Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности действия модулированного электромагнитного излучения крайне высоких частот на клетки животных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности действия модулированного электромагнитного излучения крайне высоких частот на клетки животных"

<; Г 3 о д

, , . ... На правах рукописи

' - УДК 576.32:538.569

ГАПЕЕВ АНДРЕЙ БРОНИСЛАВОВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ МОДУЛИРОВАННОГО ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ КРАЙНЕ ВЫСОКИХ ЧАСТОТ НА КЛЕТКИ ЖИВОТНЫХ

ОЗ.ОО.О2-БИОФИЗИКА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ПУЩИНО 1997 год

Работа выполнена в лаборатории биофизики нервной клетки Института биофизики клетки РАН

Научный руководитель:

доктор биологически», наук Чемерис Н.К.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Берестовский Г.Н. кандидат физико-математических наук Морнев O.A.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится " /!Я ¡95-7 г в /Ут[исов на заседании

диссертационного совета Д 200.22.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, г.Пущино Московской обл., ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН, г.Пущино.

Автореферат разослан ЯММ^У 199(?г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 200.22.01 кандидат биологических наук

Нелипович П.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Исследование биологических эффектов электромагнитного излучения (ЭМИ) крайне высоких частот (КВЧ) началось около 30 лет тому назад вслед за освоением этого диапазона частот в радиотехнике (направленная радиосвязь, мм-радио-локация и др.). Показано, что ЭМИ КВЧ может вызывать значимые изменения физиологического состояйия живых объектов [Девятков и др., 1981; Adey, 1988; Grundler et al., 1992]. Интерес к биологическим эффектам ЭМИ КВЧ определяется несколькими обстоятельствами. С одной стороны, необходимостью разработки научно обоснованных безопасных норм для населения и технического персонала, работающего на установках, генерирующих ЭМИ [Акоев, 1983]. С другой стороны, методы микроволновой терапии интенсивно внедряются в медицинскую практику для лечения самых разнообразных заболеваний [Андреев и др., 1985; Девятков и др., 1981, 1991]. Медицинское применение КВЧ-облучения в основном строится на эмпирически полученных эффектах. Существует целый ряд интересных гипотез о возможности резонансного действия излучения на биологические системы {Девятков и др., 1991; Fröhlich, 1988; Kaiser, 1995]. Однако проблема физико-химических механизмов нетеплового действия ЭМИ КВЧ на клетки и организм в целом остается открытой.

В течение последних лет достигнуты определенные успехи в исследовании механизмов действия ЭМИ КВЧ на биологические объекты различного уровня организации. Роль первичных мишеней ЭМИ могут выполнять клеточные мембраны [Девятков и др., 1991], преобразующие внешние электромагнитные колебания в управляющие сигналы. Показано резонансное изменение ионных токов через мембраны водоросли Nitellopsis [Катаев и др., 1993], изменение сродства каналообразующих белков к кальцию [Geletyuk et al., 1995]. Посредником действия ЭМИ КВЧ на биологический объект может являться водный раствор, например, контактирующий с внутриклеточной стороной ионных каналов [Fesenko et al., 1995]. Первичной мишенью ЭМИ может быть ДНК. Показано смещение резонансных частот излучения при изменении длины генома клеток E.coli [Belyaev et al., 1993]. Некоторые авторы отмечают важную роль ионов кальция в проявлении эффектов ЭМИ (Adey, 1988], излучение может влиять на осцилляции концентрации внутриклеточного свободного кальция [Walleczek, 1992]. Множественность первичных механизмов действия ЭМИ на живые объекты приводит к выводу о том, что независимо от природы сенсора, действие ЭМИ можно рассматривать на уровне систем внутриклеточной регуляции. Пути трансдукции внутриклеточных сигналов в живых системах, являющихся открытыми и нелинейными, могут оказаться чувствительными к воздействию слабых электромагнитных полей (ЭМП) [Kaiser, 1995].

Анализ имеющихся экспериментальных и теоретических данных указывает на необходимость решения следующих фундаментальных задач:

1) исследованию действия ЭМИ КВЧ на биологические объекты всегда должна предшествовать корректно выполненная дозиметрия излучения для конкретной излучающей системы и условий эксперимента; 2) к биотропным параметрам ЭМИ, кроме традиционных частоты, плотности потока поглощаемой объектом энергии и времени облучения (дозы), поляризации и модуляции ЭМИ, необходимо также отнести и структуру электромагнитного поля в плоскости объекта. Поле ближней и дальней зон излучения принципиально различны, следовательно, могут вызывать различный биологический эффект; 3) эффективно ли

действие ЭМИ КВЧ, модулированного частотами, близкими к характеристическим частотам колебательных ферментативных реакций в исследуемом пути внутриклеточной сигнализации.

Цель и основные задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в исследовании действия ЭМИ КВЧ на системы внутриклеточной регуляции клеток животных. В качестве объектов использовались одноклеточные организмы Paramecium caudatum и клетки иммунной системы - нейтрофилы. Были поставлены следующие задачи:

1) Провести тестирование излучателей мм-волн на предмет их согласования с питающим трактом, согласования излучения с объектом, распределения удельной поглощенной мощности в плоскости объекта и определить их пригодность для б£ЗирТ£фиХТ11СГ0 CCJiyiCIIII/I иЯСЛОГ/Г^С^ллл uvuvn i Co.

2) Определить, существует ли разница в эффектах непрерывного ЭМИ КВЧ на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами мыши при облучении клеток в ближней и дальней зонах используемого излучателя.

3) Исследовать влияние модулированного ЭМИ КВЧ на функциональные реакции одноклеточных простейших и нейтрофилов.

4) Провести анализ особенностей влияния модулированного ЭМИ КВЧ на пути трансдукции внутриклеточных сигналов.

Научная новизна и практическое значение работы

В результате тестирования различных излучающих систем показано, что рупорные и диэлектрические антенны малопригодны для исследования механизмов действия ЭМИ КВЧ на биологические объекты по крайней мере в ближней зоне ихтучения, поскольку неоднородность распределения удельной поглощенной мощности (УПМ) в плоскости облучаемого объекта оказывается неприемлемо большой. Разработан и эффективно использован излучатель миллиметровых волн на основе желобкового волновода, обеспечивающий однородность распределения УПМ как в ближней, так и в дальней зонах излучения.

При облучении нейтрофилов в ближней зоне желобкового излучателя обнаружено частотнозависимое ингибирование продукции активных форм кислорода клетками, активированными опсонизированным зимозаном. В дальней зоне желобкового излучателя частотная зависимость эффекта отсутствует, что указывает на принципиальную разницу во взаимодействии полей ближней и дальней зон с биологическим объектом.

Разработаны две перспективные модели для исследования действия излучения на клетки: "гиперполяризационная" модель парамеции и модель синергического действия кальциевого ионофора А23187 и форболового эфира на нейтрофилы мыши. Обнаружен эффект двойного резонанса на несущей и модулирующей частотах излучения в ингибировании двигательной активности парамеций. Эффект проявлялся только в узких полосах частот: около 42.25 ГГц по несущей частоте и около 0,095 Гц по частоте модуляции. Обнаружено ингибирование синергической реакции кальциевого ионофора и форболового эфира в активации респираторного взрыва перитонеальных нейтрофилов. При фиксированных значениях несущей частоты наблюдалась активация или ингибирование респираторного взрыва в зависимости от частоты модуляции излучения в диапазоне от 0.1 до 50 Гц.

Анализ полученных экспериментальных данных позволяет сделать вывод, что модулированное ЭМИ КВЧ влияет на кальций-зависимые системы внутриклеточной регуляции, эффект проявляется при наличии потоков ионов кальция через клеточную мембрану, проявление эффекта на строго фиксированных несущих и модулирующих частотах излучения указывает на действие ЭМИ на определен-

ные звенья трансдукции внутриклеточных сигналов. Конечный эффект может варьировать по величине и по направлению в зависимости от режима воздействия модулированного излучения, что показывает на возможность управления функциями живых клеток путем воздействия модулированным ЭМИ КВЧ.

