Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Подвижность нейтрофилов в норме и патологии

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Подвижность нейтрофилов в норме и патологии"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СЧ'

ГАЛКИН Андрей Андреевич

ПОДВИЖНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ

03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Институте хирургии им. А.В. Вишневского РАМН

Научные консультанты:

Доктор медицинских на;,к. профессор А. А.Карелин Кандидат физ.-мат. наук Е.Н.Тимин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.М.Струкова доктор биологических наук, профессор Г.ИКлебанов

Член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор В.М.Земсков

Ведущая организация:

Московская медицинская Академия им. И.М.Сеченова МЗ РФ

Защита диссертации состоится '¡с у. 1997 г. в ^~^"часов на

/

заседании Специализированного ученого совета Д.053.05.35 при Биологическом факультете МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, В-234, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет^ ¿¿у^

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Ж

Автореферат разослан "Л^-С-1 " с1997 г_

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук /iL.ll ^

Умарова Б.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инактивация и поглощение нейтрофилами бактерий является основным механизмом зашиты оргаикша хозяина на ранних стадиях бактериальной инвазии. Обычно через 2-4 часа после внедрения инфекции начинается интенсивный выход нейтрофилов в ткани, задержка может привести к генерализации инфекции (Маянский, 1989). Способность фагоцитов к самостоятельному движению в значительной мере определяет эффективность их выхода в очаг воспаления.

Высокая реактивность нейтрофилов к разнообразным гаменениям внутренней среды у больных делает их важным объектом клинико-диагностических исследований.

Одним из показателей функционального состояния нейтрофилов является их подвижиостъ. Снижение подвижности нейтрофилов крови наблюдали при заболеваниях различной этиологии: бактериальных и вирусных инфекциях, онкологических заболеваниях, ожоговой болезни, некоторых наследственных заболеваниях, связанных с дефектами лейкоцитов (Оше е1 а1., 1978; Иеро, 1987). По-видимому, механизмы нарушения подвижности нейтрофилов во всех этих случаях различны, об этом свидетельствует разнообразие токсических факторов выделяемых в кровь и способных угнетать подвижность нейтрофилов. Из бактериальных факторов угнетающим действием обладают экзотоксины, липополисахариды, ненасыщенные свободные жирные кислотыдемоатграктанты в высоких концентрациях, из сывороточных факторов - агрегированные иммуноглобулины и факторы комплемента, га тканевых факторов - гистамия, лейкотриены, кроме этого возможна аутоинтоксикация нейтрофилов токсическими продуктами генерируемыми пероксидазной системой при их активации различными стимулами

Диагностика функциональных изменений нейтрофилов может оказаться полезной для объективной оценки тяжести интоксикации и возможности осложнений заболевания, раннего распознавания септических состояний, а также для поиска специфических средств коррекции нарушений функций нейтрофилов.

В настоящее время в клинических исследованиях подвижности нейтрофилов широко применяются методы разработанные 20-30 лет назад, это метод миграции под агарозой и миграции в мшишпоровских фильтрах. Достоинство этих методов в простат« и дешевизне, но есть и существенные недостатки: во-первых регистрируется интегральная подвижность по перемещению клеточного фронта, т.е. по самым быстрым клеткам в популяции, во-вторых, эти методы исключают анализ подвижности индивидуальных клеток, в-третьих, для получения достоверной картины перемещения требуется значительное время (как минимум несколько часов).

Альтернативным этим методам исследования интегральной подвижности является визуальный метод исследования движения нейгрофилов на стеклах под микроскопом. Исследование индивидуальной подвижности нешрофилов на стеклах имеет давнюю историю (Haston, Wilkinson, 1988), прогресс в этой области исследований был связан с автоматизацией регистрации и анализа данных.

В 80х годах появляются полуавтоматические преобразователи оптического изображения в электрические сигналь! - т.н. дигитайзеры (Howard, 1982; Shields, Haston, 1985) и полностью автоматизированные методы регистрации и анализа подвижности клеток на базе систем обработки изображений на ЭВМ (Fisher et al, 1989; Туманов и др. 1990).

До последнего времени автоматизированные методы применялись только в экспериментальных исследованиях, нами впервые этот метод применен для экспресс-анализа подвижности лейкоцитов у больных. Метод позволяет получать интегральную картину поведения клеточной популяции и одновременно шучагь индивидуальное поведение клеток в норме, патологии и при различных экспериментальных воздействиях.

Исследование механизмов амебоидного движения открывает новые пути к модификации этой важной клеточной функции при лечении различных заболеваний, например, в ускорении заживления ран или притуплении воспалительной реакции при действии противовоспалительных препаратов, угнетающих выход в ткани лейкоцитов, а также задержки инвазии раковых клеток (Stossei, 1993).

Цель исследования. Изучение механизмов угнетения и стимуляции подвижности нейтрофилов и поиск специфических средств коррекции нарушений.

Задачи исследования.

1. Разработка метоле регистрации и анализа подвижности индивидуальных клеток и клеточной популяции.

2. Определение границ нормы подвижности.

3. Исследование зависимости нарушения подвижности нейтрофилов у больных

с хирургическими заболеваниями от тяжести состояния и хирургического вмешательства.

4. Разработка прогностических критериев по различным параметрам подвижности нейтрофилов у больных и доказательство принципиальной возможности оценки специфики нарушений подвижности

5. Исследование механизмов действия различных хемокинетиков в связи с возможным использованием для специфической коррекции нарушений подвижности нешрофилов.

Научная новизна. Разработано уникальное гфограммное обеспечение для регистрации и анализа подвижности нейтрофилов, по многим параметрам превосходящее известные зарубежные аналоги Впервые детально исследована гетерогенность популяции нейтрофилов по скорости движения, площади клеток и геометрии их траекторий движения. Применение средних для популяции показателей среднеквадратичного удаления позволило получить принципиально новые данные о различии механизмов действия двух хемокинетиков - альбумина и РМЬР. Фурье-анализ изменений площади нейтрофилов выявил несколько типов угнетения подвижности при действии вторичных посредников.

В клинических исследованиях метод автоматической регистрации и анализа подвижности нейтрофилов применяется впервые в мире. Впервые обнаружено хемокинетическое действие серотонина и его защитное действие на нейтрофилы больных с интоксикационным синдромом. Вводится новый прогностический показатель для больных - сдвиг частотных характеристик спектра изменения площади нейтрофилов.

Практическая значимость работы, Исследование носит как прикладной так и фундаментальный характер. В клинической практике может найти применение для оценки тяжести интоксикации, прогноза течения заболевания и в качестве экспресс-метода ранней диагностики сепсиса, а также для оценки эффективности лечебных мероприятий. Фундаментальный аспект проблемы заключается в мученик клеточных и молекулярных механтмоа двигательной активности нейтрофилов и ее нарушений, а также в поиске путей специфической коррекции.

Внедрение в практику. Разработанный коллективом авторов в содружестве клиник о-биохимической лаборатории и лаборатории кибернетики Института хирургии им. A.B.Вишневского метод апробирован на больных из отделения гнойных ран и ожогового центра Института хирургии им. A.B.Вишневского, а также больных ю МОНИКИ к 2Й Московской городской инфекционной больницы.

Основные положения, выносимые на защиту.

1 • разработан метод автоматической регистрации и анализа подвижности нейтрофилов, позволяющий проводить оценку шменений двигательной активности нейтрофилов в норме, патологии и при различных фармакологических воздействиях по большому числу показателей;

2 - определены показатели нормы подвижности и выявлены нарушения подвижности при заболеваниях различной этиологии;

3 - показана информативность метода при оценке тяжести состояния больных с

раневой инфекцией и эффективности проводимого лечения;

4 - с помощью фармакологических воздействий в эксперименте смоделированы

нарушения подвижности и показана принципиальная возможность различения типов нарушения, связанных с активацией и регуляцией;

5 - исследованы механизмы действия хемокинетиков, как наиболее вероятных

кандидатов на роль протекторов при интоксикационном синдроме;

6 - показана защитная роль серотонина при нарушениях подвижности у больных с интоксикационным синдромом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на Всесоюзном рабочем совещании по программе "Внутриклеточная сигнализация и ее использование для управления функциями органшма и биотехнологии"

(Москва, 1987); на заседании секции физиологии клетки Московского физиологического общества (Москва, 1989); на заседании Всесоюзного общества информатики и вычислительной техники, секции "Информатика в медицине" (Москва, 1990); на I Международном конгрессе патофизиологов (Москва, 1991); на симпозиуме стран СНГ "Пути передачи внеклеточного сигнала" (Звенигород 1993); на симпозиуме стран СНГ "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации" (Москва, 1993); на XII научно-практической конференции "Морфометрия в диагностике болезней" (Москва, 1994); на XVI Европейском конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Мадрид, 1995); Доклад на Президиуме РАМН о работе временной межинстигутской группы по теме: "Роль серотонина в организме человека и животных. Синдром серотониновон недостаточности." (Москва, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 статей.

Структура и объем работы. Диссертация включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, экспериментальную часть с изложением результатов исследований и их обсуждения, заключение, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на 200 стр. и иллюстрирована 26 рисунками и 17 таблицами. Список литературы содержит 254 источника, га которых 29 на русском языке и 225 на иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе изучали движение нейтрофипов, выделенных из крови человека (здоровые доноры и больные с гнойными ранами, ожогами, острой кишечной инфекцией, бронхиальной астмой).

Подвижность нейтрофилов исследовали на покровных стеклах. В основу, примененного нами, визуального метода положено исследование индивидуальной подвижности каждой клетки, последующий статистический анализ поведения большого количества клеток дает полную картину поведения всей популяции в целом.

ЭВМ обеспечение. Решение такой сложной задачи как идентификация мигрирующих клеток возможно на основе специализированных вычислительных комплексов по обработке и анализу изображений. Работа

выполнена на базе системы анализа изображений Magiscan 2А (Англия). Алгоритм и программа идентифицикацни клеток в процессе их миграции позволяют получить информацию о движении клеток с временным разрешением не ниже 1 секунды. Программа запоминает положение цешров масс клеток и обеспечивает покадровое (с выбранным интервалом времени) слежение за перемещением центра масс каждой клетки находящейся в поле зрения микроскопа. Программу можно условно разделить на две части: 1) оптическое выделение клеток в поле зрения микроскопа с помощью стандартного математического обеспечения Magiscan 2А (IMAGE ANALYSIS: Principles and Practice. A technical handbook produced by Joyce-Loebl, 1985), 2) иежкадровая идентификация клеток (установление соответствия номеров клеток в текущем и предыдущем кадре).

