Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МЕХАНИЗМЫ ПРАЙМИРОВАНИЯ РЕСПИРАТОРНОГО ВЗРЫВА НЕИТРОФИЛОВ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "МЕХАНИЗМЫ ПРАЙМИРОВАНИЯ РЕСПИРАТОРНОГО ВЗРЫВА НЕИТРОФИЛОВ"

На правах рукописи

МИЛЛЕР АННА ВИКТОРОВНА

Механизмы праймировлния

респираторного взрыва нейтрофилов

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2004

<

Г \

Работа выполнена в Путинском государственном университете на базе Института биофизики клетки РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук В.Г. Сафрояова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор В.П. Зинчекко

кандидат биологических наук ТВ. Сирота

Ведущая организация: Институт биологии развития

им. ШС, Кольцова РАН

Защита состоится к Мъ 2004г. в /^часов на заседании

диссертационного совета Д 002.38,01 при Институте биофизики клетки РА-по адресу:) 42290, г. Пущине, ул. Институтская, 3, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦБИ РАН, г. Л Автореферат разослан « /Я ¿Ж^рЯЛЛгШ г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических ваук / /ТУ5 /г Т.Н. Смо.<,и./,*

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пошшо рфноядерные нейтрофильные гранулощггы (нейтрофилы) участвуют во врожденном иммунном ответе я обеспечивают первую линию защиты организма от вторгшихся бактерий. Миграция нейтрофилов в очаг острого воспаления происходит в градиенте хемотаксических факторов, таких как N-формнл-Мет-Лей-Фен (ФМЛФ). Связывание хемотаксического пеггпща ФМЛФ со своим рецептором, сопряженным с гегеротрнмерным G белком, запускает каскад внутриклеточных процессов, с последующим развитием респираторного взрыва. Респираторный, или дыхательный, взрыв кейтрофщюв представляет собой массированный выброс активных форм кислорода при усиленном потреблении кислорода и глюкозы. За его развитие ответственен мембранный фермент NADPH оксидаза, осуществляющий перенос электронов от внутриклеточного NADPH на молекулу экзогенного кислорода [McPhail et al., 1984]. Активация фермента приводит к падению концентрации NADPH в клетке, что активирует окисление глюкозы через гекеозо-монофосфатный шунт (ГМШ) - основной поставщик NADPH в нейтрофилах [Nessel et al., 1998]. При этом может утилизироваться глюкоза из внеклеточной среды и/или глюкоза, запасенная в клетке [Tan et al., 1998], Известно, что передача сигнала от рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу идет по фосфоннозитндному пути с участием фосфолипазы С (ФЛС), инозктол-1,4,5-трисфосфата, Ca14 и прогеинкиназы С [по Theleo et al., 1993]. Кроме того, было показано участие каскада митоген-актнвируемых протеянкиназ (MAPKs) [Rane et al., 1997] и фосфотндилииознтол-З- кии азы (ФИЗК) [Ward et al., 2000].

Многими авторами разрабатывается концепция активации нейтрофилов как двухступенчатого процесса [Thelen et al., 1993; Doerfler et al, 1994; Coffer et al,, 1998]. Сначала нейтрофилы взаимодействуют с агентами, которые не активируют клетку, а переводят ее в состояние готовности к ответу [Haiiett & Lloyds, 1997]. Затем уже подготовленный нейгрофил получает соответствующий стимул, что приводит его к полностью активированному состоянию. Процесс, при котором предварительная обработка клетки агентом приводит к последующему усилению ответа «а активацию, называют премированием (от англ. "priming" - подготовка). В настоящее время интенсивно изучается

праймирование функций нейтрофилов щггоканами, хемотаксическими__. .

факторами, метаболическими регуляторами, действующими через рецц^ммСХ^

......

принадлежащие к разным семействам [Hallett & Lloyds, 1997]. Сами праймирующие агенты не вызывают изменений функций нейтрофилов, в том числе респираторного взрыва, но их предварительное воздействие приводит к усилению ответа на активацию, В зависимости от рецептора, через который действует лраймирующий агент, могут реализоваться разные механизмы премирования нейтрофилов: изменения в уровне экспрессии адгезивных молекул на поверхности клетки; освобождение содержимого гранул; полимеризация актина; фосфорилирование; синтез белка de novo; модуляция [Са1+]цит; активация фосфогашаз; образование биоактивных липвдов [Swain et al., 2002]. Показано, что при праймировании активность различных протеинкиназ, в том числе MAPKs и тирозиновых киназ может увеличиваться в несколько раз [McLeish et а!., 1998].

Одним та механизмов праймирования является усиление фосфорилирования белков по остаткам тирозина. Запуск тирозинового фосфорилирования осуществляется через рецепторы, обладающие своей собственной тирозинкиназной активностью, к ним относят рецептор инсулина. Изменения в регуляции инсулином активности нейтрофилов видны, в основном, по многочисленным нарушениям, возникающим при диабете и развивающимся, скорее, вследствие отсутствия действия инсулина, чем ш-за его влияния [Ortmeyer & Mohseoin, 1996]. Данные о сраймирующем действии инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов отсутствуют.

Известно, что праймиро ванне нейтрофилов бактериальным л ипо полисахарид ом (ЛПС), основным рецептором которого на нейтрофилах считается CD14, гликозилфосфатшдалннозитол-связанный гликопротеин [Wright et al, 1990; Ulevitch & Tobias, 1995], сопровождается усилением респираторного взрыва [Guthrie et al„ 1984]. Однако последовательность внутриклеточных событий после связывания ЛПС нейтрофилами неизвестна, как и характер взаимодействия сигнальных систем рецепторов ЛПС и формилированных пептидов в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов.

Изучение внутриклеточных сигнальных систем, вовлеченных в праймирование, может помочь разъяснить механизмы, которыми регулируются специфические функции нейтрофилов, и развить терапевтические стратегии против чрезмерной цитотоксичности нейтрофилов.