Апробация работы

Основные результаты работы были предстаатены на II Международном конгрессе "Microwaves in Medicine 1993" (Rome, Italy, 11-14 October 1993), на 3(16) съезде Физиологического Общества при РАН (г.Пущино, 2-4 ноября 1993 г.), на научных фнференциях Института биофизики клетки РАН 1993 и 1995 гг. (г.Пущино), на Международном семинаре Европейского Биоэлектромагнитного Общества (г.Пущино, 15-18 мая 1995 г.), на III Международном конгрессе Европейского Биоэлектромашитного Общества (ЕВЕА) (Nancy, France, 29 Februaiy-3 March 1996) и на Городской научной конференции молодых ученых (г.Пущино, 15-17 мая 1996 г.). По материалам диссертации опубликовано 5 статей.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 168 ссылок. Работа изложена на 111 стр., содержит 24 рис. и 1 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования действия ЭМИ КВЧ выполнены на одноклеточных простейших Paramecium caudatum и на перитонеальных вызванных нейтрофилах мышей SPF-категории аутбредной линии NMRI. Мыши были получены из вивария барьерного типа лаборатории линейных животных филиала Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и акад. Ю.А. Овчинникова.

Регистрация двигательной активности парамеций в контроле и при облучении.

Поведение парамеций чувствительно к различным стимулам, вызывающим изменение баланса Са2+. Гиперполяризация мембранного потенциала клеток в "гиперполяризующем" растворе (1 мМ CaCl2', 0.2 мМ KCl) приводит к уменьшению частоты спонтанных реакций избегания. Клетки начинают двигаться вблизи поверхности жидкости вдоль вертикальных стенок цилиндрической ячейки (d=7 мм; h=2 мм). Двигательную активность парамеций регистрировали фотодатчиком. На ячейку с клетками подавалось боковое освещение таким образом, что фотодатчик улавливал рассеянный на клетках свет. Количество возникающих импульсов тока (далее индекс подвижности), соответствующих факту появления клеток в просвете оптического окна, подсчитывалось за каждые J мин. Индекс подвижности интегрально отражает скорость и регулярность движения парамеций. При отсутствии внешних воздействий индекс подвижности клеток меняется слабо в течение 1-2 час (существует малый тренд на уменьшение). За контроль принимали изменение индекса подвижности клеток в течение 24 минут без внешних воздействий. При действии ЭМИ КВЧ в течение первых 10 минут регистрировали двигательную активность без облучения, а затем начиналось облучение клеток. Величину эффекта оценивали через 12 минут после начала облучения и выражали в процентах от контроля. Во всех проведенных экспериментах применялось термостатарование ячейки с клетками при температуре 16°С.

Излучение от генератора Г4-141 подводилось к ячейке с парамециями с помощью диэлектрического волновода длиной 85 мм, расположенного под углом 60° к поверхности раствора в ячейке. Конец волновода находился на расстоянии

2-3 мм от поверхности раствора и служил излучающей антенной. Поглощаемая мощность оценивалась с помощью термопары по скорости роста температуры в разных точках ячейки на глубине 0.4 мм при выключенном термоетатировании. Точность измерения температуры составляла 0.1°С. Импульсную модуляцию излучения осуществляли меандром с частотами 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 8 и 16 Гц, длительность импульсов модуляции контролировали с помощью ПЭВМ.

Измерение хемилюминесце/щии перитонеальных нейтрофилов.

Выделение перитонеальных нейтрофилов проводили аналогично методике [Castranova et al., 1987] с некоторыми модификациями. Плотность нейярофилов в экспериментальной ячейке с рабочим объемом 200 мкл задавали равной 10б клсток/мл. Продукция активных фирм кислорода (АФК) нейтрофилами при активации опсонизированным зимозаном и форболовым эфиром (ФМА) оценивалась по люминол-зависимой хемилюминесценции (XJI-JI). XJI-JI регистрировали хемилюминометром XJ1-U1, изготовленным в лаборатории биофизики нервной клетки ИБК РАН. Уровень XJI-JI регистрировался последовательно от 12 экспериментальных ячеек в условиях термостатировании при температуре 37°С. Время опроса всех 12 ячеек составляло 1 мин при активации респираторного взрыва нейтрофилов опсонизированным зимозаном (25 мкг/мл) и 10 с при активации ФМА (1 мкМ). Уровень XJI-JI визуально оценивался в реальном масштабе времени по кривым, выводимым на экран видеомонитора одновременно дая всех 12 ячеек. Последующий анализ данных проводили с помощью специализированных программ, написанных на языке Turbo Pascal 7.0.

Усиление продукции АФК нейтрофилами вызывалось при совместном действии на клетки кальциевого ионофора А23187 (0.1-20 мкМ) и ФМА (1 мкМ).

Нейтрофилы облучали с помощью желобкового излучателя, соединенного с высокочастотным генератором Г4-141, в экспериментальных ячейках (d = 10 мм, толщина стенки 0.3 мм, рабочий объем 200 мкл) со стороны дна ячеек при температуре 19-22°С. При помещении клеток в ячейку в течение 1-2 мин происходит их прикрепление ко дну ячейки, и облучается моно- или бислой клеток. Облучались одновременно шесть ячеек, в качестве контрольных использовали шесть ячеек, находящихся в аналогичных условиях за исключением облучения. После облучения регистрировали XJI-JI от облученных и необлученных клеток. Интакт-ные нейтрофилы облучали в течение 40 мин, а затем активировали опсонизированным зимозаном. В присутствии кальциевого ионофора А23187 различных концентраций клетки облучали в течение 20 мин, а затем активировали ФМА.

Модуляцию излучения проводили меандром с частотой от 0.1 до 50 Гц.

Анализ XJI-JI контрольных и облученных нейтрофилов.

Суммарную продукцию АФК нейтрофилами оценивали пропорционально площади под кривой зависимости интенсивности XJI-JI от времени, принимая за нулевой уровень среднюю интенсивность спонтанной XJI-JI в контрольных ячейках. За начало отсчета принимали момент подачи активирующего агента и считали площадь под кривой за выбранное время. Для дальнейшего анализа усредняли площади для контрольных и облученных ячеек, а отличие контроля от опыта оценивали как разность площадей в контроле и в опыте, нормированную к контролю и выраженную в процентах. В случае, например, превышения интенсивности XJI-JI в контроле над опытом получали положительную величину в процентах, отражающую степень ингибирования активности нейтрофилов под действием КВЧ-излучения. Коэффициент синергизма считали как отношение продукции АФК при одновременной активации нейтрофилов А23187 и ФМА к продукции АФК клеток, активированных только ФМА.

Уровень [Са2+К в нейтрофилах измеряли спектрофлуориметром по флуоресценции зонда Рига-2АМ (4 мкл/мл).

Статистический анализ данных проводили по ¡-критерию Стьюдента. На рисунках для каждой точки указано число независимых экспериментов, по которым произведено усреднение, и доверительный интервал (р<0.05).

Антенны.

В качестве излучателей использовали: 1) пирамидальные рупорные антенны с апертурами 32x32 мм и 46x46 мм; 2) диэлектрическую антенну сечением 5.2x2.6 мм длиной около 80 мм; 3) излучатель миллиметровых волн с апертурой 17.5x12.5 мм на основе желобкового волновода (желобковый излучатель).

Измерение коэффициента стоячей волны и характеристик КВЧ-поля в ближней и дальней зонах антенн.

Измерение коэффициента стоячей волны (КСВ) и ослаблений проводили с помощью панорамного измерителя Р2-68 в режиме короткого замыкания, холостого хода антенн и при облучении реального объекта. Пространственную картину распределения удельной поглощенной мощности (УПМ) оценивали термографическим методом с помощью инфракрасной камеры АСА 780/8\У.

УПМ в ближней зоне на расстояниях 0-110 мм от торца излучателя оценивали с помошыр термопары по скорости роста температуры в экспериментальной ячейке и рассчитывали по формуле УПМ = С [ДТ/Д1] при Д1 -> 0, где ДТ - изменение температуры раствора в ячейке (°С) за время Д1 (с), С=4.182 Дж/(гхК). Плотность потока поглощенной энергии (ПППЭ) рассчитывали пропорционально УПМ в плоскости объекта.

