Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние апоптоза нейтрофилов периферической крови

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Состояние апоптоза нейтрофилов периферической крови"

На правах рукописи

БАЛАШОВА Светлана Николаевна

СОСТОЯНИЕ АПОПТОЗА НЕЙТРОФШЮВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ

КРОВИ

03.03.01 — Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 МАЙ 2013

Г

Архангельск - 2013

005058513

Работа выполнена в лаборатории регуляторных механизмов иммунитета Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии природных адаптации Уральского отделения Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Ставинская Ольга Александровна

Официальные оппоненты: Данилова Раиса Игнатьевна

доктор биологических наук, профессор, ФГАОУ ВПО «Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова», заведующая кафедрой социальной работы и социальной безопасности института комплексной безопасности

Миролюбова Ольга Алексеевна

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет», заведующая кафедрой факультетской терапии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Защита состоится си-ОИ^Я- 2013 года в/3. ОСЬ асов на заседании

диссертационного совета Д 212.008.04 на базе ФГАОУ ВПО «Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 163045, г. Архангельск, пр. Бадигина, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова».

Автореферат разослан «03 » 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Старцева Лариса Фёдоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Нейтрофилы являются самой многочисленной популяцией клеток периферической крови, на долю которых приходится до 70% общего содержания лейкоцитов. Анализируя состав периферической крови, фактически можно оценить только 50% клеток гранулоцитов, т.е. циркулирующий пул. Оставшиеся 50% составляют пристеночные нейтрофилы, готовые выйти из сосудов в ткани для осуществления фагоцитоза и связанного с ним кислородного взрыва (А.Н. Маянский, 1989; И.С. Фрейдлин, 1998; Н.М. Калинина, 2008). Помимо фагоцитоза пристеночные клетки могут образовывать нейтрофильные экстрацеллюлярные сети (NET), способные фиксировать микроорганизмы благодаря трехмерной структуре (S. Yousefi, 2009; M.J. Kaplan, 2012). В свою очередь, циркулирующие нейтрофилы, находящиеся в периферической крови, не являются клетками, ограниченными в специализации. Они способны к молекулярной перестройке хроматина, реализации генетической информации, могут дифференцироваться под влиянием микроокружения в антигенпрезентирующие клетки (И.В. Нестерова, 2010).

Нейтрофилы секретируют огромное количество биологически активных веществ, в том числе почти все известные цитокины. Есть сведения, что гранулоциты способны активировать макрофаги, действуя на каспазу-6 и комплекс IL-lR/киназа-М (H. Kobayashi, 2011); могут стимулировать пролиферацию Т-лимфоцитов (1. Muller, 2009), инициировать созревание дендритных клеток (S. Boudaly, 2009), вызывать ССЬ2-зависимый хемотаксис Thl7 (M. Pelletier, 2010) и стимулировать секрецию гистамина из базофилов посредством HRA-N фактора (M.V. White, 1987). Кроме того, нейтрофилы осуществляют антителозависимую цитотоксичность, реализующуюся в реакциях противоопухолевой защиты (В.Н. Блиндарь, 2005).

Пролиферация нейтрофилов происходит в гемопоэтических элементах костного мозга, откуда в кровоток в физиологических условиях выделяются палочкоядерные формы. Продолжительность жизни нейтрофилов после выхода их из костного мозга составляет около 10 часов в циркулирующей крови и еще 2-3 дня в тканях (С.А. Луговская, 2001). Естественная гибель клеток совершается по механизму апоптоза, в очаге воспаления — преимущественно некрозом (J.F. Кегг, 1972; L. Wei-Chieh, 2011).

Существует несколько вариантов инициации апоптоза клетки. Внешний путь осуществляется за счет семейства рецепторов к фактору некроза опухоли, в частности, Fas-рецептора (АРО-1, CD95), TNFR1 (р55, CD120a), TRAIL-RI и RII и др. (W.C. Liles, 1996; Р.Н. Krammer, 1999), расположенных на клеточной мембране нейтрофилов. Внутренний путь программируемой гибели происходит в результате изменений в ядре и сопровождается увеличением концентрации Са2+ в цитоплазме, активизацией эндонуклеаз и клеточных протеаз, нарушением проницаемости мембраны митохондрий (D.J. McConkey, 1989; X. Liu, 1996). Есть сведения о малом содержании митохондрий в зрелых гранулоцитах, что приводит к значительному сокращению процессов

окислительного фосфорилирования и ограничению уровня митохондриальных белков, запускающих и регулирующих программу апоптоза (А.Н. Маянский, 1989; К.К. Peachman, 2001). Однако представлены убедительные доказательства достаточности этого минимального количества и спектра белковых молекул для инициации программируемой гибели нейтрофилов внутренним путем (В.М. Murphy, 2003).

Вместе с тем, сведения, касающиеся динамики апоптотической активности нейтрофилов под влиянием цитокинов, противоречивы. Данных о воздействии на нейтрофилы вазомоторных аминов (гистамина и серотонина) нет. Не ясно, как меняется программируемая гибель гранулоцитов от уровня их пролиферации, фагоцитарной реакции в физиологических условиях и при патологии.

Цель и задачи исследования. Цель работы — определить уровень апоптоза нейтрофилов в зависимости от их функциональной активности, цитокинового профиля, содержания вазомоторных аминов и лимфоидной реакции периферической крови.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить активность апоптоза нейтрофилов периферической крови у клинически здоровых людей и при патологии.

2. Выявить характер взаимосвязи апоптоза нейтрофилов с уровнем их пролиферации и фагоцитоза.

3. Установить влияние цитокинов и вазомоторных аминов на апоптоз гранулоцитов.

4. Изучить соотношение уровня апоптоза нейтрофилов и выраженности реакций со стороны лимфоцитов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Апоптоз нейтрофилов сопровождается увеличением количества палочкоядерных нейтрофилов, не влияя при этом на фагоцитарную их активность.

2. Уровень некроза значительно ниже программируемой гибели нейтрофилов, что способствует поддержанию клеточного гомеостаза без воспалительной реакции.

3. Активность апоптоза нейтрофилов ассоциируется с повышением содержания в крови IL-4, TNF-a, свободного лиганда TRAIL и серотонина.

4. Апоптоз нейтрофильных гранулоцитов снижает экспрессию рецепторов к главному комплексу гистосовместимости класса II на лимфоцитах.

Научная новизна исследования. Впервые выявлено, что увеличение количества апоптотических нейтрофилов AnV+/PI- в периферической венозной крови соответствует повышению концентрации палочкоядерных форм, отражающих пролиферативную активность клеток миелоидного ряда. Установлен механизм регуляции уровня апоптоза нейтрофилов посредством шеддинга лиганда sTRAIL в межклеточное пространство.

Научно-практическая значимость исследования. Материалы диссертации рекомендуются для использования в научно-экспериментальных исследованиях в области физиологии, иммунологии, в учебном процессе на

кафедрах общей биологии, клинической иммунологии и нормальной физиологии высших учебных заведений.

