Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли ионов Са2+ и Са2+- зависимыхсистем внутриклеточной сигнализации в эффектахэлектромагнитного излучения крайне высокой частотына респираторный взрыв нейтрофилов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли ионов Са2+ и Са2+- зависимыхсистем внутриклеточной сигнализации в эффектахэлектромагнитного излучения крайне высокой частотына респираторный взрыв нейтрофилов"

б од

1 4 ДЕК 1998

На правах рукописи

Аловская Алла Анатольевна

Исследование роли ионов Са2+ и Са2+ - зависглых систем внутриклеточной сигнализации в эффектах электромагнитного излучения крайне высокой частоты на респираторный взрыв нейтрофилов.

Биофизика 03.00.02

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

г.Пущино 1998

Работа выполнена в Институте биофизики РАН

Научные руководители:

Доктор биологических наук, Чемерис Н.К.

Кандидат биологических наук, Сафронова В.Г.

Офииальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Леднев В.В. Доктор биологических наук, Новоселова Е.Г.

Ведущая организация - Филиал Института Биоорганической Химии им. М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ФИБХ) РАН, г.Пушино.

Зашита состоится ¿2//£.9f в час на заседании диссертационо совета Д 200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 1422S г.Пушино, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ PAI г.Пущино.

Автореферат разослан "<£/ " II. 1998

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических на'

У

Т.И. Смолихина

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Биологические эффекты низкоинтенсивного шектромагнитного излучения крайне высоких частот (ЭМИ КВЧ) широко юследуются в настоящее время. Клинические исследования влияния ЭМИ КВЧ m течение различных заболеваний показывают, что КВЧ-терапия оказывает -шмунорегулирующее действие при онкологических заболеваниях, при зоспалительных процессах нормализует лейкоцитарный индекс, снимает шгергические реакции на лекарственные препараты. Наиболее значительный терапевтический эффект наблюдали при действии ЭМИ КВЧ на течение воспалительных процессов [Девятков Н.Д., Бецкий О.В., 1987].

Четкого представления о физико-химических механизмах действия КВЧ излучения на биологические системы на сегодняшний день нет, оно находится в ладии формирования. Существует ряд гипотез: гипотеза когерентных возбуждений и взаимодействий, объясняющая резонансное запасание энергии ЭМИ КВЧ апологическими объектами [Fröhlich H., 1988]; гипотеза о сслитонном механизме передачи энергии, причем, возбуждению солитонов сопутствует появление когерентных состояний по Фрелиху [цит. по Девяткову Н.Д., 1985]; информационная гипотеза [Девятков Н.Д., 1991], и некоторые другие, например, связывающие действие ЭМИ КВЧ с эффективным поглощением энергии ЭМИ КВЧ молекулами воды [Новскова ТА и др., 1996]. Также нет ясности в вопросе о природе сенсора ЭМИ КВЧ в клетках. Большинство работ по исследованию биологического действия ЭМИ КВЧ посвящено изучению частотных зависимостей, характеризующих изменение структурно-функционального состояния клетки при действии ЭМИ КВЧ [Lednyiczky G. et al, 1995, 1996; Хоменко А.Г. и др., 1995; Гапеев А.Б. и др., 1994, 1996]. При этом роль вторичных мессенджеров, реализующих изменение клеточного метаболизма вследствие действия ЭМИ КВЧ, остается неопределенной.

В работе [Eicwald С. & Wallcczek J., 1996] обсуждается, что к ЭМИ крайне низких частот более чувствительны активированные, а не покоящиеся клетки. В то же время с позиции информационной теории взаимодействия ЭМИ КВЧ с биологическими системами [Девятков Н.Д., 1991] влияние ЭМИ КВЧ низкой интенсивности на нормально работающую клетку несущественно; в том случае, если функционирование клетки нарушено, даже слабые внешние воздействия могут менять ее метаболический профиль [Голант М.Б., 1985]. Возможно, что иммуномодулирующее действие ЭМИ КВЧ при патологиях направлено именно на клетки с измененным функциональным статусом. Однако, специальных исследований взаимосвязи эффекта ЭМИ КВЧ и функционального состояния иммунных клеток не проводилось.

Цель и основные задана исследования. Цель работы заключалась : определении роли ионов кальция и фосфолипазы А2 в перестройке метаболизм; нейтрофила при действии ЭМИ КВЧ; исследовании взаимосвязи эффекта ЭМ£ КВЧ и функционального состояния клетки.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

Разработать и проанализировать экспериментальную модель активащи респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и форболовьн. эфиром для изучения реактивного потенциала клетки и исследования взаимосвязи функционального состояния клетки и эффектов ЭМИ КВЧ:

определить эффективность кальциевых ионофоров А23187, иономнцина, А23187-4В1 в активации респираторного взрыва нейтрофилов и т реализации эффектов ЭМИ КВЧ;

- провести сравнительный анализ способности кальциевых ионофоров А23187, иономнцина, А23187-4Вг повышать концентрацию свободного внутриклеточного кальция ([Са2+]ц„);

- определить роль входа ионов кальция из внешней среды и мобилизации ионов кальция" из внутриклеточных депо в активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором. Исследовать роль этих двух пулов кальция в реализации действия ЭМИ КВЧ.

- исследовать роль фосфолипазы А2 и продуктов арахидоновой кислоты (АК) в активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и форболовым эфиром и реализации эффектов ЭМИ КВЧ;

Научная новизна. Впервые проведено исследование взаимосвязи эффекта ЭМИ КВЧ и функционального состояния нейтрофилов. Показано, что эффект ЭМИ КВЧ наблюдается при активном статусе фосфолипазы А2 и реализуется с участием продуктов окисления арахидоновой кислоты по эпоксигеназному пути при наличии Са2+ во внешней среде. Впервые проведено сравнительное исследование эффективности известных кальциевых ионофоров А23187, иономицина, А23187-4Вг в изменении [Са2+]цит и обеспечении физиологического ответа нейтрофилов. Показано, что физиологическая реакция определяется не только ионофорными свойствами данных соединений, но и способностью вызывать мобилизацию Са2+. Предложены возможные механизмы регуляциу метаболизма нейтрофилов в зависимости от их функционального состояния.

Научно -практическая ценность. Результаты работы вносят существенный вклад в решение проблемы, касающейся механизмов регуляции клеточного метаболизма при действии ЭМИ КВЧ; разработанная модель последовательной активации кальциевым ионофором и ФМА респираторного взрыва нейтрофилов позволяет изучать реактивный потенциал клеток при действии различных факторов внешней среды.

Ллрвбацая работы. Материхты диссертации были представлены на I и III Путинских конференциях молодых ученых (Пущино, май 1996; Пущино, май 199S); на I Международном симпозиуме "Фундаментальные науки и альтернативная медицина" (Пущино, сентябрь 1997), на международных конференциях: 41nd Annual Meeting of the Biophysical Society (New Orlean, Louisiana, USA,. 1997), Third International Congress ЕВЕЛ (Nansy, 1996).