Пространственное распределение УПМ и плотность потока энергии (ППЭ) в датьней зоне на расстояниях 200-1000 мм от торца излучателя оценивали с помощью панорамного измерителя Р2-68. В качестве приемной антенны использовали пирамидальную рупорную антенну с апертурой 32x32 мм. Расчет ППЭ осуществляли с учетом коэффициента передачи приемной системы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

/ Тестирование излучающей системы

Тестирование излучающей системы требует решения следующих задач: 1) обеспечение согласования антенны с питающим трактом и облучаемым биологическим объектом; 2) измерение диаграммы направленности антенны и подбор соответствующего взаимного расположения излучателя и объекта; 3) измерение УПМ в плоскости объекта, определение степени ее неоднородности, зависимости от частоты излучения и геометрии объекта. Без проведения четкой дозиметрии излучения на реальном объекте исследование механизмов действия ЭМИ КВЧ на биологический объект оказывается некорректным.

Чаще всего облучение биологических объектов в диапазоне КВЧ проводится в ближней зоне излучателей на расстояниях 11 < 2В2/Х от излучающего торца антенн (Б - максимальный размер апертуры антенны, X - длина волны). Однако, неоднородность ЭМП в ближней зоне излучателей может быть одной из причин артефактов. В ближней зоне излучения в плоскости объекта может существовать многомодовая интерференционная картина распределения УПМ, которая и определяет неравномерность поглощенной в объекте энергии ЭМИ КВЧ. При изменении частоты излучения интерференционная картина меняется, что может при-

вести к появлению резонансноподобных пиков зависимости поглощения энергии от частоты [Гарибов и Островский, 1990; ЮшЪпуак & Х^зкт, 1994].

Пространственная неоднородность поля в ближней зоне рупорной антенны, возникающая из-за интерференции падающей и отраженной от объекта волн, оказывается неприемлемо большой [Бецкий и др., 1989; ЮщЬпуак & г^якт, 1994]. Количество и величина локальных пятен перегрева сильно зависят от частоты излучения и расстояния между объектом и антенной. Согласование диэлектрической антенны с питающим трактом зависит от формы и конфигурации антенны, и, как правило, из-за плохого согласования в волноводном тракте возникает стоячая волна. Коэффициент стоячей волны (КСВ) при изменении частоты даже в пределах 100-200 МГц может меняться в 2-3 раза, что прямо отражается на величине поглощенной объектом энергии Эмй КВЧ. По величине КСВ, определяемой как

КСВ — р — Ещад/Ещ^п,

где Етах и Етщ - напряженности электрического поля в максимуме и минимуме стоячей волны, соответственно, несложно рассчитать мощность, поступающую в нагрузку,

Р=Рпал[1- (P-1)2/(P+1)2].

Желобковый излучатель

50 52

Частота, ГГц

38 40 42 44 46 48 50 52

Частота, ГГц

Диэлектрическая airrefifia 2.0

38 40 42 44 46 48 50 52

33 40 42 44 46

50 52

Частота, ГГц

Рис.1. Изменение коэффициента стоячей волны в зависимости от частоты излучения для трех типов антенн: желобкового излучателя, рупорной антенны и диэлектрической антенны. В качестве нагрузок использованы: А - сплошной металлический экран (режим короткого замыкания) и Б - свободное пространство (холостой ход антенны).

Удовле'форительным можно считать КСВ < 1.5, при котором потери на отражение составляют около 4% мощности. Однако качество согласования характеризуется не только величиной КСВ в некотором диапазоне частот, но и крутизной его зависимости от частоты.

Для решения задачи выбора оптимальной системы облучения мы провели тестирование трех типов антенн по их согласованию с различными видами нагрузок. Из рис.1,А видно, что КСВ для рупорной и диэлектричедкой антенн оказывается неприемлемо большим: до 10 для рупорной антенны и до 3.8 для диэлектрической. КСВ для желобкового излучателя не превышает в этом случае 2.4, и характер его изменения от частоты существенно более плавный, чем для двух других антенн. Из рис.1,Б отчетливо видно, что при

холостом ходе антенн, КСВ для желобкового излучателя и рупорной антенны меняется в пределах от 1.01 до 1.18 достаточно плавно. КСВ диэлектрической антенны для этого случая оказывается большим и меняется в пределах от 1.3 до 1.68. Если нагрузкой служит реальный биологический объект, то в зависимости от его геометрических параметров и расстояния от излучающего торца антенны можно получить характер изменения КСВ от частоты промежуточный между рассмотренными предельными случаями. Причем расположению объекта в ближней зоне излучателя будет более соответствовать случай, представленный на рис.1,А.

Неприемлемо большой КСВ в ближней зоне рупорных и диэлектрических антенн, сильно меняющийся с изменением частоты излучения, отражает в том числе и неоднородность распределения УПМ в плоскости облучаемого объекта. Из-за возникновения в плоскости объекта сложной интерференционной картины распределения ЭМП, трудно говорить о характере наблюдаемого эффекта (тепловом или нетепловом), т.к. зависящие от частоты излучения локальные перегревы или температурный градиент способны оказывать влияние на исследуемый биологический объект, приводя к изменению его функционального состояния. Величина УПМ в точках перегрева может превосходить среднюю величину УПМ во всей облучаемой области на несколько порядков [Khizhnyak & Ziskin, 1994J.

Сравнительное тестирование желобкового излучателя и рупорной антенны термографическим методом показало, что желобковый излучатель обеспечивает однородное распределение УПМ в диапазоне частот 37.5-53.5 ГГц во всей ближней зоне излучения. Единственное пятно разогрева модельного фантома имеет форму эллипса, площадь которого в непосредственной близости от антенны составляет 3 см2. В отличие от рупорной антенны многомоловая интерференционная картина распределения поля в плоскости фантома для желобкового излучателя обнаружена не была.

Оценка пространственного распределения УПМ вблизи диэлектрической антенны по скорости роста температуры в экспериментальной ячейке показала, что УПМ по пространству ячейки при сканировании несущей частоты излучения в узком диапазоне от 42.0 до 42.5 ГГц меняется не более, чем в 8 раз. При облуч^ нии ячейки с парамециями с помощью диэлектрической антенны мы определенным образом корректировали выходную мощность генератора, исходя из полученной оценки пространственного распределения и частотной зависимости УПМ в реальном объекте. При этом распределение УПМ в объекте при фиксированных несущих частотах оставалось одинаковым.

Результаты тестирования трех типов антенн позволяют сделать следующие выводы. Во-первых, некорректно проводить облучение биологических объектов в ближней зоне рупорных антенн. Во-вторых, величина и характер изменения КСВ от частоты для диэлектрических антенн сильно зависят от конфигурации самой антенны и от расстояния до облучаемого объекта. Поэтому для диэлектрической антенны необходимо иметь четкое Представление о величине УПМ в реальном объекте, пространственном распределении УПМ и ее зависимости от частоты излучения. В-третьих, нами установлено, что желобковый излучатель в отличие от рупорной и диэлектрической антенн обладает хорошей пространственной избирательностью, обеспечивает однородность УПМ в плоскости объекта и хорошее согласование с питающим трактом, что, как мы полагаем, позволяет проводить облучение биологических объектов с помощью желобкового излучателя как в ближней, так и в дальней зонах антенны.

По условию Я>202Д. Для желобкового излучателя дальняя зона начинается на расстоянии Я > 100 мм от его излучающего торца, где фазовая ошибка в фазовом множителе векторов поля не превышает тс/8 [Корбанский, 19731.

На расстояниях 200-1000 мм от торца излучателя плотность потпкл поглощенном

энергии (ПППЭ) рассчитывали пропорционально плотности потока энергии, определяемой с помощью приемной рупорной антенны с площадью раскрыва 10.24 см2. Путем аппроксимации полученных точек гладкой кривой (рис.2, Б) для желобкового излучателя были установлены параметры, входящие в формулу для расчета ПППЭ (Р) на расстоянии х мм от антенны

Р = Р0/(1 + ФУ-, (1) где а = 98 мм, Р0 - ПППЭ на расстоянии х = 0 мм от антенны.

ПППЭ в дальней зоне антенны убывает обратно пропорционально квадрату расстояния от виртуальной точки излучения, находящейся внутри желобкового излучателя на расстоянии 98 мм от его внешнего торца. Значения ПППЭ, рассчитанные по скорости роста температуры в экспериментальной ячейке в ближней зоне излучателя (рис.2,Б), не совпадают с теоретической кривой, описываемой формулой (1), т.е. энергетические параметры поля в зависимости от расстояния от торца излучателя в ближней зоне излучения не подчиняются закону обратноквадратичной зависимости.