Полученные в работе данные о содержании апоитотических нейтрофилов AnV+/PI- и некрозных клеток AnV-/PI+ периферической крови у клинически здоровых людей могут быть использованы в качестве нормативов физиологических колебаний исследуемых нейтрофилов у человека в различных состояниях.

Материалы исследования внедрены в практику работы врачей медицинской компании «Биокор» (акт внедрения от 18.01.2013 г.) с целью повышения точности диагностирования и своевременного назначения лечебных мероприятий.

По результатам исследования разработан способ оценки эффективности лечения хронических воспалительных процессов дыхательной системы (патент на изобретение РФ № 2475743 от 31.10.2011).

Диссертационное исследование выполнено в соответствии с планом НИР Института физиологии природных адаптаций Уральского отделения РАН по теме «Выявление иммунных, эндокринных и метаболических маркеров возрастных перестроек функций человека, разработка методов сохранения работоспособности и продления активного периода жизни» (№ государственной регистрации 0120.0.951605).

Апробация работы. Материалы и основные положения работы докладывались и обсуждались на заседаниях Ученого Совета Института физиологии природных адаптаций УрО РАН (Архангельск, 2010-2012); XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011); IV молодежной научной конференции «Экология 2011» (Архангельск, 2011); VI конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» (2011-2012); VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012); XI Молодежной научной конференции Института физиологии КНЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2012); Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Адаптация человека на Севере: медико-биологические аспекты» (Архангельск, 2012), Архангельском отделении физиологического общества имени И.П. Павлова (Архангельск, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 121 страницах и состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 8 рисунками. Список использованной литературы включает 279 публикаций, из них 41 отечественных и 238 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов 1964 год (с изменениями и дополнениями на 2008 год).

Исследовали 200 жителей Архангельской области в возрасте от 20 до 77 лет. Обследуемые лица являлись клинически здоровыми добровольцами, у которых на момент взятия крови не было острых заболеваний. С целью определения возрастных особенностей содержания апоптотических нейтрофилов обследуемые были разделены на пять возрастных групп: 20-29 лет (56 человек), 30-39 лет (42 человека), 40-49 лет (38 человек), 50-59 лет (47 человек) и 60-77 лет (17 человек). Для анализа иммунологической реактивности и определения активности апоптоза на проточном лазерном цитофлуориметре осуществлено обследование 49 клинически здоровых людей (контрольная группа) в возрасте от 21 до 60 лет, их них 30 мужчин и 19 женщин.

В целях определения особенностей взаимосвязи активности апоптоза нейтрофилов и иммунологических показателей данная группа (49 человек) клинически здоровых людей разделена на две подгруппы с относительно пониженным и относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов, деление проводилось с учетом среднеквадратичного отклонения ± о. Уровень указанных нейтрофилов рассчитывался как по результатам проточной лазерной цитофлуориметрии АпУ+/Р1- менее 3% (п=18) и более 8% (п=15), так и по показателям морфологических изменений в ядре: гранулоциты с пятью и более фрагментами ядра менее 3% (п=16) и более 6% (п=16).

Для сравнения активности программируемой гибели гранулоцитов дополнительно изучено состояние иммунной системы 120 больных — пациентов медицинской компании МК «Биокор» - в возрасте от 20 до 60 лет, из них 27 мужчин и 93 женщины. По характеру течения и причинам возникновения патологии обследуемые лица были поделены на 2 группы: 1) группа пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями в стадии обострения, куда включены 70 человек с заболеваниями верхних и нижних дыхательных путей (хронический назофарингит, хронический тонзиллит, хронических фарингит, хронический бронхит), заболеваниями мочеполовой системы (хронический простатит, хронический аднексит, эндометрит); 2) группа пациентов с инфекционно-аллергическими процессами бактериально-грибковой этиологии в количестве 50 человек. Кроме того, обследовано 49 человек с метаболическим синдромом, диагноз поставлен врачами городского эндокринологического консультативного центра г. Архангельска. В момент исследования указанные лица проживали на территории Архангельской области и входили в возрастную группу 28-60 лет. Работа осуществлялась в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине». Группа обследуемых лиц с заболеваниями была разделена на две подгруппы с относительно пониженным и относительно повышенным

содержанием апоптотических нейтрофилов (менее 3% и более 6%). Учет результатов осуществлялся по признакам морфологических изменений ядра и степени фрагментации хроматина. В качестве группы сравнения взяты клинически здоровые лица (п=49,21-60 лет).

Определение апоптоза нейтрофилов периферической крови производилось в несколько этапов. Взвесь нейтрофилов выделяли из гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования на двойном градиенте фиколла плотностью 1,093-1,095 и 1,075-1,077 г/см3. После инкубации с Annexine V-FITS и Propidium Iodid нейтрофилы анализировали на проточном лазерном цитофлуориметре «Epics XL» («Beckman Coulter», США) с выделением 3 кластеров: живые клетки (AnV-/PI-), нейтрофилы, находящиеся на стадии апоптоза (AnV+/PI-), поврежденные (некротические) клетки (AnV-/PI+).

Структуру лейкограммы и сегментограммы нейтрофильных гранулоцитов изучали в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимза. Сегментограмму изучали по методу И. Тодорова (1968). Нейтрофильные гранулоциты дифференцировали по содержанию фрагментов ядра. Уровень выраженности апоптоза у нейтрофилов определяли по содержанию клеток с пятью и более фрагментами ядра и наличию гранулированного хроматина. Пролиферативную активность гранулоцитов выявляли по содержанию палочкоядерных форм.

Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли путем инкубации клеток крови с частицами латекса в течение 30 минут при температуре 37°С. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, подсчитывали % активных фагоцитов и среднее фагоцитарное число на 100 нейтрофильных лейкоцитов.

Содержание фенотипов лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD10+, CD16+, CD25+, CD71CD95+, HLA DR+) периферической крови определяли с помощью непрямой иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр», Москва) на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли».

Для количественного исследования цитокинов IL-4, 1L-6, IL-10, IFN-y, IL-17F, TNF-a и лиганда sTRAIL в сыворотке крови использовался метод иммуноферментного анализа с применением диагностических наборов фирмы «Bender MedSystems» (Австрия). Оценка результатов проводилась на фотометре «Multiskan MS» фирмы «Labsystems» (Финляндия), а также на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Evolis» фирмы «Bio-RAD» (США) тест-наборами «Вектор БЕСТ» (Россия). Содержание серотонина и гистамина также определяли методом ИФА тест-наборами «DRG» (Германия). Учет результатов проводили на спектрофотометре серии Multiscan (Финляндия). Показатели липидного обмена (фосфолипиды, АпоВ) изучали в сыворотке крови на биохимическом анализаторе «Stat fax 1904 Plus» реагентами фирмы «Human» (Германия).

