parkos C.A. / Identification of novel GTP-binding proteins in the human neutrophils. // FEBS Lett. 1988. P. 227. P. 66-70.

27. Bolscher J., Veerman E., Van Nieuw Amerongen A., Tulp A., Verwoerd D. / Distinct populations of high-M(r) mucins secreted by different human salivary glands discriminated by density-gradient electrophoresis. // Biochem J. 1995. V. 309. (Pt 3):801-6.

28. Bormann B.J., Huang C.-K., Maskin W.M., Becker E.L. / Receptor-mediated activation of a phospholipase A2 in rabbit neutrophil plasma membrane.// Proc. Natl. Acad. Sci. 1984. V. 81. P. 767-770.

29. Bortolussi R, Rajaraman K., Qing G., Rajaraman R. / Fibronectin enhances in vitro lipopolysaccharide priming of polymorphonuclear leukocytes. //Blood. 1997. V. 89. P. 4182-9.

30. Bos J.L. / Rapl, a Ras-like GTPase with a distinct function. // Abstract book lectures. Molecular Mechanisms of Signal Transduction. 1999.

31. Bowen R.F., Raikwar N.S., Olson L.K., Deeg M.A. / Glucose and insulin regulate glycosylphosphatidylinositol-specific phospholipase D expression in islet beta cells. // Metabolism. 2001. V. 50. P. 1489-92.

32. Boulay F., Tardif M., Brouchon L., Vignais P. / The human N-formylpeptide receptor. Characterization of two cDNA isolates and evidence for a new subfamily of G-protein-coupled receptors. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 11123-33.

33. Brozna J.P., Hauff N.F., Phillips W.A., Johnston R.B. Jr. / Activation of the respiratory burst in macrophages. Phosphorylation specifically associated with Fc receptor-mediated stimulation. // J Immunol. 1988. V. 141. P. 1642-7.

34. Brown G.E., Silver G.M., Reiff J., Allen R.C., Fink M.P. / Polymorphonuclear neutrophil chemiluminescence in whole blood from blunt trauma patients with multiple injuries. // J. Trauma Injury Infect. Crit. Care. 1999. V. 46. P. 297- 305.

35. Cheatham В., Kahn C.R. / Insulin action and the insulin signaling network. // Endocr Rev. 1995. V. 16. P. 117-42.

36. Chen R., Kang V.H., Chen J., Shope J.C., Torabinejad J., DeWald D.B., Prestwich G.D. / A monoclonal antibody to visualize PtdIns(3,4,5)P(3) in cells. // J Histochem Cytochem. 2002. V. 50. P. 697-708.

37. Chodniewicz D., Zhelev D.V./ Novel pathways of F-actin polymerization in the human neutrophil. // Blood. 2003. V. 102. P. 2251-8.

38. Choi W.C., Gerfen C.R., Suh P.G., Rhee S.G. / Immunohistochemical localization of a brain isozyme of phospholipase С (PLC III) in astroglia in rat brain. // Brain. Res. 1989. V. 9. P. 193-7.

39. Condliffe A.M., Kitchen E., Chilvers E.R. / Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. // Clin Sci. 1998. V. 94. P. 461-471.

40. Cox J.A., Jeng A.Y., Sharkey N.A., Blumberg P.M., Tauber A.I. / Activation of the human neutrophil nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)-oxidase by protein kinase C. // J. Clin. Invest. 1985. V. 76. P. 1932-1938.

41. Cross AR, Parkinson JF, Jones ОТ. / Mechanism of the superoxide-producing oxidase of neutrophils. 02 is necessary for the fast reduction of cytochrome b-245 by NADPH. // Biochem J. 1985. V. 226. P. 881-4.

42. Dana R., Malech H.L., Levy R. / The requirement for phospholipase A2 for activation of the assembled NADPH oxidase in human neutrophils. // Biochem. J. 1994. V. 297 (Pt l):217-23.

43. Daniels R.H., Finnen M.J., Hill M.E., Lackie J.M. / Recombinant human monocyte IL-8 primes NADPH-oxidase and phospholipase A2 activation in human neutrophils. // Immunology. 1992. V. 75. P. 157- 163.

44. Davies E.V., Hallett M.B. / Cytosolic Ga2+ signalling in inflammatory neutrophils: implications for rheumatoid arthritis (Review). // Int J Mol Med. 1998. V. l.P. 485-90.

45. Davies P., Bailey P.J., Goldenberg M.M., Ford-Hutchinson A.W. / The role of arachidonic acid oxygenation products in pain and inflammation.// Annu. Rev. Immunol. 1984. V. 2. P. 335-57.

46. DeLeo F.R., Quinn M.T. / Assembly of the phagocyte NADPH oxidase: molecular interaction of oxidase proteins. // J Leukoc Biol. 1996. V. 60. P. 677-91.

47. Demerdash T.M., Seyrek N., Mareinkowski W., Nasser-Moadelli S., Massry S.G. / Pathways through which glucose induces a rise in Ca2+.i of polymorphonuclear leukocytes of rats. // Kidney Int. 1996. V. 50. № 6. P. 2032-2040.

48. Diebold B.A., Bokoch G.M. / Molecular basis for Rac2 regulation of phagocyte NADPH oxidase. // Nat Immunol. 2001. V. 2. P. 211-5.

