Сравнительная характеристика бактерицидных систем нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях

Охотина, Софья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительная характеристика бактерицидных систем нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика бактерицидных систем нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях"

00305Т351

На правах рукописи

ОХОТПНА СОФЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЦИДНЫХ СИСТЕМ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ И ЛР1СТЕРИОЗНОЙ ИНФЕКЦИЯХ

03.00.25 - гистология, цитология п клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Владивосток — 2007 год

003057351

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Сомова Лариса Михайловна Научный консультант: кандидат биологических наук

Плехова Наталья Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Маркина Людмида Дмитреевна доктор медицинских наук Дюйзен Инесса Валерьевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Дальневосточный государственный

Защита состоится «18» мая 2007 г. в «10» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при Владивостокском государственном медицинском университете, 690002, г. Владивосток, Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет» (корпус 3).

Автореферат разослан « » 2007 года

медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Г.В. Рева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Нейтрофильные гранулоциты относятся к популяции клеток, обладающих уникальными возможностями, которые обусловлены наличием у них комплекса бактерицидных систем, играющих главную роль в киллинге микроорганизмов при развитии антиинфекционной защиты (Akahoshi T. et al., 2003; Labro M., 2000). Избирательность и специфичная синхронность действия ферментных систем нейтрофилов определяется широким спектром молекул-эффекторов, обеспечивающих их бактерицидные свойства. Биологически-активные вещества нейтрофилов включают свободные кислородные радикалы, протеиназы, бактерицидные протеины и цитокины, которые как по отдельности, так и в совокупности оказывают влияние ira регуляцию процессов воспаления. Однако до сих пор недостаточно широким остается спектр патогенов, в отношении которых раскрыты особенности ферментного реагирования фагоцитов, в частности, нейтрофилов. Это касается также продукции лейкоцитами нитрогенных радикалов.

В конце 1970-х гг. были выявлены и изучены четыре бактерицидных системы нейтрофильных гранулоцитов. В. Е. Пигаревским была предложена следующая их классификация: 1) миелопероксидазная система; 2) лизоцим; 3) лактоферрин; 4) неферментные катионные белки (Пигаревский В.Е., 1978). В дальнейшем, после многочисленных исследований, представления о микробицидных системах нейтрофилов несколько изменились. Так, было отмечено, что миелопероксидаза является ферментом кислородзависимой системы, а лизоцим и лактоферрин - составляющими кислороднезависимой системы. Кроме того, в связи с открытием молекулы оксида азота, была выделена нитроксидобразующая система. Таким образом, на данный момент в нейтрофилах обозначены три основные бактерицидные системы: 1) кислородзависимая система, в состав которой входят система НАДФН-нроизводных оксидантов и Н202 — миелопероксидазная система; 2) нитроксидобразующая система, включающая реактивные посредники азота, производные NO-синтазы; 3) система белков нейтрофильных гранул (антимикробные белки, протеа-зы, серинпротеиназы, металлопротеиназы) (Witko-Sarsat V. et al., 2000).

В отечественных работах до середины 1990-х годов практически отсутствовали сведения о нитроксидзависимых механизмах микробицидности фагоцитирующих клеток. Значение оксида азота в обеспечении бактерицидности фагоцитов при различных инфекциях изучалось главным образом в отношении моноцитов/макрофагов (Fang С., 1997; Nathan С., 1997; Zamora N. et al., 2000; Гончарук Ю.Н., 2005). Исследование нитроксидобразующей активности нейтрофилов и ее значение при различных заболеваниях в данный момент находится на начальном этапе и данные этих исследований малочисленны и противоречивы. Так, К. А. Remer с соавторами (2001) не выявили активности индуцибелыюй нитроксидсин-

тазы в нейтрофилах крыс, зараженных in vivo Listeria monocytogenes, тогда как J. W. Conlan с соавторами (1994) in vitro установили синтез этого фермента в стимулированных цитокинами нейтрофилах и макрофагах крыс, при последующем заражении L. monocytogenes. Что же касается состояния остальных бактерицидных систем нейтрофилов при бактериальных инфекциях, то не проводилось изучение в сравнительном аспекте активности кислородзависимой и кислороднезависимой систем этих клеток при их взаимосвязи с нитроксидобразующей активностью. Необходимо также отметить отсутствие сведений о значении оксида азота в бактерицидное™ нейтрофилов относительно псевдотуберкулезной инфекции, а относительно листериозной - эти сведения ограничены и неоднозначны. При этом практически отсутствуют работы по пито морфологическим исследованиям нитроксид-синтазной активности нейтрофилов при инфекционных заболеваниях. Цель работы:

В сравнительном аспекте охарактеризовать бактерицидные системы нейтрофилов и оценить их значение на ранних этапах псевдотуберкулезной и листериозной инфекций.

Задачи исследования:

1.В системе in vitro определить активность компонентов кислородзависимой ферментной системы нейтрофилов доноров и интактных животных при заражении их Yersinia pseudotuberculosis и L. monocytogenes.

2. В системе in vitro изучить нитроксидобразующую активность нейтрофилов доноров и интактных животных при их взаимодействии с Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes.

3.В системе in vivo изучить активность нитроксидобразующей, кислородзависимой и кислороднезависимой ферментных систем нейтрофилов морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes.

4. Провести корреляционный анализ между показателями активности нитроксидобразующей, кислородзависимой и кислороднезависимой систем нейтрофилов различных биологических моделей при обеспечении их бактерицидной функции на ранних этапах псевдотуберкулезной и листериозной инфекций.

Научная новизна:

1). Установлена активность нитроксидсинтазы и образование метаболитов оксида азота в нейтрофилах человека и животных при псевдотуберкулезной инфекции.

2). В сравнительном аспекте показана реактивность нитроксидобразующей, кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем нейтрофилов различных биологических моделей при их заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes.

3). На основании цитохимических исследований установлены различия в динамике активности составляющих ферментов дыхательной цепи нейтрофилов в зависи-

мости от вида возбудителя, что свидетельствует о дифференцированных путях образования активных метаболитов кислорода в нейтрофилах при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях. 4). Установлена корреляция между показателями активности нитроксидобразую-щей, кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем ней-трофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях. Теоретическая и практическая значимость работы:

Теоретическая значимость диссертационной работы заключается в том, что полученные в ней новые данные расширяют понятие о морфофункциональном состоянии нейтрофильных лейкоцитов в зависимости от вида патогенных бактерий, а также о нитроксидобразующей способности этих клеток при бактериальных инфекциях.

Практическая ценность работы определяется тем, что тестирование активности бактерицидных ферментных систем нейтрофилов, относящихся к первой линии антиинфекционной защиты организма, может быть использовано для выявления гранулоцитарных иммунодефицитов и для контроля эффективности коррекции этих состояний. Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены и доложены на: VIII Дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ, 2004); VI Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2005); заседаниях Ученого совета НИИЭМ СО РАМН в 2006 и 2007 гг. Публикации

По материалам исследования опубликовано 7 печатных работ - 3 статьи и 4 тезисных доклада.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 164 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, который включает 45 работ отечественных и 201 работу зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и 6 таблицами. Положения, выносимые на защиту:

l.Ha ранних этапах псевдотуберкулезной и листериозной инфекций антимикробная защита обеспечивается за счет комплексного реагирования кислородзависимой, кислороднезависимой и нитроксидобразующей бактерицидных систем нейтрофилов человека и животных, активность которых зависит от вида возбудителей и физиологического состояния этих клеток при разных условиях экспериментов.

2. Различия в динамике активности ферментов дыхательной цепи нейтрофилов изученных биологических моделей свидетельствуют о дифференцированных путях образования активных метаболитов кислорода в этих клетках при контакте с бактериями Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, отличающимися по механизмам фагоцитирования.

3.Установлена взаимосвязь между кислородзависимой, кислороднезависимой и нитроксидобразующей бактерицидными системами нейтрофилов при указанных инфекциях, с преимущественно прямой корреляцией показателей активности этих систем в ответ на воздействие Y. pseudotuberculosis и обратной корреляцией - на воздействие L. monocytogenes.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Эксперименты in vitro выполнены на 120 беспородньгх половозрелых белых мышах-самцах массой 18-25 гр, 12 морских свинках и in vivo - на 80 морских свинках массой 150-200 гр. Животные были получены из питомника РАМН "Столбовая" и находились на стандартной диете в боксированных помещениях с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции.

Для выделения фракции человеческих нейтрофилов использовали донорскую кровь, полученную в Краевой станции переливания крови.

В качестве инфекционных агентов использовались следующие виды бактерий: вирулентный штамм У. pseudotuberculosis Н—3515 и вирулентный штамм L. monocytogenes, сероварианг 4Ь, предоставленные музеем бактериальных культур НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.

Эксперименты in vitro проводились на нейтрофилах крови доноров, нейтро-филах крови и перитонеалыюго экссудата интактных мышей и морских свинок и нейтрофилах воспалительного экссудата мышей, которые получали, вызывая внут-рибрюшинное воспаление у животных путем введения стерильного 10% мясопеп-тонного бульона (0,5 мл) за 9 ч до извлечения перитонеального экссудата. Нейтро-филы инфицировали in vitro бактериями в соотношении 1:10, время контакта составило 5, 10, 15, 25, 35, 45 мии, 1, 2, 3 и 5 ч, после чего исследовали их ферментативную активность. В экспериментах in vivo использовались морские свинки, зараженные внутрибрюшинно )'. pseudotuberculosis и L. monocytogenes в дозе 550-600 тыс. м. т. В динамике - через 0,5, 2, 5, 7 и 19 часов после заражения исследовали активность ферментов бактерицидных систем лейкоцитов крови и перитонеального экссудата.

Все экспериментальные исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике ГУ НИИЭМ СО РАМН (протокол № 3/4 от 14.07.04).

а) Спектрофотометрические исследования:

• НСТ-тест. Показатели НСТ-теста определяли по методике, модифицированной A.A. Бутаковым (1991).

• Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) определяли по методам 3. Лойда (1965) в собственной модификации. В качестве субстратов использовали 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide и iodonitrotetrazolium violet (ICN) соответственно.

• Активность цитохромоксидазы определяли по методу A.B. Novikoff, S. Goldfischer (1969) в собственной модификации, используя в качестве субстрата 3,3 -diaminobenzidine.

• Активность миелопероксидазы определяли по методу 3. Лойда (1965) в собственной модификации, используя в качестве субстрата o-phenylenediamine (ОФД).

• Активность катионньгх белков определяли по методу A.A. Бутакова (1991), используя раствор прочного зеленого ("Fast Green") на основе метанолового трис-НС1-буфера.

• Определение содержания метаболитов N0 — нитритов (N0 "2) производили после инкубации нейтрофилов при 37 °С в течение 5, 10, 15, 25, 35, 45 мин, 1, 2, 3, 5, 7, 9 ч. Использовали метод (Schulz К. et al., 1999) с добавлением Griess реактива.

Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов выражали в виде показателя - индекса стимуляции (Т), в процентах, который вычисляли по формуле: Nk-No

Т = - Х100,

где Nk - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в не-стимулированных лейкоцитах;

No - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в стимулированных лейкоцитах.

б) Гистохимические исследования:

• Для выявления активности цитохромоксидазы, ЛДГ, СДГ использовали субстраты, указанные выше.

• Активность миелопероксидазы выявляли методом Грехема-Кнолли (Graham R., Karnovsky М., 1966).

• Активность катионных белков выявляли при помощи лизосомалыш катионного теста (Пигаревский В.Е., 1988) с вычислением ДЦК - дифференцированного цитохимического коэффициента по формуле, предложенной И.Г. Бондаренко (1985): Зха + 2,5хЬ + 2хс

ДЦК= -;

l,5xd + 1 хе + 0,5xf

где - 3; 2,5; 2; 1,5; 1; 0,5; 0 - степень включения в цитоплазму нейтрофила прочного зеленого в виде гранул зеленого цвета (КБ) или красителя Грехема - Кнол-ли (МПО) в виде гранул темно-коричневого цвета; а, Ь, с, d, е, f - количество

клеток, распределенных по степени окраски; 100 - общее количество подсчитанных клеток.

• Активность НАДФН-диафоразы (NO-синтазы) выявляли по методу В.Т. Норе, S.R Vincent (1989). Выявление индуцибельной N0 - синтазы в нейтрофилах проводилось методом иммуномечения (Webb J., Evans Т., 2001) с использованием смеси люминисцирующих сывороток 1:1- флюоресцирующих антииммуноглобулинов мыши и меченого альбумина (SIGMA).

В работе были применены методы корреляционного и регрессионного анализов. Для выявления различий между данными, полученными в экспериментальных и контрольных группах, применяли t-критерий Стьюдента, а для выявления взаимосвязи между компонентами бактерицидных систем нейтрофилов исследованных нами биологических моделей применяли коэффициент корреляции Спир-мена— (г). Для выражения статистических данных использованы известные графические приемы (Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Активность кислородзависимой и кнслороднезависимой бактерицидных систем нейтрофилов при заражении Y. pseudotuberculosis и L.monocytogenes

Сравнительное исследование активности бактерицидных систем нейтрофилов, зараженных указанными патогенными бактериями проводили на моделях in vitro и in vivo, определяя активность миелопероксидазы, сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, цитохромоксидазы, суммарной активности ферментов дыхательной цепи в НСТ-тесте, а также катионных белков.

В экспериментах in vitro установлено, что в нейтрофилах крови доноров в ответ на заражение как Y. pseudotuberculosis , так и L. monocytogenes повышалась активность ферментов кислородзависимой системы с участием сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. Максимальные значения для СДГ составили 36,45 ±0,15 %; р< 0,01 (25 мин) и 13,70 ± 0,17 %; р < 0,0J (45 мин) соответственно (рис. 1а), для ЛДГ - 27,3 ± 0,19 %; р < 0.05 (3 ч) и 15,94 ± 0,35 % (р < 0,05) (45 мин) соответственно (рис. 16). Повышение активности СДГ отражало запуск комплекса II дыхательной цепи нейтрофилов, тогда как наличие активности ЛДГ указывало на образование АМК с участием НАДФ.

В нейтрофилах воспалительного экссудата мышей при их контакте с Ypseudotuberculosis, наряду с повышением активности сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы (рис. 2а, б), определялась активность комплекса IV дыхательной цепи с участием цитохромоксидазы (48,04 ± 0,38 % (р < 0,01) через 25 мин) (рис. 2в). Одновременно повышалась активность миелопероксидазы до 37,67 ± 0,058 %(р <0,05) (рис. 2г), субстратом для которой является перекись водорода. Извест-

т %40 "

-15 -

Сроки инкубации, мин

-30

б)

Рис. 1. Динамика активности ферментов кислородзависимой системы нейтрофилов крови доноров при заражении in vitro }'. pseudotuberculosis (1) и L. monocytogenes (2): СДГ (а), ЛДГ (б). Здесь и далее: по оси ординат индекс стимуляции (Т, %). Оптическая плотность для интактных клеток составила: СДГ - 0,048±0,003; ЛДГ -0,052±0,003.