Полученные данные были статистически обработаны с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Exel MX» (США) и «Statistica 6.0» («StatSoft», США). Проверку нормальности распределения количественных показателей осуществляли при помощи критерия Шапиро-Уилка. Для оценки

полученных данных манипулировали методами описательной статистики с определением средней арифметической величины (М), величины средней ошибки (т), минимальных и максимальных значений, а также стандартного отклонения (а). В случае, если распределение отличалось от нормального, использовали медиану (Ме) и 25-75 перцентили. Уровень дисбалансов иммунологических показателей рассчитывался по данным частоты регистрации повышенных и пониженных их концентраций относительно нормативных пределов физиологических колебаний (Л.К. Добродеева, 2005). Проверку нулевой гипотезы о равенстве всех средних в исследуемых группах осуществляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Статистическую значимость различий между выборками выявляли при помощи I критерия Стъюдента и с использованием непараметрических методов -Крускала-Уоллиса и Манна-Уитни; различия сравниваемых показателей принимались достоверными при уровне значимости р<0,05-0,001. Корреляционный анализ проводился с определением коэффициентов линейной корреляции Пирсона (г). Выявление значимых предикторов, определяющих уровень апоптоза нейтрофилов, проводили методом дискриминантного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активность апоптоза нейтрофилов периферической венозной крови у клинически здоровых людей в среднем составляет 6,09±0,36%, и колеблется в пределах 1а от 3,31 до 8,87%. Уровень некроза в 2 раза ниже 3,58±0,24%, в пределах 1а от 1,57 до 5,59%. Живые клетки в среднем составляют 90,33±0,66%, диапазон колебаний их содержания имеет размах от 86,04 до 94,64% в пределах 1а (рис. 1). По всей вероятности преобладание апоптоза над некрозом имеет большой биологический смысл, который заключается: 1. в предотвращении воспалительной реакции от продуктов некроза; 2. обновлении клеточной популяции; 3. получении фактически неизмененных субстанций клетки, за счет чего в организме идет пополнение резерва биологически активных веществ, тем более что апоптоз — это энергетически затратный механизм, требующий значительное потребление энергии.

апоптоз 6,09±0,36%

Рис. 1. Структура относительного содержания живых, апоптотических и некрозных нейтрофилов периферической крови клинически здоровых людей

активных фагоцитов начинает достоверно снижаться в возрастных группах 30-39лет (41,83±4,79%) и 40-49 лет (42,07±4,20%) по сравнению с группой 20-29 лет (52,96±2,09%). Минимум содержания процента активных фагоцитов регистрировался в возрастной группе 50-60 лет: 36,73±3,70%. Вероятно, программируемая клеточная гибель усиливается в ответ на увеличение общего содержания нейтрофилов в результате перераспределения популяции гранулоцитов внутри сосудистого русла и выхода клеток из пристеночного депо. В то же время у лиц 60—77 лет наблюдается усиление пролиферативных процессов гранулоцитов, что может быть ассоциировано с риском возникновения дефектов противоопухолевой защиты.

Для определения особенностей взаимосвязи активности апоптоза и пролиферации нейтрофилов с иммунологическими показателями крови группа клинически здоровых людей (п=49, возраст от 21 до 60 лет) была разделена на две подгруппы с относительно пониженным и относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов. Уровень указанных нейтрофилов рассчитывался по результатам проточной лазерной цитофлуориметрии (АпУ+/Р1- менее 3% и более 8%).

Среднее содержание апоптотических нейтрофилов в группе с относительно пониженной концентрацией данных клеток составило: относительное — 2,01±0,20%, абсолютное — 0,11±0,03 х109 кл/л; в группе с относительно повышенной концентрацией — 13,08±0,44% или 0,58±0,06 х 109 кл/л. Сравнительный анализ лейкограммы показал, что в группе с относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов выше содержание палочкоядерных нейтрофилов (0,24±0,07><109 кл/л против 0,13±0,04х Ю9 кл/л) на фоне заметного снижения общего количества нейтрофилов и их сегментоядерных форм. Так, среднее число нейтрофилов при активизации их программируемой гибели составило 4,43±0,54хЮ9 кл/л, сегментоядерных нейтрофилов — 4,19±0,49х 109 кл/л. В группе с относительно пониженным содержанием апоптотических нейтрофилов общее число гранулоцитов составило 5,40±0,48х109, сегментоядерных форм — 5,27±0,47хЮ9 кл/л; установлена обратная корреляционная взаимосвязь между апоптозом нейтрофилов и относительным содержанием сегментоядерных нейтрофилов (г = -0,33; р= 0,048). Таким образом, мы подтверждаем данные Р. \Уеттапп и коллег (2003) о регулирующей роли апоптоза нейтрофилов в поддержании гомеостаза данных клеток в периферической крови. Средние значения фагоцитарного числа изменяются с 5,13±0,40 ед/кл в группе с пониженным содержанием клеток в стадии апоптоза до 4,10±0,41 ед/кл во второй группе исследуемых. Процент активных фагоцитов не меняется: 56,94±2,73 и 55,00±2,31% соответственно. Установлено, что некроз нейтрофилов имеет взаимосвязь с активностью фагоцитоза (г = 0,38; р= 0,02) и фагоцитарным числом (г = 0,36; р= 0,03).

Исследование содержания фенотипов лимфоцитов (СБЗ+, СЭ4+, СБ8+, СОЮ+, С016+, С025+, СЭ71+, СЭ95 ) не выявило достоверных различий в анализируемых группах (р>0,05). Только количество лимфоцитов НЬА ОЯ+ снижается с 0,77±0,04 до 0,66±0,03х109 кл/л при активизации апоптоза

гранулоцитов. Отсутствие взаимосвязи между уровнем программируемой гибели нейтрофилов и процессами пролиферации, дифференцировки и апоптоза лимфоцитов периферической крови можно объяснить наличием значительной временной разницы реакции нейтрофилов и лимфоцитов на любой стимулирующий фактор, эта разница достигает 72 часа. В связи с чем, регуляция апоптоза нейтрофилов осуществляется преимущественно аутокринно.

Выявлено, что концентрация IL-4 увеличивалась на фоне повышенной активности апоптоза с 2,66(2,16-4,22) до 3,72(1.18-5,64) иг/мл. Таким образом, мы не можем подтвердить данные Girard D. (1997) о задержке программируемой гибели гранулоцитов под влиянием IL-4. В литературе также показано, что при совместном действии IL-4, IL-6, IL-3 и эритропоэтина рост клеток миелоидного ряда становится более интенсивным (D. Rennick, 1989).