ПуПлвкегрся. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 4 статьи.

Структура и обыл: дисссртгц'оа. Диссертационная работа изложена на страницах, включает /J рисунков и 2 таблицы; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных экспериментальных данных и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы содержит i ссылок.

Список сокращений. ЭМИ КВЧ - электромагнитное излучение крайне высокой частоты, ЭМИ КНЧ - электромагнитное излучение крайне низкой частоты, АФК - активные формы кислорода, ХЛ - хемилюминесценция, [Са2+]цит - концентрация ионов кальция в цитозоле, ФМА - форбол 12-миристат 13-ацегат, ДАГ - диацилглицернн, ITICC - протеинкиназа С, ЭПР - эндоплазматический ретикулум. АК - арахидоновая кислота, ФЛА2 - фогфолипаза А?, БФБ - 4 -бромофенацил бромид, JITB4 - лейкстриен D4, ФЛС - фосфолипаза С.

Материалы и истоды.

Работа выполнена на перитонеальных вызванных нейтрофилах мыши линии NMRI. Функциональную активность клеток оценивали по продукции активных форм кислорода (АФК) методом люминал-зависимой хемшпоминесценции (ХЛ). Уровень свободного кальция в цитозоле ([Са2+]цит) измеряли по флуоресценции внутриклеточного зонда Fura-2AM. Нейтрофллы нреинкубировали с кальциевыми ионе порами: А23187, иономицином или А23187-4Вг в разных концентрациях при комнатной температуре 20-22°С или при 37°С в течение 1, 10 или 20 мин, затем регистрировали изменение интенсивности ХЛ в ответ на добавление форбол 12-миристат 13-ацетата (ФМА) в концентрации 1 цМ при 37°С. Облучение проводили при комнатной температуре 20-22°С на фоне одного из кальциевых ионофоров в течение 20 мин. Условия облучения: постоянное ЭМИ с частотой 41.95 ГГц, плотность потока поглощенной энергии составляла 150 цВт/см2. дальняя зона антенны (R=40 см) [Гапеев А.Б. и др., 1996]. После облучения регистрировали изменение ХЛ в ответ на доба&дение ФМА. л концентрации 1 цМ при 37°С.

Результаты н обсуждение.

Раннее было показано, что облучение изолированных нейтрофилов низкоинтенсивными ЭМИ КВЧ (40-42 ГГц) ингибирует продукцию АФК при активации клеток опсонизированным зимозаном [Гапеев А.Б. и др., 1996]. Активация нейтрофилов опсонизированным зимозаном включает такие последовательные стадии как взаимодействие лиганда с рецептором, активацию внутриклеточных сигнальных систем и НАДФН-оксидазы. На каждой из стадий возможна реализация действия ЭМИ КВЧ. Известно, что активация клеток опсонинами может вызывать мобилизацию кальция из внутриклеточных депо и быструю активацию диацилглицерином (ДАГ) протеинкиназы С (ПКС), которая осуществляет фосфорилирование белков НАДФН-оксидазного комплекса, продуцирующего АФК [Маянский АН. и др., 1989]. Обнаруженная модификация стала основой для дальнейшего исследования механизмов взаимодействия ЭМИ КВЧ с клетками. В экспериментальных условиях для увеличения [Са2+]цит используют кальциевые ионофоры и для активации ПКС используют форболовые эфиры, синтетические аналоги ДАГ.

1. Активация респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и ФМА.

Кальциевые ионофоры в низких концентрациях (менее 0.1 цМ А23187 и менее 0.01 цМ иономицин) не изменяют уровень спонтанной ХЛ нейтрофилов, в концентрациях выше указанных они являются слабыми активаторами (рис. 1). Интенсивность респираторного взрыва, вызванного ФМА зависит от концентрации данного агента. Мы выбрали концентрацию ФМА 1 цМ, которая вызывает максимальный ответ нейтрофилов. При совместном действии на нейтрофилы кальциевого ионофора и форболового эфира развивается ответ, многократно превосходящий ответ на ФМА и, тем более, кальциевый ионофор (рис. 1Б). Для оценки вклада кальциевого ионофора в усиление ответа нешрофилов, активированных кальциевым ионофором и ФМА, а так же для удобства анализа и представления результатов, мы ввели коэффициент К, который рассчитывали как отношение

1ыонофор+Фш/1фМЛ>

где Iионофор+фма - суммарная продукция АФК нейтрофилами, последовательно активированными кальциевым ионофором и форболовым эфиром, рассчитанная как площадь под кривой зависимости интенсивности ХЛ от времени за 6 мин, считая от времени подачи форболового эфира.

ч

Н 0.32

|>> е

§ 0.28 в в и

2 0.26

А

- 4

А23187 1/\ 3 1

5

5

5

к о

Б

- / \

«3187 / - г/

ФМА | 1

2 4 6 8 10 0 2.5 5 7.5 10

Время, мнн Время, мни

Рис. 1. Зависимость интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) от времени.

(А) Спонтанная ХЛ нейтрофилов (1) и ХЛ при активации клеток кальциевым ионофором А23187 в концентрациях: 0.1 цМ (2); 0.5 цМ (3); 1 цМ (4); 5 цМ (5). ХЛ регистрировали в среде, содержащей 1 мМ Са2+ при 20 °С.

(Б) ХЛ интактных нейтрофилов (1) и нейтрофилов, активированных А23187 в концентрации 5 цМ (2), ФМА в концентрации 1 цМ (3), последовательно А23187 (5 цМ) и ФМА (1 цМ) (4).

1фш - суммарная продукция АФК нейтрофилами, активированными форболовым эфиром, рассчитанная как площадь под кривой зависимости интенсивности ХЛ от времени за тот же период, что и /„окофор+ФШ.

Рассчитанный коэффициент К показывает во сколько раз изменяет ответ на ФМА присутствие ионофора за указанный промежуток времени. Так как величина коэффициента К зависит от концентрации ионофора (рис. ЗА), то, возможно, предварительная обработка клеток кальциевыми ионофорами в разных концентрациях изменяет их функциональное состояние, что и проявляется в ответе на ФМА.

2. Эффект ЭМИ КВЧ на иейтрофилы в различном функциональном состоянии.

Облучение ЭМИ КВЧ интактных* нейтрофилов не приводило к изменениям их реакции на активирующие воздействия: ответы облученных нейтрофилов на ФМА в концентрации 1 цМ (п=15) и 0.1 цМ (п=15), па кальциевый ионофор А23187 в диапазоне концентраций от 0.01-10 рМ (л=50 для всех концентраций) или на их совместное действие (п=10) достоверно не отличались от ответов необлученных клеток. Существует предположение, что эффект облучения электромагнитными полями крайне низкой частоты либо магнитными полями зависит от "степени клеточной активации" [Е1с1гжаШ С. &

Walleczek J., 1996]. Такая постановка вопроса предлгдагает, что ферменты в облучаемой клетке находятся в активированном состоянии, хоторого можно достигнуть, например, повышением [Са2+]щгг. Возможно, ЭМИ КВЧ также модулирует Са2+-зависимые процессы в клетке, меняя сродство ферментов к Са2+ [Geletyuk V. et al., 1995] иди сдвигая уровень [Са2+]цит [Walleczek J., 1995].