но, что повышение активности этого фермента отражает защитную реакцию клетки в ответ на внедрение бактерий.

При контакте нейтрофилов воспалительного экссудата мышей с L. monocytogenes образование АМК отмечалось только по пути комплекса IV с участием ЦХО (14,69 ± 0,51 %;р < 0,05, 35 мин) при нечеткой активации МПО (рис. 2в, г).

В лейкоцитах крови интактных морских свинок при заражении in vitro )'. pseudotuberculosis и L. monocytogenes активность ферментов кислородзависимой системы была выше по сравнению с таковой в нейтрофилах крови доноров. При этом по показателям НСТ-теста, активности СДГ, ЦХО и МПО изменения в целом носили однонаправленный характер, с преобладанием ферментативной активности Нф в ответ на заражение L. monocytogenes, что свидетельствовало о наработке АМК этими клетками с участием комплексов II и IV дыхательной цепн.

В лейкоцитах перитонеального экссудата интактных морских свинок также выявлено повышение активности исследованных ферментов за исключением ЦХО.

Таким образом, на различных биологических моделях в экспериментах in vitro установлены различия в динамике активности ферментов кислородзависимой системы нейтрофилов, свидетельствующие о дифференцированных путях образования активных метаболитов кислорода, зависящие от вида возбудителя. При заражении Y. pseudotuberculosis - по пути комплексов И и IV дыхательной цепи с участием соответственно ЛДГ, СДГ и ЦХО; при заражении L. monocytogenes только по пути комплекса IV с участием ЦХО.

При сравнении активности кислороднезависимой системы нейтрофилов воспалительного экссудата мышей и нейтрофилов крови доноров выявлено, что в ответ на бактериальную инфекцию, как псевдотуберкулезную, так и листериозную,

сдг

лдг

90120180300

Т,%

60 40 Н 20 0

-20 ■ -40 ■

Сроки инкубации, мин

а)

цхо

г ^

Сроки инкубации, мин б)

мпо

-1—I—-1—т—I—I—I

5 10 15 25 35 45 60 ЭОШДЮОО

Сроки инкубации, мин

В)

Т-1-1-1-1-1-1-1-г

0 5 10 15 25 35 45 60 9012018С800

Сроки инкубации, мин Г)

Рис. 2. Динамика активности ферментов кислородзависимой системы нейтрофилов воспалительного экссудата мышей при заражении in vitro Y. pseudotuberculosis (1) и L. monocytogenes (2): СДГ (а), ЛДГ (б), ЦХО (в), МПО (г). Оптическая плотность для шпактных клеток составила: СДГ - 0,053 ± 0,003, ЛДГ - 0,067 ± 0,003, ЦХО -1,54 ± 0,001, МПО - 0,047 ± 0,007.

показатели активности катионных белков (КБ) были отрицательными и их динамика носила волнообразный характер. Это свидетельствовало о расходовании катионных белков клетками при их взаимодействии с бактериями. При этом в нейтрофилах крови доноров степень дегрануляции и восстановления активности КБ была выражена более интенсивно, чем в нейтрофилах воспалительного экссудата мышей.

В экспериментах in vivo в лейкоцитах периферической крови морских свинок, зараженных указанными возбудителями, активность ферментов кислород-зависимой системы зависела от вида бактерий (рис. За).

Так, в ответ на внутрибрюшинное заражение животных У. pseudotuberculosis при нарастающем повышении активности МПО до 193,96 ± 2,33 % (р < 0,01) (19 ч) отмечалось снижение показателей суммарной активности ферментов дыхательной цепи в НСТ-тесте; через 7 ч после заражения L. monocytogenes выявлено достоверное повышение показателей НСТ-теста до 43,39 ± 2,06 % (р < 0,05) (рис. За).

НСТ-тест

-i—=—г

0,5 2 5 Сроки инфекции, ч

-40 J

а)

Сроки инфекции, ч б)

Рис. 3. Активность ферментов кислородзависимой системы в лейкоцитах периферической крови (а) и перитонеалыюго экссудата (б) морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis (1) и L. monocytogenes (2). Оптическая плотность для интактных клеток составила: в крови для НСТ - 0,087±0,005, для МПО - 0,052±0,003 и в экссудате для НСТ - 0,058±0,005, для МПО - 0,063±0,009.

В лейкоцитах очага воспаления (перитонеальный экссудат) (рис. 36) у животных, зараженных У. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, выявлено достоверное повышение суммарной активности ферментов дыхательной цепи до 126,78 ± 2,18 % (р < 0,002), (19 ч) и 97,33 ± 0,53 % (р < 0,01) (2 ч) соответственно и активности миелопероксидазы до 46,81 ± 1,83 % (р < 0,05) и 20,59 ± 0,24 % (р < 0,05) соответственно. Необходимо отметить, что при обеих инфекциях повышение показателей активности кислородзависимой системы наблюдалось вначале в лейкоцитах перитонеального экссудата, а спустя 5 - 7 ч после заражения в лейкоцитах периферической крови.

При оценке активности МПО и катионных белков нейтрофилов морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, с помощью ДЦК, который отражает наличие клеток с разной степенью активности этих ферментов, выявлены следующие различия. Так, повышение уровня МПО и катионных белков в нейтрофилах периферической крови (рис 4а, б) и очага воспаления (рис 5а, б) жи-

mulx'KWin,

Сроки

HH(|vKL!iUl Ч

Рис. 4. Показатели ДЦК для миелопероксидазы (а) и катионных белков (б) в нейтрофилах периферической крови морских снимок, зараженных К pseudotuberculosis (I) и L. monocytogenes (2). ДЦК

Сроки

ннфекции,ч

Рис. 5. Показатели ДЦК для миелопероксидазы (а) и катионных белков (б) в нейтрофилах перитонеалыюга экссудата морских свинок, зараженных У. pseudotuberculosis (11 и L. monocytogenes (2).

ватных, зараженных К pseudotuberculosis, обеспечивалось за счет клеток с высокой активностью этих ферментов, а при лисгсриошой инфекции преобладали клетки со средней и низкой степенью активности, тогда как, по данным R.i-'. i Огареве ко го и Ю.А. Мазинга (1985). кислородзависимая Миелойероксидазно - H;Oi -хлоридная система в присутствии йода оказывает более выраженное против« л истер и озное действие, нежели катиониые белки - лактоферрин и дефенсины.

Учитывая вышеизложенное, следует отметить, что исследования суммарной активности ферментов дыхательной цепи нейтрофилов in vivo и in vitro на разных биологических моделях выявили различия в интенсивности респираторного метаболизма этих клеток в ответ на заражение Y. pseudotuberculosis и L monocytogenes. Это подтверждает известный факт {Проскуряков С.Я. и др., 2000), что при заражении различными видами бактерий, фагоцитирующие клетки в опытах in vitro проявляют ферментативную активность, отличную от таковой в клетках зараженного организма (in vivo).

Нитроксидсинтаза и реактивные нитрогенные радикалы при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях

Оксид азота (NO) - молекула со свойствами радикала - широко задействована в системах антипатогенной активности клеток, участвующих в обеспечении резистентности организма к проникновению и развитию инфекций. Особый интерес вызывает участие N0 в уничтожении возбудителей, характеризующихся внутриклеточным паразитированием (Проскуряков С.Я. и др., 2000), к которым относятся У. pseudotuberculosis и L. monocytogenes. В литературе имеются сведения, что для гибели L. monocytogenes необязательна продукция N0. По мнению некоторых авторов (Wei X-Q. et al., 1995), это может быть связано с особенностями экспериментальных моделей (in vitro / in vivo) или с биологическим видом (клетки грызунов / человека). В отношении У. pseudotuberculosis нами не найдено сравнительных работ по изучению нитроксидобразующей активности нейтрофилов человека и животных.

В связи с вышеизложенным, нами был проведен ряд экспериментов по изучению указанной активности нейтрофилов. Для исследования использовались популяции этих клеток, полученные путем центрифугирования на двойном градиенте плотности крови доноров, крови и перитонеального экссудата интактных животных. Также определялась нитроксидобразующая активность нейтрофилов воспалительного экссудата, полученного через 9 ч от начала развития воспаления, после введения в брюшную полость мышей мясопептонного бульона. Одним из условий экспериментов была стимуляция нейтрофилов INF-y в течение 16 ч перед внесением бактерий, так как известно, что провоспалительные цитокины усиливают продукцию NO (Evans Т. et al., 1996; Webb J. et al., 2001).

В экспериментах in vitro в ответ на адгезию нами выявлена активная продукция метаболитов NO нестимулированными нейтрофилами крови доноров и ней-трофилами животных. Так, в нейтрофилах крови доноров содержание метаболитов N0 повышалось до 32,7 ± 0,4 % (р < 0,02) в период от 5 ч до 7 ч. При стимуляции нейтрофилов доноров INF-y, отмечались более высокие показатели уровня метаболитов N0 вплоть до конца срока наблюдения 9 ч - 76,16 ± 0,31 % (р < 0,01) (рис 6а). Содержание метаболитов N0 в нейтрофилах воспалительного экссудата мышей снижалось к 5 ч инкубации до -15,55 ± 0,65 % (р < 0,05). При внесении INF-y, количество метаболитов МО в этих нейтрофилах повышалось до 13,77 %; р < 0,05), уменьшаясь к 9 ч до -6,72 %(р < 0.10) (рис 66). При исследовании лейкоцитов интактных морских свинок выявлено, что контакт с пластиковой пробиркой клеток крови в течение 120 мин (рис. 7а) и клеток перитонеального экссудата в течение 60 мин (рис. 76) вызывал резкое повышение уровня метаболитов NO до 33,65 ± 0,05 %(р< 0,02) и 40,04 ± 1,56 % (р < 0,01) соответственно, с последующим снижением до уровня контроля.

Рис. f>. Содержание метаболитов N0 и нестиму лированных (I) и стимулированных INF-y (2} нейтрофчлах крови доноров (а) и » нейтрофилах воспалительного экссудата мышеи (б). Исходная оптическая плотно Йъ для не стимулированных 1 !ф составила 0-U87±0,003 н 0.061 ±0,004, для симулированных INF-y - 0,О94±О,ОО8 и 0.070 ±9.004 соответственно.

Таким образом, результаты экспериментов с нейтрофилами различных биологических моделей указывают на неоднозначную реакцию нитроксидобразукяцей системы этих клеток, связанной с их физиологическим состоянием. Выявлена активная продукция метаболите? NO нестнмулированшми нейтрофштами кропи доноров, а также лейкоцитами крови и перитонеального экссудата интактных морских свинок при их адгезии, тогда как, п иейтрофилах воспалительного экссудата мышей накопление метаболитов NO не установлено. На наш взгляд, это связано с тем, что вследствие предварительной стимуляции данной популяции клеток введением раздражающего агента (в нашем случае мясолелтонного бульона) нигрскеи-добразующая активность нейтрофилов значительно снижалась. Этот факт согласуется с выявленным нами значительным повышением количества метаболитов NO в нейтрофилах крови доноров и лейкоцитах интактных морских свинок непосредственно в ответ на стимуляцию гамма-интерфероном.

При контакте нейтрофилов крови доноров с К pseudotuberculosis (рис. 8а) отмечалось два периода повышения показателей метаболитов NO - от 30 до 60 мин до 31,3 ± 0,52 % (р < 0,02) и от 5 до 7 ч до 20,2 ± 0,3 % (р < 0,05). В ответ на заражение L. monocytogenes повышение индекса стимуляции относительно контроля происходило » более поздний период от 3 до 9 ч до 44.4 ± 0,52% (р <. 0.02), При предварительной стимуляции нейтрофилов интерфероном (рис. 86) уровень метаболитов NO значительно увеличивался и максимальное их количество в .лейкоцитах, зараженных У. pseudotuberculosis, отмечалось через 6 ч 144 J Я = 5,48 %; (р

< 0,002), а в ответ па заражение L. monocytogenes через 7 ч контакта 88,9 - 0,2 %;(/?

< 0.02).

60 120 300 Сроки инкубации мин

Сраки инкубацзд мин а) С»)

Рис, 7, Содержание метаболитов N0 в нести мул провал ны.ч лейкоцитах крови (а) и пери-то неально го экссудата (б) ннтактных морских свинок. Столбики на диаграмме обозначают процент NOS -положительных Нф (*;!,%). кривые - внутриклеточное содержание метаболитов NO (Т.%) Исходная оптическая плотность составила в лейкоцитах крови 0,102±0,004, экссудата—О,О76±О,0О4.

В нейтрофилах воспалительного экссудата мышей, как и в нейтрофилах крови доноров, значительное повышение содержания метаболитов NO отмечалось от 30 до 60 мин контакта с >'. pseudotuberculosis. Максимальное значение индекса стимуляции составило 27.26 ± 0,064 % (р < 0,02). [Три контакте с i. monocytogenes достоверное повышение содержания метаболитов NO до 7,07 ± 0,32 % (/> < ft/0) выявлено через 7 ч инфицирования (рис. 9а). При стимуляции нейтрофилов воспалительного экссудата fNF-y {рис. 96) выявлено низкое содержание метаболитов NO относительно контроля как при заражении Y. pseudotuberculosis, гак и L monocytogenes.

Таким образом, определено значительное повышение количества метаболитов NO в нейтрофилах крови донором в ответ на стимуляцию как INF-y, так и бактериальными агентами, тогда как в нейтрофилах воспалительного экссудата мышей отмечалось их снижение непосредственно после воздействия неспецифического стимулятора воспалена^. Это указывает на зависимость активности NO- образующей системы нейтрофилов от физиологического состояния клеток,

В экспериментах in vivo в лейкоцитах периферической крови животных, зараженных внутрибрюшинио бактериями, выявлена выраженная продукция оксида азота, причем показателя метаболитов NO находились на более высоком уровне при заражении L. monocytogenes {303,2 ± 6.9 %; р < 0,02), чем при заражении У. pseudotuberculosis (261.9 ± 8.2 %: р < 0,02) (рис. 10а), В лейкоцитах перитопсального экссудата морских свинок, зараженных >'. pseudotuberculosis и L monocytogenes, также выявлено повышение уровня метаболитов NO до 77.7 ± 1.74 % (р < 0,05) и 80.11 ±\,\1%{р < 0,05) соответственно (рйс. 106),

Результаты количественного определения продукции метаболитов NO с по-

30 45 1ч 2ч Зч 5ч 7ч. 9ч. Сроки инкубации, мин, ч

-I-г-

0 1,5 2 3 4 5 6 7 Сроки инкубации, ч

б)

Рис. 8. Содержание метаболитов NO в нейтрофилах крови доноров а) при контакте с У. pseudotuberculosis (1) и Л. monocytogenes (2); б) после стимуляции INF-y с последующим заражением бактериями. Кривые отражают содержание метаболитов NO (Т,%); столбики - процент NOS-положительных Нф (кл,%).