На фоне повышенного содержания апоптотических нейтрофилов регистрировался подъем уровня провоспалительного цитокина TNF-a (22,79(18,78-31,35) против 19,81(19,34-39,70) иг/мл). В ходе проведенного анализа не были выявлены статистически значимые различия в концентрациях IL-6, IFN-y и IL-17F в анализируемых группах (р>0,05). Нужно отметить, что в индукции апоптоза нейтрофилов большое значение играет семейство TNF, в частности, лиганд этого семейства цитокинов sTRAIL (Р. Golstein, 1997). Установлено повышение концентрации свободного TRAIL с 14,64(8,42-56,62) до 27,51(4,13-60,08) пг/мл на фоне усиления апоптоза гранулоцитов. Методом дискриминантного анализа свободный лиганд TRAIL определен как важный предиктор, влияющий на результирующее значение апоптоза нейтрофилов (р<0,029, точность 74,3%). Увеличение количества свободных форм лиганда, вероятнее всего, происходит в результате протеолитического шеддинга (удаления) внеклеточного домена специфическими металлопротеиназами путем альтернативного сплайсинга или в составе секретируемых эндовезикул (О.В. Уткин, 2012). Все это свидетельствует об использовании TRAIL во внешнем пути инициации апоптоза нейтрофилов и последующем сбросе лиганда. Подтверждением активизации внешнего пути запуска программы смерти является также повышение содержания TNF-a, который при взаимодействии с рецептором TNFRI стимулирует реакции эффекторных каспаз -3, -6, -7 и последующие морфологические изменения ядра, связанные с апоптозом. В свою очередь, свободная форма TRAIL не просто накапливается и утилизируется в межклеточной среде (A. Thorburn, 2007), но в дальнейшем может комплексироваться с мембранным рецептором и вызывать новый виток апоптотической активности.

С целью выяснения особенностей программируемой гибели нейтрофилов в условиях дефектов иммунологической реактивности проведен дополнительный сравнительный анализ уровня апоптоза нейтрофилов периферической крови клинически здоровых людей (контрольная группа) и лиц с патологиями. В ситуации хронического воспаления выявлено снижение активности апоптоза нейтрофилов (рис. 3) по сравнению с клинически здоровыми людьми (с 5,33±0,49 до 4,09±0,16%). Полученные результаты

подтверждают сведения (А.Н. Маянский, 1989; Е. Pluskota, 2008; N. Fotouhi-Ardakani, 2010) о подавлении программируемой гибели гранулоцитов в условиях воспаления. Возможно, это происходит в результате активизации нейтральной сфингомиелиназы, повышения уровня сфингозин-1-фосфата, и фосфорилирования р38 МАРК киназ в цитозоле нейтрофилов (L. Wei-Chieh, 2011). Однако, существуют данные о значительном влиянии на задержку апоптоза нейтрофилов миелопероксидазы путем передачи сигналов через интегрин CDllb/CD18 (aMß2, Мас-1), что вызывает одновременную активизацию внеклеточной сигнал-передающей киназы и Akt, фосфорилирование Bad и последующую активизацию каспазы-3 (E.K. Driss, 2008).

7 6 5 4

2 I

0

Рис. 3. Уровень апоптоза нейтрофилов периферической крови клинически здоровых людей и лиц с патологиями

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой

Не установлено статистически значимых отличий в содержании апоптотических гранулоцитов у лиц с инфекционной аллергией (6,31 ±0,27 и 5,33±0,49% соответственно, р>0,05). По данным A. S. Saffar (2007) нейтрофилы людей, страдающих аллергическими заболеваниями, экспрессируют повышенный уровень высокоаффинного рецептора FceRI и несут на себе большее количество мембранно-связанного IgE. Последний в своем мономерном состоянии способен in vitro оказывать антиапоптотический эффект на гранулощггы, что выражается в снижении выброса Smac из митохондрии и деактивации каспазы-3.

При метаболическом синдроме, наоборот, отмечено увеличение уровня программируемой гибели гранулоцитов до 7,29±0,38%. Выявленное максимальное содержание гранулоцитов с пятью и более фрагментами ядра в

-ь- jess»

ч-

* Т

контроль метаболический инфекционная хроническое синдром аллергия воспаление

крови у лид с метаболическими нарушениями свидетельствует о повышении уровня апоптотической гибели нейтрофилов в условиях дислипидемии и гипергликемии. Вероятно, это объясняется снижением в нейтрофилах окислительной реакции глутатиона, подавлением активности G6PDH и глутаминазы на фоне увеличения уровня фосфофруктокиназы (Т.О. Alba-Loureiro, 2006). По сведениям Pithon-Curi Т.С. и коллег (2003) глутатион ингибирует апоптотические процессы в гранулоцитах, восстанавливая трансмембранный потенциал митохондрий и предотвращая фрагментацию хроматина.

Для изучения влияния серотонина и гистамина на апоптоз нейтрофилов в условиях дислипидемии были выделены группы с относительно повышенным и пониженным содержанием вазомоторных аминов. Концентрация серотонина -более 270 нг/мл (п=14) и менее 150 нг/мл (п=15); гистамина — более 10 нг/мл (п=10) и менее 1 нг/мл (п=10).

Установлено, что при относительно высоких концентрациях серотонина в крови заметно повышается содержание нейтрофильных лейкоцитов с пятью и более фрагментами ядра с 0,18±0,03 до 0,27±0,05* 109 кл/л. Известно, что серотонин оказывает стимулирующее влияние на фагоцитоз (М. Freire-Garabal, 2003) и, возможно, активизация фагоцитарной реакции объясняет повышение уровня содержания фагоцитов, подвергающихся апоптозу. На фоне относительно высоких концентраций серотонина выше содержание сывороточных фосфолипидов [5,33(3,70-7,34) и 4,37(3,84-5,27) ммоль/л]. дополнительное встраивание которых в состав цитоштазматической мембраны может резко менять её проницаемость и активность функционирования. При этом увеличение содержания фосфатидилсерина в структуре клеточной мембраны имеет непосредственное отношение к активизации апоптоза. Подтверждением возможности указанного механизма стимуляции апоптоза клеток крови является резкое сокращение утилизации ЛПНП в связи со снижением лиганда АпоВ [91,5(81,9-137,7) и 161,1(90,2-201,4) мг/дл].

При увеличении концентрации гистамина более 10 нг/мл в плазме крови у лиц с метаболическим синдромом снижается общее содержание нейтрофильных гранулоцитов (с 3,70±0,24 до 2,99±0,30><109 кл/л), в основном за счет палочкоядерных форм (с 0,29±0,05 до 0,16±0,03х 109 кл/л). Значительно увеличивается фагоцитарная способность нейтрофилов с 23,7±3,23 до 39,1±5,09 % и интенсивность данного процесса (3,4 и 5,0 ед/кл.). В структуре нейтрограммы отмечается снижение уровня гранулоцитов с пятью и более сегментами ядра (с 0,35±0,05 до 0,19±0,03*109 кл/л), без значительных отличий со стороны нейтрофилов с тремя и четырьмя сегментами. Из литературных сведений известно, что через Н2 рецепторы гистамин ингибирует выделение свободного внутриклеточного Са2+ путем изменения уровня цАМФ в нейтрофилах (L. Leino, 1993). Данный факт подтверждает наши результаты, так как при инициации апоптоза активность транслоказы в большинстве типов клеток млекопитающих подавляется. Одним из механизмов данного процесса является возрастание концентрации внутриклеточного Са2+, что приводит к

накоплению фосфатидилсерина в наружном слое мембраны. Это необходимо для последующего фагоцитоза и элиминации апоптозных телец.