Для сравнения на рис.2 (А,В) показаны зависимости ПППЭ от расстояния от рупорной и диэлектрической антенн, соответственно. Для этих антенн параметры а и Ро, входящие в формулу (1), имеют другие значения, следствием чего является различная крутизна спада ПППЭ в.зависимости от расстояния.

Площадь пятна разогрева Б на расстояниях более 100 им от торца желобкового излучателя оценивалась с помощью рупора, который служил приемником излучения. При падении уровня регистрируемой мощности излучения на 3 с!В измерялось расстояние, на которое смещали приемный рупор перпендикулярно оси излучателя в направлении Е и Н векторов электромагнитного поля. Далее рассчитывали площадь пятна разогрева по измеренным осям эллипса. Бьиго.установлено, что площадь пятна разогрева увеличивается прямо пропорционально квадрату расстояния от виртуальной точки излучения

5 = Бо (1 + х/аУ-, (2)

О 200 400 600 800 1000 Расстояние о;1 горца милучсп'еля, мм

Рис.2. Изменение плотности потока поглощенной энергии в зависимости от расстояния от излучающего торца антенны для трех типов антенн: А - рупорная антенна, Б - желобковый излучатель, В - диэлектрическая антенна. Пунктиром отмечены области, где зависимость плотности потока поглощенной энергии не подчиняется обратноквадратичному закону. О - точки, полученные при расчете ПППЭ пропорционально скорости роста температуры в экспериментальной ячейке при использовании желобкового излучателя.

где а = 98 мм, S0 - площадь пятна разогрева на расстоянии х = 0 мм от антенны, причем значение параметра а совпадает в формулах (1) и (2).

Используя известные методы дозиметрии ЭМИ КВЧ: термографический метод, картирование распределения удельной поглощенной мощности в пространстве и измерение коэффициента стоячей волны в тракте при различных нагрузках (в том числе при облучении реального биологического объекта), мы подобрали геометрические параметры самого объекта и взаимного расположения объекта и антенны с целью обеспечения оптимального согласования излучения с облучаемым объектом. Используемый нами желобковый излучатель в большей степени свободен от недостатков, присущих рупорным и диэлектрическим антеннам, что позволяет использовать его для облучения биологических систем в ближней и дальней зонах излучения.

II. Биологический эффект непрерывного ЭМИ КВЧ в ближней и дальней зонах желобкового излучателя

Исходя из теоретических представлений, а также из результатов некоторых модельных расчетов [Iskander et al., 1980; Lachtakia et al., 1981], структура и характер электромагнитного поля в ближней и дальней зонах излучателей различны. Основные различия очевидны: в ближней зоне антенны фронт волны не сформирован, векторы Е и Н электромагнитного поля могут иметь как поперечные, так и продольные составляющие, возникает кроме бегущей стоячая волна, доля реактивной энергии поля резко возрастает по мере приближения к антенне. Имея корректную дозиметрию излучения при использовании желобкового излучателя, обеспечивающего однородное распределение поля в ближней и дальней зонах излучения, мы поставили задачу провести сравнительный анализ эффектов непрерывного ЭМИ КВЧ на активацию респираторного взрыва нейтрофилов опсони-зированным зимозаном при аналогичных дозовых и частотных характеристиках излучения в ближней и дальней зонах.

Поскольку возможно резонансное или квазирезонансное взаимодействие КВЧ-излучения с объектом, когда значимый эффект наблюдается в узких (менее 200 МГц) полосах частот, одной из основных проблем является выбор области несущих частот излучения. Принимая во внимание результаты ряда работ [Grundler & Keilman, 1983; Belyaev et al., 1993; Катаев и др., 1993; Grundler & Keilman, 1989], мы провели серию экспериментов, остановив свой выбор на диапазоне несущих частот излучения от 41.75 до 42.1 ГГц. ПППЭ в этих экспериментах была 240 мкВт/см2. Объект облучали в ближней зоне желобкового излучателя на расстоянии 65 мм от его излучающего торца. Облучение проводилось с шагом по несущей частоте 50 МГц.

В ходе экспериментов было установлено, что зависимость степени ингибиро-вания активности нейтрофилов от несущей частоты в ближней зоне антенны носит резонансноподобный характер (рис.3). Учитывая равномерность КСВ в выбранном диапазоне частот и пространственную однородность КВЧ-поля, можно говорить о специфическом отклике биологической системы на действие ЭМИ КВЧ с конкретной частотой. Экспериментальные точки хорошо аппроксимируются кривой нормального распределения Гаусса-Лапласа с центральной частотой 41.95 ГГц и полушириной линии 160 МГц, что соответствует эквивалентному Q-фактору 260. Максимальная величина эффекта составляет около 25%, минимальная на краях диапазона - около 6%. Величина эффекта не достигает нулевого

41.9 42.0 Частота, ГГц

42.2

Рис.3. Ингибирование люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов, активированных опсонизированным зимозаном, при действии КВЧ-излучения в ближней зоне желобкового излучателя (ПППЭ 240 мкВт/см2) и в далвней зоне (ПППЭ 150 мкВт/см2). Точками О обозначена величина эффекта в ближней зоне желобкового излучателя, • - в дальней зоне. Прямой линией показана средняя величина эффекта в дальней зоне.

уровня из-за возможности существования соседних достаточно близких максимумов.

Для определения частотной зависимости ингибирования XJI нейтрофилов в дальней зоне излучателя мы провели серию экспериментов в том же диапазоне частот (41.77-42.12 ГГц), что и в ближней зоне. Для обеспечения условий нахождения в дальней зоне расстояние от торца излучателя до плоскости объекта было установлено равным 400 мм. Значение ПППЭ на этом расстоянии равнялось 150 мкВт/см2, что соответствовало максимальной мощности на выходе генератора.

В ходе экспериментов было установлено, что степень ингибирования активности нейтрофилов в дальней зоне излучения не зависит от несущей частоты (рис.3). Величина эффекта в дальней зоне фактически не меняется с изменением частоты и

в среднем составляет около 12%.

Для определения эффективного времени облучения нейтрофилов мы провели специальную серию экспериментов при фиксированной частоте 41.95 ГГц и ПППЭ излучения 240 мкВт/см2. Эксперименты показали, что зависимость степени ингибирования активности нейтрофилов от времени воздействия КВЧ-излучения имеет колоколообразную форму. Максимальный эффект достигается при воздействии КВЧ-излучения в течение 40 мин.

Для объяснения эффектов ЭМИ КВЧ часто используется тепловая теория, которая включает в себя и локальные нагревы структур биологических объектов [Майкелсон, 1980]. Однако для конкретных экспериментальных условий и малых ПППЭ такое объяснение неприемлемо. Для оценки роли энергетических параметров излучения в полученном эффекте мы исследовали зависимость величины эффекта от ПППЭ КВЧ-излучения в ближней и дальней зонах антенны. Была проведена серия экспериментов на фиксированной несущей частоте КВЧ-излучения 41.95 ГГц с ПППЭ, задаваемой от 0.07 до 2500 мкВт/см2 в ближней зоне и от 0.04 до 150 мкВт/см2 в дальней. На рис.4 показано, что величина ингибирования активности нейтрофилов имеет S-образную зависимость от ПППЭ как в ближней, так и в дальней зонах антенны. Начиная с величины ПППЭ около 5 мкВт/см2, эффект слабо меняется с увеличением ПППЭ излучения на несколько порядков. Половина величины биологического эффекта в ближней и дальней зонах излучения достигается при ПППЭ около 1 мкВт/см2 (рис.4).

Измерения изменения температуры раствора в экспериментальной ячейке при действии КВЧ-излучения показали, что при ПППЭ излучения 2.5 мВт/см2 в ближней зоне излучателя температура раствора за 10 минут облучения достигает стационарного значения и увеличивается на 0.3°С. При облучении объекта с ПППЭ менее 1 мВт/см2 изменение температуры раствора в ячейках не обна-ружимо на фоне "шумовых" колебаний температуры, которые составляют менее 0.05°С, как и в контрольных условиях без облучения.