30 25 20 15 10 -5 0 -5 -10 -15 • -20-

Т,%

/Й

0 5 10 15 45 1ч 1,5ч 2ч Зч 5ч'| 7ч.Лг"-14

1 -" -24 \ ; ---34 V ---44

Сроки инкубации, мин, ч "" "54

-1- -64

а)

Рис. 9. Содержание метаболитов NO в не стимулированных нейтрофилах воспалительного экссудата мышей (а), зараженных Y. pseudotuberculosis (1) и L. monocytogenes (2); (б) после 16-ти часовой стимуляции INF-y с последующим заражением бактериями. Кривые отражают уровень метаболитов NO (Т,%); столбики - процент NOS-положительных Нф (кл,%).

мощью спектрофотометрического анализа совпадали с выявлением НАДФ-диафоразы (метод Норе В., Vincent S.) в нейтрофилах крови доноров, а также крови и экссудата животных, что свидетельствовало о нитроксидсинтазной активности этих клеток при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях. При гистохимическом исследовании мазков — отпечатков, приготовленных из суспензий лейкоцитов крови и перитонального экссудата изученных биологических моделей

Т. %

т,%

Рис. 10. Содержание метаболитов N0 в лейкоцитах периферической крови (а) и перито-неального экссудата (б) морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis (1) и L. monocytogenes (2). Оптическая плотность для интактных клеток составила н кроен 0.056-0,01 и в экссудате 0,134±0.019.

обнаружено значительное содержание NOS положительных нейтрофилов на фоне повышения и них уровня метаболитов оксида азота (рис. 7. 8а, 9а). С помощью непрямого метода иммунофлюоресценции при йЩользовании монойлональных антител идентифицирована активность индуцибельйрй NO-с питали в нейтрофилах воспалительного экссудата мышей при контакте с 1'. pseudotuberculosis и L. monocytogenes. На основании этого можно считать, что иитроксидобразующая способность нейтрофилав проявляется при стимуляции их этими видами бактерий.

Взаимосвязь активности кислородивпси мой и кислороднезависим ой ферментных систем с иитроксидобразующей способностью ягейтрофплов при обеспечении их бактерицидной функции на ранних этапах пеевдотуберкулезной и листериозиой инфекций

Для определения взаимосвязи между показателями активности кисло рол завис и мой, кислороднезависимой и нитрокендобразующей бактерицидных систем нейтрофилов различных биологических моделей при псевдотуберкулезной и лис-териозной инфекциях нами был проведен корреляционный анализ полученных данных.

При взаимодействии нейтрофилов крови доноров с К pseudotuberculosis обнаружена корреляция между показателями активности Ml 10 и содержанием метаболитов NO, при этом отмечена смена фаз прямой и обратной связи (табл. 1 >. Выявлена также синхронная корреляция между показателями активности ЦХО и продукцией метаболитов NO. Взаимосвязь между содержанием метаболитов NO показателями остальных ферментов (НСТ-теех, СДГ и ЛДГ) была менее регулярной, а в некоторые временные периоды носила оппозиционный характер но сравнению с корреляцией между МО, ЦХО и Ml 10. Необходимо отметить отсутствие достоверной связи между показателями активности ЛДГ' и содержанием метаболитов NO в

период от 15 мин до 2 ч, при наличии корреляции между содержанием метаболитов NO и показателями СДГ.

При контакте нейтрофилов воспалительного экссудата мышей с Y. pseudotuberculosis выявлена обратная корреляция между продукцией метаболитов NO и активностью СДГ, ЛДГ, ЦХО и МПО в период от 5 мин до 15 мин и, напротив, сильная прямая связь между ними в период от 1 ч до 5 ч (табл. 1). Также преимущественно прямая корреляция наблюдалась между содержанием метаболитов N0 и показателями НСТ-теста. Это указывало на сопряженность генерации метаболитов NO и кислорода, что подтверждало полученные ранее данные об участии в образовании молекулы оксида азота НАДФ-оксидазного комплекса (Fang С., 1997; Nathan С., Shiloh М* 2000).

При взаимодействии нейтрофилов крови доноров с L. monocytogenes также выявлена фазность корреляции исследованных показателей (табл. 2). Так, отмечалось чередование периодов синхронной прямой или обратной связи между продукцией метаболитов N0 и активностью составляющих ферментов дыхательной цепи - НСТ- тест, а также показателями активности СДГ и ЛДГ. Преимущественно обратная связь была выявлена между показателями содержания метаболитов N0, содержания метаболитов NO и активности МПО - фермента азурофильных гранул нейтрофилов, бактерицидное действие которой реализуется внутри фагосом, - характер корреляционной связи (прямая или обратная) изменялся синхронно с корреляцией между нитроксидобразующей способностью клеток и активностью ферментов СДГ и ЛДГ в период от 5 мин до 2 ч после заражения L. monocytogenes. Характер корреляции между показателями активности ЦХО и образованием метаболитов NO в период от 5 мин до 35 мин контакта с бактериями находился в проти-вофазе с показателями для вышеуказанных ферментов. Вероятно, это отражает особенности фагоцитарного процесса в отношении листерий, для которых свойственна как внутрифагосомальная, так и цитоплазматическая, вне фагосом, локализация в клетках. Корреляция между показателями содержания метаболитов N0 и активности СДГ, ЛДГ и МПО нейтрофилов воспалительного экссудата мышей была прямой в период от 35 мин до 1 ч после заражения L. monocytogenes. В остальные временные периоды контакта указанных нейтрофилов с листериями корреляция носила обратный характер.

У морских свинок, зараженных внутрибрюшинно Y. pseudotuberculosis (табл. 3), установлена прямая взаимосвязь между количеством метаболитов N0 в лейкоцитах периферической крови и активностью МПО и КБ, тогда как влейкоцитах очага воспаления корреляция выявлена только с МПО. У животных, зараженных L. monocytogenes, продукция метаболитов N0 нейтрофилами периферической крови коррелировала с показателями активности только одного фермента — МПО.

Таблица 1. Коэффициент корреляции между показателями содержания метаболитов N0 и активности компонентов кислородзависимой системы нейтрофилов крови доноров и воспалительного экссудата мышей при заражении in vitro Y. pseudotuberculosis

Временные периоды, мин между показателями НСТ-теста и содержанием метаболитов N0 между показателями СДГ и содержанием метаболитов NO между показателями ЛДГ и содержанием метаболитов NO меяеду показателями ЦХО и содержанием метаболитов NO между показателями МПО и содержанием метаболитов NO

Цейтрофчлы крови доноров

5-15 -0,41 ±0,3 р=0,8230 0,25 ± 0,32 р-0.5587 -0,24 ± 0,32 Р'0,5407 0,41 ±0,3 р=0,8230 -0,64 ± 0,25 р=0,9886

15-35 -0,88 ±0,15 р=0,9097 -0,47 ± 0,29 р '0,8859 0,87 ±0,16 /7=0,9997 0,76 ± 0,21 /7=0,999« 0,89 ± 0,15 р=0,9997

35-60 0,49 ± 0,25 р-0,9108 -0,61 ± 0,26 р=0,9797 0,07 ± 0,33 р=0,1897 0,64 ± 0,25 p=0,989S 0,90 ±0,14 р=0,9997

60 - 120 -0,41 ±0,3 р-0,8293 0,88 ±0,15 р-0,9997 0,18 ±0,33 р-0,4177 -0,73 ± 0,22 р=0,9989 -0,81 ±0,19 р=0,9997

120-300 0,90 ± 0,13 р=0,9997 -0,9 ±0,14 р-0,9997 -0,59 ±0,27 р=0,9722 -0,52 ± 0,28 р-0,9342 0,65 ± 0,25

Нейтрсн шлы воспалительного экссудата мышей

5-15 0,64 ±0,26 р=0,9869 -0,77 ±0,2 р-0.9997 -0,9 ±0,14 р=0,9997 -0,73 ± 0,23 р=0,9985 -0,88 ±0,15 /1=0,9997

15-35 0,70 ±0,24 р=0,9972 0,70 ± 0,23 р-0,9969 0,63 ± 0,26 р-0,9840 0,87 ±0,16 р=0,9997 0,3 ± 0,3 р-0,6528

35-60 -0,75 ±0,21 /7=0,9995 -0,13 ±0,33 р=0,2961 -0,44 ± 0,29 р-0,8584 0,28 ± 0,32 Р=0,6211 0,34 ±0,31 Р-0,7330

60- 120 0,50 ± 0,28 р 0,9199 0,69 ±0,23 /7=0,996« 0,90 ±0,14 р=0,9997 0,90 ± 0,14 р=0,9997 0,90 ±0,14 р=0,99970,

120-300 0,90 ±0,14 р=0,9997 -0,001 ±0,3 5 р-0,000 0,90 ± 0,14 /7=0,99970 0,83 ±0,18 /7=0,9997 0,87 ± 0,16 р=0,9997

Примечание: коэффициент корреляции С'пирмена (<0,6 - связь отсутствует; >0,7 - сильная связь), р>0,95 - достоверность связи

Представленные результаты корреляционного анализа полученных данных показали, что при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях компоненты-кислородзависимой (СДГ, ЛДГ, ЦХО, МПО, НСТ- тест), кислороднезависимой, (катионные белки) и нитроксидобразующей бактерицидных систем нейтрофилов человека и животных дифференцированно реагируют в ответ на заражение бактериями по принципу изменяющихся во времени прямых, и обратных связей в процессе генерации активных метаболитов кислорода и азота. При этом отмечена преимущественно прямая корреляция показателей в ответ на заражение Y. pseudotuberculosis и обратная корреляция в ответ на заражение L. monocytogenes. Это согласуется с данными Ю. Н. Гончарук (2005) о состоянии бактерицидных ферментных систем макрофагов при стафилококковой и листериозной инфекциях. Вероятно, указанный механизм лежит в основе развития сопряженных ферментативных реакций лейкоцитов - клеточных элементов антиинфекционной защиты организма.

Таблица 2. Коэффициент корреляции между показателями содержания метаболитов N0 и активности компонентов кислородзависимой системы нейтрофилов крови доноров и воспалительного экссудата мышей при заражении in vitro L. monocytogenes

Временные между показате- между' показа ге- между показате- между показате- между показате-

периоды, мин лями HCT-теста и лями СДГ и со- лями ЛДГ и со- лями ЦХО и лями МПО и

содержанием метаболитов NO держанием метаболитов N0 держанием метаболитов NO содержанием метаболитов NO содержанием метаболитов NO

Нейтрофилы крови доноров

5-15 0,9 ±0,14 0,9 ±0,14 0,87 ± 0,16 -0,88 ±0,15 0.28 ± 0,32

р=0,9997 р-0,9997 р=0,9997 р=0,9997 р-0,6265

15-35 -0,68 ± 0,24 -0,67 ± 0,24 -0,45 ± 0,29 0,79 ± 0,2 -0,81 ± 0,19

р=0,9956 р=0,9942 Р-0,8764 р=0,9997 р=0,9997

35-60 -0,76 ±0,21 -0,6 ±0,27 -0,85 ±0,17 -0,07 ± 0,3 0,31 ±0,3

р=0,9997 р=0,9749 р=0,9997 р-0, ¡741 Р'0,6319

60- 120 0,62± 0,26 0,75 ± 0,22 0,64 ± 0,25 0,6 ±0,26 0,72 ± 0,23

р=0,9832 р=0,9995 р=0,9886 р—0,9774 р=0,9983

120-300 -0,9 ±0,32 -0,88 ±0,16 0,32 ±0,31 0,55 ±0,27 0,81 ±0,19

р=0,9997 р=0,9997 р=0,6970 р-0,9534 р=0,9997

Нейтрофилы воспалительного экссудата мышей

5-15 0,25 ±0,32 0,44 ± 0,29 -0,80 ±0,19 -0,32 ±0,31 0,09 ±0,33

р-0,5646 р-0,8664 р—0,9997 р-0,7017 р-0,2282

15-35 -0,72 ± 0,23 -0,77 ±0,21 -0,84 ±0,18 -0,15 ±0.33 -0,65 ±0,25

р=0,9984 р=0,9997 р=0,9997 р-0,3545 р~0,9898

35-60 -0,68 ±0,24 0,90 ± 0,14 0,89 ± 0,15 -0,88 ±0,16 0,85 ±0,17

р=0,9947 р=0,99970 р=0,9997 р—0,9997 р—0,9997

60- 120 -0,07 ± 0,33 0,87 ± 0,16 -0,86 ±0,16 -0,16 ± 0,33 -0,38 ± 0,3

р-0.1663 р=0,9997 р=0,9997 р-0,3616 Р-0,7923

120 - 300 -0,36 ±0,31 -0,81 ±0,19 0,79 ± 0,2 0,57 ± 0,27 -0,75 ± ОД

р-0,7540 р=0,9997 р=0,9997 р~0,9625 р=0,9995

Таблица 3. Коэффициент корреляции между показателями содержания метаболитов N0 и активности миелопероксидазы и катионных белков в нейтрофилах крови и перито-неального экссудата морских свинок, зараженных внутрибрюшинно У. pseudotuberculosis и L. monocytogenes

Временные Y. pseudotuberculosis L monocytogenes

периоды между содержани- между содержани- меязду содержани- между содержани-

ем метаболитов ем метаболитов ем метаболитов ем метаболитов

NO и активностью NO и активностью NO и активностью NO и активностью

МПО катионных белков МПО катионных белков

а) Периферическая кровь

0,5 ч - 5 ч -0,42 ± 0,52 0,79 ±0,35 -0,46 ± 0.5 0,64 ± 0,44

р-0,582! р—0,9780 р-0,6319 р-0,8557

5 ч- 19ч 0,63 ± 0,32 -0,68 ± 0,42 0,79 ± 0,35 0,73 ± 0,38

р=0,9512 р=0,8948 р=0,9791 р-0,9451

б) Перитонеальный экссудат

0,5 ч-5 ч 0,74±0Г38 0,47 ± 0,50 -0,56 ± 0,47 -0,40 ± 0,53

р=0,9500 р-0,6476 р-0,7680 р-0,5527

5 ч- 19 ч 0,67 ± 0,43 0,51 ±0,49 -0,48 ± 0,5 -0,46 ±0,51

р-0,8812 р-0,6923 р-0,6579 р-^0,6372

>0,7 - сильная связь), р>0,95 - достоверность связи

ВЫВОДЫ

1.В сравнительном аспекте дана характеристика активности компонентов кисло-родзависимой, кислороднезависимой и нитроксидобразующей бактерицидных систем нейтрофилов человека и животных при псевдотуберкулезной и листери-озной инфекциях.

