Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли ионов Ca2+ и Ca2+-зависимых систем внутриклеточной сигнализации в эффектах электромагнитного излучения крайне высокой частоты на респираторный взрыв нейтрофилов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аловская, Алла Анатольевна, Пущино

, / '

Ь/ С/.

РОСИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

На правах рукописи

Аловская Алла Анатольевна

Исследование роли ионов Са2+ и Са2+ - зависимых систем внутриклеточной сигнализации в эффектах электромагнитного излучения крайне высокой частоты на респираторный взрыв

нейтрофилов

Биофизика 03.00.02.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н. Чемерис Н.К. к.б.н. Сафронова В.Г.

Пущино 1998 г.

Оглавление 1. Введение

Глава 1. Литературный обзор................................................................................6

1.1. Биологические эффекты ЭМИ КВЧ низкой интенсивности..............6

1.1.1 Воздействие ЭМИ низкой интенсивности на целый организм...........6

1.1.2 Воздействие ЭМИ КВЧ И СВЧ на клетки иммунной системы...........8

1.1.3 Участие систем внутриклеточной сигнализации в

перестройке метаболизма клеток при действии ЭМИ КВЧ и СВЧ............10

1.1.4. Действие ЭМИ КВЧ и СВЧ на цитоплазматическую

мембрану клетки..............................................................................................13

1.1.5. Механизмы первичного взаимодействия ЭМИ

низкой интенсивности с биологическими объектами...................................18

1.2. Структурно-функциональные особенности нейтрофилов....................22

1.2.1. Общая характеристика нейтрофилов....................................................22

1.2.2. Функциональные особенности нейтрофилов.......................................23

1.3. Функциональная пластичность нейтрофилов.......................................25

1.3.1. Покоящиеся нейтрофилы.......................................................................24

1.3.2. Праймированное состояние нейтрофилов.........1..................................27

1.3.3. Активированное состояние нейтрофилов.............................................27

Глава 2. Материалы и методы..............................................................................40

Глава 3. Результаты исследований.......................................................................43

3.1. Активация респираторного взрыва нейтрофилов

кальциевыми ионофорами и форболовым эфиром.......................................44

3.2. Эффект ЭМИ КВЧ на нейтрофилы в различном функциональном состоянии.............................................................................46

3.3. Исследование механизмов активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и фордоловым эфиром..............48

3.3.1. Особенности совместной активации респираторного

взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и ФМА.................!..........49

3.3.2. Измерение цитоплазматического кальция при действии кальциевых ионофоров.....................................................................................54

3.3.3. Взаимосвязь увеличения [Са2+]цит и изменения продукции АФК нейтрофилов в ответ на ФМА при совместной

активации с кальциевыми ионофорами..........................................................60

3.3.4. Участие ФЛА? в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов....63

3.3.5. Оценка функционального статуса нейтрофилов на модели активации респираторного взрыва кальциевым ионофором А23187 и ФМА...............68

3.4. Исследование биологического действия ЭМИ КВЧ на модели активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и ФМА.....................................................................71

3.4.1. Роль внешнего кальция в реализации эффектов

ЭМИ КВЧ на нейтрофилах..............................................................................73

3.4.2. Роль фосфолипазы А2 в эффекте ингибирования................................74

ЭМИ КВЧ продукции АФК нейтрофилов, активированных

кальциевым ионофором А23187 и ФМА........................................................74

3.4.2. Модификация эффекта ЭМИ КВЧ при облучении

нейтрофилов в присутствии проадифена, блокатора цитохрома Р-450......75

Глава 4. Обсуждение...............................................................................................77

Выводы....................................................................................................................85

Список литературы.,.,.,,.,........................................................................................86

Благодарности......................................................................................................105

Глава 1. Введение.

Биологические эффекты низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высокой частоты (ЭМИ КВЧ) широко исследуются в настоящее время. Клинические исследования влияния ЭМИ КВЧ на течение различных заболеваний показывают, что КВЧ-терапия оказывает иммунорегулирующее воздействие при онкологических заболеваниях; при воспалительных процессах нормализует лейкоцитарный индекс, снимает аллергические реакции на лекарственные препараты. Наиболее значительный терапевтический эффект наблюдали при действии ЭМИ КВЧ на течение воспалительных процессов [1, 2].

