Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активация респираторного взрыва нейтрофилов крови человека при электрическом пробое импульсами внешнего электрического поля

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Активация респираторного взрыва нейтрофилов крови человека при электрическом пробое импульсами внешнего электрического поля"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РГ 5 0 Днии ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

2 8 НОЯ 1994 На правах рукописи

УДК 612.014.4

МАЛИНИН ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ

АКТИВАЦИЯ РЕСПИРАТОРНОГО ВЗРЫВА НЕИТРОФИЛОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОМ ПРОБОЕ ИМПУЛЬСАМИ ВНЕШНЕГО ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОЛЯ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

дисссртании на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1994

Работа выполнена в Институте радиотехники и электроники РАН

Научный руководитель: '

кандидат биологических наук А.В.Путвинский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.Я.Потапенко кандидат биологических наук И.Е.Формазкж

Ведущая организация - Институт электрохимии РАН

Защита состоится "21 " декабря 1994 г. на заседании специализированного совета по специальности "биофизика" при Институте физико-химической медицины.

Адрес: 117828, Москва, ул. М. Пироговская, д. 1А С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ФХМ Автореферат разослан "_"_1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

М.А.Мурина

ХЛРЛКТЕРИСТИКЛ ДИССЕРТЛНИИ

Актуальность темы. Явление электрического пробоя биологических мембран получило в последние годы широкое распрос транение в первую очередь за счет практического применения. Особое место занимает новое направление использования электропорацин как инструмента обратимой пермеабилизации мембран для изучения клеточной физиологии и биохимии. В то же время атот метод часто используется без надлежащего изучения реальной степени и • длительности электропермеабилизации, что может приводить к ошибочным заключениям и выводам.

Использование в настоящей работе в качестве объекта исследования нейтрофилои'крови человека определяется как особой ролью этих клеток в формировании неспецифического иммуни тета, так и возможностью регистрации их функциональной активности хемилюмннесцентным методом. Высокочувствительный хемилюминесцентный метод позволяет изучать продукцию нейтрофилами активных форм кислорода в режиме реального времени. Изучение механизма индукции х'емнлюминесцентного отпета нейтрофилов в результате электрического пробоя плазматической мембраны импульсами внешнего поля имеет не только самостоятельное научное значение. Электроактлшщия может быть использована как способ ак тивации респираторного взрыва нейтрофилов для клинической диагностики и\ фагоци тарного с татуса.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение механизма активации респираторного взрыва нейтрофилов кропи человека одиночными импульсами внешнего электрического поля. В ходе работы требовалось решить следующие задачи:

1. Продемонстрировать, что нейтрофилы человека, так же как и макрофаги

крыс, отвечают вспышкой люминол-зависимой хемилюминесценЦии на импульс внешнего электрического поля:

2. Изучить влияние состава среды и параметров электрического импульса на величину хсмилюминесцентного ответа, определить оптимальные условия активации нейтрофилов;

3. Детально исследовать роль ионов кальция в механизме электроактивации нейтрофилов;

4. Определить эффективность пермеабилизации мембран при выбранных условиях: средний диаметр, количество и время жизни пор, обеспечивающих проницаемость мембраны для ионов Са2+.

Научная новизна полученных результатов. Обнаружен эффект прямой активации хемилюминесценции суспензии нейтрофилов человека одиночными импульсами внешнего электрического поля. В результате экспериментального исследования эффекта активации установлено кратковременное увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция вследствие вхождения через образующиеся в плазматической мембране поры. Анализ данного явления различными экспериментальными методами доказывает, что ключевым звеном в механизме активации является вхождение ионов Са2+ из среды в клетки. Обнаружена высокая буферная емкость внутриклеточных кальциевых депо, поддерживающих низкую концентрацию свободного кальция в цитоплазме нейтрофилов. Определены численные значения параметров пор: время жизни, площадь, количество пор. На основе обнаруженного эффекта предложено устройство для активации нейтрофилов импульсами электрического поля', защищенное патентом.

Научио-практическое значение работы. Обнаруженный в диссертационной работе эффект активации респираторного взрыва нейтрофилов

человека одиночными импульсами внешнего электрического поля может применяться в медико-биологических исследованиях, а также в целях медицинской диагностики фагоцитарной активности нейтрофилов как стандартный метод активации фагоцитарных клеток.

Полученные в результате диссертационной работы численные значения времени жизни, количества и площади электропор, а также высокая емкость внутриклеточных кальциевых депо позволяют критически взглянуть на многие результаты, полученные другими авторами. Прогнозирование на основе полученных данных реальной степени электропермеабилизации нейтрофилов даст возможность эффективно использовать метод электропорации для контролируемого введения о клетку физиологически важных молекул п научных исследованиях.