Цеди и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в -исследовании механизмов праймируюдего действия инсулина и ЛПС и участия

глюкозы в респираторном взрыве нейтрофилов

1

Были поставлены следующие задачи:

- исследовать вклад компонентов каскада мim> ген-активируемых протеинкиказ, фосфолипаз и фосфатиди линозитая-3-киназы в механизмы праймирования респираторного взрыва нейгрофилов инсулином;

- исследовать вклад компонентов каскада митоген-акшвируемых протеинкиназ и фосфолипаз в механизмы праймирования респираторного взрыва нейгрофилов липополисахаридом;

- сравнить вклад исследуемых сигнальных систем митоген-актнвнруемых протеи нкиназ и фосфолипаз в действие инсулина н липополисахарида на респираторный взрыв, вызванный ФМЛФ в низких и высоких концентрациях;

- оценить роль метаболизма глюкозы в усиление респираторного взрыва при праймирования агентами разной природы (иономицнна, инсулина и ЛПС).

Научная новизна работы. Впервые исследован вклад р38 МАРК и MEK/ERK1/2, ферментов гидролиза фоофолипидов, фосфатидилинозитол-3-киназы, в отдельные механизмы прайиировалия инсулином и што полисахаридом респираторного взрыва нейгрофилов, вызванного хемотаксическим пептидом ФМЛФ. Утилизация внутриклеточной глюкозы в нейтрофилах при развитии респираторного взрыва происходит с участием кальций-зависимых процессов.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты раскрывают некоторые аспекты функционирования нейгрофилов на уровне внутриклеточной сигнализации, а также позволят предложить новые терапевтические стратегии при лечении воспалений и могут использоваться при прогнозировании течения многих заболеваний.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 4-7 Путинских конференциях молодых ученых (Пущино, 2000-2003); На ХШ и XIV зимних международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 20012002); на конференциях: "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000); «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000); Ежегодных научных конференциях ИБК РАН (Пущино, 2001-2002); Forum of Young Scientists Protein Structure-Function Trafficking and Signaling, satellite meeting of the 27th FEBS/PABMB (Португалия, 2001); 46 Annual Meeting of the Biophysical Society (США, 2002); Third International Conference ' on Signal

Transduction (Хорватия, 2002); The 7th International Union Biochemistry and Molecular Biology Conference "Receptor-ligand interactions" (Норвегия, 2002); FEBS Special Meetmg on Signal Transduction (Бельгия, 2003),

Структура в объем диссертации. Диссертация включает в себя введение, обзор литературы, описания материале® и методов, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий....ссылок. Работа изложена на ... страницах и со держит...рисунков, и... таблиц.

Список сокращений: ФМЛФ - N-формкл-Мст-ЛеЙ-Фел; АФК - активные формы кислорода; ХЛ - люмюто.т-зависими хемюпоминесценция; ЛПС - дшхшодасахарвд;

- концентрат« свободного Са1* в датдале; ПКС - протеинкиназа С, MAPKs - митоген-актируемые протеинкиназы (miiogeibactivated protein tillases}; ERK Vi шш p44/42 ERK-Еинази, регулируемые внеклеточный сигналам (extracellular signal-regulated kinases) через предшественников - митогеи-экстра клеточные киназы (МЕК); NADPH никотинамщадешодлднухгвотид фосфат восстановленный; ФИЗК - фосфатлдилнножтол-3-киназа, ФМА - форбол 12-Млрнстат 13-аитт, ФЛС, ФШ> - фосфолилаэы; цФЛАг и СФЛА3 -кнтоплазматическая и оскрстируема! ФЛА3, соогитственно.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена на вейтрофилах мышей аутбредной линии NMRI, полученных нз лаборатории биологического тестирования филиала Института биоорганической химии им, акад. М.М. Шемякина и акад. Ю.А. Овчинникова. Нейтрофилы инкубировали в течение 20 мин при 37°С с ираймирующими агентами (I нМ инсулином или 10 нг/мл лилополисахаридом из R coif) и/или с ингибиторами, при совместной добавхе вещества добавляли с интервалом I мин, затем активировали 0,1-50 цМ ФМЛФ. Электрофорез в полиакриламвдном геле в присутствии додешшеульфата натрия и нммуноблоттинг с использованием моиоклональных мышиных антител к дмфосформированной форме р38 МАРК (р38 МАРК, клон p38-TY, Sigma, USA), проводили по стандартному методу {Laemmli, 1970; Sambrook et al., 1989]. Для исследования роли глюкозы в усилении респираторного взрыва клеши праймировали пономицином (0,01-1 цМ) в среде с 5 мМ ZJ-глюкозой или 5 мМ 2-дезокси-£>-глюкозой в течение 5 мин при 37°С, затем активировали 1 дМ ФМА. Продукцию АФК оценивали методом люмииол-зависимой хемилюминесценции, Суммарную продукцию АФК рассчитывали как площадь под кривой зависимости интенсивности хемилюминесценции от времена Эффекты праймирующих агентов или ингибиторов оценивали по отношению

продукции АФК обработанных и интактных клеток за 5 мин от момента подачи ФМА дли за 1 мин с момента подачи ФМЛФ. Продукция АФК интакгных нейгрофилов была принята за 100%. Статистический анализ результатов проводили с использованием 1-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Активация респираторного взрыва, внзванного ФМЛФ в различных концентрациях

Поскольку нейтрофилы мигрируют в диапазоне увеличивающейся концентрации а го ни ста, ранее нами была исследована зависимость интенсивности респираторного взрыва от концентрации ФМЛФ перитокеалькых иейтрофилов мышей линии МММ из конвенциональных условий, которая представляет собой кривую с насыщением [Са1х!ои!кЬако\'а е! а!., 2003] Полу максимальная доза составляла около 2 цМ, в диапазоне концентраций ФМЛФ 10-50 цМ наблюдалось плато. Мы активировали нейтрофилы в концентрации I цМ ФМЛФ, близкой к пороговой, и в концентрация 50 цМ, как насыщающей.