Выбирая по своему усмотрению величину межкадрового интервала экспериментатор имеет возможность регистрировать внешнее и внутреннее движение клеток. Под внешним движением подразумеваются перемещения сравнимые с диаметром клетки. Внутреннее движение отражает малые перемещения, в которых существенную роль играют изменения формы клеток.

Выделение неймрофилов из крови человека. Выделение нейгрофилов осуществляли из капли крови, взятой из пальца или из вены по известной методике ( Harris, 1953; Zigmood, 1977). Несколько капель крови помещали на маленькое покровное стекло и во влажной камере ставили в термостат при 37°С на 10-15 минут. Время инкубации определяет плотность посадки нейгрофилов на стекле. При 10-15 минутной инкубации плотность посадки не превышает 70 клеток в поле зренш микроскопа с объективом х 6,3. После инкубации стекло отмывали от сгустка и эритроцитов легким полосканием последовательно в трех стаканчиках с раствором Хенкса. Этот простой, атравматический способ выделения нейгрофилов основан на различии в адгезивности к стеклу различных клеток крови. Такой способ выделения позволяет получать практически чистую (95-98%) популяцию нейгрофилов.

Экспериментальные камеры. Покровное стекло с прилипшими к нему нейтрофилами переносили на предметное стекло, на котором предварительно нанесен валик вазелина по периметру малого покровного стекла, заполненный

средой Хенкса содержащей дополнительно I % человеческий сывороточный альбумин. Сверху препарат запечатывался большим покровным стеклом так, •по образовывалась глухая непересыхашая камера содержащая исследуемые клетки. Объем камеры не превышал 500 мкл.

В тех случаях, когда требовалось исследовать действие какого либо фармакологического агента на одни и те же клетки использовали камеру с протоком (Галкин и др., 1988; Галкин, Ходоров, 1988), отличающуюся от предыдущего варианта глухой камеры тем, что края камеры заливались расплавленным парафином, а с двух противоположных краев камеры были вплавлены тонкие стальные трубочки, через которые осуществлялась смена растворов. Объем камеры не превышал 700 мкл. Скорость протока приблизительно составляла 700 мкл/мин, что обеспечивало практически полную смену растворов за 2-3 минуты.

Камера для исследования хемотаксиса представляла собой пластину га плексигласа, в которой вырезались два углубления глубиной 1 мм и шириной 4 мм. Углубления разделены мостом шириной в 1 мм. Покровное стекло с прилипшими к нему нейгрофклами клали сверху (клетками вниз) так, чтобы стекло покрывало мост и углубления и прижимали зажимами, для того чтобы зазор между покровным стеклом и мостом не превышал 3-10 мкм. Введение хемоаттрактанта в одно из углублений приводило к возникновению линейного градиента хемоаттрактанта в узком зазоре моста, разделяющего два углубления (Zigmond, 1977).

Камеры с нейтрофилами помещали на термосгатируемый стол микроскопа Jenalumar. Регистрации) подвижности нейгрофилов проюводили не ранее чем после 20 минутной инкубации клеток на термостоле микроскопа при 37°С.

Регистрация внешнего движения Перемещением препарата на термостоле микроскопа выбирали участок с равномерной посадкой клеток. Вручную подбирали уровень подрезки для наиболее точного выделения контуров нейгрофилов от фона.

Темнопольное юображение клеток, полученное на микроскопе (Jenalumar, ГДР) с использованием объектива х 6,3 (размер кадра 512 х 512

мкм), подавалось на телекамеру Мав^кап и далее запоминалось в комплексе обработки изображений Май^сап 2А.

Интервал между кадрами в данном случае регистрации был выбран 1 минута. Удобство использования I минутного межкадрового интервала заключается в том, что за этот интервал времени нейгрофилы перемешаются в среднем на величину клеточного диаметра.

Программа позволяет вести регистрацию в течение 90 минут. Последовательно во времени соединяя центры масс клеток машина рисует их траектории движения. Математическая обработка полученной в эксперименте информации позволяет оценить среднюю скорость движения популяции нейтрофилов в мкм/мин, среднюю площадь нейгрофилов в популяции, построить гистограмму минутных перемещений и из нее определить процентное соотношение в популяции неподвижных, медленных и быстрых нейгрофилов, вычислять углы между двумя последовательными векторами перемещений и накопленные данные представлять в виде гистограммы распределения углов поворотов.

Регистрация внешнего движения позволяет оценить воздействие тех или иных химических и физических факторов на подвижность нейтрофилов (ускорение или замедление движения), проводить сравнение подвижности в норме и патологии.

Влияние различных активаторов, хемокинетиков и вторичных посредников на подвижность нейтрофилов оценивали по изменению средней скорости в препарате ю 30-70 клеток в камере с протокой или по усредненным данным экспериментов выполненных в глухих камерах.

Регистрация внутреннего движения. Для более детального исследования юменений подвижности, обнаруженных при регистрации внешнего движения, необходимо оценить внутреннее движение нейтрофилов, выражающееся в непрерывном изменении формы клеток, гфи котором перемещение центров масс клеток меньше клеточного диаметра.

Из большого числа наблюдений следует, что существенные изменения формы нейтрофилов за временной интервал менее 2 секунд встречаются довольно редко , поэтому для регистрации внутреннего движения межкадровый интервал выбран 2 секунды.

Исследование внутреннего движения производилось по двум направлениям: 1) анализ траекторий движения, 2) Фурье-анализ изменений площади клеток.

Анализ траекторий движения. Регистрацию движения производили с межкадровым интервалом 2 секунды. Использовали объектив х 6,3 (размер кадра 512 х 512 мкм). Длительность регистрации от 300 до 3000 кадров (от 10 до 100 минут).

Геометрические характеристики траекторий движения оценивали по среднеквадратичному удалению нешрофилов от исходной точки движения.

Центры масс движущихся клеток характеризуются набором х,у координат измеряемых через 2 секунды. Перемещение (кратчайшее расстояние) за i-ый кадровый интервал времени d,- вычисляется как различие х,у координат в начальной и конечной точках пути. Среднеквадратичное удаление D2 за время эксперимента вычисляется: I "

<Db= —Yd\

NX '

где N общее число приращений за время эксперимента.

Дополнительно программа позволяла вычислять среднюю скорость движения индивидуальных нентрофилов за 2-х секундные интервалы из отношения пройденного клетками пути по траектории движения к времени регистрации (количество кадров).

Фурье-анализ изменений площади клеток. Регистрацию изменения площади клеток в процессе движения производили с межкадровым интервалом 2 секунды. Использовали объектив х 16 (размер кадра 196 х 196 мкм). Регистрировали не менее 256 кадров (обычно, от 500 до 1000 кадров).

Вычисление спектра мощности изменений площади клетки проводили классическим способом с использованием теоремы Винера-Хинчина.

Теорема Винера-Хинчина гласит, что спектр мощности является преобразованием Фурье от функции автокорреляции. Функция автокорреляции R(T) вычисляется как:

R(T) = Z S(t,)*S(t;+T),

где суммирование производится по всем точкам t; измеренной кривой изменения площади нейгрофила S(t,) с 2-секундным интервалом. При реальных вычислениях Т естественно принимает дискретные значения: Tj.

Спектр мощности: P(f)= 2 R(Tj)»cos(2;tf*Tj)

Значения P(f) на каждой частоте показывает интесивность выбранного цикла кзмеиений площади. Если P(f) велика, то это означает что клетка имеет выраженную цикличность на этой частоте.

Среди и реактивы. Нормальной средой являлся стандартный раствор Хенхса, в который добавляли 10 мМ Hep es и 1 % человеческий сывороточный альбумин.

Состав раствора Хенкса (г/л): NaCl - 8; NaHCOj - 0,35; Na2HP04 - 0,06; KCl - 0,4; KHjP04 - 0,06; MgCl2 - 0,1; MgS04 - 0,1; CaClj - 0,14; глюкоза - 1; pH 7,3; температура 37 С.

Реактивы: dbt cAMP - дибутир ильный аналог цАМФ Sigma (США); dbt cGMP - дибугир ильный аналог цГМФ Sigma (США); А23187 - Са++ ионофор Sigma (США); РМА - форболовый эфир (phorbol 12-myristate 13- acetate), активатор протеинкиназы С Sigma (США); FMLP - formyl-methionyl-leucyl-pheuylalaniae (Calbiochem); Con-A - конканавалин-А (Sigma); LPS -липополисахарна E. coli (Sigma); PHA - фитогемагглютинин Phaseolus vulgaris (Sigma); Серотонин адипинат (Институт Биофизики МЗ СССР); человеческий сывороточный альбумин Fluka (Швейцария);

Статистическая обработка результатов осуществлялась с использованием методов вариационной статистики и определением достоверности различий по t-критерию Стьюденга. Все значения представлены, как среднее арифметическое + ошибка среднего. Различия считались значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Исследование внешнего движения нентрофилов

1.1 Регистрируемые параметры движения. Регистрацию двигательной активности нейгрофилов, выделенных из крови здоровых доноров, производили с 1 минутным межкадровым интервалом в течение 20 минут. Наблюдается прямая зависимость пути, пройденного каждым нейгрофилом по

траектории движения от времени (Рис.1). В популяции имеются клетки проходящие большой или малый путь за одно и то же время, т.е. клетки имеют различную скорость движения. Скорость каждой клетки в среднем более или менее постоянна, несмотря на флуктуации.

Рис.1. Случайное блуждание нейгрофилов, индивидуальные и средняя скорости.

Средняя скорость движения нешрофшгов в популяции (Рис.1 жирная линия) постоянна. Показатель средней скорости популяции устойчив, как минимум, в течение 4-5 часов наблюдения и может служить хара>^теристикой двигательной активности популяции. Средняя популяционная скорость определяется средними индивидуальными скоростями клеток и популяционным составом, т.е. процентным соотношением быстрых, медленных и неподвижных нейтрофипов в популяции.