2.В экспериментах in vitro установлены различия в динамике активности ферментов кислородзависимой системы нейтрофилов изученных биологических моделей, свидетельствующие о дифференцированных путях образования активных метаболитов кислорода в нейтрофилах при этих инфекциях: при заражении Y. pseudotuberculosis по пути комплексов II и IV дыхательной цепи с участием соответственно лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксида-зы; при заражении L. monocytogenes только по пути комплекса IV с участием ци-тохромоксидазы.

3.В экспериментах in vivo у морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, выявлены достоверное повышение суммарной активности ферментов дыхательной цепи (НСТ-тест) и высокая активность миелопероксидазы вначале в лейкоцитах очага воспаления / перитонеальный экссудат /, а через 5-7 ч после заражения в лейкоцитах периферической крови. При этом имелись различия степени активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы в разные временные периоды при этих инфекциях.

4. Показаны различия степени активности компонентов кислороднезависимой системы нейтрофилов при заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes. Повышение уровня катионных белков в нейтрофилах очага воспаления и периферической крови животных при контакте с иерсиниями обеспечивалось за счет клеток с высокой активностью специфических гранул, тогда как при листериоз-ной инфекции преобладали клетки со средней и низкой степенью активности.

5. Обнаружено, что активность нитроксидобразующей системы нейтрофилов разных биологических моделей зависит от физиологического состояния этих клеток. В экспериментах in vivo наиболее высокие показатели метаболитов оксида азота выявлены в лейкоцитах перитонеалыюго экссудата морских свинок, зараженных указанными видами бактерий, особенно при контакте с листериями. В экспериментах in vitro повышение продукции метаболитов оксида азота и активность нитроксидсинтазы были более выраженными в нейтрофилах крови доноров и лейкоцитах интактных животных в ответ на стимуляцию интерфероном-у и бактериями обоих видов.

няющихся во времени прямых и обратных связей. При этом отмечена преимущественно прямая корреляция показателей в ответ на заражение Y. pseudotuberculosis и обратная корреляция в ответ на заражение L. monocytogenes.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Активность неферментных катионных белков нейтрофилов при стафилококковой и псевдотуберкулезной инфекциях /С.В Охотина, Н.Г. Плехова, J1.M. Сомова // VIII Дальневосточная молодежная школа - конференция по актуальным вопросам химии и биологии: Тез. докл., - МЭС ТИБОХ, 17-24 сентября, 2004. - С. 39.

2. Реакция фагоцитирующих клеток при инфекциях, вызванных грамположитель-ными бактериями / Ю.Н. Гончарук, С.В. Охотина // Конф. молодых ученых СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины»: Тез. докл., Новосибирск, 28 - 29 июня, 2004. - С.24.

3. Некоторые показатели окислительного механизма макрофагов, зараженных Listeria monocytogenes / Ю.Н. Гончарук, С.В. Охотина // VI Тихоокеанская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины»: Тез. докл., Владивосток, 24 - 27 апр. 2005. - С. 28.

4. Содержание метаболитов оксида азота в фагоцитах при листериозной и псевдотуберкулезной инфекциях / С.В. Охотина, Ю.Н. Гончарук // VI Тихоокеанская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины»: Тез. докл., Владивосток, 24 - 27 апр. 2005. - С. 36.

5. Метаболическая активность нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях / Н.Г. Плехова, JI.M. Сомова, С.В. Охотина, Е.И. Дробот, Ю.Н. Гончарук // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2006. - № 3, (приложение) - С. 43 - 47.

6. Кислородзависимая система макрофагов при стафилококковой и листериозной инфекциях / Л.М.Сомова, Н.Г.Плехова, Ю.Н.Гончарук, Е.И. Дробот, С.В. Охотина, Л.С.Бузолева, Е.А.Зайцева, Г.П.Сомов // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 3, (приложение) - С. 39 - 43.

7. Нитроксидобразующая активность нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях / Н.Г.Плехова, С.В Охотина., Е.И.Дробот, Л.М.Сомова // Тихоокеанский Медицинский журнал (в печати).

Список сокращений:

АМК - активные метаболиты кислорода; НСТ - нитросиний тетразолий;

ДЦК - дифференцированный цитохими- Нф -нейтрофилы;

ческий коэффициент; СДГ - сукцинатдегидрогеназа;

КБ -катионные белки; ЦХО - цитохромоксидаза;

ЛДГ - лактатдегидрогеназа; INF-y - интерферон-у;

МПО - миелопероксидаза; NO -оксид азота;

НАДФН - никотннамидадениндинуклео- NOS - нитроксвдсинтаза. тндфосфат восстановленный;

Охотина Софья Владимировна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЦИДНЫХ СИСТЕМ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ И ЛИСТЕРИОЗНОЙ ИНФЕКЦИЯХ

03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 06.04.2007. Формат бОхЭО'/и;. Усл. печ. л. 1,0 _Тираж 120 экз. Зак. Л; 2_

Отпечатано в типографии ТИНРО-Цептра 690000, Владивосток, пер. Шевченко, 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Охотина, Софья Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. Обзор литературы 11 1.1. Современные представления о бактерицидных системах нейтрофилов

1.1.1. Кислородзависимая система

1.1.2. Кислороднезависимая система

1.1.3. Нитроксидсинтаза и реактивные нитрогенные радикалы при бактери- 29 альных инфекциях

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1. Материал

2.1.1. Инфекционные агенты

2.1.2. Экспериментальные животные

2.2. Методы

2.2.1. Методы выделения фагоцитирующих клеток и их культивирования

2.2.2. Методы оценки функциональной активности нейтрофилов 43 А) Спектрофотометрические 43 Б) Гистохимические и иммуноцитохимичекие

2.2.3. Методы статистической обработки данных

ГЛАВА 3. Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой бак- 53 терицидных систем нейтрофилов при заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes в системе in vitro

3.1. Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой систем 56 нейтрофилов человека при заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes

3.2. Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой систем 61 нейтрофилов воспалительного экссудата мышей при заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes

3.3. Сравнительная характеристика бактерицидных систем нейтрофилов 68 воспалительного экссудата мышей и крови доноров при заражении клеток

Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes

3.4. Сравнительная характеристика кислородзависимой и кислороднезави- 76 симой систем лейкоцитов крови и перитонеального экссудата интактных морских свинок при заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes

ГЛАВА 4. Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой 83 бактерицидных систем лейкоцитов животных, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes

ГЛАВА 5. Нитроксидсинтаза и реактивные нитрогенные радикалы в ней- 94 трофилах при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях

5.1. Нитроксидобразующая активность нейтрофилов при псевдотуберку- 94 лезной и листериозной инфекциях в системе in vitro

5.2. Нитроксидобразующая активность лейкоцитов животных, зараженных 108 Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes

ГЛАВА 6. Взаимосвязь нитроксидобразующей, кислородзависимой и кисло- 113 роднезависимой бактерицидных системам нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика бактерицидных систем нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях"

Актуальность. Активная и мгновенная реакционная способность ней-трофильных лейкоцитов на раздражитель определяет их важную роль при различных воспалительных процессах. В двоякой функции нейтрофилов, объединяющей воспалительную и противоспалительную активность, отражено понятие воспаления как совокупности воспалительных и противовоспалительных реакций [139; 142; 236]. Нейтрофилы являются первыми клеточными элементами, которые задолго до моноцитов и лимфоцитов мигрируют через эндотелии сосудов, вблизи очага воспаления. Спектр биологически-активных веществ нейтрофилов включает свободные кислородные радикалы, протеиназы, бактерицидные протеины и цитокины, которые как по отдельности, так и в совокупности, оказывают влияние на регуляцию процессов воспаления.

В конце 1970-х гг. были выявлены и изучены четыре бактерицидных системы нейтрофильных гранулоцитов. В. Е. Пигаревским была предложена следующая их классификация: 1) миелопероксидазная система; 2) лизоцим; 3) лактоферрин; 4) неферментные катионные белки [34]. В дальнейшем, в связи с многочисленными исследованиями, представления о микробицидных системах нейтрофилов несколько изменились [184]. На данный момент сочли необходимым считать миелопероксидазу ферментом кислородзавимой системы, а лизоцим и лактоферрин составляющими кислороднезависимой системы. Кроме того, в связи с открытием молекулы оксида азота, была выделена нитроксидобразующая система. Таким образом, на данный момент для нейтрофилов обозначены три основные бактерицидные системы: 1) кисло-родзависимая система, в состав которой входят система НАДФН-производных оксидантов и Н2О2 — миелопероксидазная система; 2) нитроксидобразующая система, включающая реактивные посредники азота, производные NO-синтазы; 3) система белков нейтрофильных гранул (антимикробные белки, протеазы, серинпротеиназы, металлопротеиназы) [184].

Основным компонентом бактерицидных систем нейтрофилов, является фермент миелопероксидаза. Наряду с катионными белками, этот фермент относится к специфическим маркерам нейтрофила и характеризует качественные стороны гранулярной зернистости клетки. В современной литературе акцентировано внимание на новых направлениях исследований молекул-эффекторов, производных нейтрофилов, рассмотренных на примере миело-пероксидазо-производных оксидантов, действующих на значительном расстоянии от воспалительного очага.

Вопрос о значении оксида азота в обеспечении бактерицидности фагоцитов при различных инфекциях в последнее десятилетие активно изучается в отношении моноцитов/макрофагов, что освящено в обзорах С. Fang [109], С. Nathan [179], N. Zamora с соавт. [244], Ю.Н. Гончарук [15]. Кроме того, показано значение реактивных промежуточных продуктов азота (нитратов и нитритов) при различных патологических процессах у человека, но при этом не достаточно выяснен механизм их эндогенного образования. Также на настоящий момент до конца не раскрыты причины различия нитрооксидобра-зующей активности у нейтрофилов человека и животных.

В исследованиях, проведенных в НИИ СО РАМН ранее, представлена морфофункциональная характеристика нейтрофилов и их влияние на макрофаги при псевдотуберкулезной инфекции [39; 40]. До настоящего времени в литературе отсутствуют сведения о сравнительной характеристике бактерицидных систем нейтрофилов, а также о значении оксида азота в бактерицидности нейтрофилов при бактериальных инфекциях, в частности при псевдотуберкулезе и листериозе. Работ по цитоморфологическим исследованиям NO-синтазной активности нейтрофилов при данных инфекционных заболеваниях в доступной нам литературе не обнаружено.

Цель исследования В сравнительном аспекте охарактеризовать бактерицидные системы нейтрофилов и оценить их значение на ранних этапах псевдотуберкулезной и листериозной инфекций.

Задачи исследования

1. В системе in vitro определить активность компонентов кислородзави-симой ферментной системы нейтрофилов доноров и интактных животных при заражении их Yersinia pseudotuberculosis и Listeria monocytogenes.

2. В системе in vitro исследовать нитроксидобразующую активность нейтрофилов доноров и интактных животных при их взаимодействии с Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes.

3. В системе in vivo исследовать активность нитроксидобразующей, ки-слородзависимой и кислороднезависимой ферментных систем нейтрофилов морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes.

Научная новизна

• Установлена активность нитроксидсинтазы и образование метаболитов оксида азота в нейтрофилах человека и животных при псевдотуберкулезной инфекции.

• В сравнительном аспекте показана реактивность нитроксидобразующей, кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем нейтрофилов различных биологических моделей при их заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes.

• На основании цитохимических исследований установлены различия в динамике активности составляющих ферментов дыхательной цепи нейтрофилов в зависимости от вида возбудителя, что свидетельствует о дифференцированных путях образования активных метаболитов кислорода в нейтро-филах при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях.

• Установлена корреляция между показателями активности нитроксидобразующей, кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость диссертационной работы заключается в том, что полученные в ней новые данные расширяют понятие о морфофункцио-нальном состоянии нейтрофильных лейкоцитов в зависимости от вида патогенных бактерий, а также о нитроксидобразующей способности этих клеток при бактериальных инфекциях.

1. На ранних этапах псевдотуберкулезной и листериозной инфекций антимикробная защита обеспечивается за счет комплексного реагирования кислородзависимой, кислороднезависимой и нитроксидобразующей бактерицидных систем нейтрофилов человека и животных, активность которых зависит от вида возбудителей и физиологического состояния этих клеток при разных условиях экспериментов.

2. Различия в динамике активности ферментов дыхательной цепи нейтрофилов изученных биологических моделей свидетельствуют о дифференцированных путях образования активных метаболитов кислорода в этих клетках при контакте с Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, отличающимися по механизмам фагоцитирования.

3. Установлена взаимосвязь между кислородзависимой, кислороднезависимой и нитроксидобразующей бактерицидными системами нейтрофилов при указанных инфекциях, с преимущественно прямой корреляцией показателей активности этих систем в ответ на воздействие Y. pseudotuberculosis и обратной корреляцией - на воздействие L. monocytogenes.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Охотина, Софья Владимировна

ВЫВОДЫ

1. В сравнительном аспекте дана характеристика активности компонентов кислородзависимой, кислороднезависимой и нитроксидобразующей бактерицидных систем нейтрофилов человека и животных при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях.

2. В экспериментах in vitro установлены различия в динамике активности ферментов кислородзависимой системы нейтрофилов изученных биологических моделей, свидетельствующие о дифференцированных путях образования активных метаболитов кислорода в нейтрофилах при этих инфекциях: при заражении Y. pseudotuberculosis по пути комплексов II и IV дыхательной цепи с участием соответственно лактатдегид-рогеназы, сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы; при заражении L. monocytogenes только по пути комплекса IV с участием цитохромоксидазы.

3. В экспериментах in vivo у морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes выявлено достоверное повышение суммарной активности ферментов дыхательной цепи (НСТ-тест) и высокая активность миелопероксидазы вначале в лейкоцитах очага воспаления /перитонеальный экссудат/, а через 5 - 7 ч после заражения в лейкоцитах периферической крови. При этом имелись различия степени активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы в разные временные периоды при этих инфекциях.