Считается, что в покояшихся нейтрофнлах ЫАОРН оксвдаза, определяющая выход активных форм кислорода (АФК), находится в неактивном состоянии. Для активации ИАБРН оксид азы необходимо фосфорилирование ее субьединиц и последующая сборка комплекса из нескольких специфических цитоплазматическнх и мембранных белков,

С помощью мечения 35Р нейтрофилов нами были исследованы различия в фосфорилировании клеточных белков при активации ФМЛФ в различных концентрациях. Было обнаружено, что уровень фосфорилировання белков увеличивался при активации клеток 0,1 и 50 цМ ФМЛФ (табл. ]). Таблица 1, Включение 32Р в нгокомолекулярные белки нейтрофилов в ответ на добавку ФМЛФ в разных концентрациях

ФМЛФ в

концентрации 0,1 цМ приводил к

фосфорилированию белков с массой 28 и 40 кДа, но не у белков с массой 16, 20 и 32кДз.

Белки Без ФМЛФ ФМЛФ 0,1 ФМЛФ 50 цМ

16 кДа + + +++

20 кДа + + +++

28 кДа - + +

32 кДа + + ++

34 кДа - - -и-

40 кДа - + ++

ФМЛФ в концентрации 50 рМ вызывая увеличение включения радиоактивной метки в низкомолекулярные белки, за исключением белка с массой 28 кДа.

На основании полученных экспериментов было высказано предположение, что обнаруженное усиление фосфолирования белков с массой 40 кДа в ответ на 50 цМ ФМЛФ происходит за счет вовлечения ферментов каскада МАРКв, белков с массой 44/42 кДа (р44/42 ЕШУМЕК 1/2) и 38 кДа (р38 МАРК). Киназы активируются в ответ на различные стимулы, включая факторы роста (через рецепторы-тирозиновые киназы), цитокины, ЛПС, и подразделяются на три семейства: ЕКК - киназы, регулируемые внеклеточным сигналом, ДОК - с-1ип амиио-терминальвая киназа и р38 МАРК [МсЬ^Ь е| а!., 1998, №ск е1 а1, 1999]. Известно, что активация рецептора ФМЛФ может приводить к стимуляции последовательного фосфорилдровання МАРКз через р21га5/КаР-1 путь в нейтрофилач[РИ1]гщеге{а)., 1996),

2. МАРК! в активации и пртшировании респираторного взрыва нейтрофилое

Мы сравнили действие ингибиторов МАРКз на продукцию АФК в нектрофилах, активированных ФМЛФ в концентрациях 1 и 50 цМ. Ингибирование митоген-активируемой протеинкинази р38 с помощью 1 рМ БВ 203580 приводило к подавлению на 41±6% («=11) ответа на 1 цМ ФМЛФ и усилению иа 23±5% («=13) ответа на 50 цМ ФМЛФ. Действие 50 цМ РО 098059, специфического ингибитора МЕК 1/2, активирующей р44/42 ЕМС [А1е««1 й а1„ 1995], также приводило к измененню интенсивности респираторного взрыва и зависело от концентрации ФМЛФ. РБ 098059 (50 цМ) ослаблял на 51±7% (л=5) ответ нейтро филов на 1 цМ ФМЛФ и усиливал на 11±2% (п=9) ответ на 50 рМ ФМЛФ, Можно заключить, что МЕК 1/2 и р38 МАРК действуют по принципу положительной связи в передаче сигнала с рецептора на ЫАВРН-оксидазу при действии ФМЛФ в малых концентрациях и по принципу отрицательной связи при действии ФМЛФ в высоких концентрациях.

Результаты иммуноблоттинга с использованием специфических антител к дифосфорилированной форме р38 МАРК также показали, что наблюдалось значительное усиление активации р38 МАРК после стимуляции 50 цМ ФМЛФ в течение 1 мин (рис. 1).

Контроль 50иМ ФМЛФ

Рис, 1. Иммуноанализ эффекта 50 jtM ФМЛФ на фосфорллнрование р38 МАРК по треониновым и тирозиновым остаткам белков в нейтрофилах.

Известно, что праймирование сопровождается усиленным фосфорилированием внутриклеточных белков по тирозиновым, сериновым и треонпновым остаткам. Ранее нами было показано, что одним из механизмов праймирования респираторного взрыва нейтрофилов является тирозиновое фосфорилирование [Габдулхакова, 2000]. Для праймирования инсулином нейтрофилов важен активный статус тирозиновых лротешшшаз [Сафровова и ДР., 2001].

Мы предположили, что одним из механизмов праймирования является активация митоген-активируемых протеннкиназ, активность которых может регулироваться фосфорилированием по тирозиновым, сериновым или треониновым остаткам [Suzuki et al., 1999], 2 I. Участие p3S МАРК ti p44/42 ERK в действии инсулина

Ранее нами было показано, что действие инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный ФМЛФ, зависел от сочетания концентраций инсулина и хемотаксического пептида [Сафронова и др., 2001]. Инсулин не изменял продукцию АФК,

Рис, 2. Респираторный взрыв, вызванный I цМ ФМЛФ (а) и 50 цМ ФМЛФ (б), в интактных (1) и праймированных 1 нМ инсулином (2) нейтрофилах. Стрелки указывают момент подачи активирующего агента.

При активации респираторного взрыва 1 цМ ФМЛФ, усиливающего действия инсулина не было обнаружено (рис. 2, а), тогда как ответ на 50 рЛ1 ФМЛФ был значительно усилен (рис, 2, б).

Í .5

2» 3

В Р tu А, и IX

í г с

& 1 О

г о

Вимя. «ни

Иш-ибирование р38 МАРК отменяло действие инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный 50 ¡.¡М ФМЛФ. При подаче ЭВ 203580 на фоне инсулина наблюдалось ослабление эффекта инсулина в ответ на 50 рМ ФМЛФ (рис. 3, я).

150т, 150 I в

Ине S8 SB* Име* Инс PD PD+ Инс+

Инс SB Инс Р D

Рис, 3. Эффект 1 цМ SB 203580 {а) и 50 цМ PD 098059 (6) при действии 1 нМ инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный 1 (40 ) и 50 (СИ) jifvl ФМЛФ. Указаны различия между группами: * р < 0.05] **р< 0.01.