Нетепловая природа полученного эффекта доказывается совокупностью следующих экспериментальных фактов: 1) узкая полоса эффективных несущих частот КВЧ-излучения с учетом отсутствия пространственной неоднородности поля в плоскости объекта и равномерности КСВ в используемой полосе частот (рис.3); 2) независимость величины эффекта от ПППЭ излучения, начиная с 5 мкВт/см2 (рис.4); 3) наличие эффекта при матых ПППЭ (около 1 мкВт/см2), когда нагрев раствора в ячейке пренебрежимо мал.

Таким образом, нами показано, что при облучении суспензии нейтрофилов в ближней зоне излучателя в течение 40 минут на частоте 41.95 ГГц и при ПППЭ более 5 мкВт/см2 имеет место максимальное ингибирование активности клеток на 25-26%. Биологический эффект в ближней зоне излучателя резонансно или квазирезонансно зависит от несушей частоты КВЧ-излучения в узкой полосе (рис.3), что указывает на специфический нетепловой характер действия излучения. В дальней зоне излучения при аналогичных энергетических, частотных и до-зовых параметрах ЭМИ при сохранении эффекта (12%) его частотная зависимость отсутствует. В то же время зависимости величины эффекта от ПППЭ в дальней и ближней зонах качественно аналогичны (рис.4).

Поскольку условия эксперимента при облучении интактных нейтрофилов в ближней и дальней зонах были аналогичны, мы полагаем, что различия в частотных характеристиках эффектов обуслоатены различной структурой и характером ЭМИ в ближней и дальней зонах антенны. Необходимы дальнейшие детальные и достаточно трудоемкие исследования как структуры электромагнитного поля ближней зоны, так и особенностей его взаимодействия с облучаемым биологическим объектом. Методическим выходом из этой проблематичной ситуации является облучение биологических объектов в дальней зоне излучателей, где условия облучения определены более четко: 1) в дальней зоне излучения фронт волны

иг» кг4 1(Г3 10'

Плотность потока поглощенвгой энергии, мВт/см"

Рис.4. Изменение степени ингибирования люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов, активированных опсонизированным зимозаном, в зависимости от плотности потока поглощенной энергии при действии КВЧ-излучения с несущей частотой 41.95 ГГц в ближней (-О-) и дальней (-•-) зонах желобко-вого излучателя, время воздействия 40 мин.

сформирован, и мы имеем дело с поперечной плоской волной; 2) векторы Е и Н ортогональны между собой и ортогональны направлению распространения волны. В отличие от ближней зоны в дальней зоне имеется только бегущая волна; 3) компоненты векторов Е и Н в дальней зоне убывают обратно пропорционально первой степени расстояния от антенны и их соотношение постоянно, в то время как в ближней зоне преобладает энергия электрического поля; 4) в дальней зоне согласование излучения с нагрузкой в основном определяется параметрами самой нагрузки, в отличие от ближней зоны, где сильно сказывается влияние самой антенны.

III. Биологические эффекты модулированного ЭМИ КБ Ч низкой интенсивности

В настоящее время накоплено большое количество экспериментальных данных о влиянии ЭМИ КВЧ на биологические объекты, но механизмы его действия до сих пор не ясны. Также остается открытым вопрос и о природе первичного сенсора крайне высоких частот. Однако, независимо от его природы, действие ЭМИ можно рассматривать на уровне систем внутриклеточной регуляции. В любой живой клетке одновременно идут сложные биохимические реакции, охваченные положительными и отрицательными обратными связями. Многие из систем клеточной регуляции имеют нелинейный колебательный характер. Живая клетка в определенных состояниях может оказаться высокочувствительной к воздействию ЭМИ, модулированного определенными частотами. В случае совпадения частоты модуляции и характеристической частоты конкретного биохимического процесса возможно целенаправленно управлять теми или иными физиологическими функциями клетки.

Влияние модулированного ЭМИ на двигательную активность парамеций

Экспериментальные исследования выявляют резонансные эффекты немоду-лированного ЭМИ КВЧ для ряда биологических объектов [Ве1уаеу й а1., 1992], в том числе на частотах близких к 42 ГГц при нетепловых плотностях потока мощности [Катаев и др., 1993; Гарибов и Островский, 1990]. Достоверно показано, что при воздействии на живые системы электромагнитным полем наблюдается изменение баланса ионов кальция в различных клетках животных [А(1еу, 1988; \Valleczek, 1992]. В связи с этим мы поставили задачу исследовать, возможно ли путем действия модулированным ЭМИ КВЧ влиять на двигательную активность парамеций.

При действии ЭМИ в режиме непрерывной генерации в широком диапазоне плотности потока поглощенной энергии (от единиц микроватт/см2 до десятков милливатт/см2) и несущей частоты (от 37.6 до 53.4 ГГц, шаг по частоте 200 МГц) изменения индекса подвижности клеток не наблюдалось (п=160). В качестве иллюстрации на рис.7 показана точка 2, соответствующая действию КВЧ-излучения с ПППЭ 20 мВт/см2 при непрерывной генерации на частоте 42.2 ГГц (п=10). Эффект непрерывного излучения на регистрируемый нами параметр двигательной активности клеток полностью отсутствовал (р<0.05).

Мы предположили, что более эффективное действие на двигательную активность клеток может оказывать излучение, модулированное частотами, характерными для колебательных биохимических и физиологических реакций живых клеток. В серии экспериментов (п=30) при использовании несущей частоты 42.2 ГГц с импульсной модуляцией меандром с частотами 0.05, 0.25, 0.5, 1, 8 и 16 Гц и

ПППЭ излучения от 0.1 мВт/см2 до 20 мВт/см2 изменение индекса подвижности клеток зарегистрировано не было. Однако при использовании импульсной модуляции с частотой около 0.1 Гц (период около 10 сек) и ПППЭ 0.1 мВт/см2 мы наблюдали уменьшение индекса подвижности клеток. На рис.5 показана зависимость ингибирования двигательной активности парамеций от частоты модуляции при фиксированной несущей частоте 42.2 ГГц и ПППЭ излучения 0.1 мВт/см2. Максимальная величина эффекта наблюдается при частоте модуляции fM = 0.0956 Гц, а полуширина кривой AfM = 0.005 Гц. Полученная экспериментальная зави-

Частота модуляции, Гц Несущая частота, ГГц

Рис.5. Зависимость ингибирования Рис.б. Изменение двигательной

двигательной активности клеток активности клеток Paramecium caudatum Paramecium caudatum от частоты при действии модулированного КВЧ-модуляции КВЧ-излучения (несущая излучения в зависимости от несущей частота 42.2 ГГц, ПППЭ 100 мкВт/см2). частоты (частота модуляции 0.0956 Гц,

ПППЭ 10 мВт/см2).

симость хорошо аппроксимируется кривой нормального распределения Гаусса-Лапласа, отношение fu/^u = 20.

Для определения зависимости величины полученного эффекта от несущей частоты мы исследовали действие излучения в узком диапазоне несущих частот от 42.0 до 42.5 ГГц при фиксированной частоте модуляции 0.0956 Гц. ПППЭ была в 100 раз выше, чем в ранее описанной серии экспериментов, и равнялась 10 мВт/см2. Такие условия были выбраны для того, чтобы исключить возможные неконтролируемые частотно-мощностные эффекты при сканировании несущей частоты, т.е. работать на участке кривой 1 (рис.7), где эффект не зависел от ПППЭ излучения. Было показано, что ингибирование двигательной активности парамеций зависит от несущей частоты излучения (рис.6). Эффект проявляется в узкой области несущих частот и может быть представлен кривой нормального распределения Гаусса-Лапласа. Максимальный эффект наблюдается на частоте fH = 42.25 ГГц, полуширина кривой AfH = 200 МГц, отношение f„/AfH = 200.

Таким образом, нами выявлена сильная узкополосная зависимость эффекта от частоты импульсной модуляции и от несущей частоты КВЧ-излучения. Вне зависимости от конкретного механизма эти результаты могут быть формально предстаалены как двойной резонанс на несушей и модулирующей частотах.