Апробация диссертационной работы. Основные положения диссертации были доложены на III Всесоюзном совещании по хемилюминесценции /Рига, 1990 г./, II международной школе "Электромагнитные поля и биомембраны" /Плевей. Болгария, 1989 г./, VI международном симпозиуме по Биолюминесценции и Хемилюминесценции /Кембридж, Англия, 1991 г./. Международной конференции "Клиническая хемилюминесценция" /Берлин, Германия, 1994/. Результаты работы обсуждались на семинарах кафедры биофизики РГМУ и отдела медицинской электроники ИЗЭ РАН. По материалам диссертации опубликовано 8 статей, 4 тезиса, получен патент Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков, 1 таблицу. Перечень цитированной литературы включает 250 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзор литературы. Обзор состоит из двух частей: электрический пробой биологических мембран и нейтрофилы как эффекторные клетки иммунной защиты организма.

В первой части обзора проведен анализ литературных данных о феноменологии и механизмах электрического пробоя (ЭП) биологических и искусственных мембран, Описаны основные методы и подходы изучения явления. В том числе данные, полученные с использованием бислойных липидных мембран (БЛМ), ЭП клеток внешним электрическим полем и с использованием метода "patch clamp", ЭП мембран диффузионным потенциалом. Особое внимание уделено роли электрического пробоя в физиологических процессах и в патологии, а также пракическому применению ме тода ЭП. Подробно рассмотрены экспериментальные данные о ЭП нейтрофилов с целью введения в них физиологически важных ионов и молекул, проведен критический анализ этих - работ.

Вторая часть обзора посвящена описанию нейтрофилов как объекта исследования в отношении их способнос ти продуцировать активные формы кислорода при активации дыхательного метаболизма. На основе литературных данных приведена обобщенная схема, отражающая современные представления о механизме активации нейтрофлов. Специальное внимание уделено роли ионов кальция в э том процессе. В отдельной главе подробно описаны методы регистрации респираторного взрыва, в том числе хемилюминесцентный метод.

Материалы и методы исследования. В качестве объектов исследования в работе использовали нейтрофилы крови человека и перитонеальные макрофаги крыс. Нейтрофилы выделяли из венозной крови здоровых доноров по модифицированнной методике (Boyum А., 1У76). с использованием градиента

фиколл-верографин (плотность 1.078). Перитонеальные макрофаги получали из перитонеального экссудата белых беспородных крыс-сымцов отмыванием в растворе Хенкса.

Для воздействия на клетки импульсами электрического поля и одновременной регистрации хемилюминесценции суспензии нейтрофилов была создана специальная установка ХЛМП-2, состоящая из двух изолированных блоков - пробойного и измерительного. Пробойный блок формировал импульсы электрического напряжения (амплитудой до 9 кВ), подаваемого на пластиковую кювету со встроенными позолоченными электродами (расстояние между электродами -10 мм). Кювета с образцом помещалась в измерительном блоке (для регистрации хемилюминесценции), фотог-риемником которого служил ФЭУ-100.

Кинетику изменения концентрации свободного качьция в цитоплазме нейтрофилов до и после воздействия импульсом электрического поля регистрировали, измеряя флуоресценцию Са2+-чувствительного зонда Quin-2 (^■возб = 339 нм, Афлу = 500 нм). Зонд вводили в клетки по методу [Cobbold Р.Н., Rink T.J., 1987).

Накопление общего кальция а клетках определяли по активности изотопа

45Са , определяемой на бета счетчике Rack Beta (LKB Wallac). Клеточный объем оценивали по содержанию калия в образце методом пламенной фотометрии.

Размер пор в мембране определяли с помощью меченных флуоресцентным зондом Texas Red декстранов, накопление которых в клетхах после

электропорации измеряли на флуориметре Hitachi-4000 (ХЕОзб = 595 нм, АфЛу = 620 им).

Выход АТФ из нейтрофилов регистрировали по хемилюминесценцип супернатанта в люцифирин-люциферазной системе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Хсмилюмимссцсиция нейтрофилов человека после действия одиночных импульсов электрического поля.

Измерение хемилюминесценции суспензии фагоцитов в присутствии люминола используют как стандартный метод регистрации их функциональной активности. Интенсивность хемилюминесценции в данном случае отражает способность фагоцитов генерировать активные формы кислорода. В качестве активатора обычно используют химические вещества (форболовый эфир, СМЬР, зимозан) или нерастворимые час тицы (латекс, кристаллы кварца). Недавно было показано явление прямой активации фагоцитарных клеток импульсами электрического поля на примере перитонеальных макрофагов крыс (Аннабердыева Е.М. и соавт., 19К7 г.). Предполагается, что активация вызывается электрическим пробоем плазматических мембран, однако детального изучения механизма активации проведено не было.

Для экспериментального изучения действия электрических импульсов на фагоциты нами были использованы нейтрофилы крови человека. Экспериментальная проверка показала, что импульс внешнего электрического поля (длительностью 90 мке и амплитудой несколько кВ/см) вызывает активацию респираторного взрыва нейтрофилов человека, регистрируемого как значительное увеличение люминол-зависимой хемилюминесценции суспензии клеток.

На рис.1 представлены примеры кинетических кривых люминол-зависимой хемилюминесценции суспензии ПМЛ при различных амплитудах импульса (момент разряда отмечен изломанной счрелкой). ХЛ ответ нейтрофилов имее т доста точно сложную форму и существенно зависит от амплитуды импульса. "Быстрая вспышка", развивающаяся сразу после электрического импульса, вероятно, обусловлена продукцией свободных радикалов на электродах кюветы непосредственно во время импульса тока (т.и. элсктро-хемилюминесценция).