При совместном действии ингибитора р38 МАРК и инсулина наблюдается подавление респираторного взрыва, по сравнению с действием только ингибитора или праЙмирующего агента, в ответ на 1 рМ ФМЛФ (рис.3,а).

Таким образом установлено, что праймирукицее действие инсулина опосредуется через рЗВ МАРК, которая вовлечена в передачу сигнала от инсулина независимо от концентрации ФМЛФ, используемой для активации респираторного взрыва нейтрофилов.

Предобработка клеток 50 цМ PD 09805?, ингибитора МЕК, не отменяла эффект инсулина при активации 50 цМ ФМЛФ (рис 3, 6). При обратной последовательности подачи веществ мы наблюдали их аддитнвное действие. МЕК и, вероятно, р44/42 ERK слабо вовлечены в праймирование инсулином при активации респираторного взрыва, вызванного 50 цМ ФМЛФ. Полученные результаты согласуются с сообщениями, в которых было показано, что активация респираторного взрыва ФМЛФ не зависела от р44/42 ERK [Coffer et al., 1998; Moltapour et al., 2001]. Однако, инсулин, по-видимому, частично опосредует свое действие через р44/42 ERK на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный 1 цМ ФМЛФ, ERK действуют по принципу положительной связи в передаче сигнала при активации ФМЛФ в мальк концентрациях и слабо вовлекаются в праймированне инсулином при активации 8

ФМЛФ в высоких концентрациях,

2.2. Участие р38 М4РК в действии ЛПС на респираторный взрыв иейтрофилое

ЛПС в концентрации 10 иг/мл не вызывал респираторный взрыв нейтрофилов [Gabdoulkhakova et al,, 2003], но приводил к усилению на 18±3% (п=40) вызванного 50 рМ ФМЛФ респираторного взрыва, и ослаблению на 20±9% (»=25) - при активации I рМ ФМЛФ.

Ингабирование р38 МАРК с помощью 1 рМ SB 203580 отменяло действие ЛПС. Наблюдалось также подавление респираторного взрыва при подаче ингибитора на фоне ЛПС по сравнению с эффектами отдельно ингибитора и праймирующего агента при активации 1 и 50 цМ ФМЛФ (рис. 4).

Рис. 4. Эффект 1 jiM SB 203330 иа респираторный взрыв нейтрофилов ври

праймированив 10 нг/ил ЛПС. Показаны средние значения но результатам 5-13 независимых экспериментов. За 100% принят ответ иятактаых клеток, вызванный 1 (О) и ФМЛФ. Указали различия межцу группами: * р < 0,01, ** р<0.0],***р< 0.001.

р38 МАРК вовлечена в регуляцию респираторного взрыва нейтрофилов при пранмировании ЛПС и активации 1 и 50 цМ ФМЛФ.

Полученные результаты дают основание сделать вывод, что активация р38 МАРК является одним из механизмов премирования инсулином и ЛПС респираторного взрыва нейтрофилов.

Праймирование нейтрофилов реализуется также через активацию фосфолипаз и образование биоактивных лидидов [Swain et al., 2002]. Так при премировании цитокинами, факторами роста или воспалительными медиаторами активность фосфолипаз Аъ С и Д может увеличиться в несколько раз [Roberts et al, 1996; Bauldry et al, 1997; Seeds et al, 1998; Niwa et al, 2000], Основная роль ФЛАг заключается в высвобождении арахвдоновой кислоты (АК) из фосфолигшдов мембраны с образованием биологически активных эйкоэаноидов, таких как леПкотриены, интерлейкины и простагландины под действием эпокси-, липокси- и шзклооксигеиаз [Billah et al, 1989, Serhan et al,

9

эйкозаноидов, таких как лейкотриены, интерлейкины и простагландины, под действием эпокси-, липокси- и цикжюксигеназ [Biliah et al., 1989; Se/han et al., 1996]. Мы исследовали вклад отдельных фосфолкпаз и ферментов, расщепляющих АК, в праймнрование респираторного взрыва. S. Действие фжфалипаз при активации и праймировании инсулином и ЛИС респираторного взрыва пейтрофилое

Ингибирование цФЛАг 10 рМ дексаметазоном [Сох, 1995], СФЛА11 цМ 4-бромофенацил бромидом [Fujita et al., 1996], ФЛС 10 цМ неомицмном [Nakashima et al., I9S8J и циклооксигеназы 10 jjM индомегацином [Когак et al,, 1998] приводило к уменьшению продукции АФК в ответ на ФМЛФ в низких концентрациях (0,1 - 1 рМ) и усиливала ответ на 50 цМ ФМЛФ (таблица 2).

Действие ингибиторов ФЛД 0 1 % этанола [Rubin & Rand, 1994] и эиоксигеназы 10 цМ проадифена [Rastaldo et al., 2001] увеличивало активность NADPH оксвдазы в ответ на ФМЛФ во всем диапазоне используемых концентраций.

Таблица 2. Действие ингибиторов ферментов гидролиза фосфолипидов на вызванный ФМЛФ респираторный взрьш нейтрофилов

Ферменты метаболизма фосфолипидов Специфические НЕ)ШбШ«р1>1 ферме ¡пои иетабо-иом» фосфолнпвдов Концентрация ФМЛФ

1 цМ SO (lM

цФЛАз Дсксамстазон, [OjiM Я2±9" п = 9 Д10±6*6> и - 14

СфЛАг ■i-БФБ", 1 цМ 74 ±3 п- ¡1 1IS ±6«* п-6

ФЛС Нсомищщ, 10 fiM 89 ±7 п-4 115 ±7*** л - 17

ФЛД Этанол, 0,1 % 113 ±3 rt-9 12114" п =-9

Цнклоокситензза Иидомггадии, ЮдМ 67 ±7 л 1)415*** и-7

Элоксигелаза Проадифен, 10 цМ 204133 я - 5 252121** я - 12

Примечания: " здесь н далее показан эффект ингибитора в процентах, рассчитанный как отношение продукции АФК иейтрофидами, обработанными ингибитором, к продукции АФК ингактньп клеток, принятой за 100%; е1 различи* в эффектах ингибиторов на респираторный втрыв, вызванный ФМЛФ я концентрадалх 1 н 50 ^ *р<0.05)**р< 0.01, м*р < 0.001; "'4-ЕФЕ - 4-бромофенацил бромид,

Полученные результаты дают основание считать, что продукты гидролта фосфолипидов фосфолипазами (цФЛА;, сФЛА1, ФЛС) участвуют в регуляции ЫАБРН оксидазы, повышая ее активность при действии ФМЛФ в низких

концентрациях и понижая активность - в высоких. Продукты гидролиза фосфолигщцов ФЛД и расщепления АК эпоксигеназой, вероятно, приводят к понижению активности №\БРН оксидазы при действии ФМЛФ в низких и высоких концентрациях.