В следующей серии экспериментов мы обрабатывали нейтрофилы кальциевыми ионофорами: А23187, А23187-4Вг, иономицином, чтобы создать повышенный уровень [Са2+]цит, а затем воздействовали ЭМИ КВЧ. Однако, и в этом случае мы не наблюдали достоверных различий в уровне XJI облученных и

Рис. 2. Иигибиросапие продукции АФК нейтрофилов при действии ЭМИ КВЧ.

Нейтрофилы облучали ЗМИ КВЧ (41.95 ГГц,

непрерывная генерация, 150 мкВт/см^) на фоне кальциевых ионофоров: А23187 в концентрации 2 мкМ (2), п=12 и 20 мкМ (4), п= 13; иономицина в кснцетрациях

0.5 мкМ (1) и 0.8 мхМ (3), п=10 при t=20-22°C (1,2) Х=3.0, (3,4) Х=1.0. После прекращения облучения клетки помещали в хемигаоминометр и регистрировали XJI в ответ на ФМА (1 мхМ) при 37°С.

Эффект рассчитывали как процент от контроля указана средняя квадратичная ошибка * - достоверное отличие от контроля

по 95% уровню.

В следующей серии экспериментов после прекращения облучения на фоне кальциевых ионофоров мы использовали ФМА для выявления действия поля.

В присутствии иономицина в разных концентрациях не зарегистрировано достоверного изменения XJI нейтрофилов в ответ на ФМА после облучения, однако тенденция к ингибированию наблюдалась при концентрации иономицина 0.8 иМ (рис. 2), в то время как при облучении клеток в присутствии А23187 в концентрации 20 цМ мы получили ингибирование продукции АФК на 60+10%, К=\.

* - Известные методы выделения нейтрофилов, как и примененный нами, позволяют получать клетки в праймированном (в большей или меньшей степени) функциональном состоянии. При хранении клеток более часа в условиях низкой температуры (при 2-4°С) в бескальциевой среде снижается уровень спонтанной XJ1 и уровень XJI в ответ на ФМА (1 рМ), что может бьгть связано с процессом "депраймирования" [Kitchen Е. et al., 1996], и при этом ХЛ сохраняется на одном уровне в течение эксперимента. Такие клетки мы считали интактньши и их физиологическое состояние принимали за исходное.

необлучелных клеток (п=10).

150

Г сэ

ьа юо

В (Й

о

50

т

Ж

Контроль

X

12 3 4

При облучении нейтрофилоз и присутствии А23187-4Вт и последующем действии ФМЛ также не получено достоверных различий межэу облученными и необлучешшяи клетками. По нашим результатам, ответ на ФМА модифицируется ЭМИ КВЧ только в случае предобработки клеток А23187, но не иономицином или А23187-4Вг.

Из литературы известно, что каждый кз ионофоров не является высокоселективным по отношению к ионам Са2+ (Erdahl W.L. et al., 1994, 1995, 1996]. Наибольшей селективностью к ионам Са2т обладает иономицин, А23187-4Вг более селективен к Zn2+ и Мп2+. чем к Са2+. Это справедливо и для A231S7. но он менее селективен к Zn2+ и Мп2* по сравнению с А23187-4ВГ. Кроме того, иономицин представляет собой Са2+/Н"^-обменник, а А23187 - Ca2+/Mg2+-обменник [Di Virgilio F. et al., 1983]. Поэтому мы предположили, что механизмы активации НАДФН-оксидазы нейтрофилов кальциевыми ионофорами: А23187, А23187-4Вг, иономицином имеют специфические различия, которые определяют характер ответа на последующую активацию ФМА. Возможно, что при совместной активации клеток разными кальциевыми ионофорами и ФМА активируются альтернативные системы внутриклеточной сигнализации, что и проявляется в особенностях действия ЭМИ КВЧ.

2.1. //следование механизмов активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и форболовим эфиром.

2.1.1. Особенности. совместной активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и ФМА.

Для определения механизмов активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и ФМА мы исследовали зависимость коэффициента К от концентрации каждого из трех ионофоров. Показано, что зависимое!ь коэффициента К от концентрации А23187 и иономицина в среде, содержащей I мМ Са-' (рис. ЗА), имеет кол околообразный характер: с области концентраций от 0.01 цМ до 0.5 цМ <423187 и от 0.05 цМ до 0,5 цМ иономицина происходит постепенное усиление продукции АФК; в области концентраций от 0.5 цМ до 10 цМ A231S7 и от 0.5 цМ до 5 цМ иономицина - уменьшение продукции АФК, причем, на фоне иономицина угнетение продукции АФК происходит в более узкой области высоких концентраций ионофора по сравнению с А23187. Изменение коэффициента К зависит от времени инкубации с кальциевыми ионофорами А23187 и иономицином, а так же от наличия Са2+ в среде инкубации (рис. ЗА, В). На фоне А23187-4Вг наблюдалось достоверное снижение продукт..!» АФК, которое не зависело от наличия ионов Са2+ в среде инкубации и времени инкубации (рис. ЗА В).

Ю-2 10"> 10» Концентрация ионофора, мкМ

10"4 10"3 10J 10-> 10° 101 102 Концентрация ионофора, мкМ

10 3 Ю-2 10"' 10° 101 Концентрация ионофора, мкМ

10'2 10-' 10° 101 Концентрация ионофора, мкМ

Рис. 3. Изменение продукции АФЖ нейтрофилов при совместном действии кальциевых ионофорвв и ФМА и максимального уровня [Ca2+JHum о зависимости от концентрации кальциевого ионофора.

Клетки инкубировали в течение 1 мин (время соответствует максимальной амплитуде Са2+-сигнала при активации клеток одним из ионофоров) при 37°С с одним из кальциевых ионофоров в среде, содержащей 1 мМ Са2+ (А), либо в бескальциевой среде с добавлением 2 мМ ЭГТА (В), затем регистрировали изменение продукции АФК в ответ на добавление ФМА в концентрации 1 цМ и рассчитывали К как указано выше (в главе 1). [Са2+]цит измеряли по флуоресценции Fura-2AM при добавлении различных концентраций кальциевого ионофора в среде, содержащей 1 мМ Са2+ (Б), и в бескальциевой среде с добавлением 2 мМ ЭГТА (Г). Для каждой точки усреднено 10 и более значений, указана средняя квадратичная ошибка.

О - иономицин, С - A231S7, А - А23187-4Вг.