Интенсивность ее пропорциональна амплитуде импульса и практически зависит от присутствия клеток в кювете.

ег

И о

Я"

и

и Я" о и Н Я

а

я

ч . 7 кВ/ен

ч 4кВ/ см

Лк—- 2кВ/см

• » 2 ыгт

Рис.1. Примеры кинетики хемилюминесценции суспензии нейтрофилов после воздействия импульсом электрического поля различной амплитуды (указано на рисунке). Среда - стандартный раствор Хенкса. Момент электрического импульса отмечен изломанной стрелкой. Длительность импульса здесь и далее, если не указано иначе - 90 мне.

Вторая фаза ХЛ ответа - "медленная вспышка" хемнлюминесценщш с максимумом через 1.5-2 минуты после импульса является наиболее ярко выраженным и хорошо воспроизводимым ответом нейтрофилов на воздействие электрического поля. При наиболее оптимальных условиях электроактивации амплитуда медленной вспышки сравнима с величиной ХЛ опзета нейтрофилов на добавление химических активаторов (формилированных трипцптидов или форболового эфира). В качестве параметра, отражающего степень активации

нейтрофилов использопали значение ХЛ сигнала в максимуме медленной вспышки (точнее, превышение ХЛ сигнала в максимуме над уровнем спонтанной хсмилюминесцснции клеток).

амплитуда кипульса, кВ/см

Рис.2. Зависимость ХЛ сигнала суспензии перитонеальных макрофагов крыс (1) и нейтрофилов периферической крови человека (2) от амплитуды импульса электрического поля. Концентрация клеток -1 млн/мл. Стандартная среда Хенкса

содержала 1.3 мМ СаС12 и 2 мМ М{£12- Концетрация люминола - 5 * 10"5 м. Каждая представленная точка является средним значением трех измерений.

На рис. 2 представлена зависимость ХЛ сигнала суспензии нейтрофилов периферической крови человека и перитонеальных макрофагов крыс в стандарной среде Хенкса от амплитуды импульса электрического поля. В первую очередь отметим наличие "порога" активации при напряженное™ поля Е около 1 кВ/см для нейтрофилов и около 0.5 кВ/см для макрофагов. Этот порог соответствует, вероятно, минимальному трансмембранному потенциалу, наведенному на полюсах клетки, который вызывает образование пор в мембране

(электропорацию). Действительно, на мембране сферической клетки в однородном электрическом поле наводится трансмембранный потенциал, пропорциональный диаметру клетки О и напряженности поля Е:

и = 3/2*Я*Е*счяв, где 6 - угол между вектором поля и радиус вектором выбранной точки. Очевидно, что максимальный потенциал возникает на полюсах клетки, обращенных к электродам.

Необходимо отметить, что геометрические размеры макрофага почти вдвое превышают размеры нейтрофила, и поэтому порог действия электрического поля для разных клеток также, соответственно, отличается. Так, если средний диаметр нейтрофилов принять равным 10 мкм, а макрофагов - 20 мкм. то потенциал пробоя мембраны обоих типов клеток оказывается равным примерно 0.75 В. Это значение соответствует известным литературным данным о потенциале пробоя мембран импульсами длительностью десятки микросекунд.

Отдельного внимания требует общий вид характерной зависимости ХЛ реакции фагоцитов от амплитуды электрического импульса. Видно, что существует оптимальное значение амплитуды импульса ( для нейтрофилов - 4 - 5 кВ/см), вызывающего максимальный ответ. Дальнейшее снижение ХЛ реакции при высоких значениях Е может быть вызвано повреждением клеток. Однако, специальная проверка с использованием витального красителя нитросинего тетразолия показала, что жизнеспособность нейтрофилов даже при напряженности поля 7 кВ/см снижается незначительно (не более 10 %). Другим возможным объяснением этого эффекта может быть сильное изменение

внутриклеточной концентрации ионов (в частости Са2+) из-за чрезмерной пермеабнлизации клеток.

2. Роль ионов кальция в активации хемилюминссцснции нейтрофилов.

Наличие в среде ионов кальция играет существенную роль в формировании ХЛ ответа ПМЛ в ответ на воздействие импульса электрического поля. При

изменении концентрации меняется и амплитуда ХЛ ответа и форма кинетической кривой. Отсутствие кальция в среде полностью отменяет активацию клеток. Более подробно влияние внеклеточной концентрации кальция на хемилюминесценцию нейтрофилов можно проследить на рисунке 3.

Рис.3. Влияние концентрации ионов кальция в среде на активацию хемилюминесценции нейтрофилов при электропорации импульсами различной амплитуды. (1) - 3 кВ/см. (2) - 4 кВ/см, (3) - 5 кВ/см. Остальные условия как в предыдущем эксперименте. Каждая представленная точка является средним значением трех измерений.