49. Doerschuk C.M., Beyers N., Coxson H.O., Wiggs В., Hogg J.C. / comparison of neutrophil and capillary diameters and theirrelation to neutrophil sequestration in the lung. // J. Appl. Physiol. 1993. V. 34. P. 3040-3048.

50. Dong C., Davis R.J., Flavell R.A. / MAP kinases in the immune response. // Annu. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 55-72.

51. Downey G.P., Fukushima Т., Fialkow L., Waddel Т.К. / Intracellular signalling in neutrophil priming and activation. // Cell Biology. 1995. V. 6. P. 345-356.

52. Duhl H., Borregaard N. / Effect of glycogenolytic agents on glycogen synthase activity in polymorphonuclear leukocytes. Evidence for a Ca2+-mediated regulation of glycogen synthase activity. // Biochim Biophys Acta. 1981. V. 675. P. 101-9.

53. Dusi S., Donini M., Rossi F. / Mechanisms of NADPH oxidase activation: translocation of p40phox, Racl and Rac2 from the cytosol to the membranes in human neutrophils lacking p47phox or p67phox. // Biochem.99

54. J. 1996. V. 314. P. 409-412.

55. Edwards S.W. / Biochemistry and Physiology of the Neutrophil. // New York, NY: Cambridge University Press. 1994.

56. Eggleton P., Wang L., Penhallow J., Crawford N., Brown K.A. / Differences in oxidative response of subpopulations of neutrophils from healthy subjects and patients with rheumatoid arthritis. // Ann. Rheum. Dis. 1995. V. 54. P. 916- 923.

57. Eichhorn J., Kayali A.G., Resor L., Austin D.A., Rose D.W., Webster N.J. / PLC-gammal enzyme activity is required for insulin-induced DNA synthesis. // Endocrinology. 2002. V. 143. P. 655-664.

58. Evans J.H., Spencer D.M., Zwefach A., Leslie CC. / Intracellular calcium signals regulating cytosolic phospholipase A2 translocation to internal membranes. // J. Biochem. Chem. 2001. V. 276. P. 30150-60.

59. Faenza I., Bavelloni A., Fiume R., Lattanzi G., Maraldi N.M., Gilmour R.S., Martelli A.M., Suh P.G., Billi A.M., Cocco L. / Up-regulation of nuclear PLCbetal in myogenic differentiation. // J. Cell Physiol. 2003. V. 195. P. 446-52.

60. Fenton M.J., Golenbock D.T. / LPS-binding proteins and receptors. // J Leukoc Biol. 1998. V. 64. P. 25-32.

61. Ferrero E., Jiao D., Tsuberi B.Z., Tesio G.W., Rong A., Haziot A., Goyert S.M. / Transgenic mice expressing human CD 14 are hypersensitive to lipopolysaccharide. / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 23802384.

62. Fernandez-Segura E., Garcia J.M., Santos J.L., Campos A. / Shape, F-actin, and surface morphology changes during chemotactic peptide-induced polarity in human neutrophils. // Anat. Rec. 1995. V. 241. P. 519-528.

63. Fialkow L., Chan C.K., Grinstein S., Downey G.P. / Regulation of tyrosine phosphorylation in neutrophils by the NADPH oxidase. Role of reactive oxygen intermediates. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P.17131-17137.

64. Fittschen C., Sandhaus R.A., Worthen G.S., Henson P.M. / Bacterial lipopolysaccharide enhances chemoattractant-induced elastase secretion by human neutrophils. //J. Leukoc. Biol. 1998. V. 43. P. 547- 556.

65. Follin P., Dahlgren C. / Phagocytosis by lipopolysaccharide-primed human neutrophils is associatedwith increased extracellular release of reactive oxygen metabolites. // Inflammation. 1992. V. 16. P. 83- 91.

66. Forehand J.R., Bomalski J.S., Johnston R.B. Jr. / Mechanisms of lipopolysaccharide priming for enhanced respiratory burst activity in human neutrophils. // Exp. Med. Biol. 1991. V. 297. P. 65- 73.

67. Fouda S.I., Molski T.F., Ashour M.S., Sha'afi R.I; / Effect of Iipopolysaccharide on mitogen-activated protein kinases and cytosolic phospholipase A2. // Biochem. J. 1995. V. 308. P. 815-822.

68. Freeman J.L., Lambeth J.D. / NADPH oxidase activity is independent of p47phox in vitro. // J Biol Chem. 1996. V. 271. P. 22578-82.

69. Fruhwirth M., Ruedl C., Ellemunter H., Bock G., Wolf H. / Flow-cytometric evaluation of oxidative burst in phagocytic cells of children with cystic fibrosis. // Int. Arch. Allergy Immunol. 1998. V. 117. № 4. P. 270275.

70. Fu Y.-K., Arkins S., Wang B.S., Kelley K.W. / A novel role of growth hormone and insulin-like growth factor-1. Priming neutrophils for superoxide anion secretion. //J. Immunol. 1991. V. 146. P. 1602-1608.

71. Fuchs A., Dagher M.C. / Activation of the CVgenerating NADPH oxidase in a semi recombinant cell-free system, assessment of the function of Rac in the activation process. // Eur. J. Biochem. 1994. V. 224. P. 587595.