Количество

40

30

20 10 О

к

аоЮь

10 20 30 40

Сдвиг за мииуту, мкм

50

Рис. 2. Случайное блуждание нейгрофилов, гистограмма минутных сдвигов.

Гистограмма минутных перемещений (Рис.2) напоминает распределение скоростей броуновских частиц (распределение Релея). Видно, что скорости

некгрофилов не превышают 55 мкм/мин, а наиболее часто встречаются перемещения 5-10 мкм/мин. Поскольку средняя скорость индивидуальных клеток приблизительно постоянна, непосредственно по виду гистограммы минутных сдвигов можно определить количественное соотношение активных и пассивных клеток.

Подобно тому, как сделано в работе Е^ейгБ, ОШп£ (1984), всю популяцию клеток разделили на быстрые, медленные и неподвижные. За неподвижные мы приняли клетки, совершающие перемещения менее 2 мкм/мин, медленными мы считали клетки со скоростью от 2 до 7 мкм/мин и быстрыми - у которых скорость выше 7 мкм/мин. Процентное соотношение неподвижных, медленных и быстрых нейгрофилов дает нам численное представление о по пуля цио ином составе, количество

20 16 12 8 4

Jffl

А

1

дд

•180 -120 -60 0 60 120 180

углы поворотов, град

20 18 12 8 4 О

количество

Ш>......rtTOJ

fciflmmu

-180 -120 -60 0 60 120 180

углы поворотов, град Рис. 3. Гистограммы углов поворотов в норме (А) и при хемотаксисе к FMLP (Б).

Для исследования внутриклеточной анизотропии, связанной с образованием псевдоподий при блуждающем движении вычисляли угол между

двум* последовательными векторами перемещений (за каждые 3 кадра), и накопленные данные представляли в виде гистограммы распределения углов (Рис.3). Из Рис.За видно, что в норме при блуждающем движении доминируют углы + 45°. Если просуммировать углы в диапазоне + 90°, т.е. выделить те клетки, которые двигаются вперед по отношению к предыдущему перемещению, то выясняется, что они составляют 77-80 % от общего количества. Этот факт говорит о том, что за минутный интервал псевдоподия образуется преимущественно на переднем конце клетки, или о том, что время переориентации направления движения клетки превышает одну минуту. В условиях хемотаксиса к ГМ1.Р (в градиенте концентраций от 0 до 10"8М), когда доминирует направленное движение, сумма углов в диапазоне ± 90° превышает 90% (Рис.Зб).

Таким образом, для оценки внешнего движения выбраны два основных параметра: 1) средняя популяционная скорость и 2) популяционный состав.

1.2 Определение нормы подвижности. Контрольная группа состояла из 37 здоровых доноров. Средняя скорость движения нейгрофилов в группе здоровых доноров была 8,8 + 0,2 мкм/мин, а процентное соотношение неподвижных, медленных и быстрых нейгрофилов в популяции было соответственно 16:28:56. Средние популяционные скорости распределены в диапазоне от 7 до 11 мкм/мин, эти значения мы приняли соответственно за нижнюю и верхнюю границы нормы. Таким образом, значения по пуля цио иной скорости ниже 7 мкм/мин мы принимаем как ту или иную степень нарушения подвижности нейгрофилов, а значения выше 11 мкм/мин - как ту или иную степень стимуляции подвижности В пограничных случаях необходимо обращать внимание на популяционный состав нейгрофилов.

1.3 Подвижность нейтрофипов у больных с раневой инфекцией. Средняя скорость движения нейгрофилов в препаратах, выделенных из крови тяжелых больных с раневой инфекцией, оказалась значительно ниже таковой у здоровых доноров. Гистограмма распределения минутных перемещений нейтрофилов у таких больных сильно сдвинута влево и максимум скоростей находится в диапазоне 1-2 мкм/мин. Следует отметить, что нарушения подвижности нейгрофилов больных носят устойчивый характер, несмотря на то, что клетки находятся в нормальной физиологической среде.

Эти результаты дали основание для предположения, что подвижность нейгрофилов может служить объективным показателем тяжести состояния больных с раневой инфекцией.

Были исследованы 2 группы больных (по 28 человек в каждой группе) ю отделения гнойных ран и раневой инфекции Института хирургии им. A.B.Вишневского, отличающихся по тяжести состояния.

Таблица 1.

Средняя скорость движения и процентный состав нейтрофнлов в группах

здоровых доноров и больных с раневой инфекцией

ГРУППЫ СКОРОСТЬ НЕПОДВИЖ МЕДЛЕННЫЕ БЫСТРЫЕ

мкм/мин % % %

ЗДОРОВЫЕ 8,8 ±0,2 16 28 56

СР. ТЯЖЕСТИ 6,5 ±0,3 27 34 39

ТЯЖЕЛЫЕ 3,3 ±0,3 58 27 15

Средние популяциокные скорости нейгрофилов для групп людей, подобранных по такому общему признаку как тяжесть состяния, различаются статистически достоверно по критерию Стьюдента (Табл. I).

Средние популяциокные скорости нейгрофилов в группе тяжелых больных распределены в диапазоне от 0 до 6 мкм/мин. Широкий диапазон средних скоростей нейгрофилов в этой группе объясняется тем, что тяжелые больные подвергаются наиболее интенсивным лечебным воздействиям (операции, гемосорбцш, плазмаферез, ангибиотикотерапия и др.). В группе больных средней степени тяжести популяционные скорости распределены в диапазоне от 4,5 до 9 мкм/мин частично перекрывая диапазоны тяжелых больных и нормы.

Перекрытие распределений скоростей между группами можно объяснить с одной стороны - значительной степенью субъективности определения степени тяжести состояния клиницистами, а с другой стороны - характером лечебных мероприятий.

Ухудшение общего состояния больного сопровождается уменьшением средней скорости движения нейгрофилов, уменьшением числа быстрых клеток и увеличением числа неподвижных клеток в популяции. По одной произвольно взятой пробе крови можно лишь с определенной степенью вероятности судить о состоянии больного, однако, средняя скорость в популяции ниже 3 мкм/мин

безусловно говорит о тяжелом состоянии больного, а скорости - 5-6 мкм/мин с большой вероятностью соответствуют состоянию средней тяжести.

1.4 Динамика изменения подвижности нейтрофилов у больных с гнойной хирургической инфекцией в процессе лечения. Можно думать, что измерение подвижности нейтрофилов послужит одним га объективных показателей хода лечения и позволит оценить эффективность хирургического вмешательства и медикаментозных воздействий. С этой целью была исследована подвижность нейтрофилов у трех крайне тяжелых больных с гангреной стопы и сепсисом за сутки до радикальной хирургической операции и в послеоперационном периоде с частотой взятия проб не реже одного раза в 5 суток. У двух больных с благоприятным исходом лечения подвижность нейтрофилов в течение месяца вернулась к норме, больной, у которого подвижность нейтрофилов не вернулась к норме умер. Особо обратил на себя внимание факт резкого увеличения подвижности нейтрофилов у этих больных через сутки после радикальной операции.

Для выяснения влияния радикальной операции (ампутация конечности) на подвижность нейтрофилов пробы брали у 11 больных с диабетической гангреной стопы за сутки до операции и на первые или вторые сутки после операции До операции средняя скорость движения нейтрофилов в группе была 3,4 ± 0,5 мкм/мин, а после операции увеличилась до 7,1 + 0,5 мкм/мин.

Увеличение скорости движения после радикальной операции не может быть объяснено пополнением пула циркулирующих нейтрофилов молодыми клетками го костномозгового пула. Сравнение процентного состава неподвижных, медленных и быстрых нейтрофилов с определяемой параллельно формулой крови не выявляет корреляций.

Увеличение скорости движения нейтрофилов после радикальной операции мы объясняем устранением основного очага интоксикации организма больного.

Для проверки интоксикационной гипотезы угнетения подвижности нейтрофилов были проведены эксперименты по влиянию сыворотки крови тяжелых больных с гнойными раками на подвижность нейтрофилов здоровых доноров, исходно находившихся в аугосыворотке. В трех экспериментах скорость движения нейтрофилов в аугосыворотке до подачи сыворотки

больного была (в мкм/мин) 8,9; 12,1; 8,1 , а после подачи сыворотки больного соответственно, 3,7; 5,4; 4,1. Аллосыворотка здоровых доноров угнетающего действия не оказывала.

В клинической практике давно применяются разнообразные тесты на токсичность биологических жидкостей. Разработанный нами метод экспресс-анализа подвижности нейтрофилов одновременно может служить тестом на токсичность сыворотки.

1.5 Нарушение подвижности нейтрофилов у ожогов их больных, больных с острой пищевой токсикоинфекцией и больных бронхиальной астмой. В каждой группе исследовано по 5 больных. Группу ожоговых больных составляли тяжелые больные из Всесоюзного ожогового центра с площадью ожогов свыше 50% поверхности тела. Пробы брали на 3-5 сутки после ожога, когда микробная интоксикация незначительна. Группу больных с острой пшцевой токсикоинфекцией составляли пациенты клинической инфекционной больницы

Ы 2 с тяжелой сальмонеллезной эвдотоксинемией. Пробы брали в 1-2 сутки после отравления. Группу больных бронхиальной астмой составляли пациенты МОНИКИ с тяжелым и крайне тяжелым течением болезни в период обострения.

У ожоговых больных и больных с пищевыми отравлениями интоксикация приводит к сильному угнетению подвижности нейтрофилов, сравнимому с тем, что наблюдали в группе тяжелых больных с раневой инфекцией. У больных бронхиальной астмой угнетение подвижности нейтрофилов значительно менее выражено и соотвует таковому у больных средней тяжести с раневой инфекцией (Табл.2).

Таблица 2.