Зависимость ХЛ ответа нейтрофилов от концентрации внеклеточного кальция напоминает зависимость от амплитуды импульса (рис.2). Видно, что кривая этой зависимое™ для каждой амплитуды имеет максимум при некоторой

оптимальной концетрации Са-+. Превышение эт ой концентрации приводи т к снижению активации вплоть до полного ингибирования ХЛ ответа. Оптимальная концентрация кальция в среде, вызывающая максимальную активацию нейтрофилов. зависи т от амплитуды электрического импульса: с увеличением

амплитуды действующие концентрации внеклеточного С;»2+ уменьшаются от примерно 5 мМ при Е = 3 кВ/см до 0.75 мМ при Е = 5 кВ/см. Данный результат

является наглядным указанием того, что ноны играют ключевую роль в электроактивации ПМЛ. Факт смещения концентрационных 'зависимостей влево при увеличении амплитуды импульса находит естественное логическое объяснение: чем вышенапряженность электрического поля в импульсе - тем больше общая площадь пор в мембране и, тем самым, больше диффузионный поток кальция внутрь клетки. Конечно, для получения количественных оценок необходимо провести прямые измерения количества вошедшего в клетки кальция и концентрации свободного кальция в клетке после электропорации.

Техника применения чувствительных флуоресцентных зондов позволяет измерять концентрацию несвязанных ионов Са^+ непосредственно в цитоплазме клеток (Cobbold Р.Н., Rink T.J. 1987). Использованный нами зонд Quin-2-AM в эфирной форме легко проникает через плазматическую мембрану кле ток, где превращается клеточными эстеразами п спиртовую форму (Quin-2) и а таком виде накапливается в цитозоле. Квантовый выход флуоресценции зонда в

комплексе с ионом кальция при указанных условиях (Хвозб = 339 нм, ХфЛу = 5(Х) нм) примерно в 6 раз выше, чем у свободной формы зонда, что позволяет, зная константу устойчивости комплекса, определят!» концентрацию совбодных ионов

0а2+ в клетке.

Одиночный импульс внешнего электрического поля амплитудой 4 кВ/см вызывает быстрый (И) - 20 сек) подъем концентрации кальция в цитозоле и затем медленное плавное снижение (рис.4). Можно отметить целый ряд работ, в которых показана подобная кинетика изменения концентрации клеточного кальция при воздействии на нсГпрофилы обычными химическими активаторами

хемилюминесценции. Показано, что в кальциевой среде |Са2+]| за время порядка 1 мин поднимается от уровня покоя (около ИХ) нМ) до значения 4(Х) - 800 нМ и

затем возвращается к исходному уровню за 4 - 5 мин. Кинетика снижения уровня

кальция характеризует работу Са-АТФаз, активно откачивающих Са2+ из цитоплазмы в окружающую среду а также связывания кальция во

внутриклеточных органеллах, часть из которых играет роль Са-депо.

0.0

и

и

О

.0.

а

&

Я и ЕГ

0

ш 0.

РГ

1 в

7

0.3

Х-100 Е&ТА. 1 1

А кВ/см 4 1

.4_________I--------1....... 1 ],...» . 1,.,.

2 3 4 Время, мин

Рис.4. Изменение интенсивности флуоресценции зонда (2шп-2 (ХВозб= 339 нм, Хфлу= 500 нм) в суспензии нейтрофилов при электрическом пробое импульсом внешнего поля. Момент импульса (4 кВ/см) отмечен наломанной стрелкой, добавления Тритона Х-100 (0.1 %) и ЭГТА (2 мМ) - обычной стрелкой.

Добавление детергента Тритон Х-100 на рис.4 вызывает сильное необратимое повреждение мембраны и выравнивание концентрации кальция в нейтрофилах до 1 мМ. Это сопровождается повышением флуоресценции зонда до уровня насыщения (Рмакс)- Последующее добавление ЭГТА, наоборот, резко

снижает флуоресценцию вследствие хелатирования в среде. Остаточный уровень флуоресценции (Ямин) определяется снижением квантового выхода

флуоресценции чистого зонда до 1/6 от выхода комплекса (<Зшп-2][Са2+], а также

содержанием в образце других флуоресцирующих в данной области молекул. Зная параметры Рмакс и Рмин. а также константу диссоциации комплекса Кд> = 115 иМ можно определите настоящую концентрацию свободных ионов

(Са2+); = ч*Ко/(1-ч), где ц = (Р - РшшМРмакс - Рмин)

Рис.5. Влияние амплитуды импульса электрического поля на скачек

концентрации свободных ионов Са^+ в цитоплазме нейтрофилов при электрическом пробое. Абсцисса - амплитуда электрического импульса. кВ/см: ордината - концентрация свободных ионоз кальция в цитоплазме нейтрофилов после электропорацни, нМ. Концентрация Са2+ в среде - 1 мМ.

Естественно ожидать, что величина повышения внутриклеточной концентрации кальция ( как и величина ХЛ ответа) зависит от амплитуды импульса электрического поля. На рис.5 представлена такая зависимость.

.. Изменение концентрации кальция можно зафиксировать при амплитуде выше 1 кВ/см, т.е. данный порог совпадает с порогом на рис.2. Абсолютное значение скачка концентрации тем выше, чем больше амплитуда приложенного импульса, достигая при Е = 5 кВ/см значения около 1300 нМ; Измерение концентрации

кальция при больших амплитудах электрического поля затруднено из-за

достаточно низкой константы диссоциации комплекса [С2шп-2|[Са2+], Поэтому мы ограничили диапазон напряженности электрического поля значением 5 кВ/см.