Поскольку некоторые нзоформы фосфолипаз могут активироваться тнрозиновыми к ин азами, было высказано предположение, что праймирующий эффект инсулина может реализоваться через механизм усиления гидролиза фосфолипидов.

Ряс, 5, а-г Действие инсугасна на вызванную 50 цМ ФМЛФ продукцию АФК клеток,

обработанных ингибиторами. В каждом случае ответ клеток,

обработанных ингибитором, принят за 100%; наличие

Деясаметаэон, 10рМ + Индлмвгацин, 10 ум -Кеомицин, 10 мМ Этанол, 0,1 % Инсулин, 1 нМ

л и

вещества V среде инкубации клеток показано «+»; я -число независимых гомегкашй, р<Й 05.

17 14

Ингибирование ФЛС, ФЛД и цпклооксигеназы отменяло усиливающее действие 1 нМ инсулина на клетки, активированные 50 цМ ФМЛФ (рис. 5, а-г). Более того, при совместном применении инсулина и дексаметазона наблюдалось уменьшение интенсивности респираторного взрыва (рис. 5, а).

Результаты дают основания считать, что эти ферменты могут быть вовлечены в праймирование инсулином респираторного взрыва, вызванного 50 цМ ФМЛФ.

При активации 1 цМ ФМЛФ обработанных 1 нМ инсулином клеток, ингибирование ФЛС и цикпооксигеназы приводило к понижению респираторного взрыва по сравнению с ответом клеток, обработанных одним из ингибиторов, в то время как ингибирование цФЛАг и ФЛД не изменяло эффект инсулина (рис, б, а-г).

Возможно, ФЛС п циклооксигеназа регулируют респираторный взрыв нейтрофилов в присутствии инсулина по принципу положительной связи, в то время как ФЛД и цФЛАг не вовлечены в действие инсулина при активации клеток ФМЛФ в низких концентрациях.

-Ш-

Девсэмдоэон, 10 рМ Индомвтацин, 1С рМ Наомнцин, 10 рМ Этанол, 0.1 % Инсулин, 1 нМ

ш

Рис. 6, (я-г). Действие инсулина на вызванную 1 рМ ФМЛФ

продукцию АФК клеток,

предварительно обработанных ингибиторами, ♦ -р<0.05.

Далее бьшо проведено сравнение совместного действия ЛПС и ингибиторов метаболизма фосфолипндов при активации респираторного взрыва 1 и 50 рМ ФМЛФ. Ингибирование цФЛА2> ФЛС и ФЛД отменяло усиливающее действие 10 нг/мл ЛПС на респираторный взрьгв, вызванный 50 цМ ФМЛФ (рис. 7,«).

рркслылтлзон, 10(/М

ИМД0М4ТЧЦИН, 10 ^М Неомицин, 10 рМ Эташл.0.1 % ЛПС, 10 нг/мл

Рис. а-г. Действие липоподиеахарнда нз Е.соН (ЛПС> на вызванною 50 ФМЛФ продукцию АФК клеток,

00 работам пых

ингибиторами. В каждом случав ответ клеток,

обработанных только ингибитором, принят за 100%; п - число независимых измерений. *-р<0.01.

14 11

Данные дают основание считать, что фосфолипазы играют важную роль в действии ЛПС на оксидазную активность нейтрофилов и могут осуществлять положительную регуляцию при активации 50 рМ ФМЛФ. Индометацин при совместном действии с ЛПС увеличивал продукцию АФК нейтрофилами в ответ на 50 цМ ФМЛФ (рис. 7, б). Циклооксигеназа и ее продукты слабо вовлечены в праймирование ЛПС вызванного 50 рМ ФМЛФ респираторного взрыва.

ЛПС в концентрации 10 нг/мл вызывал ослабление респираторного взрыва

нейтрофилов на 20±9% (л=25) при активации 1 рМ ФМЛФ. Ингибирование

циклооксигеназы и ФЛД приводило к подавлению ответа на 1 рМ ФМЛФ при 11

действии ЛПС (рис. 8, б и г). По-видимому, шклооксигеназа и ФЛД слабо вовлечены в действие ЛПС на оксидазную активность нейтрофилов, вызванную 1 |дМ ФМЛФ. При ингибировании цФЛАа не наблюдалось изменений в действии ЛПС (рис. 8, а).

Рис. 8, а-г. Действие ЛПС на вызванную 1 (1М ФМЛФ

продукцию АФК клеток, обработанных ингибиторами, В каждом случае ответ клеток,

обработанных только ингибитором, принят за 100%; п - число независимых измерений. * р < 0.05,**р< 0.01.

Дексдметаэод, 10 рМ Индометацин, 10 рМ Нщялицин, 10 рМ Этанол, 0.1 % ЛПС, 10 нг/мл

цФЛА] ослабляет респираторный взрыв нейтрофилов, праймированных ЛПС и активированных I цМ ФМЛФ. Совместное действие неомицина и ЛПС приводило к повышению респираторного взрыва по сравнению с их эффектами по отдельности в случае 1 цМ ФМЛФ (рис, 8, в). Результаты позволяют сделать вывод, что ФЛС участвует в действии ЛПС по принципу отрицательной связи.