Исходя из получении:* результатов, мы предположили, что каждый из ионофоров может активировать альтернативные пути внутриклеточной сигнализации, участвующие в активации респираторного взрыва совместно с ФМА, что, возможно, связано с особенностями механизмов повышения [Са2+]цет каждым из ионофоров.

2.1.2. Измерение концентрации внутриклеточного свободного кальция при действии кальциевых ионофоров.

Обнаруженные различия в активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами совместно с ФМА, скорее всего, связаны с различными механизмами увеличения [Са2+]цит. Для изучения механизмов увеличения 1Са2*]цкт в нейтрофилах мы провели измерение 1Са2+]цит с использованием трех ионофоров: А23187, иономицина и А23187-4Вг. Исходный уровень [Са2+'цит неактивированных нейтрофилов составляет 120±6 нМ (п=20). Добавление к суспензии нейтрофилов кальциевого ионофора приводит к быстрому (в течение 30-60 с) повышению [Са2+]ц„. Затем происходит постепенное снижение [Са2+1инт и через 6-10 мин устанавливается кызистационарный уровень. Обе фазы (быстрое увеличение [Са2+]цит и установившийся уровень [Са2+]цит) зависят от концентрации ионофора и концентрации ионов Са2+ в среде инкубации.

Анализ результатов показал, что все ионофоры повышают концентрацию свободного кальция в цитозоле, но с разной эффективностью, она падает в ряду: иономицин, А23187, А23187-4Вг (рис. ЗБ, Г). В бескальциевой среде ионофоры обеспечивают: кратковременное повышение [Са2+]цит за счет мобилизации кальция из внутриклеточных депо. Сравнивая динамику изменения [Са2Чцит в среде с 1 мМ Са2' и в бескальциевой среде с добавлением 2 мМ ЭГТА, мы получили, что первая фаза Са2+-сигнала, вызванного А23187 и иономицином, связана с ионофорным переносом и мобилизацией кальция из внутриклеточных депо, а А23187-4Вг, в основном, с мобилизацией кальция из внутриклеточных депо.

2.1.3. Взаимосвязь yвeJWчeнuя [Са2+]цит и изменения продукции АФК нейтрофилами в ответ на ФМА при совместной активации с кальциевыми иотфорами.

Сопоставляя изменение коэффициента К и изменение [Са2+|цит при варьировании концентраций кальциевых ионофоров, мы обнаружили существование взаимосвязи между /и [Са2+]цит. По нашим данным (рис. 3 А, Б) для иономицина и А23187 при увеличении [Са2+]иет значение К постепенно увеличиваемся, достигает максимума, а затем уменьшается. Для А23187 - 4Вг значение К монотонно уменьшается во всем диапазоне концентраций кальциевого ионофора, тогда как наблюдается увеличение уровня [Са2+]цит. Для количественной оценки степени взаимосвязи между увеличением [Са2+]Ц1П и

изменением продукции АФК нейтрофилов в ответ на ФМА при совместной активации с кальциевыми ионофорами мы рассчитали коэффициент корреляции (Я) для участков возрастания и спада зависимости коэффициента' К от концентрации кальциевого ионсфора. Полученные значения коэффициента корреляции для участка возрастания зависимости Е указывают на сильную положительную корреляцию между [Са2+]цит и усилением продукции АФК для А23187 (И=0.8±0.5), а для иономицина на функциональную связь в среде с 1 мМ Са2+(Я=0.98±0.3). Для спадающей части зависимости Хот концентрации ионофора получена значительная отрицательная корреляция для всех трех ионофоров: для А23187 Л=-0.76±0.5; для иономицина К=-0.98±0.2 и для А23187-4Вг К=-0.7±0.2. В бескальциевон среде линейной корреляции нет для иономицина и А23187, в то время как для А23187-4Вг Я=-0.91±0.2, что указывает на функциональную связь.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что существует зависимость между изменением [Са2+!цнт и коэффициентом Ж, но увеличение |(-'а2'1ии1 не всегда вызывает усиление продукции АФК при последующей активации ФМА, как это видно в случае использования А23187-4ВГ. Отсутствие корреляции между [Са2+]щгг и величиной коэффициента К в бескальциевой среде говорит о том, что для развития усиленного ответа нейтрофилов на ФМА, предварительно обработанных кальциевыми ионофорами: иономицином или А23187 необходим вход внешнего Са2+. Для того, чтобы показать, что вход ионов кальция играет критическую роль в регуляции [Са2+]цит при использовании кальциевых ионофоров в качестве праймирующих агентов и последующей активации респираторного взрыва с помощью ФМА, мы истощали запасы Са2+ в клетках инкубацией в среде с добавлением 100 нМ иономицина в комбинации с 50 нМ тапсигаргина в течение 15 мин. Добавление возрастающих концентраций СаС12 в инкубационную среду приводило как к увеличению [Са2+]цит, так и усилению ФМА - индуцированного респираторного взрыва. При этом между [Са2+]цит и продукцией АФК существует положительная и прямолинейная корреляция т=0.&±0.15).

Мы показали, что высокий уровень [Са2+]иит в клетке создается не только за счет входа Са2+ из экстраклеточной среды, но и мобилизацией из внутриклеточных депо, в частности, из инозитол-1,4,5 - трифосфат (Ин-1,4,5,-Фз) - чувсвительных депо. Скорее всего, что высокие концентрации кальциевых ионофоров вызывают опустошение внутриклеточных запасов. Об этом свидетельствует: во-первых, уменьшение Са2+-сигнала в бескальциевой среде при тех же концентрациях А23187 и иономицина, при которых происходит ингибирование респираторного взрыва в ответ на ФМА в среде с 1мМ Са2+. Во-вторых. в том случае, если изменение максимального уровня [Са2+]цит связано только с мобилизацией из внутриклеточных депо (А23187-4Вг) так же происходит

ингибирование респираторного взрыва в ответ на ФМА. В-третьих, в «истощенных» клетках мы не наблюдали ингибирования респираторного взрыва п ответ на ФМА при высоком уровне [Са2+]Ц1П (2246+50 нМ). Таким образом, внутриклеточные депо могут контролировать процесс инактивации респираторного взрыва. Показано, что рецепторы к Ин-1,4,5-Фз чувствительны к концентрации нонов Са-;. нолумаксимальное ингибирование наблюдается в присутствии 300 нМ Са2+ [Авдонин П.В., Ткачук В.А., 1994]

Показано, что связь между входом Са2"1 и опустошением внутриклеточных депо может осуществлять цкгохром Р-450 [Alvarez J. et al., 1991], который является основным компонентом эпоксигеназного пути окисления АК [Крутецкая 3. И. и др., 1993].

По-видимому, активация респираторного взрыва кальциевым ионофором и ФМА представляет сложный процесс, который нельзя формально описать только увеличением [Са2+]цит. Изменение [Са2+]цит, с одной стороны, говорит об активности Са2+ - зависимых систем, а с другой стороны, изменение [Са2+]цит служит регулятором активности этих систем. Вклад одной из таких систем изучали в следующей серии экспериментов.