Представляет несомненный интерес соотнести значение скачка концентрации кальция (рис.5) и ХЛ ответа нейтрофилов при электрическом пробое (рис.2). Как можно видеть, максимальный ХЛ ответ наблюдается, если

[Са2+|; достигает величин порядка 1 мкМ. Повышение концентрации выше этого предела приводит к снижению ХЛ ответа. Представленные результаты наглядно демонстрируют, что активация респираторного взрыва нейтрофилов при электрическом пробое является физиологическим ответом на временное повышение внутриклеточной концентрации кальция.

Необходимо отметить в данной связи работы Бэйкера и Найта по активации секреции адрсномедуллярных клеток, панкреоцитов. тромбоцитов, яиц морского ежа и др. клеток, подвергнутых электропермеабшшзацин. Авторы проводили

электрообработку клеток в среде с заданной низкой концентрацей ионов Са2+ и считали, что эта концентрация соответствует внутриклеточной концентрации

вследствие полного доступа внутреннего объема клеток для ионов среды.

Возможно,такая ситуация имеет место в действительности, т.к., по

утверждению авторов, состояние пермеабилизации изученных клеток

сохраняется достаточно долго (около 1 часа). В нашем случае время жизни пор в

мембране нейтрофилов значительно меньше(десятки секунд) и полного

выравнивания концентрации ионов вне и внутри клеток не происходит, ч то и подтверждается вышеприведенными результатами. Определенную роль в этом играют, вероятно, и более мощные сис темы регуляции и депонирования кальция а нейтрофилах. Конечно, поток кальция через поры может быть значи тельным и лишь небольшая часть всего кальция остается в свободной форме.

Оценку абсолютного количества кальция, проникшего в клетки при электрическом пробое проводили радкоизотопным методом. Клетки

инкубировали в среде, содержащей помимо стабильной формы ионов Са2+ некоторое количество изотопа Поскольку химические свойства

изотопов химических элементов не отличаются (в том числе сродство к специфическим насосам и хелаторам. коэффициент диффузии и размер) все

результаты, относящиеся к изотопу 45£а2+ можно распространить на поведение всего пула кальция. Содержание изотопа в клетке определяли как относительную удельную радиоактивность (И), которую определяли как отношениерадиоактивности изотопа в клетке к радиоактивности среды объема одной клетки.

Инкубация покоящихся нейтрофилов (без стимуляции) в растворе с 45са2+ приводит к включению радиоактивной метки в клетки и появлению базального уровня радиоактивности Ио- Опыты показали, что эта величина практически не зависит от времени инкубации и составляет приблизительно 0.1. Вероятно, К0 определяется, во первых, связыавнием Са^+ с поверхностью клеток, и во вторых, не полным удалением *5са при отмывании клеток от радиоактивной среды инкубации. Величины Я, которые представлены ниже, даны с учетом этого эффекта, т.е. за вычетом базального уровня.

Накопление ионов в нейтрофилах после действия одиночного импульса с различной пиковой напряженностью электрического поля (Е) показано на рис.6, кривая 1, Кривая 2 представляет соотвествующую зависимость хемилюмииес-центного отпета клеток. Эффект электрического поля наблюдается, как и на рис.2 ц рис.5, если амплитуда импульса превышает пороговую величину, равную приблизительно 1 кВ/см. Максимальному ХЛ ответу нейтрофилов при Е = 5 кВ/см соответствует величина отн. радиоактивности около 3.0, что ссютветствует эффективной абсолютной концентрации кальция в клетке 3.0 мМ или общему количеству кальция около 0.84 фмоль/кл. Поскольку ионы кальция входят в клетку через поры пассивно путем диффузии по градиенту концентрации, то накопление кальция может осуществляться до тех пор, пока

его внугрнклеточная концентрация сохраняется ниже, чем в окружающей среде (1 мМ). Таким образом, способность нейтрофилов аккумулировать значительные

количества кальция отражает работу Са2+- связывающих буферных систем. Буферная емкость таких депо очень высока. Так, обработка клеток 6 импульсами

амплитудой 4 кВ/см приводит к накоплению 3.2 фмоль ионов на одну клетку.

60| I 1 I I I I I «

5

О

»4

е<

N

М 81

¡5 1 2 3 4 5 6 амплитуда кипульса, кВ/см

иэ ё

о

Рис.6. Аккумуляция ионов кальция (кривая 1) и хемилюминесценция нейтрофилов человека (кривая 2) после электропорации. Абсцисса - амплитуда элект рического импульса. кВ/см: ордината - ХЛ ответ, отн.ед. (слева), и уд. отн. радиоактивность (справа) нейтрофилов. Интервал между электропорацией и процедурой отмывания клеток - 5 мин. Длительность электрического импульса -50 мкс. Концентрация в среде - 1 мМ.