Другим важным компонентом транедукции сигнала от рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу является ФИЗК и фосфор и лированные ею лип иды, преимущественно ФИ(3,4)Ф^ и ФИ(3,4,5)ФЛ, которые активируют различные изоформы протеннкиназы С и протеи ныгназу В [Toker et al., 1997; Naccache et al., 2000; Cadwallader et ai., 2002]. ФИ(3,4,5^ может активировать малый OTP-связанный белок p21flc, который является необходимым компонентом НАДФН оксидазы, а также р21-активируемую киназу, которая фосфорилирует pi?1,11011 [Knaus et а)., 1995],

4, Определение участия ФИЗК в действии инсулина на респиршпорный взрыв нейтрофилов

Мы обнаружили, что действие ингибиторов ФИЗК вортманнина и LY 294002 подавляло ответ нейтрофилов на ФМЛФ. С ростом концентрации хемотаксического пептида от 0,1 цМ до 50 цМ ингибирование респираторного взрыва ослаблялось от 98% до 46%, соответственно (по результатам 5-И независимых экспериментов).

В инсулин-компетентных клетках ФИЗК ответственна за функциональную активность чувствительного к инсулину транспортера глюкозы GLUT4, осуществляя его транслокацию в плазматическую мембрану [Cheathman & Kahn, 1995]. В настоящее время участие ФИЗК в транспорте глюкозы при развитии респираторного взрыва нейтрофнлов не показано.

На нейтрофилах нами было обнаружено, что при отсутствии экстраклеточной глюкозы ответ клеток на ФМЛФ уменьшался и эффект вортманнина отсутствовал в среде без глюкозы. Следовательно, ФИЗК участвует в утилизации экстраклеточной глюкозы при развитии респираторного взрыва нейтрофнлов.

Следующей задачей было исследование вклада ФИЗК в усиление тирозинового фосфорилирования как механизма праймирования инсулином респираторного взрыва нейгрофилов, вызванного ФМЛФ.

Вортманнин понижал продукцию АФК при активации 1 и 50 f*M ФМЛФ (рис. 9). Более того, при активации 1 и 50 рМ ФМЛФ совместное действие инсулина и вортманнина еще более понижало респираторный взрыв нейгрофилов. Это говорит о том, что ФИЗК участвует в праймировании и играет значительную роль во взаимодействии сигнальных путей рецепторов ФМЛФ и инсулина.

Рис, 9, Действие I нМ инсулина (Пне) и 0,1 цМ вортманнина (В) на респираторный взрыв нейтрофнлов, вызванный 1 и 50 цМ ФМЛФ. За 100 % принята продукция АФК ийтактнтс клеток.

Мы видим значительное подавление респираторного взрыва нейтрофнлов при подаче вортманнина и инсулина в различных последовательностях при действии 1 рМ ФМЛФ.

Эффекты ингибиторов ФИЗК 0,1 цМ вортманнина и 50 рМ ЬУ 294002 сохраняли свое направление при различных концентрациях ФМЛФ и при

Ине

8 + И

И + В

совместном действии инсулина и ФМЛФ, Это говорит о том, что ФИЗК играет ключевую роль в развитии респираторного взрыва и является одним из механизмов премирования инсулином тайтрофштов.

Взаимодействие систем транспорта глюкозы и оксидазного метаболизма, тем более с привлечением инсулина, почти не исследовано в нейтрофнлах, хотя активация клеток сопровождается усиленным транспортом глюкозы и внутриклеточной активацией молекул - транспортеров глюкозы.

Далее мы исследовали вовлечение метаболизма глюкозы в араймирование нейтрофилов инсулином и ЛПС.

5. Вклад гяюкаш в праймировапне инсулином, и ЛПС респираторного взрыва нейтрофмое

В наших исследованиях эффект инсулина отсутствовал в среде без глюкозы и в среде, содержащей 5 мМ 2-дезокси-£>-глюкозу (рис, 10). ЛПС сохранял свое действие в среде без глюкозы, но его эффект отсутствовал в среде с 2-дезокси-.£)-глюкозой - неметаболизируемым аналогом £>-глюкозы,

Рнс. 10. Прайииро ванне респираторного взрыва 1 нМ инсулином н 10 нг/мп ЛПС в средах, содержащих: Г - 5 нМ О - глюкозу; 2 - ДОГ - 5 мМ2-дезокси-О-глюкозу; -Г - без глюкозы. Респираторный взрыв активирован 50 ФМЛФ.

ЛПС оказывал свое действие на респираторный взрыв нейтрофилов независимо от наличия экстраклеточной ¿Хглкжозы, но при ингибировании метаболизма глюкозы в клетке ЛПС не оказывал воздействия на респираторный взрыв нейтрофилов.

Таким образом, необходимым условием праймирования является метаболизм глюкозы в клетке, что было проверено нами на модельной системе нерецеггторной активации нейтрофилов, где были использованы форболовый эфир ФМА для прямой активации ПКС и кальциевый ионофор иономицин для мобилизации Са5* из внутриклеточных депо.

6. Исследование «клада глюкозы « праймироеание кальциевым ионофором иоиомицином и в активацииию ФМА респираторного взрыва нейтрофилов

Окисление глюкозы через гексозо-монофосфатный шунт (ГМШ) усиливается при снижении концентрации NADPH в клетке в результате активации NADPH оксидазы, Это происходит с участием протеинкиназ, активность некоторых из ник может зависеть от ионов кальция [May et al., 1985]. Одновременное увеличение внутриклеточной концентрации свободного Са!* и усиление активности протеинкиназ приводят к сннергической активации NADPH оксидазы [Finkel et al., 1987; Raddassi et al., 1994]. Базалъная оксидазная активность нейтрофилов в инкубационной среде, не содержащей глюкозу, и в среде с 2-ДОГ была понижена по сравнению с активностью в среде с ■D-тлюкозой (рис. 11, я).

Рис. 11, Зависимость интенсивности хемилюминесценции нейтрофилов от времени в ответ на добавку кальциевого ионофора иономицина (я) и форболового эфира ФМА (б) в средах, содержащих; 1-5 мМ О - глюкозы; 2-5 мМ 2-ДОГ; 3 -без глюкозы. Стрелкой показан момент добавления ионофора или форболового эфира.