72. Fujita I., Takeshige K., Minakami S. / Inhibition of neutrophil superoxide formation by l-(5-isoquinolinesulfonyl)-2-methylpiperazine (H-7), an inhibitor of protein kinase-C. // Biochem. Pharmacol. 1986. 35(24):4555-4562.

73. Fukui Y., Ihara S., Nagata S. / Downstream of phosphatidylinositol-3 kinase, a multifunctional signaling molecule, and its regulation in cell responses. //J. Biochem. 1998. V. 124. P. 1-7.

74. Furtmuller P.G., Burner U., Obinger C. / Reaction of myeloperoxidase compound I with chloride, bromide, iodide, and thiocyanate. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 17923-30.

75. Gabdoulkhakova A.G, Safronova V.G., Miller A.V., Sadovnikov V.B. / Expression of genotypic and phenotypic features in animals during activation and priming of the neutrophil respiratory burst. // Baltic J. Lab.102

76. Annim. Sci. 2003. V. 4. P. 29-34.

77. Gabic T.G. / The 02-forming oxidase responsible for the respiratory burst in human neutrophils. // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 9070-9074.

78. Gao J.L., Murphy P.M. / Species and subtype variants of the N-formyl peptide chemotactic receptor-reveal multiple important functional domains. //JBiol Chem. 1993. V. 268. P. 25395-401.

79. Gao J.L., Chen H., Filie J.D., Kozak C.A., Murphy P.M. / Differential expansion of the N-formylpeptide receptor gene cluster in human and mouse. // Genomics. 1998. V. 51. P. 270-6.

80. Garrington T.P., Johnson G.L. / Organization and regulation of mitogen-activated protein kinase signaling pathways. // Curr. Opin. Cell Biol. 1999. V. 11. P. 211-8.

81. Geppert T.D., Whitehurst C.E., Thompson P., Beutler B. / Lipopolysaccharide signals activation of tumor necrosis factor biosynthesis through the ras/raf-1 /МЕК/МАРК pathway. // Mol. Med. 1994. V.l. P. 93103.

82. Guthrie L.A., McPhail L.C., Henson P.M., Johnston R.B., Jr. / Priming of neutrophils for enhanced release of oxigen metabolites by bacterial lipopolysaccharide. //J. Exp. Med. 1984. V. 160. P. 1656-1671.

83. Haddad P.S., Vallerand D., Mathe L., Benzeroual K., De Werve G.V. / Synergistic activation of mitogen-activated protein kinase by insulin and adenosine triphosphate in liver cells: Permissive role of Ca. // Metabolism. 2003. V. 52. P. 590-598.

84. Hale K.K., Trollinger D., Rihanek M., Manthey C.L. / Differential expression and activation of p38 mitogen-activated protein kinase a, p, у and 5 in inflammatory cell lineages. / J. Immunol. 1999. V. 162. P. 42464252.

85. Hallett M.B., Lloyds D. / Neutrophil priming: the cellular signals thatsay 'amber' but not 'green'. // Immunol. Today. 1995. V. 16. P. 264-268.103

86. Hallett M.B., Lloyds D. / The Molecular and Ionic Signalling of Neutrophils.// Landes Bioscience. Austin, Texas. USA. 1997. 211 p.

87. Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. / Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. // Blood. 1998. V. 92. P. 3007-17.

88. Harvath L., Leonard E.J. / Two neutrophil populations in human blood with different chemotactic activity: separation and chemotactic binding. // Infect. Immun. 1982. V. 36. P. 443-448.

89. Haslett C., Guthrie L.A., Kopaniak M.M., Johnston R.B., Henson P.M. / Modulation of multiple neutrophil functions by preparative methods or trace concentrations of bacterial lipopolysaccharide. // Am. J. Pathol. 1985. V. 119. P. 101-112.

90. Hashimoto A., Katagiri M., Torii S., Okuyama H. / Effect of dietary alpha-linolenate/linoleate balance on the formation of leukotrienes in rat polymorphonuclear leukocytes. // Arerugi. 1988. V. 37. P. 157-65.

91. Haziot A., Ferrero E., Kontgen F., Hijiya N., Yamamoto S., Silver J., Stewart C.L., Goyert S.M. Resistance to endotoxin shock and reduced dissemination of gram-negative bacteria in CD14-deficient mice. // Immunity. 1996. V. 4. P. 407-414.

92. Heit В., Tavener S., Raharjo E., Kubes P. / An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. //J Cell Biol. 2002. V. 159. P. 91-102.

93. Henderson W.R. / The role of leukotrienes in inflammation. // Ann. Intern. Med. 1994. V. 121. P. 684-697.

94. Hennekke P., Golenbock D.T. / TIRAP: how Toll receptors fraternize. // Nat. Immunol. 2001. V. 2. P. 828-830.

95. Herrera-Velit P., Reiner N.E. / Bacterial lipopolysaccharide induces the association and coordinate activation of p53/561yn and phosphatidylinositol 3-kinase in human monocytes. // J. Immunol. 1996. V. 156. P. 1157-1165.

96. Heumann D., Roger T. / Initial responses to endotoxins and Gram-negative bacteria. // Clin Chim Acta. 2002. V. 323. P. 59-72.

97. Heyworth P.G., Cross A.R., Curnutte J.T. / Chronic granulomatous disease. // Curr. Opin. Immunol. 2003. V. 15. P. 578-84.