Четкого представления о физико-химических механизмах действия КВЧ-излучения на биологические системы на сегодняшний день нет, оно находится в стадии формирования. Существует ряд гипотез: гипотеза когерентных возбуждений и взаимодействий, объясняющая резонансное запасание энергии ЭМИ КВЧ биологическими объектами [3]; гипотеза о солитонном механизме передачи энергии, причем, возбуждению солитонов сопутствует появление когерентных состояний по Фрелиху [цит. по 4]; информационная гипотеза [5], и некоторые другие, например, связывающие действие ЭМИ КВЧ с эффективным поглощением энергии ЭМИ КВЧ молекулами воды [6]. Также нет ясности в вопросе о природе сенсора ЭМИ КВЧ в клетках. Большинство работ по исследованию биологического действия ЭМИ КВЧ посвящено изучению частотных зависимостей, характеризующих изменение структурно-функционального состояния клетки при действии ЭМИ КВЧ [7-11]. При этом роль вторичных мессенджеров, реализующих изменение клеточного метаболизма вследствие действия ЭМИ КВЧ, остается неопределенной.

В работе [12] обсуждается, что к ЭМИ крайне низких частот более чувствительны активированные, а не покоящиеся клетки. В то же время с позиции информационной теории взаимодействия ЭМИ КВЧ с биологическими

системами [5] влияние ЭМИ КВЧ низкой интенсивности на нормально работающую клетку несущественно; в том случае, если функционирование клетки нарушено, даже слабые внешние воздействия могут менять ее метаболический профиль [13]. Возможно, что иммуномодулирующее действие ЭМИ КВЧ при патологиях направлено именно на клетки с измененным функциональным статусом. Однако, специальных исследований взаимосвязи эффекта ЭМИ КВЧ и функционального состояния иммунных клеток не проводилось.

Цель и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в определении роли ионов кальция и фосфолипазы к-) в перестройке метаболизма нейтрофила при действии ЭМИ КВЧ; исследовании взаимосвязи эффекта ЭМИ КВЧ и функционального состояния клетки.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

Разработать и проанализировать экспериментальную модель активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и форболовым эфиром для изучения реактивного потенциала клетки и исследования взаимосвязи функционального состояния клетки и эффектов ЭМИ КВЧ:

- определить эффективность кальциевых ионофоров А23187, иономицина, А23187-4Вг в активации респираторного взрыва нейтрофилов и в реализации

эффектов ЭМИ КВЧ;

!

- провести сравнительный анализ способности кальциевых ионофоров А23187, иономицина, А23187-4Вг повышать концентрацию свободного внутриклеточного кальция ([Са2+]цит);

- определить роль входа ионов кальция из внешней среды и мобилизации ионов кальция из внутриклеточных депо в активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором. Исследовать роль этих двух пулов кальция в реализации действия ЭМИ КВЧ;

- исследовать роль фосфолипазы А2 и продуктов арахидоновой кислоты (АК) в активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и форболовым эфиром и реализации эффектов ЭМИ КВЧ.

Научная новизна. Впервые проведено исследование взаимосвязи эффекта ЭМИ КВЧ и функционального состояния нейтрофилов. Показано, что эффект ЭМИ КВЧ наблюдается при активном статусе фосфолипазы А? и реализуется с участием продуктов окисления арахидоновой кислоты по эпоксигеназному пути при наличии Са2+ во внешней среде. Впервые проведено сравнительное исследование эффективности известных кальциевых ионофоров А23187, иономицина, А23187-4Вг в изменении [Са2+]цит и обеспечении физиологического ответа нейтрофилов. Показано, что физиологическая реакция определяется не только ионофорными свойствами данных соединений, но и способностью вызывать мобилизацию Са2+. Предложены возможные механизмы регуляции метаболизма нейтрофилов в зависимости от их функционального состояния.

Научно-практическая ценность. Результаты работы вносят существенный вклад в решение проблемы, касающейся механизмов регуляции клеточного метаболизма при действии ЭМИ КВЧ; разработанная модель последовательной активации кальциевым ионофором и ФМА респираторного взрыва нейтрофилов позволяет изучать реактивный потенциал клеток при действии различных факторов внешней среды.