Скорость движения и процентный состав неподвижных, медленных и быстрых нейтрофилов у ожоговых больных, больных с острой пшцевой

токсикоинфекцией и б ронхиальной астмой

БОЛЬНЫЕ ОЖОГИ ПИЩЕВАЯ ТОКСИКОИНФ БРОНХИАЛЬНАЯАС ТМА

N=5 Скор. % состав мкм/мин н:м:б Скор. % состав мкм/мин н:м:б Скор. % состав мкм/мин н:м:б

СРЕДНИЕ 3,2 62:24:14 2,1 75:19:6 6,3 31:31:38

ОШ.СРЕДН 0,4 0,5 0,5

Тяжесть состояния больных определяется степенью бактериальной обсемененности, объемом повреждения тканей и функциональными нарушениями органов. По-видимому, у больных бронхиальной астмой токсический компонент не определяет тяжесть состояния, а у ожоговых больных интоксикация, скорее всего, связана с объемом повреждения тканей.

1.6 Моделирование нарушений подвижности нейтрофилов с помощью фармакологических воздействий. Перед нами встал вопрос, можно ли показатель скорости движения нейтрофилов использовать для дифференциальной диагностики нарушений подвижности нейтрофилов? Этот вопрос, разумеется, имеет не только теоретический интерес, его решение важно и для правильной диагностики, прогноза и коррекции течения болезни. С этой целью мы испытали разнообразные фармакологические воздействия, по литературным данным вызывающие угнетение двигательной активности нейтрофилов здоровых доноров.

Угнетение подвижности нейтрофилов, выделенных из крови здоровых доноров, можно добиться разнообразными путями: 1) через специфические рецепторы активации на плазматической мембране, 2) через внутриклеточные вторичные посредники, включающие биохимические каскады минуя рецепторы, 3) прямым воздействием на структуры цитоскелета, 4) неспецифическими воздействиями, такими как резкое изменение pH, снижение температуры или солями некоторых металлов.

1.6.1 Действиерецепторних активаторов. Известными активаторами нейтрофилов, действующими через специфические рецепторы являются формилпегттид (FMLP), конканавалин А (Con-А), фигогемагглютинин (РНА), липополисахарид E.coli (LPS).

При действии FMLP в активирующей концентрации KV'M наблюдалось значительное уменьшение скорости случайного блуждания нейтрофилов. До подачи FMLP средняя скорость движения в шести экспериментах, выполненных в камерах с протоком, была 9,6 + 0,4 мкм/мин, после подачи FMLP скорость упала до 4,5 + 0,4 мкм/мин. Различия статистически достоверны (Р<0,05). В концентрации 10"^ FMLP не подавляет подвижность нейтрофилов

полностью, угнетение подвижности происходит резко в среднем на 4 мкм/мин и устойчиво сохраняется по крайней мере в течение 1 часа.

Коиканавалин А (Соа-А) и РНА, подобно FMLP, вызывали резкое и сильное уменьшение скорости движения нейтрофилов.

LPS, в отличие от предыдущих активаторов, вызывал плавное постепенное уменьшение скорости движения в течение 1 часа.

Возможно, что различие в кинетике действия исследованных активаторов связана с тем, что FMLP, Соа-А, РНА активируют нейтрофилы (один га компонентов действия) через мобилшацию внутриклеточного Са", тогда как LPS не мобилизует внутриклеточный Са" (ВштеЦ, 1990).

Наибольшим угнетающим действием обладают лектины Соа-А и РНА, наименьшим - LPS. Для LPS значения скорости приведены после 40-50 минут его действия (Табл.3).

Таблица 3.

Скорость движения нейтрофилов при действии FMLP, Соп-А, РНА, LPS.

СРЕДНЯЯ СКОРОСТЬ ДВИЖЕНИЯ НЕИТРОФИЛОВ мкм/мин

N=5 FMLP Соп-А РНА LPS

(10-*М) (100 мкг/мл) (100 мкг/мл) (60 мкг/мл)

СРЕДНЕЕ 4,5 2,7 3,7 5,2

ОШ.СРЕДН 0,4 0Т2 0,1 0,7

1.6.2 Действие вторичних посредников. Для повышения внутриклеточной концентрации Са" применяли кальциевый ионофор А23187. Для увеличения внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов (сАМР и cGMP) применяли проникающие в клетку дибутир ильные производные этих веществ. Активацию лротеинкиназы С осуществляли с помощью форболового эфира РМА, являющегося аналогом естественного вторичного посредника диацилглицерина.

Влияние вторичных посредников на подвижность нейтрофилов оценивали по изменению средней скорости в препарате из 40-50 клеток в глухой камере и в камере с протоком. Скорости движения измерены через 0,5 -1 час после приложения агентов (Табл.4).

Таблица 4.

Скорости движения нейтрофилов (мкм/мин) при действии вторичных _посредников_

N=5 А23187 (Ю-'М) РМА (10'5М) сАМР (5*10'5М) cGMP

СРЕДНИЕ 4,8 4,1 5,0 11,7

ОШ. СРЕДИ 0,4 0,5 0,4 0,5

А23187, РМА, сАМР уменьшают скорость, a cGMP - увеличивает скорость движения по сравнению с нормой Исследования в камерах с протоком показали, что угнетающее действие кальциевого ионофора А23187 развивается постепенно. Угнетающее действие форболового эфира РМА в трех случаях из пяти развивалось резко, а в двух случаях плавно. Dbt сАМР вызывал резкое угнетение подвижности нейтрофилов.

1.6.3. Действие агентов разрушающих цитоскепет. Было исследовано влияние колхицина, агента препятствующего сборке микротрубочек, и цитохалазина В, разрушающего акгиновые михрофиламе1ггы, на скорость движения нейтрофилов.

Колхицин в концентрации 0,5 мт/мл вызывал постепенное в течение 1 часа сильное снижение скорости до 3,9 + 0,4 мкм/мин (N=5). Скорость движения нейтрофилов при действии колхицина определяли через 1 час после начала воздействия.

Цигохалазин В в концентрации 5 мкг/мл вызывал быстрое и очень сильное угнетение двигательной активности нейтрофилов. В 5 экспериментах средняя скорость была 1,5 + 0,1 мкм/мин

1.6.4. Неспецифическое угнетение подвижности. Уменьшение рН до 6,0 в 5 экспериментах приводило к полному ингибированию подвижности нейтрофилов. Увеличение рН выше 8,0 приводило к значительному уменьшению скорости движения.

Плавное охлаждение препарата от 37°С в течение 90 минут до 23°С вызывало плавное уменьшение скорости движения от 8,8 мкм/мин в начале эксперимента, до 3,8 мкм/мин в конце эксперимента, а нагревание препарата от 22°С до 37"С, наоборот, вызывало плавное увеличение скорости от 3,1 до 7,8 мкм/мин.

Угнетение движения нейтрофилов наблюдалось при действии солей C0CI2 и MnClj в концентрации 5 мМ. В проточной камере исходная средняя скорость движения нейтрофилов до подачи СоСЬ в 5 экспериментах была 8,6 ± 0,5 мкм/мин, а после подачи СоСЬ 4,6 ± 0,3 мкм/мин. Подобное же угнетение было в 2 экспериментах с МпСЬ.

Несмотря на то, что нами не были исследованы концентрационные зависимости действия угнетающих агентов, даже применение их в фиксированных концентрациях позволяет обнаружить различия в глубине и динамике снижения скорости движения нейтрофилов. В тех случаях, когда различные агенты вызывают приблизительно одинаковое угнетение подвижности (вторичные посредники) показатель средней скорости движения нейтрофилов не позволяет выявить специфику их действия, однако, при визуальном наблюдении за поведением нейтрофилов обнаруживаются различия в юменении характера движения, проявляющиеся в изменении площади и формы клеток. Эти данные указывают на необходимость, дополнительно к показателю средней скорости движения, проводить оценку показателей внутреннего движения нейтрофилов.

Особый интерес представляет тот факт, что среди исследованных фармакологических агентов, угнетающих движение нейтрофилов большинство оказывает активирующее воздействие. Активация нейтрофилов разнообразными агонистами всегда выражается в генерации супероксид-аниона и дегрануляции. Эти два процесса сцеплены между собой и в литературе встречаются единичные примеры их разобщения (Korchak et al., 1984; Thelen et al., 1993).

Литературные данные о связи подвижности нейтрофилов с их активацией носят фрагментарный характер.

Нами было изучено влияние на подвижность нейтрофилов активаторов, действующих через специфические рецепторы на плазматической мембране, таких как формилпептиа (FMLP), конканавалин А (Con-А), фитогемагглютинин Phaseolus vulgaris (РИА), бактериальный липополисахарна из Е. coli (LPS) и, активаторов, действующих минуя специфические рецепторы на плазматической мембране, таких как кальциевый ионофор А23187 и форболовый эфир (РМА)-активатор протеинкиназы С. Все вышеуказанные препараты применяли в

концентрациях, которые по литературным данным вызывают активацию нейтрофклов.

Каким образом активационные процессы могут вызывать угнетение случайного блуждания нейгрофилов неизвестно. Наиболее широко распространено представление, что активаторы, такие как FMLP и РМА, вызывают увеличение адгезивное™ нейгрофилов к субстрату (Roos et aL, 1987)

В своем объяснении угнетающего действия активаторов мы исходим из того, что нейгрофкл многофункциональная клетка обладающая функциями движения и секреции Одновременное осуществление обеих функций без ущерба для каждой из них невозможно.

Классическим примером связи движения с секрецией служит двухфазый двигательный ответ нейгрофилов на увеличение концентрации FMLP. Пороговая концентрация FMLP, вызывающая хемокинез около пиковая

концентрация, вызывающая максимальный хемокинез - 10"®М, эта же концентрация является пороговой для дегрануляции неГпрофилов, дальнейшее увеличение концентрации FMLP угнетает двигательную активность и усиливает дегрануляцию ( Robertson, Grutsch, 1987). Подобная зависимость подвижности и секреции от концентрации агониста обнаружена при действии С5а фактора комплемента (Ehrengruber et al., 1994).

В настоящее время общепризнана концепция, что структурной основой двигательной активности немышечных клеток служит цитоскелет состоящий из актина, миозина, тубулина и большого числа разнообразных актинсвязывающих белков (Stossel, 1993). Важную роль цитоскелега в движении нейгрофилов подтверждают и наши эксперименты с действием колхицина и цигохалазина В.

Участие цитоскелета в кальций-зависимой секреции гранул различными секретирующими клетками считается показанным (Глебов, 1987).