4. Показаны различия степени активности компонентов кислороднезависимой системы нейтрофилов при заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes. Повышение уровня катионных белков в нейтрофилах очага воспаления и периферической крови животных при контакте с иерсиниями обеспечивалось за счет клеток с высокой активностью специфических гранул, тогда как при листериозной инфекции преобладали клетки со средней и низкой степенью их активности.

5. Обнаружено, что активность нитроксидобразующей системы нейтрофилов разных биологических моделей зависит от физиологического состояния этих клеток. В экспериментах in vivo наиболее высокие показатели метаболитов оксида азота выявлены в лейкоцитах перитонеального экссудата морских свинок, зараженных указанными видами бактерий, особенно при контакте с листериями. В экспериментах in vitro повышение продукции метаболитов оксида азота и активность нит-роксидсинтазы были более выраженными в нейтрофилах крови доноров и лейкоцитах интактных животных в ответ на стимуляцию интер-фероном-у и бактериями обоих видов.

6. С помощью корреляционного анализа установлено, что при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях компоненты кислородзависимой / СДГ, ЛДГ, ЦХО, МПО, НСТ-тест /, кислороднезависимой / кати-онные белки / и нитроксидобразующей бактерицидных систем нейтрофилов человека и животных дифференцированно реагируют в ответ на заражение бактериями по принципу изменяющихся во времени прямых и обратных связей. При этом отмечена преимущественно прямая корреляция показателей в ответ на заражение Y. pseudotuberculosis и обратная корреляция в ответ на заражение L. monocytogenes.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По физиологическому потенциалу нейтрофильные гранулоциты рассматриваются как клетки, обладающие уникальными возможностями, которые реализуются как в условиях нормы, так и при развитии патологии [207; 142]. Данные функции нейтрофилов обусловлены наличием у них комплекса бактерицидных систем, играющих главную роль в киллинге микроорганизмов при развитии антиинфекционной защиты. Благодаря возросшему интересу к изучению молекулярных основ фагоцитоза, в конце 1990-х - начале 2000-х гг. расширилось представление о бактерицидных механизмах фагоцитирующих клеток [18; 27; 43; 93; 115; 147; 164; 166]. В классификацию бактерицидных систем нейтрофилов была внесена нитроксидобразующая система [184]. Несмотря на это остается недостаточно широким спектр патогенов, в отношении которых раскрыты особенности ферментного реагирования фагоцитов, в частности нейтрофилов, а также продукции лейкоцитами нитро-генных радикалов.

В настоящей работе приведены данные сравнительного изучения активности бактерицидных систем нейтрофилов, зараженных патогенными бактериями Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes в экспериментах in vivo и in vitro. Для комплексной оценки активности кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем нейтрофилов нами были проведены цитохимические исследования активности ферментов миелопероксидазы, сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, цитохромоксидазы, суммарной активности ферментов дыхательной цепи в НСТ-тесте, а также катионных белков.

При проведении сравнительного анализа были выявлены различия в динамике активности составляющих компонентов кислородзависимой системы нейтрофилов разных биологических моделей в зависимости от вида возбудителя. Это свидетельствует о дифференцированных путях образования активных метаболитов кислорода (АМК) в нейтрофилах в ответ на воздействие патогенов [111; 122; 164; 177; 203; 243].

Известно, что к образованию АМК приводит нарушение передачи электронов по электронно-транспортной цепи при стимуляции нейтрофила [13]. Из-за малого времени существования АМК их действие улавливается субстратами, которые используют для определения активности ферментов [14; 20]. В экспериментах in vitro нами установлено, что в нейтрофилах крови доноров в ответ на заражение как Y. pseudotuberculosis , так и L. monocytogenes образование АМК происходит с участием сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, что косвенно отражает наработку активных метаболитов кислорода при взаимодействии нейтрофилов с этими видами бактерий. При этом необходимо отметить, что повышение активности СДГ, которая принадлежит к цитратному циклу, отражает запуск комплекса II дыхательной цепи, а участие ЛДГ указывает на образование АМК с участием НАДФ [20].

При контакте нейтрофилов воспалительного экссудата мышей с Y. pseudotuberculosis в образовании АМК задействованы сукцинатдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа, а также комплекс IV дыхательной цепи с участием цитохромоксидазы, активность которой отражает непосредственно образование основного аниона 0{ [20], Одновременно имеет место активации миело-пероксидазы, субстратом для которой является перекись водорода, образующаяся наряду с кислородным радикалом при стимуляции клеток, а значит, повышение активности МПО отражает защитную реакцию клетки в ответ на внедрение бактерий [139]. При контакте указанных клеток с L. monocytogenes образование АМК протекает только по пути комплекса IV при нерезкой активации МПО. Эти факты, по нашему мнению, указывают на сниженную защитную реакцию нейтрофилов воспалительного экссудата мышей в ответ на заражение L. monocytogenes и отражают более активное образование ими основного аниона Ог" в ответ на заражение их Y pseudotuberculosis.

В популяции лейкоцитов крови интактных морских свинок, среди которых наблюдалось процентное преобладание нейтрофилов, при заражении in vitro Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes активность ферментов кислородзависимой системы была выше по сравнению с таковой в нейтрофилах крови доноров. В целом изменения показателей НСТ-теста, активности СДГ, ЦХО и МПО носили однонаправленный характер. Причем отмечались более высокие показатели ферментативной активности Нф в ответ на заражение L. monocytogenes. Это свидетельствовало об активной наработке этими клетками АМК с участием комплексов II и IV дыхательной цепи. В популяции лейкоцитов перитонеального экссудата интактных морских свинок, где преобладали макрофаги, также выявлено повышение активности исследованных ферментов за исключением ЦХО, слабая активность которой свидетельствовала о присутствии цитотоксического действия на клетки большого количества образованных АМК [138; 139].

Таким образом, следует отметить, что в экспериментах in vitro имелись количественные различия степени активации отдельных компонентов кислородзависимой системы нейтрофилов с преобладанием суммарной активности ферментов дыхательной цепи в НСТ-тесте при листериозной инфекции.

При сравнении активности кислороднезависимой системы нейтрофилов воспалительного экссудата мышей и нейтрофилов крови доноров (в экспериментах in vitro) выявлено, что в ответ на бактериальную инфекцию, как псевдотуберкулезную, так и листериозную, показатели активности катионных белков были отрицательными и их динамика носила волнообразный характер. По данным Ю. А. Мазинга [24], это свидетельствует о расходовании катионных белков в процессе взаимодействия Нф с бактериями. При этом в нейтрофилах крови доноров степень дегрануляции была выражена более интенсивно, чем в нейтрофилах воспалительного экссуД&ташы^шментах in vivo у морских свинок, зараженных внутрибрю-шинно Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, активность ферментов кислородзависимой системы лейкоцитов периферической крови также зависела от вида бактерий. Так, в ответ на заражение животных Y. pseudotuberculosis уже в первые часы (2 ч) снижалась суммарная активность ферментов дыхательной цепи в НСТ-тесте при нарастающем повышении активности МПО, тогда как, через 7 ч после заражения L. monocytogenes, выявлено повышение показателей НСТ-теста. В лейкоцитах очага воспаления (перитонеальный экссудат) у зараженных животных выявлено достоверное повышение суммарной активности ферментов дыхательной цепи и активности миелоперок-сидазы. При обеих инфекциях повышение показателей активности кислородзависимой системы наблюдалось вначале в лейкоцитах перитонеального экссудата (в очаге воспаления), а спустя 5 - 7 ч после заражения в лейкоцитах периферической крови.

Исходя из вышеизложенного, следует заключить, что показатели суммарной активности ферментов дыхательной цепи нейтрофилов разных биологических моделей свидетельствуют о различиях в интенсивности респираторного метаболизма в ответ на заражение Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes в условиях in vivo и in vitro. Это подтверждает известный факт [31; 56; 57; 63], что при заражении различными видами бактерий, фагоцитирующие клетки в опытах in vitro проявляют ферментативную активность, отличную от таковой в клетках зараженного организма (in vivo) [31].

При оценке активности миелопероксидазы и катионных белков нейтрофилов морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, с помощью ДЦК, который отражает наличие клеток с разной степенью активности ферментов, выявлены следующие различия. Повышение уровня МПО и КБ в нейтрофилах периферической крови и очага воспаления животных, зараженных Y. pseudotuberculosis, обеспечивалось за счет клеток с высокой активностью этих ферментов, а при листериозной инфекции преобладали клетки со средней и низкой степенью активности. По данным В.Е. Пи-гаревского и Ю.А. Мазинга [37], кислородзависимая миелопероксидазно

Н202 - хлоридная система в присутствии йода оказывает более выраженное противолистериозное действие, нежели катионные белки - лактоферрин и дефенсины.

Оксид азота (N0) - молекула со свойствами радикала - широко задействована в системах антипатогенной активности клеток, участвующих в обеспечении резистентности организма к проникновению и развитию инфекций. Особый интерес вызывает участие N0 в уничтожении возбудителей, характеризующихся внутриклеточным паразитированием [31; 56; 57; 60; 63; 108]. Большинство исследованных патогенов проявляют чувствительность к метаболитам оксида азота в инфицированном организме. Тем не менее, по данным некоторых авторов [56; 57; 88; 234], существует ряд микроорганизмов, в том числе L. monocytogenes, для гибели которых продукция N0 необязательна. По мнению X.-Q Wei с соавт. [56] это может быть связано с особенностями экспериментальных моделей (in vitro/ in vivo) или с биологическим видом (клетки грызунов / человека) [56; 57].

Исследования in vivo [152; 153] и in vitro [81; 89; 237] показали, что при некоторых бактериальных инфекциях провоспалительные цитокины (TNF-a и INF-y) способны регулировать продукцию N0 в нейтрофилах. В качестве моделей в основном использовали нейтрофилы крови доноров. Нами не найдено сравнительных работ по изучению нитроксидобразующей активности нейтрофилов человека и животных при бактериальных инфекциях. В связи с этим, был проведен ряд экспериментов по исследованию активности нитро-ксидзависимой системы нейтрофилов крови доноров и нейтрофилов животных. Перед внесением бактерий в клеточную культуру нейтрофилы в течение 16 ч были стимулированы INF-y.

В системе in vitro при адгезии клеток выявлена активная продукция N0 нестимулированными нейтрофилами крови доноров и лейкоцитами перито-неального экссудата интактных морских свинок, что подтверждает данные С.Е. Wright с соавт. [242] и J.L. Webb с соавт. [237]. В то же время нами в нейтрофилах воспалительного экссудата мышей накопление метаболитов N0 не установлено, что, по нашему мнению, связано с предварительной стимуляцией данной популяции клеток введением в брюшную полость раздражающего агента (в нашем случае мясопептонного бульона), вследствие чего нитроксидобразующая активность нейтрофилов значительно снижалась. Этот факт согласуется с выявленным нами значительным повышением количества метаболитов N0 в нейтрофилах крови доноров и лейкоцитах перитонеального экссудата интактных животных в ответ на стимуляцию гамма-интерфероном и бактериальными агентами Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, причем в нейтрофилах воспалительного экссудата мышей отмечалось их снижение непосредственно после стимуляции INF-y. Все вышесказанное свидетельствует о зависимости активности NO-образующей системы нейтрофилов различных биологических моделей от их физиологического состояния.

В экспериментах in vivo в лейкоцитах периферической крови животных, зараженных внутрибрюшинно бактериями, выявлена выраженная продукция оксида азота, причем, показатели метаболитов N0 находились на более высоком уровне при заражении L. monocytogenes, чем при заражении Y. pseudotuberculosis. В лейкоцитах перитонеального экссудата морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, также выявлено повышение уровня метаболитов N0.

Нами установлено, что у морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, основной объем N0, продуцируемого лейкоцитами в динамике инфекции, обеспечивается клетками моноцитарного ряда. Тем не менее, высокое количество NOS- положительных нейтрофилов указывает на их нитроксидобразующую активность при этих инфекциях.

Цитохимическое исследование внутриклеточного содержания NO-синтазы в нейтрофилах показало аналогичную зависимость активности фермента от физиологического состояния клеток. Необходимо отметить, что некоторыми исследователями [69] указывалось на отсутствие синтеза индуци-бельной NO-синтазы и продукции нитритов в интактных нейтрофилах крови человека и крысы. При этом отмечалось, что только в нейтрофилах воспалительного экссудата крыс продуцировались нитриты. На этом основании авторами был сделан вывод о различных путях активации гена экспрессии инду-цибельной NO-синтазы в нейтрофилах человека и крыс. Нами с помощью цитохимического метода была выявлена значительная активность NO-синтазы как в нейтрофилах доноров, так и в нейтрофилах мышей, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes. На основании этого можно считать, что нитроксидобразующая способность нейтрофилов проявляется при стимуляции их этими видами бактерий. На наличие активности NO-синтазы в экстравазальных нейтрофилах человека при бактериальных инфекциях указывали в своих работах и другие авторы [48; 69; 77; 89; 113; 237].

Продукция оксида азота в нейтрофилах выявлена нами также после предварительной инкубации клеток с провоспалительным цитокином - интерфероном у, причем в нейтрофилах человека она была более выраженной, чем в нейтрофилах животных. Повышение внутриклеточного содержания NO-синтазы можно объяснить тем, что в нейтрофилах присутствуют как конститутивные, так и индуцибельная формы NO-синтазы, которые суммарно могут проявлять свою активность в интактных и стимулированных клетках [48; 69; 86; 96; 124; 141; 145].

Для определения взаимосвязи между показателями активности кислородзависимой, кислороднезависимой и нитроксидобразующей бактерицидных систем нейтрофилов различных биологических моделей при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях нами был проведен корреляционный анализ полученных данных.

В динамике взаимодействия нейтрофилов крови доноров с Y. pseudotuberculosis на протяжении всех временных периодов исследования обнаружена корреляция между показателями МПО и содержанием метаболитов N0, при этом отмечена смена фаз прямой и обратной связи между этими показателями. Выявлена также синхронная корреляция между показателями активности ЦХО и продукцией N0. По другим показателям (НСТ-тест, СДГ, ЛДГ) взаимосвязь с содержанием метаболитов N0 была менее регулярной, а в некоторые временные периоды носила оппозиционный характер, по сравнению с корреляцией между N0, ЦХО и МПО. Необходимо отметить отсутствие достоверной связи между показателями активности ЛДГ и содержанием метаболитов N0 в период от 15 мин до 2 ч, при наличии корреляции между содержанием метаболитов N0 и показателями активности СДГ.