Интенсивность ответа на 1 ¡лМ ФМА была значительно ослаблена как в

среде без глюкозы, так и в среде с 2-ДОГ по сравнению с интенсивностью ответа

в среде, содержащей 5 мМ £>-глюкозу. Кальциевый ионофор иономицин в

концентрации 0,5 цМ активировал оксндазную активность нейтрофилов в среде с

Д-глюкозой и в среде с 2-ДОГ (рис. 11, б). Наблюдались три фазы ответа: 1)

быстрое нарастание интенсивности хемилюминесценции после добавления

иономишша в течение 30 с в обеих средах; 2} спад более чем наполовину на

второй минуте ответа в среде с ^-глюкозой к до базального уровня - на третьей

минуте ответа в среде с 2-ДОГ; 3) повторное нарастание до некоторого

стационарного уровня примерно на 5 мин в среде с £>-глюкозой и незначительное 16

3

б

s

5

Время, мин

увеличение в среде с 2-ДОГ (рис. 11,5). Суммарная продукция АФК в среде с 2-ДОГ была меньше за весь период регистрации ответа.

Базальный уровень оксндазной активности нейгрофилов обеспечивается глюкозой, поступающей а клетку. Вероятно, что в ответе на иономицнн в начальной фазе респираторного взрыва используются внутриклеточные энергетические запасы, а в последующем - экстраклеточная глюкоза

6,1. Оценка вклада калъций-зависилшх процессов в утилизацию глюкозы при развитии респираторного взрыва

Ответ на I рМ ФМА интактных нейгрофилов клеток не отличался от ответа истощенных по кальцию клеток в среде, содержащей 5 мМ В-глюкоэы, тогда как эквимоляркое замещение Й-глюхозы на 2-ДОГ приводило к значительному понижению ответа по сравнению с ответом клеток в среде, содержащей 1 мМ Са1+(рие. 12, кривые / и 3).

г I

с

* ч

I. 1 •

Рис, 12, Зависимости интенсивности хгмилюмянеспенци н истощенных по Са1* нейтрофнлов от времени в ответ на активацию 1 цМ ФМА в средах: 1,2-5 мМ й ~ глюкозы; 3, 4 ~ 5 мМ 2 ~ ДОГ; 5,6-без глюкозы; 1,3,

5 - без добавления Са2*; 2, 4,

6 - с добавлением 2 мМ Са1*, Стрелкой показан момскт добавления форболового

8р*мп, мин эфира.

Добавление 1,5 мМ Са1+ в среду инкубации истощенных по кальцию клеток приводило к возрастанию ответа почти в 3 раза, если среда содержала С-глюкозу (рнс. 12, кривые 1 и 2), Другая реакция на добавление 1,5 мМ Са1+ наблюдалась в среде с 2-ДОГ: не усиление ответа, как в среде с ¿»-глюкозой, а дополнительное подавление по сравнению с ответом истощенных по Са1+ клеток (рис. 12, кривые Зъ4).

Интенсивность ответа на ФМА истощенных по Са1+ клеток, содержащихся в среде без глюкозы, была значительно ниже, чем в среде с £>-глюкозой (рис, 12, кривые 1 и 5), однако при добавлении 1,5 мМ Са2+, как и в среде с ¿»-глюкозой, развивался синергический ответ (рис. 12, кривая €). Таким образом, для развития полноценного ответа на ФМА необходимо наличие глюкозы в среде инкубации и возможность утилизации внутриклеточных энергетических запасов, что требует наличия достаточного количества Са2+ внутри клетки.

Выводы:

1. Исследование компонентов сигнальных систем рецептора ФМЛФ при актив алии оксидазной активности нейтрофилов показало, что вклад компонентов сигнальных систем зависит от концентрации ФМЛФ: действие протеинкиназ р38 МАРК и р44/42 ERK и продуктов гидролиза фосфолипидов фосфолипазами - цФЛАг, сФЛАг, ФЛС - приводит к усилению активности NADPH оксидазы при низких концентрациях ФМЛФ и ослаблению активности в случае 50 рМ ФМЛФ.

2. ФИЗК является ключевым ферментом в передаче сигнала от рецептора ФМЛФ на NADPH оксид азу. ФИЗК усиливает оксидазную активность нейтрофилов и играет более значительную роль при низких концентрациях ФМЛФ, чем при высоких,

3. Утилизация экстраклегочной глюкозы при развитии респираторного взрыва происходит с участием ФИЗК.

4. Механизмы нраймирования инсулином вызванного ФМЛФ респираторного взрыва нейтрофилов включают активацию фосфолипаз -ФЛС, цФЛАг и ФЛД циклооксигеназы, р38 МАРК, и ФИЗК. Для усиления инсулином респираторного взрыва нейтрофилов необходимо поступление экстраклеточной глюкозы.

5. Праймирование ЛПС оксидазной активности нейтрофилов реализуется через активацию фосфолипаз (ФЛС, цФЛАг и ФЛД), р38 МАРК и зависит от метаболизма глюкозы.

6. Базовый уровень продукции активных форм кислорода обеспечивается D-глюкозой из внешней среды и внутриклеточными энергетическими запасами. Утилизация внутриклеточных запасов глюкозы при развитии респираторного взрыва зависит от концентрации кальция в цитозоле. Для развития полноценного ответа при активации нейтрофилов необходимо поступление в клетку экстраклеточной глюкозы.

Список публикаций

1, Сафронова В.Г, Габдулхакова А.Г, Миллер A.B., Косарев ИВ,, Василенко Р.Н. Вариабельность действия инсулина на респираторный взрыв в нейтрофилах. Роль тирози новых киназ и фосфатаз. // Биохимия. - 2001. - Т, бб, - 8, - С, 1036-1047.

2, Миллер A.B., Габдулхакова А.Г, Сафронова В.Г. Роль экстра- и внутриклеточной глюкозы в развитии респираторного взрыва нейтрофилов из очага острого воспаления. // Биод. Мембраны. - 2002. -Т. 19.-3. С. 195-201.