Последние литературные данные указывают на то, что эффектор ные механизмы двигательной активности и экзоцигоза у нейгрофилов, по-видимому, кальций-независимы ( Lafiäfian, Hallett, 1995; Limdqvist et al., 1994). Роль цитоскелета в транслокации гранул и дегрануляции нейтрофилов неясна.

Мы предполагаем, что угнетение двигательной активности нейтрофилов при активации связано с частичным переключением структур цигоскелета с двигательного аппарата на секреторный.

В отличие от известных активаторов нейтрофилов, стимулирующих секрецию, сАМР не только угнетает двигательную активность нейтрофилов, но и блокирует активацию (Кош, 1982; Ouiann et aL, 1987). По-видимому, регуляторное действие сАМР основано на ингибировании общих структур, отвечающих как за движение нейтрофилов, так и за секрецию.

1.7 Действие веществ ускоряющих движение нейтрофилов.

1.7.1 Хемокинетическое действие формилпептида. Формилпегггид (FMLP) в концентрациях 10'"- Ю"10М не влиял на скорость движения нейтрофилов здоровых доноров. Нерегулярное увеличение скорости наблюдалось при концентрациях FMLP 10"9М, по-видимому, эту концентрацию можно рассматривать как пороговую для нейтрофилов человека. Устойчивый хемокинетический эффект FMLP наблюдался при концентрации 10'8М.

Эксперименты выполнены в камере с протоком, что позволяло измерять скорость, процентный состав неподвижных, медленных и быстрых клеток в популяции и по углам поворотов оценить вероятность движения вперед в диапазоне ±90° до подачи FMLP и после подачи FMLP (Табл.5).

Таблица 5.

Влияние FMLP (10'8М) на скорость движения, процентный состав в популяции неподвижных, медленных и быстр их нейтрофилов и вероятность углов

поворотов в диапазоне ± 90°.

ДО ПОДАЧИ FMLP ПОСЛЕ ПОДАЧИ FMLP

N=15 Скорость % состав Углы % Скорость % состав Углы %

мкм.мин км: б + 90° мкм.мин н:м:б + 90°

Средние 8,8 17:28:55 78 11,5 14:20:66 78

Ош.среди 0,3 0,4 0,5 0,5

РМЬР вызывает увеличение скорости движения нейтрофилов в среднем на 2,7 мкм/мин, различия скоростей в двух группах статистически значимы (р<0,05).

Сравнение процентного содержания в популяции неподвижных, медленных и быстрых клеток до- и после подачи БМЕР указывает на сложный характер действия этого агента. РМГР слабо стимулирует двигательную

активность неподвижных клеток, но стимулирует активность остальной части популяции.

Вероятность углов поворотов не изменяется, этот факт говорит о том, что хемокинегическое действие ПИЬР в условиях равномерной подачи отличается от его хемокинетического действия в градиенте концентрации при хемотаксисе (см. Рис.Зб). В случае хемотаксиса к ГМЬР доминирует эффект поддержания выбранного направления движения вдоль градиента концентрации, в отличие от этого при равномерной подаче 1*М1_Р ориентация движения клеток не изменяется по сравнению с нормой, а возрастание скорости движения может бьггь объяснено увеличением элементарного шага или изменением частоты и длительности периодов активности и покоя.

1.7.2 Хемокинетическое действие человеческого сывороточного альбумина

Сывороточный альбумин используется как обязательный компонент нормальной среды для нейгрофилов. Отсутствие сывороточного альбумина в среде приводит к сильному угнетению двигательной активности нейгрофилов. По литературным данным, хемокинетическое действие сывороточного альбумина связывают с уменьшением адгезии нейгрофилов к субстрату.

Из Таблицы 6 видна обшая закономерность увеличения скорости движения нейгрофилов с увеличением концентрации сывороточного альбумина в растворе Хенхса, при этом процентное содержание неподвижных клеток уменьшается, а быстрых - увеличивается.

Таблица 6.

Скорость движения и процентный состав неподвижных, медленных и быстрых

нейгрофилов в зависимости от концентрации альбумина в среде

ЭКСПЕР. 0,5 % АЛЬБУМИН 1 % АЛЬБУМИН 2% АЛЬБУМИН

N=5:37:5 СКОР. % состав СКОР. % состав СКОР. % состав

икм/мин н:м:б икм/мин н:м:б икм/мин н:м:б

СРЕДНЕЕ 7,8 26:27:47 8,8 16:28:56 12,6 11:17:72

ОШ.СРЕДН 0,5 0,2 0,8

1.7.3 Хемокинетическое действие серотонина на нейтрофилы здоровых доноров и больных с раневой инфекцией. Исследование влияния серотонина на подвижность нейгрофилов человека проведено в связи с тем, что в экспериментах на животных и в клинике показано благоприятное

терапевтическое действие экзогенного введения серогонина при интоксикационном синдроме (Симоненков и др., 1995).

Серотонин в концентрации 10"'г/мл в 17 экспериментах на нейтрофилах здоровых доноров оказьгаал умеретое хемокинетическое действие, средняя скорость бьша 10,5 + 0,3 мкм/мин, процентное соотношение неподвижных, медленных и быстрых клеток соответственно 13:22:65. Серотонин увеличивал среднюю скорость движения по сравнению с нормой на 1,7 мкм/мин, вызывал незначительное уменьшение процентного состава неподвижных и медленных клеток и увеличение быстрых и, практически, не влиял на углы поворотов. В отличие от ИМЬР, серотонин слабо стимулировал двигательную активность нейтрофилов здоровых доноров.

В концентрации 10"7г/мл серотонин вызывал умеренное угнетение двигательной активности нейтрофилов здоровых доноров. Значения средней скорости в 3 экспериментах были: 6,2 ; 7,3; 5,8 (в среднем 6,4 мкм/мин) , что несколько ниже нижней границы нормы. Соотношение в популяции неподвижных, медленных и быстрых клеток было в среднем 26:37:37 .

В экспериментах на нейтрофилах 7 больных из отделения ран и раневой инфекции Института хирургии им. А. В. В ишневского серотонин в концентрации 10"'г/мл вызывал значительное увеличение средней скорости движения в группе с 5,1 ± 0,6 до 9,1 + 0,6 мкм/мин, процентное соотношение неподвижных, медленных и быстрых нейтрофилов в популяции соответственно изменялось с 42:29:29 до 23:19:58, т.е. серотонин уменьшал количество неподвижных и медленных клеток в популяции и соответственно увеличивал количество быстрых клеток.

Визуальные наблюдения за исходным состоянием нейтрофилов больных показали, что клетки как правило сильно распластаны на стекле, с этим связано увеличение средней площади клеток по сравнению с нормой, форма клеток блинообразная или сигарообразная с отсутствием выраженной морфологической поляризации, изменения формы клеток носят хаотический характер, вследствие чего не образуются полноценные псевдоподии и двигательный акт оказывается незавершенным. Из трех форм движения, характерных для нормальных клеток - " ползание"," перекатывание" и" прыжки" у больных клеток сохраняется только "ползание", и то в

редуцированной форме. Сильное распластывание и хаотические юменения формы клеток скорее всего указывают на потерю жесткости подмембранного кортикального цигоскелета.

При действии серотонина на больные клетки их форма нормализуется, появляются головной и хвостовой концы клеток, псевдоподии становятся выраженными и двигательный акт приобретает завершенность. Появляются также "перекатывания" и "прыжки". Если в больных клетках наблюдалась патологическая зернистость серотонин ее не устранял.

В качестве рабочей гипотезы можно думать, что серотонин каким то образом влияет на полимеризацию актина и формирование полноценного кортикального цигоскелета, разрушенного под влиянием интоксикации. В пользу этого предположения говорят литературные данные о прямом связывании серотонина с актином в культуре эцдотелиальных клеток и стимуляции полимеризации актина (Alexander et al, 1987), а также об иммуномодулирующем и хемокинетическои действии серотонина на макрофагальные клетки (Sandler et aL, l975;Sihtermaa etal, 1985).

У больных с интоксикационным синдромом серотонин не только восстанавливает подвижность нейгрофилов in vitro, но и нормализует гемодинамику, вследствие чего наблюдается увеличение потребления кислорода тканями (Симоненков и др., 1996).

Резюмируя все вышеизложенные данные по оценке внешнего движения нейгрофилов можно отметить, что: 1) Средняя скорость движения популяции нейгрофилов представляет собой сложный показатель, в котором отражаются внутренняя двигательная способность каждого индивидуального нейтрофила и популяционный состав неподвижных, медленных и быстрых клеток. 2) По отдельно взятой пробе можно только с некоторой долей вероятности судить о степени угнетающего или стимулирующего воздействия. 3) Совокупность показателей внешнего движения нейгрофилов (средняя скорость, популяционный состав, утлы поворотов) в больших группах статистически достоверно выявляет угнетающее или стимулирующее действие фармакологических агентов и дает предварительную информацию о возможных механизмах изменения подвижности нейгрофилов. 4) Для более

детальной оценки специфики воздействий необходимо исследовать внутреннее движение.

II. Исследование внутреннего движеиия нейтрофилов Регистрация внешнего движения позволяет оценить двигательную активность нейтрофилов по среднему перемещению центров масс клеток за 1 минуту, однако, она не дает информацию о поведении клеток в периоды межкадрового интервала.

Дня детального анализа движения нешрофилов межкадровый интервал выбран 2 секунды, за этот промежуток времени не наблюдается существенных изменений формы клеток, а перемещения центров масс значительно меньше диаметра клеток.

11.1. Анализ траекторий движения по среднеквадратичному удалению от исходной точки. График среднеквадратичного удаления от исходной точки движения популяции клеток в растворе Хенкса + 1% человеческий сывороточный альбумин в двойном логарифмическом масштабе хорошо укладывается на прямую (Рис. 4), характеризующуюся углом наклона (Н) и точкой пересечения с осью у (А), т.е. эта величина может бьггь описана функцией sqrt(<D2>)= A*tH

Функция среднеквадратичного удаления содержит две независимых переменных А, Н. Величина А отражает перемещение центров масс нейтрофилов в микронах за 1 секунду (элементарный шаг), а величина Н (тангенс угла наклона прямой) является характеристикой, отражающей геометрическую сложность траекторий в популяции (заплетенность трека).