При взаимодействии нейтрофилов крови доноров с L. monocytogenes также выявлена фазность корреляции между показателями содержания метаболитов N0 и компонентами кислородзависимой системы. Так, отмечалось чередование периодов синхронной прямой или обратной связи между продукцией N0 и активностью составляющих ферментов дыхательной цепи (суммарная активность ферментов в НСТ-тесте, активность СДГ и ЛДГ). Преимущественно обратная связь была выявлена между показателями продукции N0, показателями активности СДГ и ферментов дыхательной цепи в НСТ-тесте. Между показателями содержания метаболитов N0 и активности МПО - фермента азурофильных гранул нейтрофилов, бактерицидное действие которой реализуется внутри фагосом, - характер корреляционной связи (прямая или обратная) изменялся синхронно с корреляцией между нитрокси-добразующей способностью клеток и активностью ферментов СДГ и ЛДГ в период от 5 мин до 2 ч после заражения L. monocytogenes. Характер корреляции между показателями активности ЦХО и образованием метаболитов N0 в период от 5 мин до 35 мин контакта Нф доноров с L. monocytogenes находился в противофазе с показателями для вышеуказанных ферментов. Вероятно, такая картина отражает особенности фагоцитарного процесса в отношении листерий, для которых свойственна как внутрифагосомальная, так и цито-плазматическая (вне фагосом) локализация в клетках [123; 159].

При контакте нейтрофилов воспалительного экссудата мышей с Y pseudotuberculosis in vitro в период от 5 мин до 15 мин выявлена обратная связь содержания метаболитов N0 с активностью СДГ, ЛДГ, ЦХО и МПО, а от 1 ч до 5 ч - сильная прямая связь с показателями активности всех исследованных ферментов. Также преимущественно прямая связь наблюдалась между показателями содержания метаболитов N0 и НСТ-теста. Это указывало на сопряженность генерации метаболитов N0 и кислорода и подтверждало полученные ранее данные других исследователей об участии в образовании молекулы оксида азота НАДФ-оксидазного комплекса [74; 108; 109; 177; 178; 213]. При заражении L. monocytogenes взаимосвязь продукции N0 с активностью ферментов кислородзависимой системы была преимущественно обратной. Прямая взаимосвязь нитроксидобразующей активности установлена в сроки от 35 мин до 1 ч с активностью СДГ, ЛДГ и МПО. Кроме того, на протяжении всего срока наблюдения при контакте нейтрофилов воспалительного экссудата мышей с L. monocytogenes была установлена прямая взаимосвязь между продукцией N0 и активностью катионных белков.

В наших исследованиях установлена корреляционная связь между содержанием метаболитов N0 и активностью бактерицидных компонентов нейтрофилов крови и перитонеального экссудата интактных морских свинок при заражении in vitro Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes. Необходимо отметить, что при контакте с Y. pseudotuberculosis связь нитроксидобразующей активности лейкоцитов крови была выявлена с МПО, а при контакте с L. monocytogenes - с катионными белками. В лейкоцитах перитонеального экссудата, напротив, показатели содержания метаболитов N0 при заражении иерсиниями коррелировали с активностью катионных белков, а при заражении листериями - с активностью МПО.

У морских свинок, зараженных внутрибрюшинно Y. pseudotuberculosis, установлена прямая взаимосвязь между содержанием метаболитов N0 в лейкоцитах периферической крови и активностью МПО и КБ, тогда как в лейкоцитах очага воспаления корреляция выявлена только с МПО. У животных, зараженных L. monocytogenes, продукция метаболитов N0 в нейтрофилах периферической крови коррелировала с показателями активности только одного фермента - МПО.

Представленные в работе результаты сравнительных исследований обосновывают значение ферментативных механизмов, обеспечивающих бактерицидный потенциал нейтрофильных лейкоцитов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях. С помощью корреляционного анализа установлено, что компоненты бактерицидных ферментных систем нейтрофилов (кислородзависимой, кислороднезависимой и нитроксидобразующей) дифференцированно реагируют в ответ на инфекции по принципу изменяющихся во времени прямых и обратных связей в процессе генерации активных метаболитов кислорода и азота. Это согласуется с данными Ю. Н. Гончарук [15] о состоянии бактерицидных ферментных систем макрофагов при стафилококковой и листериозной инфекциях. Вероятно, указанный механизм лежит в основе сопряженных ферментативных реакций фагоцитирующих клеток при развитии антиинфекционной защиты организма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Охотина, Софья Владимировна, Владивосток

1. Афанасьев, Б.В. Родоначальные кроветворные клетки человека Текст. / Б.В.Афанасьев, В.А. Алмазов Л.: Наука, 1985. -202 с.

2. Бережная, Н.М. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз Текст. / Н.М. Бережная. Киев, Наукова думка, 1988. - 187с.

3. Бондаренко, И.Г. Оптимизация оценки активности миелопероксидазы в нейтрофилах крови Текст. / И. Г. Бондаренко // Лабораторное дело. -1986. -№ 5. С. 313 -314.

4. Бутаков, А.А. Разработка комплекса экспресс-методов оценки фагоцитарного звена иммунитета для иммуноэпидемиологических исследований Текст.: дис. канд. мед. наук: 14.00.36 / А.А. Бутаков М., 1991. -131с.

5. Ванин, А. Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях Текст. / А. Ф. Ванин // Вестник РАМН. 2000. - № 4. - С. 3 - 5

6. Ванин, А.Ф. Оксид азота регулятор клеточного метаболизма Текст. / А.Ф. Ванин // Соросовский образовательный журнал.- 2001.- Т. 7, №11. - С. 7-12.

7. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах Текст. / Ю.А. Владимиров // Соросовский образовательный журнал. -2000.- Т.6, №12.-С. 13-19.

8. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в живых системах Текст. / Ю.А Владимиров, О.А. Азизова, А.И Деев и др. // Итоги науки и техники. Серия биофизика, Т.29.; сб. науч. трудов / ВИНИТИ; М., 1991. С. 3-250.

9. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты Текст. / Ю.А. Владимиров // Вестник РАМН.- 1998. № 7.- С. 43 - 51.

10. Воробьев, А. И. Руководство по гематологии, Т. 1. Текст. / А. И. Воробьев М., 2002 - 350 с.

11. Галанкин, В. Н. Принципы морфофункциональной классификации гранулоцитарных дефицитов Текст. / В. Н. Галанкин, А. М. Токмаков, Н. М. Харченко // Архив патологии 1990. - Т. 52, №6. - С. 39 - 43.

12. Галанкин, В.Н. Проблемы воспаления с позиций теории и практики Текст. / В.Н. Галанкин, A.M. Токмаков. М.: Универ. дружбы народов, 1991.- 120с.

13. Гамалей, И.Ф. Перекись водорода как сигнальная молекула Текст. / И.Ф. Гамалей, И.В. Клюбин // Цитология. 1996. - Т. 38, №12. - С. 1223 - 1247.

14. Герасимов, И.Г. Кинетика реакции восстановления нитросинего тетра-золия нейтрофилами крови человека Текст. / И.Г. Герасимов, О.А. Калуцкая // Цитология. 2000. - Т. 42, №2. - С. 160 - 165.

15. Гончарук, Ю. Н. Кислородзависимая и нитроксидзависимая ферментные системы макрофагов при стафилококковой и листериозной инфекциях Текст.: / автореф. дис. канд. мед. наук: 03.00.25 / Ю. Н. Гончарук. Владивосток, 2005. - 26с.

16. Динамика иммунологических показателей полостного смыва у больных острыми абсцессами легких Текст. / Ю. П. Селезнев, С.В.Иванов, В.И.Темирбулатов и др. // Научно-медицинский вестник Центрального Черноземья. 2004. - № 18, IV кв.

17. Кашкин, К. П. Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность (лекция) Текст. / К. П. Кашкин // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - № 11. - С.21 - 32.

18. Клебанов, Г. И. Клеточные механизмы прайминга и активации фагоцитов Текст. / Г.И. Клебанов, Ю. А. Владимиров // Успехи современной биологии. 1999. - Т. 119, №5 - С.462 - 475.

19. Козлов, В.А. Стволовая кроветворная клетка и иммунный ответ Текст. / В.А. Козлов, И.Н. Журавкин, И.Г. Цирлова. Новосибирск: Наука, 1982.

20. Кольман, Я. Наглядная биохимия Текст. / Я. Кольман, К.-Г. Рем. М.: Мир, 2000. - 467с.

21. Кулинский, В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита Текст. / В.И. Кулинский //Соросовский образовательный журнал. 1999. - №1. - С.2-7.

22. Лакин, Г.Ф. Биометрия Текст. / Г. Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990.-С. 225 -303.

23. Лойда, 3. Гистохимия ферментов лабораторные методы Текст. / 3. Ллойда, Р. Госсрау, Т. Шиблер. М.: Мир, 1982. - 270с.

24. Мазинг, Ю.А. Нейтрофильные гранулоциты и система защиты организма Текст. / Ю.А. Мазинг // Архив патологии. 1991. - Т. 53, № 9. -С.70-73.

25. Маянский, Д. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге Текст. / Д. Н. Ма-янский, А. Н. Маянский . Новосибирск: Наука, 1989. - 344с.

26. Маянский, Д. Н. Хроническое воспаление Текст. / Д. Н. Маянский. М.: Медицина, 1991.-С.98.

27. Меныцикова, Е. Б. Оксид азота и NO-синтаза в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях Текст. / Е. Б. Меныцикова, Н. К. Зенков, В. П. Реутов // Биохимия. 2000. - Т.65, вып.4. - С.485 - 503.

28. Мисюк, Н.С. Корреляционно-регрессионный анализ в клинической медицине Текст. / Н.С. Мисюк, А.С. Мастыкин, Г.П. Кузнецов. М.: Медицина, 1975. - 192 с.

29. Нагоев, Б.С. Очерки о нейтрофильном гранулоците Текст. / Б.С. Наго-ев Нальчик: Изд-во Эльбрус, 1986.

30. Нестеренко, В.Г. Определение завершенности фагоцитарной реакции с помощью выявления лизомальных катионных белков Текст. / В.Г. Нестеренко // Лабораторное дело. 1982. - №5. - С. 11-12.

31. Оксид азота в механизмах патогенеза внутриклеточных инфекций Текст. / С. Я. Проскуряков, С. И. Бикетов, А. И. Иванников и др. // Иммунология. 2000. - №4. - С.9-20.

32. Осипов, А.Н. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорида с ионами железа Текст. / А.Н. Осипов // Биофизика. 1993.-Т.38,№3.-С. 390-396.

33. Пигаревский, В.Е. Возрастные иммунодефицита системы нейтро-фильных гранулоцитов Текст. / В.Е Пигаревский, Ю.А.Мазинг, В. Н. Кокряков // Архив патологии. 1990. - Т. 52, №6. - С. 43 - 46.

34. Пигаревский, В. Е. Зернистые лейкоциты и их свойства Текст. / В. Е. Пигаревский. М.: Медицина, 1978. - 128 с.

35. Пигаревский, В. Е. К методике применения лизосомально-катионного теста в лабораторно-диагностической практике Текст./ В. Е. Пигаревский, Ю. А. Мазинг// Лабораторное дело. 1981. -№10. - С.579-584.

36. Пигаревский, В.Е. Клиническая морфология нейтрофильных гранулоцитов Текст. / В. Е. Пигаревский. -Л., 1988. С.87-101.

37. Пигаревский, В.Е. Поиск и разработка новых диагностических тестов неспецифической резистентности Текст. / В.Е. Пигаревский, Ю.А. Мазинг // ДСП. Отч. закл. НИИ эксперимент, мед. АМН. 1985. - 56 с.

38. Плехова, Н. Г. Бактерицидная активность фагоцитов Текст. / Н. Г. Плехова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2006,-№6.-С. 89-96.

39. Плехова, Н. Г. Функциональное состояние полиморфноядерных лейкоцитов и их влияние на функции макрофагов при некоторых бактериальных инфекциях Текст.: / автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.11 / Н. Г. Плехова. Владивосток, 1996. - 23с.

40. Плехова, Н.Г. Электронно-цитохимическая характеристика процесса взаимодействия нейтрофилов и макрофагов с Yersinia pseudotuberculosis Текст. / Н.Г Плехова, Л.М. Исачкова // Мед. журн. России. 1998. -№1-2.-С. 61-65.

41. Ройт, А. Основы иммунологии Текст. / А. Ройт. М.: Мир, 1991. -328с.

42. Саркисов, Д. С. Электронномикроскопическая радиография клетки Текст. / Д. С. Саркисов, А. А. Пальцын, Б. В. Втюрин . М., 1980.

43. Тотолян, А. А. Клетки иммунной системы Текст. / А. А. Тотолян, И. С. Фрейдлин. СПб.: Наука, 2000. - 232 с.

44. Хэм, А. Гистология Текст.; Т.2 / А. Хэм, Д. Кормак. М.: Мир, 1983. - с.127- 149.

45. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих Текст. / В.П. Реутов, Е.Г. Сорокина, В.Е. Охотин и др. М.: Наука, 1997. - 159с.

46. A contractive activity that closes phagosomes is macrophages Text. / J.A. Swanson, M.T. Johnson, K. Beningo et al. /J. Cell Sci. 1999. - Vol. 112. -P.307-316.

47. A large subset of neutrophils expressing membrane proteinase 3 is a risk factor for vasculitis and rheumatoid arthritis Text. / V. Witko-Sarsat, P. Le-savre, S. Lopez, et al. // J. Am. Soc. Nephrol. 1999. - № 10 - P. 12241233.

48. Activation of nitric oxide release and oxidative metabolism by leukotrienes B4, C4, and D4 in human polymorphonuclear leukocytes Text. / G. Larfars, F. Lantoine, M.-A. Devinck , J. Palmblad et.al // Blood. 1999. - Vol. 93, №4. - P.l399-1405.

49. Activation of the NADFH oxidase involves the small GTP-binding protein p21racl Text. / A. Abo, E. Pick, A. Hall et. al. // Nature. 1991. - Vol. 353. - P. 668-670.

50. Activities of LL-37, a cathelin-associated antimicrobial peptide of human neutrophils Text. / J. Turner, Y. Cho, N.N. Dinh et al.// Antimicrobial. Agents. Chemother. 1998. - Vol. 42. - P. 2206-2214.

51. Activity of protegrins against yeast-phase Candida albicans Text. / Y. Cho, J.S. Turner, N.N. Dinh et al. // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 2486-2493.

52. Adams, D.R Nitric oxide: physiological roles, biosynthesis and medical uses Text. / D.R. Adams, M. Brochwicz-Lewinski, A.R. Butler // Fortschr. Chem. Org. Naturst. 1999. - Vol. 76. - P. 1-211.