Полученные данные свидет ельствуют об активном поглощении кальция

алектропорированной клеткой, причем высокая емкость депо, связывающих а значительной степени объясняет физиологические низкие значения скачка

концентрации свободного кальция при электрическом пробое. Известно, что свободный кальций в цитозоле составляет лишь небольшую долю общего кальция в клетке, большая часть которого содержится в клеточных депо. На роль таких депо предлагаются различные внутриклеточные органеллы (митохондрии, эндоплазматичесхий ретикулюм и др.), в частности, некоторые авторы доказывают существование специальных органелл микросомального происхождения, названных кальциосомы. Химачи и соавт. (1986) выделяют в нейтрофилах два пула кальция: митохондриальный пул с высокой емкостью и низким сродством к кальцию, и немитохондриальный пул с низкой емкостью и

высоким сродством к кальцию. Общее количество Са2+, содержащееся в немитохондриальиом пуле покоящихся клеток составляет 0.23 фмоль/кл. Примерно такое же количество может быть дополнительно аккумулировано в этом пуле при повышении концентрации свободного кальция до 1 мкМ. Митохондриальный пул связывает Са2+ только если его концентрация в цитоплазме превышает 1 мкМ. В присутствие 0.12 мМ свободного Сэ?+ около 7.5 фмоль/кл может быть аккумулировано митохондриальным пулом. Сравнивая эти

данные с нашими результатами можно заключить, что физиологическая Са^+ емкость нейтрофилов, проявляющаяся при максимальном ХЛ ответе (0.84 фмоль, Е = 5 кВ/см) определяется немитохондриальными органеллами. Абсолютная емкость (3.2 фмоль, 4 кВ/см * 6 раз) - митохондриями. 3. Оценка времени жизни и площади пор.

Важнейшее свойство пор в мембранах нейтрофилов - это их способность залечиваться за период времени 1-2 мин. Для определения времени жизни пор в

мембранах электропорированных нейтрофилов мы добавляли изотоп 45Сак суспензии клеток через разные интервалы времени после электрического пробоя. Очевидно, что зависимость поглощения клетками изотопа кальция от времени (I) отражает процесс залечивания пор. Действительно, оказалось, что чем больше и тем меньше измеряемая величина К. На рис.7 представлены эти

данные в полулогарифмических координатах. Легко заметить, что в процессе закрывание пор проявляются две экспоненты:

И = К1*схр(-1УТ1) + Я2*схр(-1/Т2).

О

20 40 60 ао интервале, сек

Рис.6. Залечивание пор в плазматической мембране нейтрофилов после электропорации. Абсцисса - интервал между электрическим импульсом и моментом добавления кальция в суспензию, сек.; ордината - огн. радиоактивность клеток после электропорации. Амплитуда импульса для обеих кривых показана на рисунке. Каждая точка является средним значением трех измерений.

Регрессионный анализ экспериментальных данных показал, что константы времени Т} и Т2 достоверно отличаются и равны около 5 и 50 сек. Это означает, что по видимому, в нейтрофилах при электропорации образуются два типа пор: короткоживущие и долгоживущие со средними временами жизни соответственно 5 и 50 сек. Конечно, возможно и другое объяснение. Сам процесс эволюции пор

может проходить о два этапа: сначала образуются большие поры, которые быстро (за 5 секунд) уменьшают свой диаметр, превращаясь в более устойчивые, живущие около 1 мин. Не найдено достоверного отличия скорости залечивания пор для двух значений амплитуды импульса (Т[ и Т2 равны соответственно 5.7+3.1 сек и 48.9+15.2 сек для Е = 4 кВ/см, и 5.0+1.6 сек и 55.5+8.6 сек для Е = 6 кВ/см).

Зная абсолютное количество проникшего через поры кальция и время жизни пор мы имеем возможность оценить общую площадь образующихся пор. Расчеты

(в предположении, что общая площадь пор уменьшается во времени по

*

двухэкспоненциальной зависимости) дают следующее уравнение:

Sp = hmVc.(Rirri + R2/T2)/D, Предполагая в качестве допущения, что коэффициент диффузии Са^+ D внутри поры равен D в воде (10*5 см^с-'), hm - толщина мембраны (5 нм), Vc - объем клетки (300 мкмЗ), а также используя экспериментальные значения Rl, R2- "П, Т2 получим: Sp ~ 247 нм^ при амплитуде импульса 4 кВ/см и 465 нм^ при 6 кВ/см.

Данные оценки дают представление об общей начальной площади пор, образующихся в плазматической мембране нейтрофилов при электрическом пробое. Для определения же среднего размера единичной поры мы использовали ряд меченных флуоресцентным красителем Texas Red декстранов различного молекулярного веса (3,10 и 40 кД). Суспензию нейтрофилов в среде, содержащей декстран, обрабатывали импульсом электрического поля. После

инкубирования в течение мин при температуре 0° С образец дважды отмывали от декстрана и измеряли флуоресценцию Texas Red в осадке. Как видно из рис.7 декстран 3 кД проникает в клетки при амплитуде импульса 3 кВ/см и выше, декстран 10 кД/см - при ампли туде 6 кВ/см и выше. В то же время при инкубировании нейтрофилов с декстраном 40 кД повышение напряжения вплоть до 9 кВ/см не приводит к достоверному увеличению флуоресценции осадка.