При чисто случайном характере движения, подобно броуновским частицам, величина Н примет значение 0,5, при движении по траектории в виде прямой линии показатель Н примет значение I. Тот факт, что величина Н в норме блшка к 0,7, говорит о неслучайном характере движения или, другими словами, о наличии некоторого предпочитаемого направления движения.

среднеквадратичное удаление, мкм

1000

100 10 1

1 10 100 1000 10000 Время, с

Рис.4. График среднеквадратичного удаления нейтрофилов от исходной точки движения. Среднеквадратичное удаление и время даны в логарифмических координатах.

II. 1.1. Внутрипопуляционний анализ гетерогенности нейтрофилов, связь скорости движения клеток с геометрией траектории. Рассматривая траектории движения в нормальной среде разных клеток из одной и той же популяции можно видеть разнообразие форм треков начиная от плотного клубка и вплоть до сильно расплетенных нитей.

Если под визуальным контролем в одной и той же популяции выбрать клетки имеющие траектории движения в виде клубка, то показатель H среднеквадратичного удаления таких траекторий лежит в области 0,5 - 0,6. У клеток с расплетенной траекторией значения H приближаются к 0,8. При регистрации внешнего движения, клетки, имеющие траекторию в виде клубка, были оценены как медленные.

Литературные данные указывают на то, что быстрые и медленные клетки в популяции различаются характером поведения и геометрией траекторий, быстрые клетки имеют меньшие углы поворотов и меньше времени гфебывают в фазе покоя, медленные клетки больше "отдыхают" и углы поворотов у них больше (Howard, 1982; Hartman et al., 1994), однако, во всех этих случаях не проводился анализ по всей популяции, а только по произвольно выбранным клеткам.

Нам представлялось необходимым провести объективный анализ отношения скорости движения и геометрии траектории С этой целью все

клетки в популяции имеющие одинаковую среднюю скорость были собраны в группы и для каждой группы определены значения Н.

Вычисление средних скоростей движения клеток за 2 секунды из отношения длины траектории к времени регистрации показывает, что в нормальном растворе скорости клеток в популяции распределены в диапазоне от 0,3 до 1,3 мхмИс. Для увеличения статистики группы клеток, имеющие одинаковые скорости движения, составлялись т 10 независимых экспериментов так, что в каждой группе оказывалось по 20-30 клеток.

' Выяснилось, что в широком диапазоне скоростей движения нейгрофилов от 0,6 до 1,3 икм/2с показатель Н среднеквадратичного удаления не зависит от скорости и имеет значения 0,65 - 0,75 и только у клеток с очень низкой скоростью движения 0,3-0,4 мкм/2с показатель Н близок к 0,5 (Рис. 5, 1%). Клетки с низкой скоростью движения вероятно сильно адгезивны к субстрату, их траектории всегда образуют клубок. Клетки со средней и высокой скоростью движения формируют траектории со средней степенью заплетенности.

среднеквадратичное удаление (Н)

Рис. 5. Зависимость показателя Н среднеквадратичного удаления от скорости движения клеток в популяции при различных концентрациях альбумина (даны у каждой кривой).

Полученные нами данные показывают, что связь между скоростью движения и геометрией траекторий проявляется только при сравнении очень медленных клеток с быстрыми, если исключить ш рассмотрения очень медленные клетки, то, в широком диапазоне скорость движения не зависит от

ориентации движения клеток, что согласуется с литературными данными других авторов о независимом от скорости движения (вменении ориентации нейтрофилов (Bultmann, Gniler, 1983; Van Duijn, Van Haasteit, 1992; Grnler, 1993).

11.1.2. Связь скорости движения с площадью клеток. В этих же 10 экспериментах была определена средняя площадь нейтрофилов в норме, она составляла 152 + 4,7 мкм2. Скорость движения нейтрофилов в широком диапазоне 0,5-1,3 мкм/2с не связана с абсолютными значениями площади клеток , и только у клеток с очень низкой скоростью 0,3-0,4 мкм/2с площадь клеток достоверно увеличена, что вероятно связано с повышенной адгезнвностью и сильным распластыванием на стекле.

Относительные изменения (девиация) площади клеток коррелируют со скоростью движения. У клеток с низкой скоростью 0,3-0,4 мкм/2с и увеличенной распластанностью на стекле девиация площади (SD) составляет 69%, а у более быстрых клеток со скоростями 0,5-0,9 мкм/2с девиация площади 10-14%. Стабилизация девиации площади на уровне 13-14% наблюдается у очень быстрых клеток со скоростями 0,9-1,3 мкм/2с.

Если принять, что относительные изменения площади нейтрофилов отражают интенсивность изменения формы клеток в процессе движения или мощность "внутриклеточного двигателя", то можно сделать вывод о неоднородности популяции нейтрофилов по адгезивности к субстрату и мощности "внутриклеточного двигателя". Малоподвижные клетки сильно адгезивны и маломощны, а быстрые клетки менее адгезивны к субстрату и имеют большую мощность "внутриклеточного двигателя".

Неоднородность популяции по адгезивности к субстрату и мощности "внутриклеточного двигателя" вероятно определяет широкий разброс нормы средних скоростей, обнаруженный при регистрации внешнего движения в группе здоровых доноров. Возможно, что широкий разброс нормы связан с методической сложностью выделения клеток без нарушения субпопуляционното состава.

Представленные нами данные дают основания для предположения, что форма траектории движения определяется соотношением адгезивности клетки к стеклу и мощности "внутриклеточного двигателя", стремящегося преодолеть

силу адгезии, а действие хемокинетиков может проявляться, либо через изменение адгезии к субстрату, либо через повышение мощности "внутриклеточного двигателя".

11.1.3. Влияние концентрации альбумина на геометрию траекторий движения, определение нормы подвижности нейтрофилов. С увеличением концентрации альбумина показатель Н среднеквадратичного удаления возрастает от 0,6 в 0,1% альбумине до 0,9 в 2% альбумине, это говорит о том, что с увеличением концентрации альбумина траектории движения выпрямляются.

Высокоадгезивная и малоподвижная часть клеточной популяции, показатель Н которой находится та нелинейном участке графика (Рис.5) и, имеющая скорость движения менее 0,7 мкм/2с, малоинформативна в определении среднего для всей популяции показателя Н, но вносит существенную ошибку в среднее значение Н.

Для сравнения действия различных хемокинетиков нет необходимости проводить детальный по клеточный анализ по всей популяции, а достаточно выбрать клетки, имеющие скорость движения выше 0,7 мкм/2с и определить по ним среднее значение Н для популяции.

Средние значения элементарного шага А (0,691) и показателя геометрии траекторий Н (0,730), полученные в II экспериментах с 1% альбумином представляют норму, с которой можно сравнивать данные по действию хемокинетиков.

Теоретически возможны два крайних ' случая хемокинетического действия фармакологических агентов: 1) увеличение Н без изменения А -выпрямление траекторий движения (действие на клеточный компас), 2) увеличение А без изменения Н • (действие на клеточный мотор)

С увеличением концентрации альбумина от 1% до 2% среднее значение Н увеличивается, тогда как среднее значение элементарного шага А практически не меняется (Табл. 7).

Ранее было показано, что при регистрации с 1 минутным межкадровым интервалом увеличение концентрации альбумина приводит к увеличению скорости движения нейтрофилов, теперь можно внести уточнение, что этот хемокинетический эффект альбумина связан с выпрямлением траекторий

движения клеток, а не с увеличением элементарного шага. Такой тип хемохннеза называется клинокинезом.

11.1.4. Хемокинетическое действие формилпептида. При регистрации с 1 минутным межкадровым интервалом РМ1Р в равномерной концентрации вызывал устойчивый хемокинетический эффект на нейтрофилах здоровых доноров. Для выяснения механизма хемокинетического действия ШЬР было проведено 9 экспериментов по определению показателей А и Н среднеквадратичного удаления (Табл. 7).

РМЬР, по сравнению с нормой, сильно увеличивает элементарный шаг А и мало изменяет геометрию траекторий Н. Хемокинез обусловленный увеличением элементарного шага называется ортокинезом. Таким образом, ГШ-Р при подаче его в равномерной концентрации 10"8М оказывает на нейгрофилы преимущественно ортокинетическое действие, выражающееся в увеличении мощности "внутриклеточного двигателя", клинокинетический эффект выражен слабо.

Таблица 7.

Сравнение хемокинетического действия альбумина и РМЬР_

ХЕМОКИНЕТИКИ А Н

1% АЛЬБУМИН (норма) 0,691 + 0,023 0,730 ±0,011

2% АЛЬБУМИН 0,692 + 0,017 0,880 + 0,010

РМЬР ю'м 0,770 + 0,038 0,764 + 0,028

Результаты исследования внешнего и внутреннего движения при действии ИМЬР в градиенте концентраций (хемотаксис) и при равномерной концентрации (хемокинез) дают основание думать, что механизмы хемокинетического действия РМЬР в этих двух случаях существенно различаются; при хемотаксисе доминирует клинокинетический эффект, а при равномерной подаче - ортокинетический эффект.

11.2. Фурье-анализ изменения площади нейтрофилов. Движение нейтрофила в нормальной среде (р-р Хенкса + 1% сывороточный альбумин) сопровождается циклическими, нерегулярными изменениями площади клетки. Эти изменения связаны с периодичностью вытягивания и округления клеток. Характерные времена этой периодичности от 20 до 60 секунд. Более быстрые

цикли связаны с образованием незавершенных псевдоподий и полиподиальных форм, а также с изменением проекции клеток при подтягиваниях и поворотах.

Спектр изменения площади непрерывен во всем частотном диапазоне от 1/2 до 1/120 циклов в секунду, максимум мощности спектра приходится на частоты 1/30 - 1/50 циклов в секунду, т.е. на частоты вытягивания и округления клеток (Рис. 6).

Сравнение спектров изменения площади у быстрых и медленных клеток в популяции, имеющих приблизительно одинаковый тип траекторий движения выявляет приблизительное сходство спектральных кривых, различие состоит лишь в мощности спектров. V быстрых клеток изменения во всем частотном диапазоне более интенсивные чем у медленных клеток.