98. Hirsch E., Katanaev V.L., Garlanda C., Azzolino O., Pirola L., Silengo L., Sozzani S., Mantovani A., Altruda F., Wymann M.P. / Central role for G protein-coupled phosphoinositide 3-kinase gamma in inflammation. // Science. 2000. V. 287. P. 1049-53.

99. Hoffman J.F., Keil M.L., Riccobene T.A., Omann G.M., Linderman J.J. / Interconverting receptor states at 4 degrees for neutrophil N-formyl peptide receptor. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 13047-55.

100. Hogg J.C. / Neutrophil kinetics and lung injury. // Physiol. Rev. 1987. V. 67. P. 249-256.

101. Horl W.H., Schafer R.M., Horl M., Heidland. / Neutrophil activation in acute renal failure and sepsis. // Arch. Surg. 1990. V. 125. P. 651-658.105

102. Horton J.W. / Cellular basis for burn-mediated cardiac dysfunction in adult rabbits. // Am. J. Physiol. 1990. V. 271. P. 2615-21.

103. Huang C.-K. / Protein kinases in neutrophils: a review. // Membrane Biochemistry. 1989. V. 8. P. 61-79.

104. Irvine R.F. / Inositol lipids in cell signalling. // Curr. Opin. Cell Biol. 1992. V. 4. P. 212-9.

105. Jablonska E., Kiluk M., Markiewicz W. / Priming effects of GM-CSF, IFN-gamma and TNF-alpha on human neutrophil inflammatory cytokine production. // Melanoma Res. 2002. V. 12. P. 123-8.

106. Jiang H., Kuang Y.N., Wu Y.P., Smrchka A.V., Simon M.I., Wu D.Q. / Pertussis toxin-sensitive activation of phospholipase С by the C5a and fMet-Leu-Phe receptors. //J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 13430-13434.

107. Jin G.F., Guo Y.S., Ball C., Houston C.W. / Insulin-like growth factors enhance phagocytosis by human neutrophils in vitro. // Regul. Pept. 1993. V. 49. P. 125-131.

108. Juhl H., Borregaard N. / Effect of glycogenolytic agents on glycogen synthase activity in polymorphonuclear leukocytes. Evidence for a Ca2+-mediated regulation of glycogen synthase activity. // Biochim. et biophys. acta. 1981. V. 675. № 1. P. 101-109.

109. Kadiiska M.B., Burkitt M.J., Xiang Q.H., Mason R.P. / Iron supplementation generates hydroxyl radical in vivo. An ESR spin-trapping investigation. // J Clin. Invest. 1995. V. 96. P. 1653-7.

110. Kahn C.R. / Diabetes. Causes of insulin resistance. // Nature. 1995. V. 373. P. 384-5.

111. Kahn N.N. / Platelet-stimulated thrombin and PDGF are normalized by insulin and Ca2+ channel blockers.// Am. J. Physiol. 1999. V. 276. P. 856862.

112. Kitchen E., Rossi AG., Condliffe A.M., Haslett C., Chilvers E.R. / Demonstration of reversible priming of human neutrophils using platelet-activating factor. // Blood. 1996. V. 88. P. 4330-4337.

113. Klebanoff S.J., Clark R.A. / The neutrophil: function and clinical disorders. // Amsterdam, The Netherlands, North Holland, 1978. 326 P.

114. Knaus U.G., Morris S., Dong H.J., Chernoff J., Bokoch G.M. /107

115. Regulation of human leukocyte p21-activated kinases through G protein-coupled receptors. // Science. 1995. V. 269. P. 221-3.

116. Kozak W., Archuleta I., Mayfield K.P., Kozak A., Rudolph K., Kluger M.J. / Inhibitors of alternative pathways of arachidonate metabolism differentially affect fever in mice. // Am. J. Physiol. 1998. V. 275. Pt 2):R1031-40.

117. Krause H., Dieter P., Schulze-Specking A., Ballhorn A., Ferber E., Decker K. Synergistic effect of magnesium and calcium ions in the activation of phospholipase A2 of liver macrophages. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 15. P. 532-6.

118. Krump E., Borgeat P. / Adenosine. An endogenous inhibitor of arachidonic acid release and leukotriene biosynthesis in human neutrophils. // Adv. Exp. Med. Biol. 1999. V. 447. P. 107-115.

119. Kyriakis J.M., Avruch J. / Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation. // Physiol. Rev. 2001 V. 81. P. 807-69.

120. Laemmli U.K. / Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-682.

121. Lambeth J.D., Cheng G., Arnold R.S., Edens W.A. / Novel homologs of gp91phox. //Trends Biochem Sci. 2000. V. 25. P. 459-61.

122. Lane T.A., Lamkin G.E. / Glycogen metabolism in stored granulocytes. // Transfusion. 1985. V. 25. P. 246-250.

123. Lee A., Young S.K., Henson P.M., Haslett C. / Modulation of neutrophil programmed cell death by inflammatory mediators. // 1989. FASEB J. V. 3. A1344.

124. Leet C.S., Vincan E., Thomas R.J., Phillips W.A. / Lipopolysaccharide-induced priming of the human neutrophil is not associated with a change in phosphotyrosine phosphatase activity. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999.V. 31. P. 185-193.