2.1.4. Участие фосфояипазы Aj в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов, активированных кальциевым ионофором и ФМА,

Известно, что для функциональной активности лейкоцитов большое значение имеет метаболизм арахидоновой кислоты (АК). Мы предположили, что в активации нейтрофила при использовании кальциевого ионофора и ФМА участвует фосфолипаза Ki (ФЛАг), уникальной функцией которой является гидролиз мембранных фосфолипндов с образованием свободной АК. Общепринято, что дня активации ФЛА^ существенно увеличение [Са2+]цит после стимула агониста в разных типах клеток [по Reddy S. et al., 1995], показана прямая корреляция между внеклеточной концентрацией Са2+ и активацией ФЛАг [по Крутецкой З.И. и др., 1997], т. е. потенциальными активаторами ФЛАэ являются кальциевые нонофоры. например, A231S7 или иономицин. С другой стороны, существуют доказательства участия ПКС в активации ФЛАг [Nishizuka Y., 1992]. Форболовый эфир вызывал выброс АК, иногда совместно с физиологическими агонистами АК [Matsumoto Т. et al., 1988]. Вероятнее всего, в механизм продукции АФК при активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и ФМА включена ФЛА^ и продукт ее метаболизма АК. Для проверки этого предположения мы использовали специфический ингибитор ФЛАз с молекулярной массой 14 кДа 4-бромофенацил бромид (БФБ); ингибиторы ключевых ферментов трех путей окисления АК: циклооксигеназы (индометацин), липоксигеназы (нордигвдрогуаретиковая кислота, хинакрин, кверцетин), ■люкс иге пазы - иитохрома Р-450. (проадифен): а также неомицкн - ингибитор

фосфолипазы С (ФЛС), которая может непрямым путем высвобождать АК из мембранных фосфолипидоа.

Показано, что при максимальном значении коэффициента Ж БФБ, блокатор ФЛАг, ингибировал продукцию АФК до 75±3% при активации клеток иономицииом и ФМА. По сравнению с А23187 эффект был почти в 2 раза меньше: при 0.5 цМ А23187 наблюдалось ингибирование до 40±10%. Исследование липоксигеназного пути окисления АК было затруднено тем, что примененные блокаторы 5-липоксигеназы: хинакрин, кверцетин и нордигидрогуаретиковая кислота, используемые доя исследования респираторного взрыва [Dana R. et al., 1994], по нашим результатам гасят ХЛ клеток, являясь "ловушками" АФК.

На фоне индометацина, проадифена и неомицина продукция АФК нейтрофидами при активации иономицином в концентрации 0.1 цМ и ФМА (1 цМ) достоверно не отличалась от контроля.

Полученные результаты, а так же литературные данные [Крутецкая З.И. и др., 1997] дают основание считать, что в совместной активации нейтрофилов кальциевыми ионофорами А23187 или иономицином и ФМА участвует фосфолипаза А; и продукты ее метаболизма.

2.1.5. Оценка функционального статуса нейтрофмов на модели активации респираторного взрыва кальциевым ионофором Л23187и ФМА.

В организме нейтрофилы могут находиться в состоянии покоя, праймирования, активации и гиперакгивации. В цитоплазме покоящихся клеток концентрация ионов Са2+ по разным оценкам варьирует от 50 до 200 нМ. Основной вклад в поддержание низкой концентрации цитоплазматического Са2+ вносят кальциевые АТФазы внутриклеточных мембран (гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума) [Авдонин П.В., Ткачук В. А., 1994]. Праймирование - это процесс, когда клетки, предварительно обработанные "праймирующим" агентом перешли из состояния покоя к состоянию готовности отвечать на последующий стимул изменением "оксидазной или клеточной активности" [Hallett В.М., Lloyds D., 1997]. В настоящее время рассматривают несколько механизмов праймирования: синтез белков de novo, экспрессия рецепторов на поверхность клетки, изменение [Са2+]цит, модуляция активности фосфолипазы Д, тирозиновое фосфорилирование [Hallet! В.М., Lloyds D., 1997]. Активация - это процесс, который приводит к "измеряемым" изменениям в клетке [Downey G. Р. et al., 1995]. В экспериментальных условиях определенный уровень активности можно задавать, варьируя концентрации действующих агентов. Так, на кривой зависимости коэффициента К от концентрации А23187 можно выделить области концентраций ионофора, переводящих клетки в тот или иной функциональный статус (рис. ЗА). Оценка уровня функциональной активности была проведена нами по изменению [Са2+]цит и по эффектам БФБ (10 цМ),

блокатора ФЛА2, и проадифена, блокатора цитохрома Р-450 (10 |хМ) (рис. 4). Данная классификация носит условный характер и использована дня удобства описания результатов.

Интактные клетки. [Са2+]ц„т в таких клетках составляет 120+5 нМ, при добавлении ФМА в концентрации 1 цМ* наблюдается изменение ХЛ (рис 1). На таких клетках БФБ вызывал уменьшение продукции АФК до 0.34±0.02, на фоне проадифена продукция АФК не изменялась (рис 4).

Праймированные клетки. Предварительная обработка клеток низкими концентрациями А23187 (0.1 цМ) приводила к кратковременному повышению [Са- |циг. которая составляла 208+8 нМ (рис. 3). Уровень спонтанной ХЛ в этом случае не менялся. Такое изменение [Са2+]щгг может свидетельствовать о локальном изменении концентрации ионов кальция в клетке, в результате чего

клетки

Концентрация А23187, мк!И

Рис. 4. Изменение продукции АФК нейтрофилов, активированных А23187и ФМА (1 мкМ) в присутствии блокаторов при ЗТО,.

\ I - без блокатора

П223 - на фоне бромофенацил бромида (10 мкМ), блокатора ФЛА2;

ШШ - на фоне проадифена (10 мкМ), блокатора цитохрома Р-450

Для каждой концентрации усреднено 10 и более значений, указана средняя квадратичная ошибка

* здесь и во всех других случаях при обработке клеток ФМА его концентрация остается постоянной и равна 1 цМ.

наблюдается изменение формы клетки в процессе адгезии или фагоцитоза, а так же усиление продукции АФК внутрь клетки [Hallett М. В., Lloyds D., 1997]. При последующем добавлении ФМА проявляется тенденция к слабому увеличению коэффициента К. БФБ на таких клетках вызывал уменьшение продукции АФК почти в 2 раза; на фоне проадифена, блокатора цитохрома Р-450, продукция АФК не изменялась (рис. 4).

Активированные клетки. Обработка клеток А23187 в концентрациях 0.2-2 цМ вызывала кратковременное повышение [Са2+]цит от 230±5 нМ до 861±60 нМ и обеспечивала поддерживаемый уровень [Са2+]цит, который менялся от 200±10 нМ до 360+20 нМ. В этом случае уровень ХЛ, вызванной А23187, отличался от уровня ХЛ интактных клеток (рис. 1А), а в ответ на ФМА происходило усиление продукции АФК примерно вдвое, К=2.31+0.2. На фоне БФБ наблюдалось ингибирование продукции АФК приблизительно на 50% (рис. 4; 0.5 или 1 цМ); на фоне проадифена в указанном диапазоне концентраций А23187 изменения продукции АФК не зарегистрировано.