Апробация работы. Материалы диссертации бьши представлены на I и III Путинских конференциях молодых ученых (Пущино, май 1996; Пущино, май 1998); на I Международном симпозиуме "Фундаментальные науки и альтернативная медицина" (Пущино, сентябрь 1997), на международных конференциях: 41nd Annual Meeting of the Biophysical Society (New Orlean, Louisiana, USA, 1997), Third International Congress EBEA (Nancy, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 4 статьи.

Список сокращений. ЭМИ КВЧ - электромагнитное излучение крайне высокой частоты, ЭМИ КНЧ - электромагнитное излучение крайне низкой частоты, ЭМИ СЗЧ- электромагнитное излучение сверхвысокой частоты, ЭМП - электромагнитые поля, НПЭ - плотность потока энергии, АФК - активные

формы кислорода, ХЛ - хемилюминесценция, [С^+]цит - концентрация ионов кальция в цитозоле, ФМА - форбол 12-миристат 13-ацетат, ДАТ -диацилглицерин, ПКС - протеинкиназа С, ЭПР - эндоплазматический ретикулум, АК - арахидоновая кислота, ФЛА2 - фосфолипаза А2, БФБ - 4 -бромофенацил бромид, ЛТВ4 - лейкотриен В4, ФЛС - фосфолипаза С, ФЛД -фосфолипаза Д, ФИн-1,4,5-Фз - инозитол 1,4,5-трифосфат, ФИн -фосфатидилинозитол, ФЛМФ - Н-формилметионил-лейцил-фениаланин.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Биологические эффекты ЭМИ КВЧ низкой интенсивности.

1.1.1. Воздействие ЭМИ низкой интенсивности на целый организм.

В настоящее время накоплено достаточно данных, указывающих на взаимодействие ЭМИ низкой "нетепловой" интенсивности с биологическими объектами (для бактерий она составляет 0.05 мВт/см2, для животных - 9-10 мВт/см2).

Показано, что облучение электромагнитными полями крайне высокой частоты (30-300 ГГц) (ЭМИ КВЧ) и электромагнитными полями сверх высокой частоты (3 - 30 ГГц) (ЭМИ СВЧ) при различных патологических состояниях нормализует функции организма. Клинические исследования влияния ЭМИ КВЧ на течение различных заболеваний показывают, что КВЧ-терапия оказывает благоприятное воздействие на репаративные и обменные процессы: способствует заживлению язв, ран, росту костной ткани, влияет на системы гомеостаза и фибринолиза, нормализует уровень липопротеидов в крови [1]. Кроме того, известно, что ЭМИ КВЧ потенциирует действие лекарственных препаратов, обладает иммунопротекторным и иммунорегулирующим действием: показаны иммуностимулирующий эффект при онкологических заболеваниях,

нормализация лейкоцитарного индекса при воспалительных процессах, снятие аллергической реакции на лекарственные препараты [2].

В то же время клинико-физиологические исследования людей, работающих в условиях длительного воздействия на организм электромагнитных полей (ЭМП) различных диапазонов, показали, что у них отмечаются изменения деятельности ЦНС [14, 15, 16]. Нарушение памяти у людей, подвергшихся воздействию ЭМП, свидетельствуют, что ЦНС и ее высшие отделы являются наиболее чувствительными к воздействию ЭМП. При воздействии на различные формы памяти ЭМП в СВЧ диапазоне с большой плотностью потока энергии (ППЭ) отмечено нарушение кратковременной памяти, в то время как долговременная память не претерпевала изменений [цит по 17]. Авторы заключают, что изменения функционального состояния ЦНС, вызываемое ЭМИ СВЧ, оказывают влияние на процессы воспроизведения, не затрагивая механизмов хранения следов памяти. Особая роль в поддержании надежности и стабильности функционирования мозга принадлежит гематоэнцефалическому барьеру (ГЭБ). В большинстве работ [цит по 17] указывается на повышение проницаемости ГЭБ, а, значит, и на возможность проникновения в ликвор ряда биологически активных веществ, нежелательных для деятельности мозга. Существуют результаты исследований [цит по 17], указывающих на отрицательное влияние ЭПМ на иммунологическую реактивность организма. В последнее время получены новые данные о специфических явлениях аутоиммунитета, развивающихся у животных под влиянием воздействия ЭМИ КВЧ и СВЧ с низкой ППЭ 50-500 мкВт/см2. На основании этих данных была сформулирована' аутоиммунная концепция повреждающего действия неионизируюшего излучения [18]. Было показано, что электромагнитные поля могут . выступать в качестве индуктора аутоиммунизации организма. Возникновение аутоиммунитета связывают не столько с изменением антигенной структуры тканей, сколько с патологией иммунной системы, в результате чего она реагирует на нормальные тканевые антигены. В соответствии с этой концепцией основу всех аутоиммунных состояний в первую очередь составляет