125. Lew D.P. / Receptor signalling and intracellular calcium in neutrophil activation. // Eur. J. Clin. Invest. 1989. V. 19. P. 338-343.

126. Li Z., Jiang H., Xie W., Zhang Z., Smrchka A.V., Wu D. / Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. // Science. 2000. V. 287. P. 1046-1049.

127. Liles W.C., Klebanoff S.J. / Regulation of apoptosis in neutrophils — Fas track to death? // J. Immunol. 1995. V. 155. P. 3289-3295.

128. Linnekin D., Bowles C.A., Murano G., Macvittie T.J. / Migration of dog polymorphonuclear neutrophilic leukocytes to formylated peptides. // Inflammation. 1990. 14:691-703.

129. Liochev S.I., Kuchumov A.R., Vinogradov S.N., Fridovich I. / Superoxide dismutase activity in the giant hemoglobin of the earthworm, Lumbricus terrestris. // Arch Biochem Biophys. 1996. V. 330. P. 281-4.

130. Liscovitch M. / Crosstalk among multiple signal-activated phospholipases. //TIBS. J. 1992. V. 17. P. 393-399.

131. Lloyds D., Hallett M. B. / Neutrophil "priming" induced by orthovanadate: evidence of a role for tyrosine phosphorylation. // Biochem. Pharmacol. 1994. V. 48. P. 15-21.

132. Lorenzo M., Teruel Т., Hernandez R., Kayali A.G., Webster N.J. / PLCgamma participates in insulin stimulation of glucose uptake through activation of PKCzeta in brown adipocytes. // Exp. Cell Res. 2002. V. 278. P. 146-157.

133. Malech H.L., Gallin J.I. / Current consepts: immunology. Neutrophils in human diseases. // N. Eng. J. Med. 1987. V. 317. P. 687-683.

134. Mansfield P.J., Hinkovska-Galcheva V., Carey S.S., Shayman J.A., Boxer L.A. / Regulation of polymorphonuclear leukocyte degranulation and oxidant production by ceramide through inhibition of phospholipase D. // Blood. 2002. V. 99. P. 1434-1441.

135. Masuda K., Kobayashi Y., Kinoshita Y. / Heterogeneity of Fc receptor expressoin in chemotaxis and adherence of neonatal neutrophils. // Pediatric Research. 1989. V. 25. P. 6-10.

136. May M.J., Ghosh S. / Signal transduction throughNF-kappa В. // Immunol. Today. 1998. V. 19. P. 80- 88.

137. Mazengera R.L., Kerr M.A. / The specificity of the IgA receptor purified from human neutrophils. // Biochem. J. 1990. V. 272. P. 159-165.

138. McLeish K.R., Knall C., Ward R.A., Gerwins P., Coxon P.Y., Klein J.B., Johnson G.L. / Activation of mitogen-activated protein kinase cascades during priming of human neutrophils by TNF-alpha and GM-CSF. // J. Leukoc. Biol. 1998. V. 64. P. 537-45.

139. McPhail L.C., Clayton C.C. / The NADPH oxidase of human, polymorphonuclear leukocytes. // Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 5768-5775.

140. Meng F., Lowell C.A. / Lipopolysaccharide (LPS) -indused macrophage activation and signal transduction in the absence of SRC family kinases Hck, Fgr, and Lyn. // J.Exp. Med. 1997. V. 185. P. 1661-1670.

141. Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway С A Jr. / A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. // Nature. 1997. V. 388. P. 394-7.

142. Mire-Sluis A.R. / Analytical characterisation of cytokines and growth factors. // Dev. Biol. Stand. 1999. V. 97. P. 3-9.

143. Morris A.J., Hammond S.M., Colley C., Sung T.-C., Jenco J.M., Sciorra V.A., Rudge S.A., Frohman M.A. / Regulation and functions of phospholipase D. // Biochem. Soc. Trans. 1997. V. 25. P. 15045-15048.

144. Murphy P.M., Eide В., Goldsmith P., Brann M., Gierschik P., Spiegel A., Malech H.L. / Detection of multiple forms of Gi alpha in HL60 cells. // FEBS Lett. 1987. V. 221. P. 81-6.

145. Murphy S., Welk G. / Arachidonic acid evokes inositol phospholipid hydrolysis in astrocytes. // FEBS lett. 1989. V. 257. P. 68-70.

146. Murphy P.M., Tiffany H.L., McDermott D., Ahuja S.K. / Sequence and organization of the human N-formyl peptide receptor-encoding gene. // Gene. 1993. V. 15. P. 285-90.

147. Nagai Y., Akashi S., Nagafiiku M., Ogata M., Iwakura Y., Akira S., Kitamura Т., Kosugi A., Kimoto M., Miyake K. / Essential role of MD-2 in112

148. S responsiveness and TLR4 distribution. // Nat. Immunol. 2002. V. 3. P. 667-72.

149. Nagaoka I, Hirota S. / Increased expression of matrix metalloproteinase-9 in neutrophils in glycogen-induced peritoneal inflammation of guinea pigs. // Inflamm Res 2000. V. 49. P. 55-62.

150. Nagata K., Nozawa Y. / Role of GTP-binding proteins in phospholipid metabolism in human platelets. //Nippon. Rinsho. 1992. V. 50 P. 223-9.