Дополнительно каждая группа обследуемых лиц с заболеваниями была разделена на две подгруппы с относительно пониженным и относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов (менее 3% и более 6%). Учет результатов осуществлялся по признакам морфологических изменений ядра и степени фрагментации хроматина.

Полученные данные при исследовании сегментограммы показали, что у клинически здоровых людей уровень апоптоза нейтрофилов растет параллельно увеличению палочкоядерных нейтрофилов с 0,15±0,02 до 0,22±0,03х Ю9 кл/л, что подтверждает данные проточной цитофлуориметрии. При метаболическом синдроме наблюдается лишь тенденция к росту палочкоядерных нейтрофилов с 0,19±0.03 до 0,23=0,04^109 кл/л при активизации апоптоза (рис. 4). При аллергических реакциях и воспалении пролиферация преобладает, апоптоз отстает и замещается некрозом. Так, у лиц с инфекционно-аллергическими процессами и хроническим воспалением при пониженном содержании апоптотических нейтрофилов уровень палочкоядерных клеток выше: 0,31=0,03 и 0,25±0,04хЮ9кл/л соответственно.

палочкоядерные нейтрофилы хЮ' кл/л

контроль метаболический инфекционная хроническое синдром аллергия воспаление

13 группы с пониженным содержанием апоптотических нейтрофилов ■ группы с повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов

Рис. 4. Уровень пролиферации нейтрофилов в зависимости от активности их апоптоза

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с группой пониженного содержания апоптотических нейтрофилов

В ходе проведенного анализа нами не были установлены статистически значимые различия в содержании активных фагоцитов в группах с пониженным и повышенным уровнем апоптотических нейтрофилов у обследуемых лиц: у

клинически здоровых людей 57,25±2,61 и 59,25±2,72%; у лиц с метаболическим синдромом 36,06±3,68 и 30,04±2,71%; у пациентов с инфекционной аллергией 45,67±1,37 и 42,76±1,37%; у людей с хроническим воспалением 44,31±1,08 и 43,16±1,11%. Однако, повышение активности апоптоза обуславливает снижение интенсивности фагоцитоза по фагоцитарному числу: у клинически здоровых людей с 5,63±0,41 до 4,44+0,22 ед/кл; у лиц с метаболическим синдромом с 5,44±0,63 до 3,88=0,37 ед/кл; у людей с хроническим воспалением с 10,20±0,69 до 8,85±0,54 ед/кл; кроме лиц с инфекционной аллергией (9,12±0,49 и 9,82±0,43 ед/кл).

Сравнительный анализ лейкограммы лиц с метаболическими нарушениями показал, что в группах с относительно повышенным и пониженным содержанием апоптотических нейтрофилов нет различий по концентрации нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, как общего содержания (3,20±0,24 и 3,50±0,19><109 кл/л), так и сегментоядерных форм (3,01±0,24 и 3,27±0,16*Ю9 кл/л). Однако выше содержание моноцитов в группе с относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов (0,45±0,07х 109 кл/л против 0,35±0,06><109 кл/л). Лимфоцитарный фон обследуемых лиц с метаболическими нарушениями характеризуется повышенными содержаниями СОЮ+ лимфоцитов, СЭ71+ лимфоцитов и НЬА ОЯ+ лимфоцитов в группе с апоптотическими нейтрофилами > 6%. Среднее количество исследуемых клеток в данной группе составило: 0,77±0,03х 109 кл/л; 0,72±0,03хЮ9 кл/л и 0,74±0,03*109 кл/л соответственно. Однако при активизации апоптоза гранулоцитов снижается содержание С08+ лимфоцитов с 0,75±0,04 до 0,64±0,02х109 кл/л. Установлено, что концентрации №N-7 увеличивались на фоне повышенной активности апоптоза с 8,50(6,00-15,00) до 27,00(13,00-39,00) пг/мл. В ходе проведенного анализа нами не были выявлены статистически значимые различия в концентрациях 1Ь-4, 1Ь-6, ТМ-'-сх, 1Ь-11¥ и зТКАІЬ в анализируемых группах (р>0,05).

У лиц с инфекционно-аллергическими процессами анализ лейкограммы в зависимости от активности апоптоза нейтрофилов показал, что в группе с апоптотическими нейтрофилами > 6% ниже содержание лейкоцитов, нейтрофилов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов по сравнению с группой, где апоптотических нейтрофилов < 3%. Так лейкоциты снижаются с 8,01±0,36 до 6,25±0,34х Ю9 кл/л, нейтрофилы - с 4,92±0,29 до 3,67±0,25х Ю9 кл/л, палочкоядерные нейтрофилы — с 0,31±0,03 до 0,20±0,03х Ю9 кл/л, сегментоядерные нейтрофилы — с 4,61±0,35 до 3,67±0,29*109 кл/л. При активизации апоптоза нейтрофилов у лиц с инфекционно-аллергическими процессами снижается содержание СОЗ+ лимфоцитов с 1,20±0,04 до 0,95±0,03х 109 кл/л и СБ4+ лимфоцитов с 0,75±0,03 до 0,59±0,04хЮ9 кл/л. Исследование содержания фенотипов лимфоцитов С08+, СОЮ+, С025 , СЭ71+, НЬА ОИ.', СЭ16+, СБ95+ не выявило достоверных различий между анализируемыми группами (р>0,05). В условиях инфекционной аллергии концентрация провоспалительного цитокина ТЫР-а достоверно не отличалась в анализируемых группах: 37,88(22,51-48,16) и 36,53(24,00-51,21) пг/мл (р>0,05).

У лиц с хроническими воспалительными заболеваниями в стадии обострения в группе с повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов (> 6%) ниже как относительная, так и абсолютная концентрация палочкоядерных нейтрофилов (2,71 ±0,52%; 0,19±0,04х109 кл/л) по сравнению с группой апоптотических нейтрофилов < 3% (3,55±0,45%; 0,25±0,04><109 кл/л). Установлено, что активизации апоптоза нейтрофилов сопутствует увеличение относительного и абсолютного содержания эозинофилов с 2,12±0,28 до 2,80±0,37% и с 0,14±0,02 до 0,18±0,03х 109 кл/л. По уровню фенотипов лимфоцитов не выявлено достоверных различий между анализируемыми группами (р>0,05). Концентрация провоспалительного цитокина TNF-a при хронических воспалительных заболеваниях снижалась в группе с повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов (34,86(23,16-69,32) пг/мл); в группе с пониженным содержанием апоптотических нейтрофилов содержание TNF-a составило 43,15(28,16-81,16) пг/мл. Можно предположить, что при активизации программируемой гибели нейтрофилов в ситуации хронического воспаления задействован внутренний митохондриальный путь инициации апоптоза. Это подтверждается сокращением концентрации TNF-a и стабилизацией уровня лимфоцитов CD 16+в периферической крови. Известно, что при взаимодействии TNF-a со своим рецептором TNFRI запускается рецепторный путь гибели клетки (D. Wallach, 1998). Лимфоциты CD16+ или натуральные киллеры также вызывают каспазозависимый апоптоз гранулоцитов посредством активизации рецепторов Fas и NKp46 (F.B. Thoren, 2012)