Г: 'С-

иммуннодифицит по тимус-зависимой клеточной популяции лимфоцитов. Влияние ЭМП высоких интенсивностей на иммунную систему организма проявляется в угнетающем эффекте на Т-систему клеточного иммунитета. Было установлено, что воздействие ЭМП малой мощности так же способствует угнетению Т-лимфоцитов [цит по 17].

Таким образом, из приведенных данных ясно, что при воздействии ЭМИ на целый организм в нем наблюдается изменение иммунного статуса, что связано с перестройкой биохимических процессов, протекающих с участием рецегггорных систем и систем внутриклеточной сигнализации. Однако анализ механизмов эффектов ЭМИ КВЧ на уровне целого организма затруднен. Также неизвестна роль вторичных мессенджеров, реализующих изменения клеточного метаболизма вследствие действия ЭМИ КВЧ. Для понимания механизмов взаимодействия ЭМИ со сложной биологической системой необходимы исследования, выполненные на более низких уровнях организации системы -клеточном и субклеточном.

1.1.2. Воздействие ЭМИ КВЧ И СВЧ на клетки иммунной системы.

Большой интерес для практики представляют исследования эффектов ЭМИ на иммунные клетки. Так как в последние годы ЭМИ КВЧ и СВЧ широко применяется в медицине для лечения различных заболеваний, то существенное значение имеет выбор параметров излучения, которые важны для эффективного взаимодействия ЭМИ с живыми системами. Поэтому в большинстве работ [7-11, 19,20] основное внимание уделяется изучению частотной зависимости изменений под действием излучения параметров, характеризующих структурно-функциональное состояние клетки.

Оценка эффективности действия ЭМИ часто проводится по изменениям основных функций клеток, например, респираторного взрыва и фагоцитоза у полиморфноядерных лейкоцитов [7-11, 19, 20]. В работе [8] на полиморфноядерных лейкоцитах показана зависимость активности клеток от частоты, интенсивности и фазы преобразованных низкочастотным ЭМИ (900 Гц, 1.2 кГц) собственных электромагнитных колебаний человеческой крови.

В большинстве работ [7-11, 19, 20] при действии ЭМИ КВЧ обнаружено частотнозависимое изменение скорости фагоцитоза, измеряемого по НСТ-тесту у моноцитов и нейтрофилов, уровню хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов. Частотная зависимость эффекта напоминает по форме резонансную характеристику колебательного контура. По аналогии с этим обычно говорят о резонансных эффектах ЭМИ КВЧ и СВЧ. Результаты некоторых работ, демонстрирующих острорезонансное действие ЭМИ КВЧ, могут быть объяснены сложной интерференционной картиной, возникающей в ближней зоне излучателя [21]. Авторы статьи [11] показали, что немодулированное ЭМИ КВЧ низкой интенсивности в ближней зоне излучателя ингибирует люминол-зависимую ХЛ нейтрофилов, активированных опсонизированным зимозаном, в то время как в дальней зоне излучателя при сохранении эффекта не обнаружено зависимости эффекта от частоты излучения. Авторы предполагают, что квазирезонансная зависимость биологического эффекта от частоты в ближней зоне излучателя обусловлена структурой и характером электромагнитного излучения в ближней зоне.

В работах [8, 19, 20] продемонстрирована высокая селективность нейтрофилов к несущим и модулирующим частотам излучения и различное направление эффекта. Авторы [19] считают, что возможно дистантное управление функциями клеток низкоинтенсивным модулированным ЭМИ КВЧ на уровне процессов внутриклеточной сигнализации.

Помимо квазирезонансного отклика, биологические эффекты ЭМИ КВЧ и СВЧ имеют пороговый характер по мощности КВЧ, то есть биологические объекты откликаются на ЭМИ КВЧ, начиная с некоторой пороговой величины, а затем появляется область независимости биологического эффекта �