При исследовании действия ЭМИ КВЧ на двигательную активность парамеций при различных ПППЭ излучения была обнаружена S-образная зависимость величины эффекта от ПППЭ (рис.7, кривая 1). Начиная с ПППЭ около 0.1 мВт/см2, величина эффекта слабо меняется с увеличением средней мощности излучения на несколько порядков. При средней ПППЭ излучения более 100 мкВт/см2 получено достоверное отличие изменения индекса подвижности клеток от уровня контроля (р<0.05).

Прямое измерение температуры с помощью микротермопары при выключенном термо-статировании показало, что температура раствора в экспериментальной системе во время облучения с ПППЭ до 3 мВт/см2 не отличается от температуры в контрольных условиях без облучения. Изменение температуры при увеличении ПППЭ на 1 мВт/см2 составляет 0.065°С. В модельной системе прямой нагрев на 1-1.5°С с помощью инфракрасного излучения, модулированного частотой 0.0956 Гц, дает слабый кратковременный эффект другого знака. Таким образом, обнаруженный эффект двойного резонанса не обусловлен тепловым действием ЭМИ КВЧ.

Поскольку одним из возможных путей влияния на двигательную активность парамеций является изменение трансмембранных потоков ионов кальция [Saimi, 1986], мы проверили, каким образом модель откликается на увеличение [Ca2+]j при действии кальциевого ионофора А23187 [Doughty, 1988]. Увеличение [Са2+]; у парамеций вызывает деполяризацию мембраны, что приводит к уменьшению регистрируемого индекса подвижности клеток. 50% уменьшение индекса подвижности клеток было получено при концентрации ионофора 1.8 мкМ.

Сравнивая ответы парамеций на действие кальциевого ионофора А23187 и КВЧ-излучения, можно отметить, что эффекты качественно совпадают. Под действием ЭМИ КВЧ с частотой 42.2 ГГц, модулированного частотой около 0.1 Гц, и ПППЭ более 1 мВт/см2 двигательная активность клеток за .12 минут облучения уменьшается приблизительно на 25%. Подобный эффект соответствует действию кальциевого ионофора А23187 с концентрацией около 1 мкМ. Таким образом, смена модели поведения клеток под действием КВЧ-иалучения может быть обусловлена изменением баланса внутриклеточной концентрации ионов кальция. Модулированное определенной частотой КВЧ-излучение может влиять на осцилляции внутриклеточного кальция или их вызывать. В ряде работ показано, что характерный период колебаний кальция имеет порядок 5-100 секунд [Berridge, 1991;

Ю"3 1(Гг 10-' 10° 10' ю2 Плотность потока поглощенной энергии, мВт/см2

Рис.7. Кривая 1 - ингибирование двигательной активности клеток Рагаппесшт саисЫит (%) в зависимости от плотности потока поглощенной энергии при действии модулированного КВЧ-излучения (частота модуляции 0.0956 Гц, несущая частота 42.2 ГГц). Точка 2 - изменение двигательной активности клеток при действии КВЧ-излучения с непрерывной генерацией на частоте 42.2 ГГц (ПППЭ 20 мВт/см2. Усреднение для каждой точки произведено по десяти независимым экспериментам.

Cobbold et al, 1991J. Наблюдаемый в наших экспериментах резонанс на частоте модуляции около 0.1 Гц попадает в этот диапазон. Однако трудно объяснить, почему полоса эффективного действия модуляции КВЧ-излучения оказывается очень узкой (AfM = 0.005 Гц). Наблюдаемые осцилляции концентрации ионов ци-тозольного кальция в различных живых клетках не яатяются строго фиксированными по частоте, которая может изменяться даже в процессе одного эксперимента [Cobbold et al., 1991].

Как видно из приведенных данных, по результатам действия на биологический объект модулированное иатучение оказывается более эффективным. Полученный эффект двойного резонанса позволяет обосновать, с одной стороны, не только поиск эффективных несущих частот ЭМИ, но и частот модуляции, с другой стороны, подтверждает предположение о высокой чувствительности биологических систем именно к модулированным ЭМИ КВЧ.

Влияние модулированного ЭМИ на активность перитонеальных нейтрофиюв

Практический интерес представляют исследования эффектов модулированного ЭМИ КВЧ на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами при респираторном взрыве как на функционачьную реакцию клеток иммунной системы теплокровных животных. Возможно ли подобрать комбинации несушей и модулирующей частот излучения, способных модифицировать функционирование внутриклеточных сигнальных систем ?

Нами показано, что низкоинтенсивное ЭМИ КВЧ икгибирует продукцию АФК при активации нейтрофилов опсонизированным зимозаном (рис.3). Однако анализ действия ЭМИ на эту многокомпонентную реакцию, включающую в себя взаимодействие лиганда с рецептором, активацию внутриклеточных сигнальных систем и НАДФН-оксидазы, довольно сложен. Поэтому дальнейшие исследования действия излучения на нейтрофилы были проведены на упрощенной модели.

Известно, что активация рецептора вызывает в первую очередь мобилизацию внутриклеточного кальция и затем быструю активацию протеинкиназы С (ПКС), которая осуществляет фосфорилирование белков НАДФН-оксидазного комплекса (Theten et al., 1993]. Показано, что при одновременной активации ПКС и кальциевой мобилизации специфическими внутриклеточными мессенджерами, диацилглицеролом (ДАТ) и инозитол-1,4,5-трифосфатом, наблюдается усиленный физиологический ответ нейтрофила в выбросе лизосомальных ферментов и супероксида, в активации НДЦФН-оксидазьг [Badwey & Kamovsky, ¡986; Nishizuka, 1992]. При одновременном действии на клетки катьциевого ионофора А23187, повышающего внутриклеточную концентрацию Са2+ ICampbell & Hallet, 1983] и форболового эфира, активирующего ПКС, минуя рецепторный путь [Nishizuka, 1992], развивается усиленный ответ клетки, значительно превышающий активацию нейтрофила при действии каждого из этих агентов в отдельности (рис.8). В литературе это явление известно как синергизм. Модель синергиче-ского действия кальциевого ионофора А23187 и ФМА далее использовалась нами для исследования эффектов ЭМИ КВЧ на нейтрофилы.

При облучении интактных нейтрофилов и последующей их активации ФМА или кальциевым ионофором А23187 хемилюминеспентные ответы облученных и необлученных нейтрофилов не отличались друг от друга.

Коэффициент синергизма определялся нами как отношение продукции АФК клетками, активированными ФМА на фоне А23187, к продукции АФК нейтрофи-

100 200 300 400 500 600 Время, с

0.1 1 10 [А23187], мкМ

Рис.9. Зависимость отношения коэффициентов синергизма для облученных (в)) и контрольных (5С) нейтро-филов от концентрации А23187. Концентрация ФМА 1 мкМ. Непрерывная генерация, {„=41.95 ГГц, ПППЭ 100 мкВт/см2. Каждая точка на графике представляет среднее значение (N>10) и доверительный интервал (р<0.05).

Рис.8. Оригинальные записи уровня люминол-зависимой хемилюминесцен-ции от суспензии нейтрофилов, активированных ФМА (1 мкМ). 1 - интенсивность ХЛ-Л интактных клеток, 2 и 3 -ХЛ-Л клеток, предварительно обработанных А23187 (7.5 мкМ). 1 и 2 -необлученные клетки; 3 - облученные клетки (непрерывная генерация, {„=41.95 ГГц, ПППЭ 100 мкВт/см2).

лами, активированными только ФМА. Мы исследовали изменение коэффициента синергизма при действии ЭМИ с частотой 41.95 ГГц при концентрациях А23187 от 50 нМ до 20 мкМ (рис.9). В интервале концентраций А23187 от 0.1 до 20 мкМ зависимость коэффициента синергизма для облученных и необлученных клеток имеет колоколообразную форму с максимальным значением около 2.7-3 при концентрации ионофора 2 мкМ.