Таким образом, инициация апоптоза нейтрофилов у клинически здоровых людей происходит рецепторным (внешним) путем под влиянием TNF-a, лиганда sTRAIL и 1L-4 с последующим увеличением внутриклеточного уровня эффекторных каспаз -3, -6, -7. Активизация апоптоза гранулоцитов ассоциирована с повышением их палочкоядерных форм на фоне снижения количества зрелых дифференцированных клеток. Программируемая гибель нейтрофилов не меняет активность фагоцитарной реакции, однако сокращается интенсивность данного процесса за счет уменьшения фагоцитарного числа. Реакция со стороны лимфоцитов выражается в снижении экспрессии HLADRII, участвующих в презентации экзогенных антигенов.

У лиц с инфекционной аллергией и хроническим воспалением на фоне активизации апоптоза нейтрофилов нарушается баланс клеточных событий, что выражается в снижении их пролиферативной активности. Запуск апоптотических изменений происходит за счет внутренних клеточных механизмов, при которых из митохондрий в цитозоль выходят цитохром с, факторы Apaf-1, Smac/DIABLO и HtrA2/Omi. В ситуации метаболических нарушений пролиферативная способность нейтрофилов компенсируется достаточным уровнем апоптоза, который, вероятно, также инициируется внутренним митохондриальным путем. Это подтверждается тем, что внешние факторы запуска программируемой гибели клетки TNF-a и sTRAIL не изменяют своего содержания при значительной динамике уровня сегментоядерных нейтрофилов с 5 и более фрагментами ядра.

ВЫВОДЫ

1. Уровень апоптоза нейтрофилов у клинически здоровых людей в периферической крови в среднем составляет 6,09±0,36% с пределами колебаний 3,31-8,87%.

2. У величение активности апоптоза нейтрофильных гранулоцитов (с2,01±0,20 до 13,08±0,44%) сопряжено с нарастанием концентрации палочкоядерных форм (с 0,13±0,04 до 0,24±0,07*109 кл/л).

3. Уровень апоптоза нейтрофилов (у клинически здоровых людей, при хронических воспалительных процессах и метаболическом синдроме) не оказывает влияние на активность фагоцитоза, но снижает интенсивность фагоцитарной реакции.

4. Активность апоптоза нейтрофилов ассоциирована с увеличением концентрации сывороточных цитокинов IL-4, TNF-a и лиганда sTRAIL без изменения со стороны IL-6, IFN-y и IL-17F.

5. Серотонин способствует повышению содержания в крови апоптотических нейтрофильных гранулоцитов с 0,18±0,03 до 0,27±0,05хЮ9 кл/л; гистамин, наоборот, сокращает количество данных клеток с 0,35±0,05 до 0,19±0,03х109кл/л.

6. Программируемая гибель нейтрофилов сопряжена со снижением концентрации HLADR II, участвующих в презентации экзогенных антигенов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В условиях преобладания некроза нейтрофилов при хронических воспалительных процессах рекомендуется включить в комплекс лечебно-профилактических мероприятий сорбционную терапию с целью эффективного связывания и удаления из организма продуктов клеточного метаболизма.

2. Снижение активности фагоцитоза нейтрофилов периферической крови у лиц с воспалительными заболеваниями, инфекционной аллергией и метаболическими нарушениями обусловливает необходимость стимуляции фагоцитарного звена иммунитета.

3. Для оценки эффективности лечения хронических воспалительных процессов дыхательной системы в динамике проводимого лечения у обследуемых лиц в периферической венозной крови необходимо определять относительный уровень активных фагоцитов и абсолютное содержание лимфоцитов CD8 . При увеличении уровня активных фагоцитов на 30% и более, и снижении содержания CD8+ не менее чем на 25% от исходного значения - лечение оценивается как эффективное.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Якушкина С.Н. (Балашова С.Н.) Роль нейтрофилов в регуляции иммунологической реактивности человека i С.Н. Якушкина, O.A. Ставинская,

Подписано в печать 25.04.2013. Формат 60x84 1/16. Бумага офисная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 103.

Отпечатано с готового оригинал-макета Типография «КИРА» 163061, г. Архангельск, ул. Поморская, 34, тел. 65-47-11. e-mail: oookira@atnet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Балашова, Светлана Николаевна, Архангельск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ПРИРОДНЫХ АДАПТАЦИИ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

0420135^698

БАЛАШОВА СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА

СОСТОЯНИЕ АПОПТОЗА НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ

КРОВИ

03.03.01 - Физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Ставинская Ольга Александровна

Архангельск - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Апоптоз нейтрофилов: молекулярные механизмы и регуляция 9

1.2. Особенности пролиферативной активности нейтрофилов 18

1.3. Влияние цитокинов на апоптоз и пролиферацию нейтрофилов 20

1.4. Активность апоптоза нейтрофилов в условиях патологии 27 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 33

2.1. Общая характеристика обследованных лиц 34

2.2. Иммунологические методы исследования 37

2.3. Статистическая обработка 41 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 43

3.1. Уровень апоптоза и пролиферации нейтрофилов с учетом содержания иммунологических показателей крови у клинически здоровых людей 43

3.2. Сравнительная оценка состояния иммунологической реактивности клинически здоровых людей в зависимости от активности апоптоза нейтрофилов 55

3.3. Сравнительный анализ содержания иммунологических показателей крови и уровня апоптоза и пролиферации нейтрофилов у лиц с патологиями 61 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 78 ВЫВОДЫ 90 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 91 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 92

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

IL-4 - интерлейкин-4

IL-6 - интерлейкин-6

IL-10 - интерлейкин-10

IL-17F - интерлейкин-17F

TNF-a - фактор некроза опухоли альфа

IFN-y - интерферон гамма

sTRAIL - TNF-связанный апоптоз индуцирующий лиганд

CD3+ - активированные (зрелые) Т-лимфоциты

CD4+ - Т- хелперы

CD8' - цитотоксические Т-лимфоциты

CD104 - ранний антиген В-клеток, предшественников В-лимфоцитов

CD16+ - натуральные киллеры

CD25+ - Т-лимфоциты с рецептором к интерлейкину-2

CD71+ - Т-лимфоциты с рецептором к трансферрину

HLA DR - Т-лимфоциты с рецептором к главному комплексу

гистосовместимости класса II

CD95* - лимфоциты, меченные к апоптозу

AnV+/PI- - нейтрофилы, находящиеся на стадии апоптоза

AnV-/PI+ - поврежденные (некротические) нейтрофилы

AnV-/PI- - живые нейтрофилы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Нейтрофилы являются самой многочисленной популяцией клеток периферической крови, на долю которых приходится до 70 % общего содержания лейкоцитов. Анализируя состав периферической крови, фактически можно оценить только 50 % клеток гранулоцитов, т.е. циркулирующий пул. Оставшиеся 50 % составляют пристеночные нейтрофилы, готовые выйти из сосудов в ткани для осуществления фагоцитоза и связанного с ним кислородного взрыва [7, 14, 39]. Помимо фагоцитоза пристеночные клетки могут образовывать нейфофильные экстрацеллюлярные сети (ЫЕТ), способные фиксировать микроорганизмы благодаря трехмерной структуре [132, 274]. В свою очередь, циркулирующие нейтрофилы, находящиеся в периферической крови, не являются клетками, ограниченными в специализации. Они способны к молекулярной перестройке хроматина, реализации генетической информации, могут дифференцироваться под влиянием микроокружения в антигенпрезенгирующие клетки [19].