3. Gabdoulkhakova AG, Safronova V.G,, Miller A.V, Sadovnikov V,B. Expression of genotypic and phenotypic features in animals during activation and priming of the neutrophil respiratory burst. // Baltic J. Lab. Animal Set. - 2003, - V. 13. - 2. - P. 78-85.

4. Миллер A.B., Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г. Участие ферментов гидролиза фосфолипвдов в действии инсулина и липополисахарвда на респираторный взрыв нейтрофилов. // Биол. Мембраны. - 2004. - В печати.

5. Safronova V.G., Gabdoulkhakova AG, Miller A.V., Alovskaya A.A, Dedkova E.N, Modulation of insulin pruning of the fMLP-induced respiratory burst by cycloheximide. // FASEB J, - 2000, - V.14. - 4. -P442.20.

6. Сафронова В.Г, Габдулхакова А.Г, Миллер А.В. Инсулин как модулятор аигогоксичеекой активности нейтрофилов. // Отчетная конференция ИБК РАН, Сессия Ученого совета, 2000 г.

7. Миллер А.В, Габдулхакова АГ, Сафронова В.Г. Сравнение праймирующего действия инсулина, лилополисахарида и хемотаксического пептида на респираторный взрыв нейтрофилов в средах с D-глюкозой и 2-дезокси-В-тлюкозой. Н Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии»: Тезисы. - Пущкно, 2000. - С. 44.

8. Миллер А.В, Габдулхакова АХ., Сафронова В.Г. Сравнение реакций нейтрофилов на активирующие агенты в среде с 2-дезокси-&-глюкозой. // Международная конференция «М1ггохондрии, клетки и активные формы кислорода»: Тезисы. -Пущино, 2000. - С. 106-107.

9. Миллер А.В, Габдулхакова АГ, Сафронова В.Г. Праймирование оксидазиой активности нейтрофилов: роль фосфолипазы Aj. // ХП1 зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии биотехнологии»: Тезисы. -М, 2001,-С,86.

10. Миллер А.В, Габдулхакова А.Г. Дозо-зависимое воздействие хемотаксического пептида ФМЛФ иа оксидазную активность нейтрофилов. // 5ая Пущи некая конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века»: Тезисы. - Пущино, 2001 г. -С, 153,

11. Gabdoulkhakova A.G., Miller A.V, Safronova V.G, Insulin priming of the fMLP-induced neutrophil respiratory burst: role of ERK and p38 МАРК. // 27th Meeting of the FEBS. Lisbon, Portugal. 2001. P.68 (PS3-013).

12. Gabdoulkhakova A G, Miller A.V., Evdokimov V.A, Safronova V.G. Insulin priming of the fMLP-induced neutrophil respiratory burst: role of ERK and p38 МАРК. // Forum of Young Scientists Protein Structure-Function Trafficking and Signalling, Satellite Meeting of the 27th FEBS/PABMB. Oeiras, Portugal. 2001. P.3S,

13. Safronova V.G,, Gabdoulkhakova A,G, Miller A.V, Evdokimov V.A, Involvement of protein kinases in insulin priming of fMLP-induced oxidase activation in neutrophils. It International Symposium "Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems". Kyiv, Ukraine. 2001. P. 93.

14. Миллер А.В, Сафронова В.Г, Габдулхакова А.Г,, Авхачева Н.В,, Санталов Б.Ф. Респираторный взрыв нейтрофилов: вовлечение фосф атнди лннознто л 3-киназы в активацию хемотаксическим пептидом и праймирование инсулином. И Отчетная конференция ИБК РАН, Сессия Ученого совета, 2001 г.

15, Миллер А.В„ Авхачева Н.В., Чоу Г., Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г. Праймирование оксидазной активности нейгрофилов: роль фосфатидилинозигол-3-киназы. // XTV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии биотехнологии»: Тезисы. - М , 2002, - С.93,

] 6, Шкт A.V., Gabdoulkhakova A.G., Safronova V.G. Dual-dealing regulation m neutrophil oxidase activity. // 46 Annual Meeting of Biophysical Society, San-Francisco, USA. Biophys, J. 2002. V.82. N.l (Pt. 2). P. 220a.

17. Miller A.V., Avhacheva N.V., Gabdoulkhakova A.G., Safronova V.G., MAP kinases changeover in the Lipopolysaccharide and insulin priming of the neutrophil respiratory burst. // Third Internationa] Conference on Signal Transduction. Conference on Cellular Signaling. Dubrovnik. 2002.

18. Gabdoulkhakova A.G., Miller A.V., Avhacheva N.V., Evdokimov V.A., Safronova V.G, Up- and down-regulation of insulin priming of the fMLP-induced neutrophil respiratory burst. // The 7th International Union Biochemistry and Molecular Biology Conference "Receptor-ligand interactions". Bergen, Norway. 2002. P. A41.

19. Авхачева H.B., Миллер A.B., Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г., Шехгман Д,Г, Регуляция респираторного взрыва нейгрофилов при сердечно-сосудистых заболеваниях. // VI Всероссийский научный форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». Мед. 11ч му но л,, 2002.-Т. 4(2).-С. 139.

20. Avkhacheva N,V,, Miller A.V., Gabdouikhakova A G., Safronova V.G., Maltseva V.N,, Matveeva N.K., Sukhih G,T, Two-faced granulocytes: defense or alarm under pathologies of reproductive system? !i Physiological Society Spring Workshop "Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress". Budapest, Hungary. 2003. РЗ. P.20.

21. Мальцева B.H., Авхачева H.B., Миллер А В., Габдулхакова А_Г. Функциональная активность нейгрофилов мышей с экспериментальной опухолью. // 7ая Пущинская конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века»: Тезисы. - Пущина, 2003 г. -С.30.

22. Maltseva V.N., Avkhacheva N.V., Miller A.V., Gabdoulkhakova A.G., Safronova V.G. Tumor process tangling signaling systems in neutrophils from inflammatory center. // FEBS Special Meeting on Signal Transduction. Brussels, Belgium. 2003. P.192 (PS01-0976),

Принято к исполнению 16/02/2004 Исполнено 16/02/2004

Заказ № 49 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 \vww.autore ferat.ru

гд