151. Nahas N., Molski T.F., Fernandez G.A., Sha'afi R.I. / Tyrosine phosphorylation and activation of a new mitogen-activated protein (MAP)-kinase cascade in human neutrophils stimulated with various agonists. // Biochem. J. 1996.V. 318. P. 247-253.

152. Nakatomi K., Aida Y., Kusumoto K., Pabst M.J., Maeda K. / Neutrophils responded to immobilizedlipopolysaccharide in the absence of lipopolysaccha- ride-binding protein. // J. Leukoc. Biol. 1998. V. 64. P. 177184.

153. Nanda A., Romanek R., Curnutte J.T., Grinstein S. / Assessment of the contribution of the cytochrome b moiety of the NADPH oxidase to the transmembrane H+ conductance of leukocytes. // J Biol Chem. 1994. V. 269. P. 27280-5.

154. Nauseef W.M. / Assembly of the neutrophil respuratory burst oxidase. // J.Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 5911-5917.

155. Nessel C.C., Henry W.L., Mastrofrancesco В., Reichner J.S., Albina J.E. / Vestigial respiratory burst activity in wound macrophages. // Am. J. Physiol.1999. V. 276. P. 1587-94.

156. Nick J.A., Avdi N.J., Gerwins P., Johnson G.L., Worthen G.S. / Activation of a p38 mitogen-activated protein kinase in human neutrophils by 1 ipopolysaccharide. //J. Immunol. 1996. V. 156. P. 4867-4875.

157. Nisimoto Y., Motalebi S., Han C.H., Lambeth J.D. / The p67(phox) activation domain regulates electron flow from NADPH to flavin in flavocytochrome b(558). //J Biol Chem. 1999. V. 274. P. 22999-3005.

158. Nishida E., Gotoh Y. / The MAP kinase cascade is essential for diverse signal transduction pathways. //Trends. Biochem. Sci. 1993. V. 18. P. 128131.

159. Noack В., Jachmann I., Roscher S., Sieber L., Kopprasch S., Luck C., Hanefeld M., Hoffmann T. / Metabolic diseases and their possible link to risk indicators of periodontitis. // J. Periodontal. 2000. V. 71. № 6. P. 898903.

160. Nunoi H., Rotrosen D., Gallin J.I., Malech H.L. / Two forms of114autosomal chronic granulomatous disease lack distinct neutrophil cytosol factors. // Science. 1988. V. 242. P. 1298-301.

161. Oldenborg P.-A. / Effects of insulin on N-formyl-methinyl-leucyl-phenylalanine (fMet-Leu-Phe)-stimulated production of reactive oxygen metabolites from normal human neutrophils. // Inflamm. Res. 1999. V. 48. P. 404-411.

162. Oldenborg P.-A., Sehlin J. / Insulin-stimulated chemokinesis in normal neutrophils is dependent on D-glucose concentration and sensitive to inhibitors of tyrosine kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. // J. Leukoc. Biol. 1998. V. 63. P. 203-208.

163. Olivero J., Ganey P.E. / Role of protein phosphorylation in activation of phospholipase A2 by the polychlorinated biphenyl mixture Aroclor 1242. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2000. V. 63. P. 9-16.

164. Ortmeyer J., Mohsenin V. / Inhibition of phospholipase D and superoxide generation by glucose in diabetic neutrophils. // Life. Sci. 1996. V. 59. P. 255-62.

165. Packman C.H., Lichtmann M.A. / Activation of neutrophils: measurement of actin conformational changes by flow cytometry. // Blood cells. 1990. V. 16. P. 193-197.

166. Park H.S., Kim I.S., Park J.W. / Phosphorylation induces conformational changes in the leukocyte NADPH oxidase subunit p47phox. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 259. P. 38-42.

167. Pember S.O., Barnes K.C., Brandt S.J., Kinkade J.M. / Density and heterogenity of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes: gradient action and relationship to chemotactic stimulation. // Blood. 1983. 61:1105-1110.

168. Petrequin P.R., Todd R.F., Devall L.J., Boxer L.A., Curnutte J.T. / Association between gelatinase release and increased plasma membrane expression of the Mol glycoprotein. // Blood. 1987. V. 69. P. 605-611.

169. Pollin P., Wymann M.P., Dewald В., Ceska M., Dahlgren C. / Human neutrophil migration into skin chambers is associated with production of NAP/IL-8 and C5a. // Eur. J. Haematol. 1991. 47:71-76.

170. Ponting C.P. / Novel domains in NADPH oxidase subunits, sorting nexins, and Ptdlns 3-kinases: binding partners of SH3 domains? // Protein Sci. 1996. V. 5. P. 2353-7.

171. Pricop L., Gokhale J., Redecha P., Ng S.C., Salmon E. / Reactive oxygen intermediates enhance Fcg receptor signaling and amplify phagocytic capacity. //J. Immunol. 1999. V. 162. P. 7041- 7048.

172. Prossnitz E.R., Ye R.D. / The N-formyl peptide receptor: a model for the study of chemoattractant receptor structure and function. // Pharmacol Ther. 1997. V. 74. P. 73-102.

173. Pugin J., Heumann I.D., Tomasz A., Kravchenko V.V., Akamatsu Y., Nishijima M., Glauser M.P., Tobias P.S., Ulevitch R.J. / CD14 is a pattern recognition receptor. // Immunity. 1994. V. 1. P. 509-516.