Гиперактивированные клетки. Обработка клеток А23187 в концентрациях 5-20 цМ также вызывала кратковременное повышение [Са2+]цит от 1090+100 нМ до 2403+200 нМ и обеспечивала поддерживаемый уровень [Ся2 который изменялся от 400+60 нМ до 609±96 нМ. При регистрации ХЛ в ответ на /J31&7 мы наблюдали изменение динамики продукции АФК (рис. 1А, кривая 5) по сравнению с более низкими концентрациями (рнс. 1А кривые 3, 4). Последующее добавление ФМА вызывало ослабление продукции АФК по сравнению с продукцией АФК, вызванной совместной активацией нейтрофилов ФМА и более низкими концентрациями А23187. В этом случае на фоне БФБ мы наблюдали ингибирование продукции АФК на 64±10%, т.е. эффект БФБ слабо зависел от концентрации ионофора. На фоне проадифена наблюдалось усиление продукции АФК на 187%, т.е. эффект зависел от концентрации кальциевого ионофора.

Таким образом, по нашим результатам при последовательной активации нейтрофилов кальциевым ионофором А23187 и ФМА значительную роль в развитии ответа нейтрофилов играет ФЛА2 и продукты ее метаболизма. Активация ФЛА2 обеспечивается следующими процессами: входом внешнего Са2+ в присутствии А23187, что создает повышенный уровень [Са2+]цит в клетке в течение длительного времени; активацией форболовым эфиром ПКС, которая осуществляет положительную обратную связь на ФЛА2, образованием эндогенного ЛТВ4, который может выходить из клетки и, связываясь с рецептором, запускать каскад реакций по типу положительной обратной связи.

В праймированных клетках мы не наблюдали усиленного ответа на ФМА вследствие того, что ионофор вызывал только кратковременное увеличение [Са2+]цит, что былонедостаточно для активации ФЛА2 [Clark D.J. et al., 1991], в

активированных клетках кратковременное повышение [Са2+]цит от 300 до 800 нМ и стационарный повышенный уровень [Са2+)цит создают условия для активации ФЛА2 и образования продуктов ее метаболизма, пока не начнут работать механизмы, связанные с инактивацией респираторного взрыва (гиперактивированные ктстки). В этом процессе участвует активированная эпоксшеназная система метаболизма АХ. Ингибирование проадифеном ключевого фермента этого пути - цитохрома Р-450 устраняет инактивацию репираторного взрыва в ответ на ФМА нейтрофилов, предварительно обработанных высокими концентрациями А23187.

3. Исследование биологического действия ЭМИ КВЧ на яейтрофялы при активации респираторного взрыва A231S7 и ФМА.

3.1 Взаимосвязь биологического действия ЭМИ КВЧ и функциона.гьного статуса клеток.

Время, мин Концентрация А23107, мкМ

Рис. 5. Изменение продукции АФК пейтрофилов

при облучении ЭМИ КВЧ.

Клетки облучали ЭМИ КВЧ (41.95 ГГц, непрерывная генерация, 150 мкВт/'см2) на фоне А23187 при 20-22°С в течение 20 мин. После прекращения облучения регистрировали ХЛ нейтрофилов в ответ на ФМА (1 цМ) при 37JC.

(А) Зависимость

интенсивности ХЛ нейтрофилов от времени при активации интактных клеток ФМА в концентрации ! цМ (1); при активации ФМА необлученных (2) и облученных ЭМИ КВЧ (3) клеток, предварительно обработанных

А23187 (5 цМ).

(Б) Изменение продукции АФК в зависимости от концентрации А23187 необлученных (<§) и облученных (П) нейтрофилов. Приведены усредненные результаты по 10-12 независимым опытам, укзано среднее значенке±средняя квадратичная ошибка

Зависимость Кат концентрации ионофора в среде с 1 мМ Са2+ имеет аналогичный характер для облученных и необлученных клеток (рис. 5Б) с максимальным значением при концентрации А23187 равной 2 цМ. При облучении нейтрофилов в присутствии кальциевого ионофора в концентрациях от 0.5 цМ до 5 цМ мы не обнаружили достоверных различий в изменении К, по сравнению с необлученными клетками, хотя наблюдается тенденция к такому различию. Начиная с концентрации 5 цМ до 20 цМ коэффициент К, облученых клеток достоверно ниже, чем необлученных.

При оценке эффекта ЭМИ КВЧ по отношению продукции АФК облученных и необлученных клеток в области концентраций ионофора от 50 нМ мо 1 цМ (эта область соответствует праймированным и активированньиц клеткам) отношение близко к 100% и практически не зависит от концентрации ионофора. Критическими концентрациями являются концентрации выше 2 цМ, при которых наблюдается резкое снижение величины отношения продукции АФК облученных и необлученных клеток. Достоверное отличие от контроля получено . для концентраций А23187 выше 3 цМ (рис. 6). При увеличении концентраций А23187 от 3 до 20 цМ (гиперактивированные клетки) происходит ослабление продукции АФК при облучении клеток ЭМИ КВЧ (рис. 6). Максимальное ослабление продукции АФК при облучении ЭМИ КВЧ достигает 60±10% нри концентрации А23187 20 цМ.

Таким образом, анализ полученных результатов подтверждает предположение о том, что эффект ЭМИ КВЧ зависит от "степени активации клетки", по крайней мере в данном случае, при ее активации возрастающими концентрациями А23187.

Мы показали, что существует корреляция между коэффициентом К и [Са2+]Ц11Т, тот факт, что К облученных клеток достигается при более низкой концентрации А23187, чем необлученных (рис. 5), клеток может указывать, что нри облучении ЭМИ КВЧ усиливается гидролиз фосфолипидов [Лунева И.О. и др., 1987], образованные жирные кислоты могут повышать сродство ПКС к Са2+. В этом случае активация ПКС осуществляется при более низкой концентрации Са2+ [5с1гасМег 1.В. й а!., 1996, ЫйЬиика У., 1984].

3.2. Роль внешнего кальция в реализации эффектов ЭМИ КВЧ на нейтрофилах.

Мы показали, что А23187 способствует не только ионофорному входу Сл2', но и его высвобождению из внутриклеточных депо, что является причиной повышения [Са2+]дит в бескальциевой среде. Чтобы установить роль внеклеточного кальция в полученном эффекте ингибирования респираторного взрыва ЭМИ КВЧ была использована среда, не содержащая Са2+, с добавлением 2 мМ ЭГТА. Можно было ожидать, что эффект ЭМИ КВЧ сохранится и в этих условиях.