Оценка эффекта ЭМИ КВЧ по отношению коэффициентов синергизма облученных и необлученных клеток (рис.9) показывает, что в области концентраций А23187 от 50 нМ до 2 мкМ отношение коэффициентов синергизма близко к 1, т.е. эффект ЭМИ не наблюдается. Достоверные различия коэффициентов синергизма облученных непрерьгрным ЭМИ КВЧ (41.95 ГГц) и необлученных клеток (рис.9) обнаруживаются при высоких концентрациях А23187 (выше 3 мкМ), на фоне которых в клетке создается повышенный, поддерживаемый в течение времени облучения, уровень свободного кальция (более 200 нМ). В этих условиях ионофор обеспечивает мобилизацию, на ранних временах, и ионофорный перенос, в течение всего времени действия. Коэффициент синергизма является отражением активности Са2"1"- и ПКС-зависимых процессов, ведущих к активации респираторного взрыва. Известно, что в нейтрофилах основным рецептором для ФМА является ПКС. ФМА, подобно ДАГ, вызывает транслокацию растворимой цитоплазматической ПКС в мембранную фракцию. При интенсивной деградации фосфолипидов требуются более низкие концентрации кальция для активации фермента. Полученные изменения коэффициента синергизма нейтрофилов при действии излучения могут быть следствием усиления деградации фосфолипидов, изменения внутриклеточной концентрации кальция или изменения аффинности ферментов, включая ПКС, для Са2+. В любом случае, эффект ЭМИ КВЧ на про-

о

дукцию активных форм кислорода, как показано, опосредован увеличением [Са2+], и активацией протеинкиназы С.

Для дальнейшего исследования эффектов ЭМИ на синергическую реакцию кальциевого ионофора А23187 и ФМА в активации респираторного взрыва в нейтрофилах мы выбрали узкий диапазон концентраций А23187 от 5 до 7 мкМ, где наблюдалось стабильное ингибирование реакции синергизма на 25-30% под действием непрерывного излучения с частотой 41.95 ГГц.

Величина эффекта ЭМИ КВЧ на синергическую реакцию при фиксированной несущей частоте излучения 41.95 ГГц имеет 8-образную зависимость от плотности потока поглощенной энергии в дальней зоне желобкового излучателя.

30 25 20 15 10 5 0

41.7 41.8 41.9 42.0 42.1 42.2 Несущая частота, ГГц

0 0.1 1.0 10.0 Частота модуляции, Гц

Рис.10. Ингибирование люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофи-лое в синергической реакции А23187 и ФМА в результате действия непрерывного ЭМИ КВЧ в зависимости от несущей частоты излучения (ПППЭ 50 мкВт/см2).

Рис.11. Модификация продукции активных форм кислорода нейтрофилами в результате действия модулированного ЭМИ КВЧ (несущая частота 41.95 ГГц, ПППЭ 50 мкВт/см2). Точка НГ - эффект непрерывного излучения с несущей частотой 41.95 ГГц.

Как и в случае действия излучения на активацию нейтрофилов опсонизирован-ным зимозаном (рис.4), половина величины эффекта достигается при ПППЭ около 1 мкВт/см2. В диапазоне' ПППЭ от 5 до 100 мкВт/см2 величина эффекта меняется слабо и в. среднем составляет около 22%.

Исследование действия непрерывных ЭМИ КВЧ в узком частотном диапазоне (41.75-42.15 ГГц) на реакцию синергизма кальциевого ионофора А23187 и ФМА в нейтрофилах показало высокую селективность систем связанных биохимических реакций, участвующих в активации респираторного взрыва, к несущей частоте излучения (рис.10). При несущей частоте излучения 41.95 ГГц обнаружено максимальное ингибирование синергической реакции около 25%, достоверно отличающееся от эффекта ЭМИ КВЧ для других несущих частот. Величина эффекта плавно спадает почти до нуля при увеличении либо уменьшении несущей частоты в узком частотном диапазоне. Однако идентифицировать сенсор крайне высоких частот в настоящее время представляется довольно сложным. С другой стороны, в клетке протекают квазипериодические процессы, характерные частоты которых могут лежать в низкочастотной области (0-100 Гц) [Jackson, 1985]. Следовательно, используя модулированное ЭМИ КВЧ, можно попытаться

целенаправленно воздействовать на системы ферментативных реакций, характеристические частоты которых близки к частоте модуляции ЭМИ.

Мы исследовали влияние низкоинтенсивкого (ПППЭ 50 мкВт/см2) модулированного ЭМИ КВЧ на активность перитонеальных нейтрофилов в синерги-ческой реакции кальциевого ионофора А23187 (5-7 мкМ) и форболового эфира ФМА (1 мкМ). Клетки облучали в дальней зоне желобковой антенны в течение 20 минут. При воздействии излучения с несущей частотой 41.95 ГГц и частотами амплитудной модуляции 0.5, 2, 4 и 8 Гц достоверно значимого эффекта на синер-гическую реакцию обнаружено не было (рис.11).

Однако, синергическая реакция усиливалась на 10% при частоте модуляции 1 Гц и ;ц:г::б;;ровалась на 16-20% при частотах модуляции 0.1- 16 и 50 Гц. Из рис.11 видно, что частота модуляции 1 Гц при фиксированной несущей частоте 41.95 ГГц является критической. В отличие от непрерывной генерации на частоте

Несущая частота, ГГц Частота модуляции, Гц

Рис.12. Модификация продукции ак- Рис.13. Модификация продукции

гивных форм кислорода нейтрофилами в активных форм кислорода нейтрофилами зависимости от несущей частоты излуче- в результате действия модулированного ния при фиксированной частоте модуля- ЭМИ КВЧ (несущая частота 41.85 ГГц, ции 1 Гц. В области частот 41.8-41.9 ГГц ПППЭ 50 мкВт/см2). Точка НГ - эффект - ингибирование, а в области частот 41.9- непрерывного излучения с несущей 42.05 ГГц - активация синергической ре- частотой 41.85 ГГц. акции. Точка НГ - эффект непрерывного излучения с несущей частотой 41.95 ГГц.

41.95 ГГц, где было обнаружено ингибирование ХЛ нейтрофилов на 25%, при модуляции излучения с частотой 1 Гц наблюдается активация синергической реакции на 10%, т.е. обнаруживается эффект другого направления.

При использовании фиксированной частоты модуляции 1 Гц была обнаружена нелинейная зависимость величины эффекта от несущей частоты излучения (рис.12). Установлены области частот 41.95-42.05 ГГц, где наблюдалась активация синергической реакции, и 41.8-41.9 ГГц, где было обнаружено ингибирование. Интересно было проверить, каким образом зависит эффект ЭМИ КВЧ на синер-гическую реакцию А23187 и ФМА в нейтрофилах от частоты модуляции излучения при другой несущей частоте 41.85 ГГц, выбранной из области частот, где наблюдалось ингибирование синергической реакции при частоте модуляции 1 Гц.

Эксперименты с использованием несущей частоты 41.85 ГГц при частотах модуляции от 0.1 до 50 Гц показали, что величина эффекта нелинейно зависит от частоты модуляции (рис.13) как и для несущей частоты 41.95 ГГц (рис.11). Однако зависимости, показанные на рис.11 и рис.13, принципиально различны. Если в случае действия излучения с несущей частотой 41.95 ГГц с увеличением частоты модуляции, начиная с 1 Гц, наблюдается постепенная смена знака эффекта ЭМИ от активации около 10% до ингибирования около 21%, то при несущей частоте 41.85 ГГц существует обратная тенденция: начиная с частоты модуляции 1 Гц, эффект меняет знак от ингибирования около 16% до активации 10%.

Система связанных биохимических реакций, участвующих в продукции АФК нейтрофилами, включает процессы активации ПКС, фосфорилирование белков в том числе НАДФН-оксидазы, конформационные изменения ферментов, изменения их свойств связывания и внутриклеточного распределения, а также ряд других процессов. Из анализа данных, представленных на рис.10-13, следует, что мишенью действия модулированного ЭМИ может быть система или системный комплекс, высокоселективный к несущей частоте излучения 41.95 ГГц и частоте модуляции 1 Гц. Как правило, действие ЭМИ с этими частотами оказывается для системы критическим, в частности, при несущей частоте 41.95 ГГц и частоте модуляции 1 Гц эффект меняет направление. При облучении нейтрофилов с другой несущей частотой 41.85 ГГц происходит усиление ингибирования синергической реакции при модуляции с частотой 1 Гц, а с увеличением частоты модуляции наблюдается тенденция сначала к снятию эффекта ингибирования, а затем к активации синергической реакции. Таким образом, синергическая реакция А23187 и ФМА в нейтрофилах ингибируется либо активируется в зависимости от определенной комбинации несущей и модулирующей частот ЭМИ КВЧ, что указывает на высокую селективность и чувствительность систем связанных биохимических реакций, участвующих в активации респираторного взрыва, к несущим и модулирующим частотам излучения.