174. Raddassi K., Berthon В., Petit J.F., Lemaire G. / Role of calcium in the activation of mouse peritoneal macrophages: induction of NO synthase by calcium ionophores and thapsigargin. // Cell Immunol. 1994. V. 153. P. 443-55.

175. Rastaldo R., Paolocci N., Chiribiri A., Penna C., Gattullo D., Pagliaro P. / Cytochrome P-450 metabolite of arachidonic acid mediates bradykinin-induced negative inotropic effect. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001. V. 280. P. 2823-32.

176. Rhee S.G. / Redox signalling: hydrogen peroxide as intracellular messenger. //Exp. Mol. Med. 1999. V. 31. P. 53-59.

177. Roberts P.J., Williams S.L., Linch D.C. / The regulation of neutrophil phospholipase A2 by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and its role in priming superoxide production. // Br. J. Haematol. 1996. V. 92. P. 804-814.

178. Roitt I., Brostoff J., Male D. / Immunology. // Sixth edition. Mosby, Harcourt Publishers Limited. 2001. 480 P.

179. Rubin R., Rand M.L. / Alcohol and platelet function. // Alcohol Clin Exp Res. 1994. V. 18. P. 105-10.

180. Rubinek Т., Levey R. / Arachidonic acid increases the activity of the assembled NADPH oxidase in cytoplasmic membranes and endosomes. // Biochem. Biophys. Acta. 1993. V. 1176. P. 51-58.

181. Salazar E.P., Rozengurt E. / Bombesin and platelet-derived growth factor induce association of endogenous focal adhesion kinase with Src in intact Swiss 3T3 cells. //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 28371-28378.

182. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. / Molecular cloning: A laboratory manual. // 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 1989. P. 1815.

183. Sayeed М.М. / Signaling mechanisms of altered cellular responses in trauma, burn, and sepsis: role of Ca2+. // Arch Surg. 2000. V.135. № 12. P. 1432-1442.

184. Schimke J., Mathison J., Morgiewicz J., Ulevitch R.J. / Anti-CD14 mAb treatment provides therapeutic benefit after in vivo exposure to endotoxin. // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V. 95. P. 13875-80.

185. Schwandner R, Dziarski R, Wesche H, Rothe M, Kirschning С J. / Peptidoglycan- and lipoteichoic acid-induced cell activation is mediated by toll-like receptor 2. // J Biol Chem. 1999. V. 274. P. 17406-9.

186. Sedgwick J.B., Berube M.L., Zurier R.B. / Stimulus-dependent inhibition of superoxide generation by prostaglandins. // Clin. Immunol. Immunopathol. 1985. V. 34. P. 205-15.

187. Seeds M.C., Jones D.F., Chilton F.H., Bass D.A. / Secretory and cytosolic phospholipases A2 are activated during TNF priming of human neutrophils. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V.1389. P. 273-284.

188. Seely A.J., Pascual J.L., Christou N.V. / Cell membrane expression (connectivity) regulates neutrophil delivery, function and clearance. // Crit. Care. 2003. V. 7. P. 291-307.

189. Serhan C.N., Haeggstrom J.Z., Leslie C.C. / Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. // FASEB J. 1996. V. 10. P. 1147-58.

190. Shah S.V., Wallin J.D., Elien S.D. / Chemiluminescence and supreoxide production by leykocytes from diabetic patients. // J. Immunol. 1985. P. 2069-2073.

191. Shalaby M.R., Aggarwal B.B. / Activation of human polymorphonuclear neutrophil functions by interferon and tumor necrosis factors. // J. Immunol. 1985. p. 2069-2073.

192. Snyderman R., Pike M.C. / Chemmoattrectant receptors on phagocytic cells. // Ann.Rev.Immunol. 1984. V. 2. P. 257-281.

193. Spagnoli A., Spadoni G.L., Sesti G., Del Principe D., Germani D., Boscherini B. / Effect of insulin on hydrogen peroxide production by human polymorphonuclear leukocytes. // Horm. Res. 1995. 43:286-293.

194. Stefanova I., Corcoran M.L., Horak E.M., Wahl L.M., Bolen J.B., Horak I.D. / Lipopolysaccharide induces activation of CD14-associated protein tyrosine kinase p53/56lyn. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 20725-20728.

195. Stephens L.R., Eguinoa A., Erdjument-Bromage H., Lui M., Cooke F., Coadwell J., Smrcka A.S., Thelen M., Cadwallader K., Tempst P., Hawkins

196. Р.Т. / The G beta gamma sensitivity of a PI3K is dependent upon a tightly associated adaptor, pi01. // Cell. 1997. V. 89. P. 105-14.

197. Steinbeck M.J., Roth J.A. / Neutrophil activation by recombinant cytokines. // Rev. Infect. Dis. 1989. 11:549-568.

198. Surette M.E., Nadeau M., Borgeat P., Gosselin J. / Priming of human peripheral blood mononuclear cells with lipopolysaccharides for enhanced arachidonic acid release and leukotriene synthesis. // J. Leukoc. Biol. 1996. V. 59. P. 709-715.

199. Suzuki Y.J., Forman H.J. Sevanian A. / Oxidants as stimulators of signal transduction. // Free. Radic. Biol. Med. 1997. V. 22. P. 269-285.