Нейтрофилы секретируют огромное количество биологически активных веществ, в том числе почти все известные цитокины. Есть сведения, что грапулоциты способны активировать макрофаги, действуя на каспазу-6 и комплекс 1Ь-1 ИУкиназа-М [144]; могут стимулировать пролиферацию Т-лимфоцигов [181], инициировать созревание дендритных клеток [57], вызывать ССЬ2-зависимый хемотаксис ТЫ7 [194] и стимулировать секрецию гистамина из базофилов посредством НЯА-К фактора [260]. Кроме того, нейтрофилы осуществляют антителозависимую цитотоксичность, реализующуюся в реакциях противоопухолевой защиты

И].

Пролиферация нейтрофилов происходит в гемопоэтических элементах костного мозга, откуда в кровоток в физиологических условиях выделяются палочкоядерные формы. Продолжительность жизни нейтрофилов после выхода их из костного мозга составляет около 10 часов в циркулирующей

крови и еще 2-3 дня в тканях [11]. Естественная гибель клеток совершается по механизму апопюза, в очаге воспаления — преимущественно некрозом [136, 258].

Существует несколько вариантов инициации апоптоза клетки. Внешний путь осуществляется за счет семейства рецепторов к фактору некроза опухоли, в частности, Раз-рецептора (АРО-1, С095), ТЫРЮ (р55, СО 120а), и ГШ и др. [149, 159], расположенных на клеточной

мембране нейтрофилов. Внутренний путь программируемой гибели происходит в результате изменений в ядре, характеризуется увеличением концентрации Са2+ в цитоплазме, активизацией эндонуклеаз и клеточных протеаз, нарушением проницаемости мембраны митохондрий [162, 171]. Есть сведения о малом содержании митохондрий в зрелых гранулоцитах, что приводит к значительному сокращению процессов окислительного фосфорилирования и ограничению уровня митохондриальных белков, запускающих и регулирующих программу апоптоза [14, 193]. Однако представлены убедительные доказательства достаточности этого минимального количества и спектра белковых молекул для инициации программируемой гибели неГпрофилов внутренним путем [182].

Вместе с тем, сведения, касающиеся динамики апоптотической активности нейтрофилов под влиянием цитокинов, противоречивы. Данных о воздействии на нейтрофилы вазомоторных аминов (гистамина и серотонина) нет. 11е ясно, как меняется программируемая гибель гранулоцитов от уровня их пролиферации, фагоцитарной реакции в физиологических условиях и при патологии.

Цель и задачи исследования. Цель работы - определить уровень апоптоза нейтрофилов в зависимости от их функциональной активности, цитокинового профиля, содержания вазомоторных аминов и лимфоидной реакции периферической крови.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить активность апоптоза нейтрофилов периферической крови у клинически здоровых людей и при патологии.

2. Выявить характер взаимосвязи апоптоза нейтрофилов с уровнем их пролиферации и фагоцитоза.

3. Установить влияние цигокинов и вазомоторных аминов на апоптоз гранулоцитов.

4. Изучить соотношение уровня апоптоза нейтрофилов и выраженности реакций со стороны лимфоцитов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Апоптоз нейтрофилов сопровождается увеличением количества палочкоядерных нейтрофилов, не влияя при этом на фагоцитарную их активность.

2. Уровень некроза значительно ниже программируемой гибели нейтрофилов, что способствует поддержанию клеточного гомеостаза без воспалительной реакции.

3. Активность апоптоза нейтрофилов ассоциируется с повышением содержания в крови IL-4, TNF-a, свободного л и ганда TRAIL и серотонина.

4. Апоптоз нейтрофильных гранулоцитов снижает экспрессию рецепторов к главному комплексу гистосовместимости класса II на лимфоцитах.

Научная новизна исследования. Впервые выявлено, что увеличение количества апоптотических нейтрофилов AnV+/PI- в периферической венозной крови соответствует повышению концентрации палочкоядерных форм, отражающих пролиферативную активность клеток миелоидного ряда. Установлен механизм регуляции уровня апоптоза нейтрофилов посредством шеддинга лиганда sTRAIL в межклеточное пространство.

Научно-практическая значимость исследования. Материалы диссертации рекомендуются для использования в научно-экспериментальных исследованиях в области физиологии, иммунологии, в учебном процессе на кафедрах общей биологии, клинической иммунологии и нормальной физиологии высших учебных заведений.

Полученные в работе данные о содержании апоптотических нейтрофилов AnV+/PI- и некрозных клеток AnV-/PI+ периферической крови у клинически здоровых людей могут быть использованы в качестве нормативов физиологических колебаний исследуемых нейтрофилов у человека в различных состояниях.

Диссертационное исследование выполнено в соответствии с планом НИР Института физиологии природных адаптаций Уральского отделения РАН по теме «Выявление иммунных, эндокринных и метаболических маркеров возрастных перестроек функций человека, разработка методов сохранения работоспособности и продления активного периода жизни» (№ государственной регистрации 0120.0.951605).

Материалы исследования внедрены в практику работы врачей медицинской компании «Биокор» (акт внедрения от 18.01.2013 г.) с целью повышения точности диагностирования и своевременного назначения лечебных мероприятий.

По результатам исследования разработан способ оценки эффективности лечения хронических воспалительных процессов дыхательной системы (патент на изобретение РФ № 2475743 от 31.10.2011).