Совокупность экспериментальных данных по действию модулированного ЭМИ КВЧ на одноклеточные простейшие Paramecium caudatum и перитонеаль-ные нейтрофилы доказывают возможность дистантного управления функциями клеток иммунной системы (нейтрофилов) с помощью низкоинтенсивного модулированного ЭМИ КВЧ. Управление осуществляется на уровне систем биохимических реакций, включенных в процесс генерации активных форм кислорода нейтрофилами при респираторном взрыве. Возможно, что вызванные ЭМИ изменения являются результатом интенсификации деградации фосфолипидов, изменения концентрации внутриклеточного кальция или изменения сродства белков, включая протеинкиназу С, к ионам кальция. Характер действия ЭМИ КВЧ на нейтрофилы сильно зависит от несущей и модулирующей частот, что говорит о возможности влияния определенной комбинации этих частот на определенные звенья трансдукции внутриклеточного сигнала при активации нейтрофилов. Доказательством служит тот факт, что при облучении клеток в условиях непрерывной генерации нами было обнаружено только ингибирование синергической реакции А23187 и ФМА, а при действии на клетки модулированного излучения был получен эффект как активации, так и ингибирования синергической реакции.

Полученные результаты могут служить основой для дальнейшего исследования механизмов действия ЭМИ на клеточном уровне. Задачей будущих исследований должно стать выявление отдельных ферментов или ферментативных реакций, чувствительных к определенным несущим и модулирующим частотам ЭМИ. Основные функции нейтрофилов достаточно хорошо изучены. Существуют из-

вестные методы ингибиторного и активаторного фармакологического анализа для определения роли отдельных экстра- и внутриклеточных компонентов, контролирующих активность нейтрофила. Имеются литературные данные о функционировании ключевых ферментов трансдукции рецепторного сигнала, роли внутри- и экстраклеточного пулов кальция и кальциевой мобилизации. Мы полагаем, что на основе результатов математического моделирования можно определить и экспериментально проверить оптимальные режимы воздействия низкоинтенсивного модулированного ЭМИ КВЧ на работу ферментных систем, участвующих в формировании респираторного взрыва в нейтрофилах. Основываясь на полученных результатах, возможно создание моделей активированного нейтрофила для дальнейшего исследования эффектов ЭМИ, в частности для скрининга частот модуляции излучения (от 0 до 1 кГц) с целью выявления наиболее эффективных режимов облучения. Результаты анализа данных могут быть использованы для дальнейшего совершенствования биохимических моделей и для целенаправленного воздействия на функции нейтрофилов.

ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнительное тестирование трех типов антенн: разработанного на основе желобкового волновода желобкового излучателя, рупорной и диэлектрической антенн. Показано, что в отличие от рупорной и диэлектрической антенн желобковый излучатель обеспечивает однородное распределение УПМ в плоскости объекта, что позволяет использовать его для облучения биологических объектов в ближней и в дальней зонах антенны.

2. Обнаружен квазирезонансный эффект ингибирования респираторного взрыва в нейтрофилах непрерывным ЭМИ КВЧ в ближней зоне желобкового излучателя. В дальней зоне антенны частотная зависимость, не обнаружена. Теоретический анализ приводит к выводу, что различие в частотных зависимостях биологического эффекта в ближней и дальней зонах антенны обусловлено принципиальным отличием структуры и характера ЭМП в этих зонах. Проблема распределения электромагнитного поля в ближней зоне излучения требует дальнейших детальных исследований, поэтому целесообразно проводить облучение биологических объектов в дальней зоне антенн, где структура поля имеет более определенный характер.

3. При воздействии модулированного ЭМИ КВЧ на парамеции обнаружен эффект двойного резонанса по несущей и модулирующей частотам излучения в ингибировании двигательной активности клеток.

4. Синергическая реакция кальциевого ионофора А23187 и форболового эфира в активации респираторного взрыва перитонеальных нейтрофилов ингиби-руется либо активируется в зависимости от комбинации несущей и модулирующей частот ЭМИ КВЧ, что указывает на высокую селективность связанных систем биохимических реакций, участвующих в активации респираторного взрыва, к несущим и модулирующим частотам излучения.

5. На двух биологических объектах.- парамециях и нейтрофилах - показано, что при смене режима действующего ЭМИ от непрерывного к модулированному принципиально меняется функциональный ответ облучаемых клеток. Полученные результаты служат доказательством гипотезы о влиянии ЭМИ КВЧ на пути внутриклеточной сигнализации, а также показывают возможность дистантного управления функциями различных клеток путем воздействия модулированным

эми. 4

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гапеев А.Б., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е., Храмов Р.Н. Двойное резонансное действие модулированных миллиметровых волн на двигательную активность одноклеточных простейших Paramecium caudatum. ДАН, 1993, т.332, N 4,

. с.515-517.

2. Gapeev А.В., Chemeris N.K., Fesenko Е.Е., Kliramov R.N. The phenomenon of double resonance effect of modulated millimeter waves on the motor activity of protozoa Paramecium caudatum. In: Proceedings of the 2nd International scientific meeting "Microwaves in Medicine 1993", Rome, 11-14 October 1993, p.207-210.

3. Гапеев А.Б., Чемерис H.K., Фесенко E.E., Храмов Р.Н. Влияние модулированного КВЧ поля низкой интенсивности на двигательную активность одноклеточных простейших. Тез. докл., представленных на 3(16) съезд физиологического общества при РАН. Успехи физиологических наук, 1994, т.25(1), с.98.

4. Гапеев А.Б., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е., Храмов Р.Н. Резонансные эффекты модулированного КВЧ поля низкой интенсивности. Изменение двигательной активности одноклеточных простейших Paramecium caudatum. Биофизика, 1994, т. 39, вып. 1, с. 74-82.

5. Гапеев А.Б., Сафронова В.Г., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Модификация активности перитонеальных нейтрофилов мыши при воздействии миллиметровых волн в ближней и дальней зонах излучателя. 1996, Биофизика, т. 41, вып. 1, с. 205-219.

6. Gapeyev А.В., Chemeris N.K. Effect of modulated millimetre waves on synergistic reaction of calcium ionophore and phorbol ester in the mouse neutrophils. Abstracts of the III International Congress of EBEA 1996, 29 Februaiy-3 March, Nancy, France.

7. Gapeyev A.B., Safronova V.G., Chemeris N.K., Fesenko E.E. Different effect of millimetre wave radiation on the mouse neutrophils in near field and far field zones of radiator. Abstracts of the III International Congress of EBEA 1996, 29 February -3 March, Nancy, France.

8. Safronova V.G., Gapeyev A.B., Alovskaya A.A., Zinchenko V.P., Chemeris N.K. Inhibition of synergistic influence of calcium ionophore and phorbol ester in the mouse neutrophils by millimetre waves. Abstracts of the III International Congress of EBEA 1996, 29 February - 3 March, Nancy, France.

9. Аловская А.А., Габдулхакова А.Г., Гапеев А.Б. Миллиметровые волны подавляют реакцию синергизма кальциевого ионофора А23187 и форболового эфира в нейтрофилах. Городская научная конференция молодых ученых, тезисы докладов, стр.10, Пущино, 15-17 мая 1996.

10. Якушина B.C., Гапеев А.Б. Воздействие модулированных миллиметровых волн низкой интенсивности на активность перитонеальных нейтрофилов мыши. Городская научная конференция молодых ученых, тезисы докладов, стр.104, Пущино, 15-17 мая 1996.

11. Gapeyev А.В., Safronova V.G., Chemeris N.K., Fesenko E.E., Inhibition of production of reactive oxygen species in mouse peritoneal neutrophils by millimeter wave radiation in the near and far field zones of the radiator. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1996 (in press).

12. Сафронова В.Г., Гапеев А.Б., Аловская А.А., Габдулхакова А.Г., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Миллиметровые волны ингибируют синергический эффект кальциевого ионофора А23187 и форболового эфира в активации респираторного взрыва нейтрофилов. Биофизика, 1996 (в печати).