200. Swain S.D., Rohn T.T., Quinn M.T. / Neutrophil priming in host defense: role of oxidants as priming agents. // Antioxidants &Redox signaling. 2002. V. 4. P. 69-83.

201. Syrbu S.I., Waterman W.N., Molski T.F.P., Deepa Nagarkatti, Hajjar J.J., Sha'afi R. / Phosphorylation of cytosolic phospholipase A2 and the release of arachidonic acid in human neutrophils. // J. Immun. 1999. V. 162. P.2334-2340.

202. Takemura O.S., Banno Y., Nozawa Y. / Inhibition of N-formylmethionyl-Ieucyl-phenylalanine-stimulated tyrosine phosphorylation and phospholipase D activation by quercetin in rabbit neutrophils. // Biochem. Pharmacol. 1997. V. 53. P. 1503-10.

203. Tapping R.I., Akashi S., Miyake K., Godowski P.J., Tobias P. / Toll-Like Receptor 4, But Not Toll-Like Receptor 2, Is a Signaling Receptor for Escherichia and Salmonella Lipopolysaccharides. // J Immunol. 2000. V. 165. P. 5780-5787.

204. Thelen M., Dewald В., Baggiolini M. / Neutrophil signal transduction and activation of the respiratory burst. // Physiol. Rev. 1993. V. 73. P. 797821.

205. Thomson G.A., Fisher B.M., Gemmell C.G., MacCuish A.C., Gallacher S.J. / Attenuated neutrophil respiratory burst following acute hypoglycaemia in diabetic patients and normal subjects. // Acta Diabetol. 1997. V. 34. P.253-256.

206. Toker A. / Phosphoinositides and signal transduction. // Cell Mol Life Sci. 2002. V. 59. P. 761-79.

207. Vasselon Т., Detmers P.A. / Toll receptors: a central element in innate immune responses. // Infect Immun. 2002. V. 70: P. 1033-41.

208. Volpp B.D., Nauseef W.M., Clark R.A. / Two cytosolic neutrophil oxidase components absent in autosomal chronic granulomatous disease. // Science. 1988. V. 242. P. 1295-7.

209. Walker BAM and Ward PA. / Priming and signal transduction in neutrophils. // Biol Signals. 1992. V. 1. P. 237- 249.

210. Ward R.A., Nakamura M., McLeish K.R. / Priming of the neutrophil respiratory burst involves p38 mitogen-activated protein kinase-dependent exocytosis of flavocytochrome b558-containing granules. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 36713-36719.

211. Wientjes / NADPH oxidase and the respiratory burst. // Semin. Cell Biol. 1995. V.6. P. 357-65.

212. Wiggs B.R., English D., Quinlan W.M., Doyle N.A., Hogg J.C., Doerschuk C.M. / Contributions of capillary pathway size and neutrophil deformability to neutrophil transit through rabbit lungs. // J. Appl. Physiol. 1994. V. 77. P. 463-470.

213. Wright S. D., Ramos R.A., Tobias P.S., Ulevitch R.J., Mathison J.C. / CD 14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding proteins. // Science. 1990. V. 249. P. 1431-1432.

214. Wright D.C., Fick C.A., Olesen J.B., Craig B.W. / Evidence for the involvement of a phospholipase C—protein kinase С signaling pathway in insulin stimulated glucose transport in skeletal muscle. // Life Sci. 2003. V. 73. P. 61-71.

215. Wu D., Huang C.-K., Jiang H. / Roles of phospholipids signaling in chemoattractant-induced responses. // J. Cell. Sci. 2000. V. 113. P. 29352940.

216. Yamashita. / Comparative study on the stimulation of superoxide production in guinea-pig eosinophils by the calcium ionophore A23187. // Biochim Biophys Acta. 1987. V. 927. P. 359-65.

217. Yan S.R., Novak M.J. / Beta2 integrin-dependent phosphorylation of protein-tyrosine kinase Pyk2 stimulated by tumor necrosis factor alpha and fMLP in human neutrophils adherent to fibrinogen. // FEBS Lett. 1999. V. 451. P. 33-8.

218. Yang R.B., Mark M.R., Gray A., Huang A., Xie M.H., Zhang M., Goddard A., Wood W.I., Gurney A.L., Godowski P.J. / Toll-like receptor-2 mediates lipopolysaccharide-induced cellular signalling. // Nature 1998. V. 395. P. 284-8.

219. Ye R.D., Cavanagh S.L., Quehenberger O., Prossnitz E.R., Cochrane

220. C.G. / Isolation of a cDNA that encodes a novel granulocyte N-formyl peptide receptor. // Biochem Biophys Res Commun. 1992. V. 184. P. 582-9.

221. Yoshimura A., Lien R., Ingalls R., Tuomanen, Dziarski R., Golenbock

222. D. / Recognition of Gram-positive bacterial cell wall components by the innate immune system occurs via Toll-like receptor 2. // J. Immunol. 1999. V. 163. P. 1-8.

223. Yu W., Cassara J., Weller P.F. / Phosphatidylinositide 3-kinase localizes to cytoplasmic lipid bodies in human polymorphonuclear leukocytes and other myeloid-derived cells. // Blood. 2000. V. 95. P. 1078-1085.1. Благодарности