Однако, во всем диапазоне концентраций А23187 ответ на ФМА облученных и необлученных клеток в бескальциевой среде не различался (рис. 6).

120

Ковцеотрация А23187, мжМ Рис. 6. Оценка эффективности ЭМИ КБ Ч по отношению продукции АФК облученных и необлученных клеток, последовательно активированных А23187 и ФМА.

Нейтрофилы облучали в среде, содержащей 1 мМ Са2+ (Ц ), и в среде без Са2+ (£2>. Указано среднее значение±ст, приведены усредненные результаты по 10-12 независимым экспериментам. * - достоверное отличие от контроля по 95% уровню.

Таким образом, эффект ЭМИ КВЧ зависит от наличия Са2+ во внешней

среде. Это указывает на возможность участия ФЛА2 в реализации полученного

эффекта ЭМИ КВЧ. Кратковременное значительное повышение [Са2+]цит и далее

высокий поддерживаемый уровень [Сз2+]цих создают условия для активации

сигнальных путей, в частности ФЛАг [11ес)с1у Б. е1 а1., 1995], обеспечивающих

гиперактивированное состояние клетки.

3.3 Роль фосфолипазы А2 в эффекте ингибирования ЭМИ КВЧ продукции

АФКнейтрофилов, активированных кальциевым ионофором А23187и ФМА.

Для проверки предположения об участии ФЛА2 в реализации эффекта

ингибирования ответа нейтрофилов ЭМИ КВЧ, клетки облучали в присутствии

блокаТора ФЛА^, 4-бромофенацил бромида (БФБ) (10 цМ). На рисунке 7

представлены диаграммы, на которых показано изменение К при

последовательной активации нейтрофилов А23187 (5 цМ) и ФМА (1 цМ) на фоне

ЬФЬ (рис. 7А) и при действии ЭМИ КВЧ (рис. 7Б). Было обнаружено, что клетки,

выделенные из разных животных, различаются по чувствительности к БФБ: 1)

клетки с высокой чувствительностью, у которых происходило уменьшение

коэффициента К от 2.3+0.2 до 0.9±0.1 при действии блокатора; 2) клетки с более

низкой чувствительностью, коэффициент К которых уменьшался от 3.0+Ю.1 до

2.1±0.1. Клетки в выделенных группах обладали разной чувствительностью к ЭМИ КВЧ: в первой группе клеток наблюдалось ингибирование ХЛ при действии ЭМИ КВЧ до 75±6?о, добавление блокатора снижало эффект ЭМИ КВЧ до 93±7?с, что достоверно не отличалось от контроля (N=10, п=20).

.120

К

з -

2 -

О Я

га 100

и

о

О.

В 80 О

в к Я

60

контроль

X

i

3 4

3 4

Рис. 7. Влияние ЭМИ КВЧ на респираторный

взрыв нейтрофилов на фоне блокатора ФЛА2.

Клетки инкубировали с блокатором ФЛ/уь 4-бромофенацил бромидом (10 цМ) в течение 2 мин, затем добавляли А23187 (5-8 мкМ) и облучали ЭМИ КВЧ (41.95 Ггц, непрерывная генерация, 150 мкВт/см2) при 20°С в течение 20 мин. После прекращения облучения клетки помещали в регистрирующее устройство и регистрировали изменение ХЛ в ответ на ФМА (1 р.М) при 37°С. (А) Влияние БФБ на продукцию АФК при последовательной активации А23187 и ФМл: 1 и 3 -без блокатора, 2 и 4 - в присутствии БФБ. (Б) Эффект ЭМИ КВЧ на продукцию АФК нейтрофилов при последовательной активации А23187 и ФМА: 1 и 3 - без блокатора, 2 и 4 - в присутствии БФБ.

Указано среднее значение±средняя квдратичная ошибка, для каждого столбика усреднено 10 и более независимых экспериментов. * - достоверное отличие от контроля по уровню 95%.

Во второй группе клеток облучение не было эффективным, снижение уровня ХЛ по отношению к контролю не было достоверным и составляло: :90+6% на фоне А23187 и до 90+7% на фоне блокатора (N=11, п=26).

Таким образом, эффект ЭМИ КВЧ отсутствовал па фоне БФБ, блокатора ФЛА2. Полученные результаты указывают на то, что ФЛА2 участвует в реализации эффектов ЭМИ КВЧ. Причем, действие ЭМИ КВЧ, скорее всего, проявляется при активном статусе ФЛА2 и зависит от уровня начальной активации данного фермента в клетке.

2.4 Модификация эффекта ЭММ КВЧ при обучении нейтрофилов в присутствии проадифена, блокатора цитохрома Р-450..

Исследуя механизмы активации респираторного взрыва в ответ на ФМА, нейтрофилов, предварительно обработанных А23187 в концентрациях 0.5-10 цМ, мы показали, что ингибирование респираторного взрыва связано с активацией эпоксигеназного пути окисления АК. Мы предположили, что блокирующее действие ЭМИ КВЧ на респираторный взрыв нейтрофилов, активированных А23187 и ФМА может быть опосредовано образованием продуктов метаболизма АК

Б

по эпоксигеназному пути. Для проверю! этого предположения мы использовали блокатор цитохрома Р-450 проадифен (10 цМ).

На рисунке 8А приведены зависимости интенсивности ХЛ нейтрофилов от времени при активации кальциевым ионофором А23187 (8 цМ) и ФМА (1 цМ)

г

1.25

2 10 &

2 в са ЕВ

3 0-5 S

*S 0-25 К

3 / 6NN А

-ФМА|/\! 1

JL5 N.

Время, мвп

Рис. 8. Влияние ЭМИ КВЧ на продукцию АФК нейтрофилов, активированных А23187 и ФМА на фоке

проадифена.

(А) Зависимость интенсивности ХЛ от времени: при активации интактных (1) и облученных ЭМИ КВЧ (4) клеток ФМА (1 цМ), при активации ФМА (1 цМ) необлученных (2) и облученных (5) клеток, предварительно обработанных А23187 (5-8 цМ), при активации ФМА (1 цМ) необлученных и облученных ЭМИ КВЧ (6) клеток, предварительно обработанных проадифеном (10 цМ) и А23187 (5-8 цМ).

(Б) Эффект ЭМИ КВЧ при последовательной активации клеток А23187 (5-8) цМ и ФМА (1 цМ):

(1) - sham - контроль

(2) - без блокатора,

(3) - на фоне проадифена (10 цМ). Для каждого столбика усреднено 10-15независимых экспериментов, указана средняя квадратичная ошибка.

* - достоверные отличия по 95 % уровню

в контроле и в условиях облучения ЭМИ. Видно, что проадифен "нормализует" продукцию АФК, т.е. приближает к максимальному значению; при действии ЭМИ КВЧ на фоне проадифена между облученными и необлученными нейтрофилами отличия нет (рис. 8 А кривые 3 и 6).