11.2.1 Фурье-анализ изменения площади нейтрофилов при действии вторичных посредников. Целью настоящей работы было: 1) смоделировать различные типы нарушения подвижности нейтрофилов, выделенных из крови здоровых доноров, с помощью экзогекно прикладываемых агентов, повышающих концентрацию или активность различных внутриклеточных вторичных посредников (cAMP, cGMP, Са", аналог естественного вторичного посредника диацилглицерина - форболовый эфир РМА), 2) в условиях приблизительно одинакового угнетения подвижности (средней скорости движения) по характеристикам изменения площади клеток выявить особенности нарушения подвижности нейтрофилов, 3) сопоставить объективно регистрируемые параметры с визуально наблюдаемым поведением клеток.

Увеличение внутриклеточной концентрации вторичных посредников вызывало характерные изменения формы и средней площади клеток (Табл. 8).

Таблица 8.

Характерные формы и средние площади нейтрофилов в норме и при действии вторичных посредников (цифрами даны средние площади в кв. микронах.

полученные по 100 измерениям)

Норма cGMP сАМР А23187 РМА

150 162 151 126 204

слабо поляризованы поляризованы округлы сильно округлы, сжаты сильно поляризованы, распластаны

Средние значении величины площади клеток и их формы отражают физико-химическое состояние примеибранных кортикальных структур и адгезивностъ к субстрату. Динамика изменения площади клеток в процессе движения дает информацию о мощности процессов сокращения-расслабления и характерных частотах образования псевдоподий.

Одновременно с измерением площади клеток проводился анализ траекторий движения по среднеквадратичному удалению от исходной точки движения, для того, чтобы приблизительно оценить характерные изменения двигательной активности. Значения средней площади клеток (S), девиации площади (SD), показателей А и H в норме и при действии cAMP, А23187, РМА, cGMP приведены в Таблице 9. Значения площади (S) и элементарного шага за секунду (А) даны в относительных единицах.

Из этих данных просматриваются некоторые характерные черты поведения клеток при действии вторичных посредников. сАМР незначительно, по сравнению с нормой изменяет S и Н, но уменьшает SD и А, т.е. геометрический характер траекторий мало изменяется, но явно ослабляется интенсивность движения. А23187 уменьшает S и Н, но не влияет на SD и А, это связано с большим временем пребывания клеток в округленном состоянии и появлением больших узлов в траекториях движения. РМА сильно увеличивает S, мало изменяет А и уменьшает SD и Н, эти изменения объясняются тем, что РМА вызывает распластывание клеток, устраняет полиподиальные формы, в результате чего активным становится только передний конец клеток, кроме этого РМА увеличивает адгезивностъ хвоста, что проявляется в появлении длинных нитей в хвосте клетки, клетка оказывается привязанной к стеклу и траектории движения напоминают клубок. cGMP слабо влияет на S и А, но увеличивает SD и Н, клетки интенсивнее вытягиваются за счет большей морфологической поляризации и траектории движения спрямляются.

Таблица 9.

Средняя площадь клеток (5), девиация площади (БО), мгновенная скорость (А) и среднеквадратичное отклонение (Н) при действии вторичных посредников

Вещества N S (откед) SD (%) А (отед) H

НОРМА 3

Среднее 927 9,8 1,471 0,712

Ош. средн. 29 0,4 0,190 0,029

сАМР 5

Среднее 870 8,1 0,938 0,666

Ош.средн 47 0,6 0,162 0,005

А23187 . 4

Среднее 793 10,1 1,410 0,642

Ош. среда. 60 0,9 0,144 0,025

РМА 3

Среднее 1135 8,6 1,195 0,562

Ош.средн. 20 0,7 0,115 0,042

cGMP 3

Среднее 923 10,4 1,433 0,756

Ош.средн. 33 1,0 0,058 0,007

Для построения спектров изменения площади выбирались клетки имеющие среднюю для данного препарата подвижность. К сожалению, программа суммации спектров большого числа клеток нами не разработана, в значительной мере из за того, что в препарате с плотной посадкой клеток происходит много слипаний клеток, в результате чего площадь слипшихся клеток резко возрастает, устранение таких артефактов требует большой ручной работы по вырезанию искаженных участков записи. Ввиду этого пришлось ограничиться анализом типичных изменений спектра индивидуальных клеток.

Все вещества угнетающие подвижность нейтрофилов (сАМР, А23187, РМА) уменьшают мощность спектра, но по разному изменяют частотные характеристики. сАМР не вызывает частотного сдвига по сравнению с нормой, А23187 вызывает сдвиг спектра в область высоких частот, а РМА - в область низких частот. cGMP не изменяет мощность спектра по сравнению с нормой и незначительно сдвигает спектр в область низких частот (Рис. б).

Спектральная плотность, отн. ед.

Частота, Гц

Рис. 6. Спектральные характеристики изменения площади нейтрофилов при действии вторичных посредников.

Объяснение обнаруженных фактов мы видим в исходно заложенных в клетках механизмах двигательной активности

Визуальное наблюдение за клетками позволяет выделить три типа перемещения, с которыми связаны флуктуации скорости и площади клеток.

1-й тип перемещения связан с образованием коротких тонких выростов, приклеиванием их к стеклу и подтягиванием сжатого, округленного тела клетки к одному га них. Этому типу соответствует перемещение путем перекатывания с хаотической направленностью. Возможно, что узлы в траекториях движения связаны именно с этим типом перемещений. 2-й тип перемещения связан с образованием широких, относительно длинных псевдоподий и подтягиванием или перетеканием тела клетки в направлении псевдоподии, при этом перемещение напоминает ползание с относительно устойчивым выбором направления. 3-й тип перемещения связан с сильной морфологической поляризацией клеток, он сопровождается отчетливыми сократительными волнами, бегущими от переднего конца клетки к хвосту. Этому типу соответствует наиболее быстрое ползание с устойчивой направленностью (наиболее выражен при хемотаксисе).

Выделенным трем типам перемещения соответствуют характерные частоты в спектре изменения площади нейтрофилов: 1-й тип - примерно от 1/2

до 1/8 циклов в секунду., 2-й тип - примерно от 1/6 до 1/40 циклов в секунду., 3-йтип- примерно от 1/30 до 1/120 циклов в секунду.

Мы считаем, что процентное соотношение этих трех типов перемещения в реальном движении клетки определяет мощность и частоту спектра изменения площади и может изменяться при действии вторичных посредников. Согласно этому утверждению сАМР равномерно угнетает все три типа перемещений и вероятнее всего это угнетение связано с общим ослаблением контрактильных структур клетки Известно, что киназа легких цепей миозина может бьпгь фосфор нлнрована каталитической субъединицей сАМР-зависимой протеинкиназы (Conti, Adelstein, 1981), это фосфорилирование ингибирует связывание кальмодулина и может быть одним из механизмов общего угнетения сократительной активности. С другой стороны, сАМР усиливает полимеризацию тубулина (Means et al., 1982), что может привести к увеличению ригидности клетки.

При действии на нейтрофилы кальциевого ионофора А23187 доминируют перемещения 1-го и 2-го типа, что отражается на спектре сдвигом в область высоких частот. Кортикальный слой нейтрофила образован перекрестно соединенными друг с другом актиновыми филаменгами образующими актюювую решетку. Кальций-зависимый белок гельзолин определяет жесткость решетки и тем самым ее способность к сокращению (Hartwig et aL, 1980), при высоких концентрациях Ca решетка теряет жесткость и сокращается, с чем, повидимому, связано уменьшение площади клеток. Другой причиной уменьшения площади может быть активация кальцием выхода калия m клеток, подобный механизм известен для лимфоцитов (Grinstein et al., 1982). Преобладание коротких выростов по всей поверхности нейтрофила возможно связано с тем, что Ca принимает активное участие в образовании стресс-фибрилл в образующихся псевдоподиях, в свою очередь на стресс-фибриллах локализуется кальмодулин, регулирующий активность киназы легких цепей миозина (Means et al., 1982). В комплексе с кальмодулином Ca вызывает деполимеризацию тубулина (Means et al., 1982). Возможно, что вышеназванными причинами можно объяснить уменьшение поляризованных форм при действии А23187.

При действии PMA нейтрофилы перемешаются исключительно по 2-му и 3-му типу, при этом спектр сдвигается в низкие частоты, снижение мощности спектра связано с тем, что значительная часть клетки пассивно распластана на стекле и не принимает участия в движении, активность проявляет только передний конец клетки. Основными причинами такого поведения нейтрофилов при активации протинкиназы С могут быть: снижение жесткости кортикального актинового слоя вследствие нарушения связи некоторых актинсвязывающих белков (в частности винкулина) с плазматической мембраной (Werth et aL, 1983) , уменьшение вязкости мембранных липидов (Па ль мина и др., 1992), активация Na/H ангипортера, вследствие чего повышается внутриклеточный pH (Grinstein et al., 1986) , известно также, что изменения внутриклеточного pH имеют прямое отношение к изменениям формы клеток (Faucher, Naccache, 1987). При действии cGMP преобладают перемещешм по 2-му и 3-иу типу. Известно, что cGMP принимает участие в элонгации клеток (Small et al., 1987), но механизм действия не изучен.

Таким образом, анализ изменения площади нейтрофилов при действии различных агентов позволяет различить механизмы угнетения подвижности по мощности и частотным характеристикам спектра. Вторичные посредники способны избирательно действовать на различные двигательные механизмы клетка

Прикладное значение для клиники этих данных заключается в том, что кальциевый ионофор А23187 и форболовый эфир РМА являются мощными активаторами нейтрофилов (критерием активации считается "респираторный взрыв" и секреторная дегрануляция), их действие имитирует возможную активацию нейтрофилов при хирургических заболеваниях, в отличие от этого сАМР деактивирует нейтрофилы, подавляет "респираторный взрыв" и дегрануляцию, по этим признакам его действие на нейтрофилы сходно с действием таких противовоспалительных препаратов как гидрокортизон и пироксикам.