амплитуда импульса, кВ/сзс

Рис.7. Проницаемость пор, образующихся в результате электрического пробоя, для Texas Red меченных декстранов различного молекулярного веса.

Концентрация клеток в образце - 5'IOV1. Коцентрация декстрана -10 мг/мл. Абсцисса - амплитуда импульса, кВ/см; ордината - флуоресценция осадка клеток

за вычетом базальной флуоресценции (без электрообработки). Флуоресценцию измеряли при Хвозб = 595 им, Хфлу = 620 нм.

Согласно (Granath К.А., Kvist В.Е, 1967) радиус негидратированной эквивалентной сферы для декстранов 3,10 и 40 кД равен соответственно 1.4,2.3 и 4.3 нм. Таким образом, электрический импульс амплитудой 3 кВ/см образует поры радиусом около 1.4 нм, импульс 6 кВ/см - около 2.3 нм. В то же время даже при повышении амплитуды до 9 кВ/см радиус пор не превышает 4.3 нм. С другой стороны, сопоставляя эти данные с данными об общей площади пор легко вычислить количество пор, образующихся в результате электрического пробоя.

Действительно, если при амплитуде 3 кВ/см общая площадь Sp = 117 нм^, а площадь одной поры s = кР- = 6 нм^, следовательно число пор N = Sp/s - 20. Аналогично, при амплитуде 6 кВ/см: Sp = 465 нм^, s = 16.5 нм^, N - 28. Эти

результаты позволяют нам сделан, важный вывод: при увеличении амплитуды импульса увеличивае тся как диаметр, так и количество образующихся пор.

4. Влияние электрического пробоя па жизнеспособность иейтрофи.шп.

Практическое применение метода электропорации как для непосредственной активации респираторного взрыва нейтрофилов, так и в качестве инструмента изучения клеточной физиологии или просто для нагрузки клеток необходимыми веществами, в норме не проникающими через плазматическую мембрану, принципиально ограничивается необходимостью сохранения жизнеспособности. Действительно, при таком экстремальном воздействии, каким является электрический пробой внешним электрическим полем, необходимо быть уверенным, что нетрофилы не подвергаются значительным структурным и физиологическим нарушениям. Обычно жизнеспособность клеток определяют по включению в них витального красителя трипанопого синего. Другим хорошим тестом именно для электропорации может быть определение по тери нейтрофилами через образовавшиеся поры основного энергетического субстрата АТФ. На рис.8 представлены результаты такого теста. Суспензию нейтрофилов обрабатывали импульсом электрического поля инкубировали при данной

темпера туре 30 минут, после чего при температуре 37°С - 5 минут - для полного залечивания мембран нейтрофилов. После центрифугирования в надосадке определяли количества АТФ с помощью хемилюминесцентной люциферин-люцнферазной системы. Концентрацию АТФ в образце определяли исходя из отношения интегралов за 30 сек ХЛ сигнала образца и АТФ-стандарта. Содержание АТФ в клетках определяли таким же методом, предварительно лизировав клеточный осадок в растаоре Тритона Х-НХ). Данные на рис.8 выражены в % отношении количества вышедшего из клеток АТФ к общему его

содержанию в нейтрофилах. Видно, что при температуре 37°С потеря АТФ составляет незначительную величину. Достоверное повышение концентрации

АТФ в надосадке наблюдается только при амплитуде выше 6 кВ/см и достигает при 9 кВ/см 2% - 2.5%. Для сравнения мы измерили долю выходящего АТФ при

низкой температуре (0° С), когда поры являются открытыми в десятки раз дольше. При таких условиях удается зарегистрировать наличие АТФ в

надосадочной жидкости уже при амплитуде импульса 2-3 кВ/см. Максимальная

потеря АТФ наблюдалась при электрическом пробое импульсом 9 кВ/см и

достигала 30% - 32%. Такая значительная величина может существенно

отразиться на жизнеспособности нейтрофилов, что необходимо учитывать при

использовании низких температур для введения в электролорированные клетки

достаточно больших молекул.

Рис.25. Выход АТФ из нейтрофилов после электрического пробоя. Ось абсцисс: амплитуда импульса, кВ/см; ось ординат: содержание АТФ в окружающей среде после электропорации, % к общему содержанию АТФ в клетках. Каждая точка является средним значением трех измерений.

Таким образом, наши результаты показывают, что электрический пробой

нейтрофилов при выбранных нами условиях (температура 37° С. длительность импульса 50 - 90 мкс и амплитуда импульса 2-7 кВ/см) не сказывается сильно на их жизнеспособности и физиологической активности и может использоваться как метод ак тивации клеток в целях клинической диагностики фагоцитарного статуса нейтрофилов крови, а также как удобный подход в научных исследованиях физиологии клетки.

26

ВЫВОДЫ

1. Обнаружен эффект стимуляции респираторного взрыва нейтрофилов крови человека импульсами внешнего электрического поля длительностью 50 -90 мке и амплитудой 1 - 9 кВ/см. Показано, что клетки отвечают- на электростимуляцию вспышкой хемилюминесценции в присутствии люминола вследствие образования сквозных пор в плазматической мембране (электропорации) и проникновения через них в цитоплазму ионов Сц2+.