53. Albina, J.E. On the expression of nitric oxide synthase by human macrophages. Why no NO? Text. / J.E. Albina // J. Leukocyte Biol. 1995. -Vol. 58.-P. 643-649.

54. Alican, I. A critical role of nitric oxide in intestinal barrier function and dysfunction Text. /1. Alican, P.Kubes // Am. J. Phisiol. 1996. - Vol. 33. -G. 225.

55. Altered immune responses in mice lacking inducible nitric oxide synthase Text. / X.-Q. Wei I., G. Charles, A. Smith et al. // Nature (London). -1995,-Vol. 375.-P.408-411.

56. Altered responses to bacterial infection and endotoxic shock in mice lacking inducible nitric oxide synthase Text. / J.D.MacMicking, C.Nathan, G.Hom et al. // Cell. 1995. - Vol. 81. - P.641-650.

57. Alternative, nonapoptotic programmed cell death: mediation by arrestin 2, ERK2, and Nur77 Text. / S. Castro-Obregon, R. V. Rao, G. del Rio et al // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P.17543-17553.

58. Alving, К. Increased amount of nitric oxide in exhaled air of asthmatics / K. Alving, E. Weitzberg, J.M. Lundberg Text. //Eur. Resp. J. 1993. - Vol. 6. -P. 1368.

59. Andonegui, G. Effect of nitric oxide donors on oxygen-dependent cytotoxic responses mediated by neutrophils. Text. / G. Andonegui, A.S.Trevani // The J. of Immunol. 1999. - Vol. 162. - P.2922 - 2930.

60. Andrews, F. J. Protection against gastric ischemia-reperfiision injury by nitric oxide generators Text. / F. J. Andrews, M. Wilson, P.E. O'Brrien // Dig. Dis. Sci. - 1994 - Vol. 228. - P.439^142.

61. Antileukoprotease: An endogenous protein in the innate mucosal defense against fungi Text. / J.F. Tomee, P.S. Hiemstra, R. Heinzel-Wieland et al. // J. Infect. Dis. 1997. - Vol. 176. - P.740 - 747.

62. Arzumanian, V. Mechanisms of nitric oxide synthesis and action in cells Text. / V.Arzumanian, E.Stankevicius, A.Laukeviciene // Medicina. -2003. Vol. 39, № 6. - P.535 - 541.

63. Babior, B.M. Familial Mediterranean fever and the control of inflammation Text. / B.M Babior// Curr. Op. Hematol. 1998. - Vol. 5. - P. 1-2.

64. Babior, B.M. NADFH Oxidase: An Update Text. / B.M. Babior // Blood. -1999. Vol. 93, №5. - P.1464 - 1476.

65. Bacterial Infection Induces Nitric Oxide Synthase in Human Neutrophils Text. / M. A. Wheeler, S. D. Smith, G. Garcia-Cardena et al. // J. Clin. Invest. 1997.- Vol. 99, №1.-110-116.

66. Bactericidal properties of hydrogen peroxide and copper or iron-containing complex ions in relation to leukocyte function Text. / H. Elzanowska, R.G. Wolcott, D.M. Hannum et al. // Free Radic. Biol. Med. 1995. - Vol. 18. -P. 437-450.

67. Bannick, P. Nitric oxide ininhibits neutrophil p2 integrin function by inhibiting membrane-associated cyclic GMP synthesis Text. / P. Bannick, Q.Chen, Y.Hu //J. Cell. Physiol. 1997. - Vol. 172. - P.12.

68. Barnes, P.J. Nitric oxide and asthmatic inflammation Text. / P.J. Barnes, F.Y. Liew // Immunol. Today. 1995. - Vol. 16. - P.128.

69. Baud, L. Specificity and cellular distribution of human polymorphonuclear leucocyte receptors for leukotriene C4 Text. / L. Baud, C.H. Koo, E.J. Goetzl // Immunol. 1987. - Vol. 62. -P.53.

70. Beckmann, J.S. Nitric oxide, superoxide, and peroxinitrite: The good, the bad, and ugly Text. / J.S. Beckmann, W.H. Koppenol // Am. J. Phisiol. -1996.- Vol. 271. -P.1424- 1437.

71. Berton, G. Tyrosine kinases in neutrophils Text. / G. Berton // Curr. Opin. Hematol. 1999. - Vol. 6. - P.51-58.

72. Borregaard, N. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte Text. / N.Borregaard, J.B. Cowland // Blood. 1997. - Vol. 89, №10. - P.3503-3521.

73. Bratt, J. Gyllenhammar H: The role of nitric oxide in lipoxin A4-induced polymorphonuclear neutrophil-dependent cytotoxicity to human vascular endothelium in vitro Text. / J. Bratt, H.Gyllenhammar //Arthritis Rheum. -1999.-Vol.38.-P.768.

74. Cassatella, M.A. Neutrophil-derived proteins: Selling cytokines by the pound Text. / M.A. Cassatella // Adv. Immunol. 1999. - Vol. 73. - P.369 -509.

75. Cassatella, M.A. The production of cytokines by polymorphonuclear neutrophils Text. / M.A. Cassatella // Immunol. Today. 1995. - Vol. 16. -P.21-26.

76. Clancy, R.M. Nitric oxide stimulates the ADP-ribosylation of actin in human neutrophils Text. / R.M. Clancy, J. Leszczynska-Piziak, S.B. Abram-son// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - Vol. 191. -P.847-852

77. Clark, RA. Activation of the neutrophil respiratory burst oxidase Text. / R.A. Clark//Infect. Dis. 1999. - Vol. 179. - S.309-317.

78. Conlan, J.W. Critical roles of neutrophils in host defense against experimental systemic infection of mice by Listeria monocytogenes, Salmonella typhi-murium, and Yersinia enterocolitica Text. / J.W. Conlan // Infect. Immunol.-1997.-Vol. 65.-P.630-635.

79. Constitutive and inducible nitric-oxide synthases incorporate molecular oxygen into both nitric oxide and citrulline Text. / A.M. Leone, R.M. Palmer, R.G. Knowles et al. // Ibid. 1991. - Vol. 266. - P.23790-23795.

80. Co-purification of 130 kd nitric oxide synthase and a 22 kd link protein from human neutrophils Text. / J.L. Bryant, P.Mehta, A. Vonderporten et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - Vol. 189. - P.558.

81. Cytokine-treated human neutrophils contain inducible nitric oxide synthase that produces nitration of ingested bacteria Text. / T.J. Evans, L.D.K.Buttery, A. Carpenter et al. // Cell Biology 1996. - Vol. 93. - P. 9553-9558.

82. Defensins: key players or bystanders in infection, injury, and repair in the lung? Text. / S. van Wetering , P.J. Sterk , K.F. Rabe et al. // Clin. Immunol. 1999. - Vol. 104, №6.-P.l 131-1138.

83. DeGroote, M.A. NO inhibitions: antimicrobial properties of nitric oxide Text. / M.A, DeGroote, F.C. Fang // Clin. Infect. Dis. -1995. Vol. 21, №2. - P. 162 - 165.

84. DeLeo, F.R. Assembly of the phagocyte NADPH oxidase: molecular interactions of oxidase proteins Text. / F.R. DeLeo, M.T. Quinn // J. Leukoc. Biol.- 1996.- Vol.60. P.677-691.

85. Determination of mitochondrial reactive oxygen species: methodological aspects Text. / C. Batandier, E. Fontaine, C. Kriel et. al. // J. Cell. Mol. Med. -2002.-Vol. 6, №2. P.175-187.

86. DNA deaminating ability and genotoxicity of nitric oxide and its progenitors Text. / D.A. Wink, K.S. Kasprzak, C.M. Maragos et al. // Science (Wash. DC). 1991. - Vol. 254. - 1001-1003.

87. Druge, W. Free radicals in the physiological control of cell function Text. / W. Druge // Physiol. Rev. 2002 - Vol. 82, №1. - P. 47 - 95.

88. Effect of nitric oxide on staphylococcal killing and interactive effect with superoxide Text. / S.S. Kaplan, J.R. Lancaster, R.E. Basford et al. // Infect, and Immun. 1996. - Vol. 64, №1.- P.69-76.

89. Effects of exogenous nitric oxide on neutrophil oxidative function and vi-abilityText. / A.H. Daher, J.D. Fortenberry, M.L. Owens et al. // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1997. - Vol. 16. - P. 407.

90. Effects of leukotrienes and f-met-leu-phe on oxidative metabolism of neutrophils and eosinophils Text. / J. Palmblad, H.Gyllenhammar, J.A. Lindgren et al. // J. Immunol. 1984. - Vol. 132. - P.3041.

91. Effects of nitric oxide synthase inhibitors on murine infection with Mycobacterium tuberculosis Text. / J. Chan, K. Tanaka, D. Carroll et al. // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P.736-740.

92. Effects of Staphylococcal Enterotoxins on Human Neutrophil Functions and Apoptosis Text. / D. A. Moulding, C. Walter, C. A. Hart S. W. Edwards et al.// Infection and Immunity. 1999. - Vol. 67, № 5. - P.2312-2318.

93. Electron microscopic study of phagocytosis of Echerichia coli by polymorphonuclear leukocytes Text. / M. Rozenberg-Arska, M.E. Salters, J.A.G. van Strijp et al. I I Infect. Immun. 1985. - Vol. 50, №6.- P.852-859.

94. Elsbach, P. What is the real role of antimicrobial polypeptides that can mediate several other inflammatory responses? Text. / P. Elsbach, American Society for Clinical Investigation // J. Clin. Invest. 2003. - Vol. 111, №11. - P.l643—1645.

95. Endogenous antimicrobial peptides and skin infections in atopic dermatitis Text. / P.Y. Ong et al. // N. Engl. J. Med. 2002. - Vol. 347. - P.1151 -1160.

96. Endogenous gamma interferon, tumor necrosis factor, and interleukin-6 in Staphylococcus aureus infection in mice Text. / A. Nakane, M. Okamoto, M. Asano et al. // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 1165-1172.

97. Enhanced host defense after gene transfer in the murine p47phox-deficient model of chronic granulomatous disease Text. / M. Mardiney, S.H. Jackson, S.K. Spratt et al. // Blood. 1997 - Vol. 89. - P. 2268 - 2275.

98. Extensive nitration of protein tyrosines in human atherosclerosis detected by immunohistochemistry Text. / J. S. Beckmann, Y. Z.Ye, P. G. Anderson et al. // Biol. Chem. Hoppe. Seyler. 1994. - Vol. 375. - P.81 - 88.

99. Fang, F.C. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies Text. / F.C. Fang // Nat. Rev. Microbiol. 2004. - Vol. 2. -P.820-832.

100. Fang, F.C. Mechanisms of Nitric Oxide related antimicrobal activity Text. / F.C. Fang / J. Clinical Invest. - 1997. - Vol.99, №12. - P.2818-2825.

101. Free radicals and phagocytic cells Text. / G.M. Rosen, S. Pou, C.L. Ramos et al. // FASEB. J. 1995. - Vol. 9. - P.200 - 215.

102. Ganz, T. Defensins Text. / T. Ganz, R.I. Lehrer // Pharmacol. Ther. -1995. Vol. 66. - P.191-205.

103. Generation of nitric oxide by human neutrophils Text. / C.D. Wright, A Mulsch, R Busse et al./ // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. - Vol. 160, N2. - P.813-819.

104. Greenberg, S. Phagocytosis and innate immunity Text. / S. Greenberg, S. Grinstein // Curr. Opin. Immunol. 2002. - Vol. 14. - P. 136-145.

105. Griswold, D.E. Induction of plasma exudation and inflammatory cell infiltration by leukotriene C4 and leukotriene B4 in mouse peritonitis Text. / D.E.Griswold, E.F. Webb, L.M. Hillegass // Inflammation. 1991. - Vol. 15. -P.251.

106. Hampton M.B., Kettle A.J. Inside the Neutrophil Phagosome: Oxidants, Myeloperoxidase, and Bacterial Killing Text. / M.B. Hampton, A.J. Kettle // Blood. 1998. - Vol. 92, N.9. - P.3007-3017.

107. Hausladen, A. Superoxide and peroxynitrite inactivate aconitases, but nitric oxide does not Text. / A.Hausladen, I. Fridovich / J. Biol. Chem. 1994. -Vol. 269. - P.29405-29408.

108. Heimbtirger, M. Effects of leukotriene C4 and D4, histamine and bradykinin on cytostatic calcium concentrations and adhesiveness of endothelial cells and neutrophils Text. / M. Heimbiirger, J. Palmblad // Clin. Exp. Immunol. 1996.-Vol. 103.-P.454.

109. Heinecke, J.W. Is lipid peroxidation relevant to atherogenesis? Text. / J.W. Heinecke//J. Clin. Invest. 1999. - Vol. 104. - P. 135-136.

110. Hope, B.T. Histochemical characterization of neuronal NADPH-diaforase Text. / B.T. Hope, S.R. Vincent // J. Histochem. Cytochem. 1989. - Vol. 37. - P.653-661.

111. Host defense functions of proteolytically processed and parent (unprocessed) cathelicidins of rabbit granylocytes Text. / K.A Zazember, S.S. Katz, B. F. Tack et al. // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70, №2. - P. 569 - 576.

112. Human and rat neutrophils constituvely express neural nitric oxide synthase mRNA Text. / S. S. Greenberg, J. Ouyang, X. Zhao et al. // Nitric Oxide -1998.-Vol.2.-P.203-212.

113. Human neutrophil defensin and serpins form complexes and inactivate each other Text. / A.V. Panyutich, P.S. Hiemstra, S. Van Wetering et al. // Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1995. - Vol.12. - P.351 - 357.

114. Human polymorphonuclear leukocytes lack detectable nitric oxide synthase activity Text. / L. Yan, R.W. Vandivier, A.F. Suffredini et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994 - Vol. 153. - P.1825 - 1834.

115. Impaired innate immunity in the newborn: newborn neutrophils are deficient in bactericidal/permeability-increasing protein Text. / O. Levy, S. Martin, E. Eichenwald, T. Ganz, et al. // Pediatrics. 1999. - Vol. 104. - P. 1327 -1333.

116. Inducible expression of an antimicrobial peptide of the innate immunity in polymorphonuclear leukocytes Text. / L. Tomasinsig, M. Scocchi C. Di Loreto et al. //J. Leuk. Biol. 2002.- Vol. 72. - P. 1003-1010.

117. Inhibition by nitric oxide donors of human polymorphonuclear leucocyte function Text. / E. Moilanen, P. Vuorinen, H. Kankaanranta et al. // Br. J. Pharmacol. 1993. - Vol. 109. - P. 852.