На рисунке 8Б представлены диаграммы, на которых показано изменение эффекта ЭМИ КВЧ при использовании проадифена: на фоне блокатора нет достоверного отличия между облученными и необлученными клетками. В то время

как в сггсугсвии блокатора при действии ЭМИ КВЧ, наблюдали достоверное ингибирование продукции АФК в ответ на ФМА (1 цМ) до 74±10%.

Таким образом, из приведенных результатов видно, что на фоне проадифена, блокатора ключевого фермента эпоксигеназного пути цитохрома Р-450, ЭМИ КВЧ неэффективно. Это говорит о том, что в рассматриваемых условиях эффект ЭМИ КВЧ, возможно, реализуется с участием продуктов метаболизма АК по эпоксигеназному пути.

Выводы.

1. Исследованные кальциевые ионофоры повышают [Са2+]цит, с разной эффективностью, которая падает в ряду: иономицин, A231S7, А23187 - 4Вг. Для развития усиленною ответа клетки при активации ее кальциевым ионофором и ФМА необходим как вход внешнего кальция, так и мобилизация кальция из внутриклеточных депо, которые обеспечивают иономицин и А23187.

2. В механизме активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и форболовым эфиром участвует фосфолипаза Ai. В области высоких концентраций кальциевый ионофор А23187 активирует эпоксигеназный путь окисления АК, что приводит к снижению ответа клетки на ФМА.

3. К воздействию ЭМИ КВЧ чувствительны клетки, обработанные высокими концентрациями А23187, но не иономицинок или А23187-4 Вг.

4. Эффект ЭМИ КВЧ проявляется только при активном статусе ФЛАг и зависит от уровня начальной активации этого фермента в клетке.

5. Ингибирование цитохрома Р-450, ключевого фермента эпоксигеназного пути окисления АК предотвращает развитие блокирующего эффекта ЭМИ КВЧ.

Список публикаций.

1. Safronova V.G., Gapeyev A.B., Alovskaya A.A., Zinchenko V.P., Chemeris N.K. Inhibition of synergistic influence of calcium ionophore and phorbol ester in the mouse neutrophils by millimeter waves. EBEA Nancy'96, Third International Congress. 1996.

2. Safronova V.G., Alovskaya A.A., Gabdulkhakova AG., Dedkova E.N,, Zinchenko V. Chemeris N.K. Priming mechanism of calcium ionophoies in activation of neutrop respiratory burst. 41st Annual Meeting of the Biophysical Society. New Orlean, Louisiai USA. Biophys. J., V.72, N.2, part 2, A296, W-pos 274. 1997.

3. Аловская A.A., Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Ро фосфолипазы Ai в эффектах ЭМИ КВЧ. 1 Международный симпози "Фундаментальные науки и альтернативная медицина". Пущино. 1997. Стр. 48.

4. Габдулхакова А.Г.. Аловская A.A., Сафронова В.Г., Чемерис Н.К. Фесенко Е.Е. ЭМ КВЧ и "прайминг" нейтрофилов. 1 Международный симпозиум "Фундаментальш науки и альтернативная медицина". Пущино. 1997. Стр. 52.

5. Аловская АЛ., Гапеев А.Б., Сафронова В.Г., Фесенко Е.Е., Чемерис Н.К., Якушина B.C. Резонансное ингибирование активности перитонеальных нейтрофилов мыши при действии низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ в ближней и дальней зонах антенны. Вестник новых медицинских технологий. 1997, T.IV, N.3, стр. 38-44.

6. Сафронова В.Г., Гапеев А.Б., Аловская АЛ., Габдулхакова А.Г., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Миллиметровые волны ингибируют синергический эффект кальциевого ионофора А23187 и форболового эфира в активации респираторного взрыва нейтрофилов. Биофизика. 1997, Т.42, вып. 6, стр.1267-1273.

7. Safronova V.G., Gabdulkhakova A.G., Alovskaya АЛ, Dedkova E.N., Zinchenko V.P., Chemeris N.K.. Role Extracellular Calcium in Priming of Neutrophil Respiratory Burst by Calcium lonophore. 42nd Annual Meeting of the Biophysical Society. Kansas City, Missouri, USA. M-Pos-286. 1998.

8. Аловская АЛ, Габдулхакова А.Г., Гапеев А.Б., Дедкова Е.Н., Сафронова В.Г. Е.Е.Фесенко, Н.К.Чемерис. Биологический эффект ЭМИ КВЧ определяется функциональным статусом клеток. Вестник новых медицинских технологий. 1998, Т. V, N 2, стр.11-15.

9. А.А.Аловская, А.Г.Габдулхакова, А.Б.Гапеев, Е.Н.Дедкова, В.Г.Сафронова, Е.Е.Фесенко, Н.К.Чемерис. Иммуномодулируюшее действие ЭМИ КВЧ и функциональное состояние клеток. Тезисы докладов международного конгресса "Медицинские технологии на рубеже веков". Тула, 1998, с.41.

10. V.G.Safronova, A.G.Gabdulhakova, AAAlovskaya, E.N.Dedkova, A.B.Gapeyev, N.K.Chemeris, E.E.Fesenko. Physiological state of neutrophils determinates biological effects of EHF EMF. Experimental Biology'98 Meeting. San Francisco, USA. A-95. 1998.

11. Габдулхакова А.Г., Аловская АЛ, Дедкова Е.Н. Элементы механизма синергической активации респираторного взрыва нейтрофилов. Тезисы докладов 2 открытой городской научной конференции молодых ученых г.Пущино, 1997, стр. 96.

12. Аловская АА., Габдулхакова А.Г., Гапеев А.Б. Миллиметровые волны подавляют реакцию синергизма кальциевого ионофора А23187 и форболового эфира в нейтрофилах. Тезисы докладов I конференции молодых ученых, Пущино, 1996, с. 10.

13. Дедкова Е.Н., Аловская АЛ, Габдулхакова А.Г. Механизм активирующего действия кальциевых ионофоров на интактные клетки. Различная чувствительность клеток к ионофорам. Тезисы докладов I конференции молодых ученых, Пущино, 1996, с. 30.

14. Dedkova E.N., Gabdulhakova A.G., Alovskaya АЛ, Safronova V.G. Zinchenko V.P. Calcium ionophores in cell activation and priming. 25th Silver Jubilee FEBS Meeting. Copenhagen, 1998 p-6.51.

15. Дедкова E.H., Аловская A.A., Габдулхакова А.Г., Сафронова В.Г., Зинченко В.П. Праймирующее действие кальциевых ионофоров на РМА - чдуцируемый респираторный взрыв. 1998. (В печати)

Научное издание Автореферат Аловской А.А.

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции СЖ-005-93; том 2; 953000 - книги и брошюры.

12.11.98 г. 3.8167Р. Т. 100 экз. Усл.печ.л. 1,25.

Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации Пущинского научного центра РАН. 142292 г. Пущино Московской о<5л., проспект Науки, 3. ОНТИ ПНЦ РАН.