Апробация работы. Материалы и основные положения работы докладывались и обсуждались на заседаниях Ученого Совета Института физиологии природных адаптаций УрО РАН (Архангельск, 2010-2012); XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологни» (Москва, 2011); IV молодежной научной конференции «Экология 2011» (Архангельск, 2011); VI конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» (2011-2012); VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012); XI Молодежной научной конференции Института физиологии КНЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2012); Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Адаптация

человека на Севере: медико-биологические аспекты» (Архангельск, 2012), Архангельском отделении физиологического общества имени И. П. Павлова (Архангельск, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 121 страницах и состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 8 рисунками. Список использованной литературы включает 279 публикаций, из них 41 отечественных и 238 иностранных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аноптоз нейтрофилов: молекулярные механизмы и регуляция

Нейтрофилы - самая многочисленная популяция лейкоцитов. У человека ежедневно обменивается около 1,6x109 /кг нейтрофилов, благодаря чему, несмотря на громадный ростовой потенциал костномозговых предшественников, количество зрелых нейтрофилов в организме поддерживается на постоянном уровне. Это объясняется непрерывной эмиграцией нейтрофилов из сосудистого русла [24]. Они не возвращаются назад, подвергаясь элиминации с секретами слизистых оболочек, или быстро (в течение 2-6 дней) погибают в тканях [13]. В нормальных условиях (вне очагов воспаления) отмирание нейтрофилов происходит незаметно, что достигается благодаря механизмам апоптоза - или программируемой клеточной гибели [136, 258]. Апоптоз рассматривается как активная смерть в отличие от некроза, наступающего при грубых повреждениях плазматической мембраны с последующим набуханием клетки, лизосом гранул и ядра, неупорядоченной деградацией ДНК [31].

Морфологические признаки апоптоза нейтрофилов состоят в уменьшении размеров клетки, уплотнении и фрагментации хроматина с появлением скоплений хроматина, прилегающих к ядерной оболочке [41, 150]. В последней образуются инвагинации, что приводит к образованию апоптотических телец - фрагментов ядра, окруженных мембраной. В цитоплазме происходит конденсация и сморщивание гранул, расширение эндоплазматического ретикулума [36]. Мембрана теряет микроворсинки и нормальную складчатость, образует пузыревидные вздутия. Нейтрофилы утрачивают связь с субстратом, нарушается целостность мембраны. Сформированные апоптозные тельца располагаются в межклеточных пространствах, выталкиваются в просвет железы или фагоцитируются макрофагами и фибробластами [12, 26, 217]. Весь процесс апоптоза

нейтрофилов обычно происходит в течение 12-16 часов после действия индукторных факторов.

На молекулярном уровне апоптоз проявляется фрагментацией ДНК. Сначала образуются крупные фрагменты нуклеиновых кислот (30000-700000 пар оснований). Затем происходит межнуклеосомная деградация ДНК - ее расщепление в результате разрывов между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 пар оснований или кратных им по величине. Эти фрагменты выявляются при электрофорезе ДНК апогпотических клеток в виде «лесенки» - дискретных полос, соответствующих молекулярной массе образующихся фрагментов ДНК [35J. Деградация хроматина является активным процессом: зависит от температуры, требует синтеза РНК и белка de novo, ингибируется при связывании ионов Са и Zn. Процесс обусловлен активацией ядерной Ca2+/Mg2+ -зависимой эндонуклеазы.

В динамике клеточных событий можно выделить три фазы развития апоптоза. Первая - рецепция сигнала и начальные этапы его передачи; эта фаза обратима. Вторая фаза - активация каспаз - является ключевым событием процесса апоптоза; она приводит к необратимым последствиям. Третья фаза состоит в реализации гибели клетки, запрограммированной на предыдущем этапе. Проявления первой фазы развития апоптоза многообразны, вторая и третья фазы протекают более стандартно.

В настоящее время рецепцию апоптотических сигналов и включение процесса апоптоза изучают по трем направлениям - рецепторному, митохондриальному и липидному [28, 49]. Рассмотрим их более подробно. На поверхности нейтрофилов могут экспрессироваться специализированные рецепторы, передающие сигналы к развитию апоптоза. Их общее обозначение - рецепторы смерти (Death receptors - DR). Эти рецепторы относятся к семейству рецепторов фактора некроза опухоли a (TNF-a) [163]. От других рецепторов этой группы они отличаются наличием в цитоплазматической части специального «домена смерти», содержащего

около 80 аминокислотных остатков, который необходим для включения внутриклеточного сигнала, приводящего к развитию апоптоза.

К настоящему времени описано 6 DR-рецепторов. Среди них наиболее известен Fas-рецептор (АРО-1, CD95) [2]. Его лигандом служит тримерная молекула, относящаяся к семейству TNF-a - Fas-лиганд (FasL, CD 178) [149, 159]. Известны мембранная и растворимая формы FasL, из которых первая является значительно более эффективным индуктором апоптоза клеток, несущих рецептор CD95, по сравнению со второй [21, 22, 160]. К семейству DR относится также рецептор TNF 1-го типа - TNFR1 (р55, CD120a), тогда как рецептор 2-го типа (р75, CD120b) лишен домена смерти и непосредственно не включает апоптогенные сигналы [252]. Лигандом для TNFR1 служат молекулы семейства TNF - TNF-a и лимфотоксин ß.

Рецептор DR3 передает сигналы от недостаточно охарактеризованной молекулы DR3L (АРОЗ-L). DR4 и DR5 служат рецепторами для молекулы TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) [114], активно вызывающей программируемую гибель гранулоцитов [130, 173]. Данный тример, относящийся к семейству TNF, увеличивает свою экспрессию в результате взаимодействия фактора SDF-1, координирующего возвращение стареющих нейтрофилов в костный мозг, и молекулы CXCR4 [165]. В самих нейтрофилах TRAIL содержится в секреторных везикулах и азурофильных гранулах, и высвобождается под влиянием антигенов [65, 231].

Данных, касающихся лиганда DR6, в литературе представлено мало. Во всех случаях взаимодействие указанных лигандов с рецепторами приводит к тримеризации последних, что является обязательным условием их функционирования в качестве передатчиков апоптогических сигналов [38].

В нейтрофилах РА8/С095-индукцированная гибель сопровождается формированием в мембранных доменах участков PtdGlc фосфатидилгликозидов [140] и активизацией каспазы-8, в то время как TNFR1 опосредованный процесс действует в направлении активизации МАРК р38 и IA PI3K киназ без участия каспазы-8 [108]. FAS-

индукцированная гибель блокируется в результате связывания клеток с Р2 интегринами, либо под влиянием липополисахаридов [263]. Недавно были представлены сведения о том, что FAS-опосредованный апоптоз нейтрофилов, кроме того, может тормозиться под влиянием молекул Вс1-2 и Mci-1, и ускоряться под действием белков Bid, Bak и Вах [80]. Рецепторный путь включения апоптоза не требует синтеза РНК и белка de novo, но требует затрат энергии [40].

Митохондриальный (внутренний) путь программируемой клеточной гибели характеризуется увеличением концентрации Са2+ в цитоплазме [171], активизацией эндонуклеаз и клеточных протеаз [28]. Нарушается проницаемость митохондриальной мембраны, образуются поры; из митохондрий в цитозоль выходят цитохром с, факторы Apaf-1, Smac/DIABLO и HtrA2/Omi [109, 162, 166]. Apaf-1 вытесняется из гетеродимера Вс1-2 и Вс1-Х1, в составе которого он удерживается в мембране [18, 43, 179] и в присутствии АТФ образует комплекс с прокаспазой 9 [29, 117]; последняя активируется и вовлекает каспазу 3 [10, 23]. В отличие от рецепторного механ