2. С использованием флуоресцентно-меченных декстранов и изотопа ^Са определены средние размеры, число и "время жизни" пор. образующихся в мембранах нейтрофилов под действием импульсов различной амплитуды. Проведенные оценки показали, что при стимуляции импульсами 3-6 кВ/см в клеточной мембране образуются 20 - 30 пор радиусом 1.4 - 2.3 нм , площадь

которых при температуре 37° С. уменьшается экспоненциально с эффективным временем около 1 мин.

3. Методом флуоресцентных зондов показано, ч то реальная концентрация свободного кальция в ци топлазме нейтрофилов после электропорации не

превышает 1 - 1.2 мкМ. В то же время общее количество ионов Са2+. проникающих в кле тку, может достига ть величины порядка 1 фмоль, что соответствует средней концентрации кальция на объем клетки - несколько миллимолей. Сделан вывод о существовании в неГпрофилах мощной буферной системы, поддерживающей концентрацию свободного кальция на низком уровне.

4. С помощью люцифернн-люциферазной биолюминесцентной системы определено количество АТФ. выходящего из клеток при электропорации. Показано, ч то даже при максимальной амплиуде импульса 9 кВ/см нейтрофилы

при температуре 37° С теряю т не более 2 - 2.5 % АТФ.

5. Предложено использован, электро стимуляцию нейтрофилов крови

человека как метод активации клеток в целях клинической диагностики их фагоцитарного ста туса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Малинин B.C.. Шаров B.C., Осипов А.Н.. Вилков С.А., Путинский А.В. Активация нейгрофилов человека в результате электрического пробоя мембран импульсами внешнего поля. - Биол.Мембр. 1989, т. 6, № 11, с. 1196-1202.

2. Malinin V.S.. Sharov V.S.. Putvinsky A.V.. Osipov A.N.. Vladimirov Yu.A. Chcmilumincsccnt reactions of phagocytcs induced by clcctroporation. The role of Ca2+ and Mg2+ ions. - Bioclcctrochemislry and Bioencrgctics, 19X9, v. 22. p. 37-44.

3. Malinin V.S.. Sharov V.S., Putvinsky A.V. The role о ГСа2+ ions in elcctoaetivation of neutrophils. - In: Sccond Int. School "Electromagnetic fields and Biomembrancs", Abstracts, Pleven, 1989. P. 174

4. Шаров B.C., Казаманов B.A.. Катариной К.Д.. Полников А.Г.. Путзииский А.В., Малинин B.C. Разработка хемилюминесцентных методов и приборов для клинической диагностики. - Отчет ИРЭ РАН № ЗОН-1-К9. М.: 1989. Кб с.

5. Малинин B.C.. Путвинский А.В.. ВладммировЮ.А. Электроактивация хсмилюминесценции фагоцитов. - В сб.: III Всесоюзное совещание по хемилюминесции. Тезисы. Рига: 1990. с. 76.

6. Schmidt Н.. Malinin V.S.. Putvinsky A.V.. Graba U. The determination of the

Ca2+ flux and a correlated chcmilumincsccncc in clcctroporatcd human Icueoeyics. - In: Biolumincsccncc and Chcmilumincsccncc. Eds. Stanley P.. John Wiley & Sons, Chiehcstcr: 1990. p. 59-62.

7. Malinin V.S.. Vilkov S.A.. Sharov V.S.. Putvinsky A.V. Synergic effect of a phorbol ester and calcium ions. - Bioclcclrochemislry and Biocncrgctics. 1992. v. 27, p. 49 - 52.

8. Malinin V.S.. Schmidt П.. Graba U.. Putvinsky A.V. Accumulation of calcium ions in clcctroporatcd human neutrophils. - Phys.Chcm.Biol.Med.. 1993. v. 1, p. 17-22.

9. Малинин B.C., Казаринов К.Д.. Путинский А.В.. Шмидт X. Изучение-механизма активации фагоцитарных клеток импульсами электрического поля. Препринт №5(587). ИРЭ РАН.М.: 1993.20 с.

10. Казаманов В.А., Казаринов К.Д.. Малинин B.C., Вилков С.А., Огансзова P.A.. Путвинский A.B. Биофизический анализ клеток, мембран и биологических жил костей. Теория и применение в медицине. Отчет ИРЭ РАН № 308-4-93, М.: 1993.86 с.

11. Казаринов К.Д., Малинин B.C.. Путвинский A.B. Определение фагоцитарной ак тивности нейтрофилов человека в микрообъемах цельной крови. Препринт № 6(588), ИРЭ РАН, М.: 1993.12 с.

12. Malinin V.S., Putvinsky A.V., Schmidt Н. Chcmilumincsccnt reactions of neutrophils upon cicclroporation. - In: Int. Conf. on Clinical Chemilumincscencc, Abstracts, Berlin, 1994. P-M9.

Подписано r, ii"1..!!!. 1 i,, i i „ li;; 4 r.

'<<орм;:т ШхК'1/Н>. (V.v!M J.'':' ycvi.iv. Tu|;„t. ПО

Рог.'чрнп ИРЭ 1411. Лак.:^,