Данные спектрального анализа позволяют выделить, как минимум, две формы угнетения подвижности при интоксикациях, связанных с увеличением внутриклеточной концентрации вторичных посредников: 1) угнетение, связанное с активацией нейтрофилов, сопровождающееся сдвигом спектров в

сторону высоких или низких частот (А23187, РМА) и 2) угнетение, связанное с регуляцией, происходящее без спектрального сдвига (сАМР).

11.2.2. Фурье-анализ изменения площади нейтрофипов у больных с гнойной хирургической инфекцией. В свете данных по действию вторичных посредников мы исследовали изменения площади нейгрофилов у тяжелых больных из отделения ран и раневой инфекции Института хирургии им. АВ.Вишневского РАМН.

У тяжелых больных с гнойными ранами средняя площадь нейгрофилов как правило увеличена, усилено распластывание на стеклах, понижена осморезистенгность (в наших экспериментах осмотический разрыв здоровых нейгрофилов при помещении их в дистиллированную воду происходил через 57 минут, а нейгрофилов от тяжелых больных с интоксикационным синдромом -через 3-4 минуты) это связано с потерей жесткости подмембранного каркаса клеток.

Мощность

1/128 1/1в 1/2 1/128 1/16 1/2 1/СЕК 1/СЕК

Исследование спектров изменения площади нейтрофипов у 15 тяжелых раневых больных с сахарным диабетом показало, что основной формой спектра является нормоподобная, или точнее сАМР-подобная (Рис.7а). У 6 больных с диагностированным сепсисом наблюдались сдвиги в частотных характеристиках спектра. У одного из них наблюдался устойчивый сдвиг в

нюкие частоты (больной умер), у пяти других отмечена неустойчивость спектра со сдвигами в разные сутки как в сторону высоких, так и низких частот. У септических больных преобладающей формой был сдвиг спектров в сторону высоких частот (Рис.7б,г). У 3 умерших больных без сепсиса на фоне сниженной подвижности наблюдался сдвиг спектра в область низких частот (Рис. 7в).

Таким образом, сдвиг частотных характеристик спектра на фоне общего угнетения подвижности нейтрофилов мы рассматриваем как показатель риска осложнений заболевания.

Как отмечают в своем обзоре по проблеме хирургического сепсиса Светухин и др. (1995) "совершенно очевидно, что в основе успешного лечения хирургического сепсиса лежит его ранняя диагностика". Разработка методов ранней диагностики сепсиса в настоящее время является актуальной хирургической проблемой и, возможно, что данный метод окажется полезным в решении этой проблемы. Выяснение механизмов нарушения подвижности нейтрофилов больных под действием бактериальных или сывороточных факторов позволит по новому подойти к тонкой дифференциальной диагностике некоторых заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

1) Анализ траекторий движения нейтрофилов показал, что скорость движения клеток определяется двумя независимыми механимами: а) механизмом, определяющим мощность "внутриклеточного двигателя" и, ответственным за величину элементарного шага, б) механизмом ориентации определяющим направленность движения.

2) Увеличение средней скорости движения нейтрофилов при увеличении концентрации альбумина связано с изменением ориентации и выпрямлением тр аектор ий дв юкекия ( клинокинез).

3) Увеличение средней скорости движения при действии FMLP в равномерной концентрации 10'8М определяется в основном увеличением мощности элементарного двигательного акта (ортокинез).

4) Фурье-анализ изменений площади нейтрофилов в процессе движения показал, что спектр непрерывен в диапазоне от 1/2 до 1/120 колебаний в секунду и в норме имеет максимум на частотах 1/40-1/50 колебаний в секунду.

5) Увеличение внутриклеточной концентрации вторичных посредников вызывает характерные изменения спектров. При действии сАМР уменьшается мощность спектра без частотного сдвига. При действии РМА уменьшается мощность спектра и он сдвигается в область низких частот. При действии А23187 уменьшается мощность спектра и он сдвигается в область высоких частот.

6) У тяжелых больных с гнойными ранами преобладающей формой спектра была сАМР подобная, т.е. снижена мощность спектра без частотного сдвига. Сдвиг в область высоких частот в спектре преобладал у септических больных, а сдвиг в область низких частот у больных с неблагоприятным исходом заболевания. Сдвиг частотных характеристик спектра у больных принимается как показатель возможности осложнений и критического состояния больного.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан метод автоматической регистрации и анализа подвижности нейтрофилов на базе системы анализа изображений Magiscan 2А, позволяющий исследовать влияние на подвижность нейтрофилов разнообразных фармакологических и токсических факторов, а также проводить экспресс-диагностику подвижности нейтрофилов у больных.

2. Популяция нейтрофилов гетерогенна, в ней имеются неподвижные, медленные и быстрые клетки. Средняя скорость движения популяции нейтрофилов является устойчивым показателем двигательной активности популяции. Показатель средней скорости движения позволяет статистически достоверно различать стимулирующие и угнетающие воздействия на нейгрофилы.

3. Обнаружено снижение подвижности нейтрофилов у больных с различной этиологией заболевания. Приведены данные в пользу интоксикационной гипотезы нарушения подвижности нейтрофилов у больных.

4. Показано стимулирующее действие серотонина на подвижность нейтрофилов у больных с интоксикационным синдромом.

5. Вещества вызывающие активацию нейтрофилов угнетают их подвижность.

6. Механизм хемокинетического действия ГМЬР различается в условиях градиента концентраций (хемотаксис) и в условиях равномерной концентрации.

7. Детальный анализ скоростей и траекторий движения индивидуальных нейтрофилов позволил различить два типа хемокинеза: клинокинез - при действии альбумина и ортошнез - при действии ИМЬР в равномерной концентрации.

8. Спектральный анализ изменений плошади нейтрофилов и анализ траекторий движения позволяют оценить специфику воздействия фармакологических агентов на поведение нейтрофилов, что открывает принципиально новые подходы к дифференциальной диагностике нарушений подвижности нейтрофилов у больных

9. На нейгрофилах больных с интоксикационным синдромом показано, чгго сдвиг частотных характеристик спектра может служить сигналом осложнения течения болезни.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Галкин A.A., Маляев A.A. Одиночные хлорные каналы высокой проводимости в мембране перигонеальных макрофагов мыши// Биологические мембраны. 1985. Т.2. N12. С. 1242-1246.

2. Галкин A.A., Ходоров Б.И. Участие фуросемид-чувствительной системы ионного котранспорта в саморегуляции объема макрофагов. Роль цигоскелета.// Биологические мембраны. 1988. Т.5. N3. С.302-307.

3. Маляев A.A., Галжин A.A. Кальций-активируемая калиевая проводимость мембраны пептониндуцированных перигонеальных макрофагов мыши.// Укр. физиологический журнал. 1988. Т.34. N5. С.79-84.

4. Галкин A.A., Туманов Е.А., Яковеико В.Н. Простой метод регистрации относительных объемных юменений адгезированных на стекле клеток.// Бюлл.экспер. биол. мед. 1988. N11. С.626-628.

5. Галкин A.A., Ходоров Б.И. Регулягторное уменьшение объема макрофагов в гипоосмотической среде обусловленное активацией фуросемид-чувствигельной системы ионного котранспорта.// Сб. "Внутриклеточная сигналипация". М. "Наука". 1988. С. 166-171.

6. Malyaev A.A., Gallun A.A. Ca-activated potassium conductance in the membrane of

pepton-induced peritoneal macrophages of mouse.// Journal biochemistry abstracts. 1988. PI. vol.15. ISS 9.

7. Galkin A.A., Khodorov B.l. The involvenient of furosemide-sensitrve ion cotransport system in the autoregulation of macrophage volume.// Journal chemoreception abstracts. 1989. vol. 15. ISS 3.

8. Туманов E.A., Галкин AA, Филиппов M.M., Сакович В.В., Карелин A.A., Тимин E.H. Метод автоматической регистрации и анализа миграции лейкоцитов на базе системы обработки изображений// Бюлл.экспер. биол.мед. 1990. N6. С.594-597.

9. Галкин A.A., Лковеико В.Н. "Способ определения сократительной функции живой клетки"// 1991. авт.свид. N 1627883.

10. Галхин A.A., Туманов Е.А., Филиппов М.М., Светухин A.M., Тимин E.H., Карелин A.A. Подвижность нейтрофилов у больных с раневой инфекцией.// Бюллэкспер.биол.мед. 1991. N5. С.491-495.

U. Galkin A.A., Tumanov E.A., Philippov M.M., Svetukhin A.M., Timia E.N., Karelin A.A. A magiscan study of neutrophil mobility in normal and pathological conditions// Abstr. Congress Internal. Soc. Pathophysiology. Moscow. 1991. P.283.

12. Галкин A.A., Туманов E.A., Филиппов M.M., Светухин AM., Тимин Е.Н. Экспресс-анализ подвижности нейгрофилов у больных с раневой инфекцией.// Сб. "Биохимические проблемы хирургии" М. 1991. С.43-47.

13. Тепляков В.Г., Каем Р.И., Втюрин Б.В., Панова Н.В., Диковская Е.С., Галкин А.А., Туманов Е.А. Роль функционального состояния полиморфноядерных лейкоцитов в патогенезе экспериментального сепсиса.// Бюлл.экспер.биол.мед. 1993. N4. С.430-432.

14. Галкин А.А., Туманов Е.А., Тимин Е.Н., Мисочко И.В., Карелин А.А. Влия>ше вторичных посредников на двигательную активность нейгрофилов. //Вопр. мед химии. 1994. N6. С.7-10.

15. Галкин А.А., Василенко И.А., Туманов Е.А., Кинетика эффекгорных реакций нейгрофилов при взаимодействии антигена с мембранными структурами клетки.// ВИНИТИ. 1995. N538-B95.

16. Симоненков А.П., Федоров В.Д., Федоров А.В., Смирнова В.И., Лужников Е.А., Маткевич В.А., Шугалев Н.П., Жирникова М.Л., Затолокин В.Д, Горпинич А.Б., Лковеико В.Н., Галкин А.А., Звягин А.А., Махмудова Л.С. Роль серотонина в организме человека и животных. Синдром серотониновой недостаточности// Вестник РАМН. 1995. N6. С.27-30.

17. Симоненков А.П., Федоров В.Д, Галкин А.А. Серотониновая недостаточность нейгрофилов.// Бюлл.экспер.биол.мед. 1996. N4. С.467-469.