118. Investigating antibody-catalyzed ozone generation by human neutrophils Text. / B.M., Babior, C. Takeuchi., J.Ruedi et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100. - P. 3031-3034.

119. Jackson, S.H. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease Text. / S.H. Jackson, J.I. Gallin, S.M. Holland // J. Exp. Med. -1995.-Vol. 182. -P.751-758.

120. Kanner, J. Nitric oxide as an antioxidant Text. / J. Kanner, S. Harel, R. Granit //Arch. Biochem. Biophys. -1991. Vol. 289. - P.130-136.

121. Kim, C., Dinauer M.C. Rac2 is an essential regulator of neutrophil nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase activation in response to specific signaling pathways Text. / C. Kim, M.C. Dinauer // J. Immunol. 2001.-Vol. 166. P.1223-1232.

122. Klebanoff, S.J Oxygen metabolites from phagocytes Text. / S.J Klebanoff // Inflammation: basic principles and clinical correlates / By ed. J.I. Gallin, R. Snyderman. Philadelphia, Lippincott-Williams & Wilkins, 1999. - P. 345 -386.

123. Klebanoff, S.J. Myeloperoxidase: friend and foe Text. / S.J. Klebanoff // J. Leuk. Biol. 2005. - Vol. 77. - P. 598-625.

124. Klebanoff, S.J. Nitrite production of stimulated human polymorphonuclear leucocytes supplemented with azide and catalase Text. / S.J. Klebanoff, C.F. Nathan // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - Vol. 197, №1. -P. 192-196.

125. Kubes, P. Nitric oxide: an endogenous modulator of leukocyte adhesion Text. / P. Kubes, M. Susuki, D. Grander // Proc. Nat. Acad. Sci. USA -1991.-Vol. 88.-P. 4651.

126. Labro, M.T. Interference of antibacterial agents with phagocyte functions: immunomodulation or "Immuno-Fairy Tales"? Text. / M.T. Labro //Clin. Microbiol. Rev. 2000. - Vol. 13, №4. -P.615 -650.

127. Larfars, G. Measurement of methemoglobin formation from oxyhemoglobins real-time, continuous assay of nitric oxide release by human polymorphonuclear leukocytes Text. / G. Larfars, H.Gyllenhammar // J. Immunol. Methods. 1999. - Vol. 184. - P.53.

128. Larfars, G. Nitric oxide (NO) production in human polymorphonuclear neutrophil granulocytes Text. / G. Larfars, H. Gyllenhammmar // Endothelium. 1993.-Vol. 1.-P.31.

129. Larfars, G. Stimulus-dependent transduction mechanisms for nitric oxide release in human polymorphonuclear neutrophil leukocytes Text. / G. Larfars, H. Gyllenhammar // J. Lab. Clin. Med. 1998. - Vol. 132. - P.54.

130. Lehrer, R.I. Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence Text. / R.I. Lehrer, T. Ganz // Curr. Opin. Immunol. 1999. - №11. -P.23-27.

131. Leukotriene B4 — a stereospecific stimulator for release of lysosomal enzymes from neutrophils. FEBS Text. / I.Hafstrom, J. Palmblad, C. Malm-sten et al. // Lett. -1981. Vol. 130. - P.146.

132. Leukotriene B4 is a complete sectretagogue in human neutrophils: A kinetic analysis Text. / N.C. Serhan, A. Radin, J.E. Smolen et al. // Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 1982. - Vol. 107. - P. 1006.

133. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence Text. / J Palmblad, C.L. Malmsten, A.M. Uden et al.// Blood. 1981. - Vol. 58. - P.658.

134. Levy, O. Antimicrobial proteins and peptides: anti-infective molecules of mammalian leukocytes Text. / 0. Levy // J. Leukoc. Biol. 2004. - Vol. 76. - P.909 - 925.

135. Levy, O.A Neutrophil-Derived Anti-Infective Molecule: Bactericidal/Permeability-Increasing Protein Text. / O.A Levy // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2000. - Vol. 44, №1. - P.2925-2931.

136. Liew, F. Y. Regulation of nitric oxide synthesis in infectious and autoimmune diseases Text. / F. Y Liew// Immunol. Lett.- 1994. Vol. 43. - P.95-98.

137. Liew, F. Y. Tumor necrosis factor-a synergizes with IFN-g in mediating killing of Leishmania major through the induction of nitric oxide Text. / F. Y. Liew, Y. Li, S. Millot // J. Immunol. 1990. - Vol. 145. - P.4306-4310.

138. Lipopolysaccharide-related stimuli induce expression of the secretory leukocyte protease inhibitor, a macrophage-derived lipopolysaccharide inhibitor Text. / F. Jin, C.F. Nathan, D. Radzioch et al. // Infect. Immun. 1998. -Vol. 66.- P.2447-2452.

139. Lisozyme in human neutrophils and plasma. A parameter of myelopoetic activity Text. / K.Lollike, L.Kjeldsen, H.Sengelov at al. //Leukemia. 1995. -Vol.9. - P.159-171.

140. London, S.J. Myeloperoxidase genetic polymorphism and lung cancer risk Text. / S.J. London, T.A.Lehman, J.A. Taylor // Cancer Res. 1997. - Vol. 57. - P.5001-5003.

141. Long-term correction of phagocyte NADPH oxidase activity by retroviral-mediated gene transfer in murine X-linked chronic granulomatous disease Text. / M.C. Dinauer, L.L. Li, H. Bjorgvinsdottir et al. // Blood. 1999. -Vol. 94.-P.914-920.

142. Lorber, B. Listeriosis Text. / B. Lorber // Clin. Infect. Dis. 1997. - Vol.24. -P.l-11.

143. Lowy, F.D. Staphylococcus aureus infections Text. / F.D. Lowy // N. Engl. J. Med.-1998.-Vol. 339.-P.520-532.

144. Malech, H. L. Primary inherited defects in neutrophil function: Etiology and treatment Text. /Н. L. Malech, W.M. Nauseef// Semin. Hematol. 1997. -Vol.34. - P. 279-290.

145. Marietta, M.A. Nitric oxide synthase structure and mechanism Text. / M.A. Marietta // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 12231 - 12234.

146. Mayer-Scholl, A. How do neutrophils and pathogens interact? Text. / A. Mayer-Scholl, P. Averhoff, A. Zychlinsky // Curr. Oppin. Microbiol. -2004. Vol. 7 P.62 - 66.

147. McCall, T. Induction of nitric oxide synthase in rat peritoneal neutrophils and its inhibition by dexamethazome Text. / T. McCall, R.M.J. Palmer, S. Moncada // Eur. J. Immunol. 1991. - Vol. 21,- P.2523 - 2527.

148. McLennan, H.R. The contribution of mitochondrial respiratory complexes to the production of reactive oxygen species Text. / H.R. McLennan, M. Degli Esposti //J. Bioenerg. Biomembr. 2000. - Vol. 32. - P.153-162.

149. Mice lacking inducible nitric oxide synthase are not resistant to lipopolysac-charide-induced death Text. / V.E. Luabach, E.G. Shesely, 0. Smithies et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. -P.l0688-10692.

150. Michel, T. Perspective series: nitric oxide and nitric oxide synthases. Nitric oxide synthases: which, where, how and why? Text. / T. Michel, 0. Feron //J. Clin. Invest. 1997.-Vol. 100. - P.2146- 2152.

151. Miller, R.A. Role of oxidants in microbial pathophysiology Text. / R.A. Miller, B.E. Britigan // Clin. Microbiol. Rev. 1997. - Vol.10. - P.l-18.

152. Modulation of granulocyte survival and programmed cell death by cytokines and bacterial products Text. / F. Colotta, F. Re, N. Polentarutti et al. // Blood. 1992. - Vol. 80. - P.2012-2020.

153. Moncada, S. Nitric oxide: Physiology, pathology and pharmacology Text. / S.Moncada, R.M.J. Palmer, E.A. Higgs // Phamacol. Rev. 1991. - Vol. 43. -P.109.

154. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production Text. / J.D. Pollock, D.A. Williams, M.A. Gifford et al. // Nat. Genet. 1995. - № 9. - P.202-209.

155. Myeloperoxidase and horseradish peroxidase catalyze tyrosine nitration in proteins from nitrite and hydrogen peroxide Text. / J.B Sampson, Y. Ye, H. Rosen et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1998. - Vol. 356. - P.207-213.

156. Myeloperoxidase-generated reactive nitrogen species convert LDL into an atherogenic form in vitro Text. / E.A.Podrez, D. Schmitt, H.F. Hoff et al. // J. Clin. Invest. 1999. - Vol. 103. - P.1547-1560.

157. NADF Oxidase activation and assembly during phagocytosis Text. / F.R. Deleo, L.-A.H. Allen, M. Apicella and William M. Nauseef // J. Immunol. -1999. -Vol. 163.-P. 6732-6740.

158. Nathan, C. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens Text. / C.Nathan, M.U.Shiloch // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97, №16. - P.8841 -8848.

159. Nathan, C. Regulation of biosynthesis of nitric oxide Text. / C. Nathan, Q.W. Xie // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 13725-13728

160. Nathan, C. Perspectives series: nitric oxide and nitric oxide synthases. Inducible nitric oxide synthase: what difference does it make? Text. / C. Nathan//J. Clin. Invest. 1997. - Vol. 100.- P. 2417-2423.

161. Nauseef, W.M. Effect of the R 569 missense mutation on the biosynthesis of myeloperoxidase Text. / W.M. Nauseef, M. Cogley, S. McCormick // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P.9546 - 9549.

162. Nauseef, W.M. Insights into myeloperoxidase biosynthesis from inherited deficiency Text. / W.M. Nauseef// J. Mol. Med. 1998. - Vol. 76. - P. 661 -668.

163. Neutrophil apoptosis is associated with a reduction in CD 16 (FcRIII) expression Text. /1. Dransfield, A. Buckle, J. S. Savill, A. McDowall, et al //J. Immunol. 1994. - Vol. 153. - P.1254-1263.

164. Neutrophils: molecules, functions and pathophysiological aspects Text. / V.Witko-Sarsat, P.Rieu, L.Descamps-Latscha, P. Lesavre, et al. // Laboratory Investig. 2000. - Vol. 80. - P.617-653.

165. Ney, P. Nitrovasolidator induced inhibition of LTB4 release from hu-manPMN may be mediated by cyclic GMP Text. / P. Ney, H. Schroder, K. Schror // Eicosanoids. - 1990. - №3. - P.243.

166. A^-methyl-L-arginine inhibits tumor necrosis factor-induced hypotension: implications for the involvement of nitric oxide Text. / Kilborn R. G., S. S. Gross, A. Jubran, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. -P.3629-3632.

167. Nitric oxide (NO) protects against cellular damage by reactive oxygen species Text. / D.A. Wink, J.A. Cook, R. Pacelli et al. // Toxicol. Lett. 1995. - Vol. 82-83. -P.221 -226.

168. Nitric oxide and intracellular heme Text. / Y.-M. Kim, H.A. Bergonia, C. Muller et al.// J. Adv. Pharmacol. 1995. - Vol. 34. - P.277-291.

169. Nitric oxide diffusion in membranes determined by fluorescence quenching Text. / J.M. Denicola, A. Souza, R. Radi et al. // Arch. Biochem. Biophys. -1996.-Vol. 328. P.208-212.

170. Nitric Oxide Is Protective in Listeric Meningoencephalitis of Rats Text. / K. A. Remer, T. W. Jungi, R. Fatzer et al. // Infection and Immunity. 2001. -Vol. 69, №6. - P.4086 - 4093.

171. Nitric oxide produced during murine listeriosis is protective Text. / K.S. Boockvar, D.L. Granger, R.M. Poston et al. // Infect. Immun.-1994.-Vol. 62, №3.- P.1089-110.

172. Nitric oxide synthase in circulating v. s. extravaseted polymorphonuclear leucocytes Text. / A.M. Miles, M.W. Owens, S. Milligan et al. // J. Leuk. Biol. 1995. - Vol. 58. - P.616 - 622.

173. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemi-cal, molecular, and biochemical studies Text. / R. Saini, S. Patel, R. Saluya et al. //J. Leukocyte Biol. 2006. - Vol. 79. - P. 1 - 10

174. Novikoff, A.B. Visualisation of peroxisomes (microbodies) and mitochondria with diaminobenzidine Text. / A.B. Novikoff, S. Goldfischer // J. His-tochem. Cytochem. 1969. - Vol. 17. - P.675-68.

175. Owen, C.A. The cell biology of leukocyte-mediated proteolysis Text. / C.A. Owen, E.J. Campbell // J. Leukocyte Biol. 1999. - Vol. 65. - P. 137— 150.

176. Oxygen radical-nitric oxide reactions in vascular diseases Text. / B.A. Freeman, C.R. White, H. Gutierrez et al. // Adv. Pharmacol. 1995. - Vol. 34. - P.45-69.

177. Pabst, M.J. Priming of neutrophils Text. / M.J. Pabst //Im-munopharmacology of neutrophils / By ed. P.J. Hellewell, T.J. Williams -London, Academic. Press, 1994. P. 195-221.

178. Pacelli, R. Nitric oxide potentiates hydrogen peroxide-induced killing of Escherichia coli Text. / R. Pacelli, D.A. Wink, J.A. Cook // J. Exp. Med.1995.-Vol. 182. P.1469-1479.

179. Padgett, E.L. Rat, mouse and human neutrophils simulated by a variety of activating agents produce much less nitrite than rodent macrophages Text. / E.L. Padgett, S.B. Pruett//Immunology. 1995. - Vol. 84. - P.135 - 141.

180. Pero, R.W. Hypochlorous acid/N-chloramines are naturally produced DNA repair inhibitors Text. / R.W. Pero, Y. Sheng, A. Olsson //Carcinogenesis.1996.-Vol. 17. P.13-18.

181. Petrides, P.E. Molecular genetics of peroxidase deficiency Text. / P.E. Pet-rides / J. Mol. Med. 1998. - Vol. 76. - P.688-698.

182. Phenotype of mice and macrophages deficient in both phagocyte oxidase and inducible nitric oxide synthase Text. / M.U. Shiloh, J.D. MacMicking, S. Nicholson et al. // Immunity. 1999. - №10. - P.29-38.

183. Pieper, G. Similatiry and ingibitory action of nitric oxide donor agents vs. nitrovasolidators on reactive oxygen production by isolated polymorphonu-clearleucocytes Text. / G. Pieper, A.Clarke, G.Gross // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994.-V. 269-P. 451.

184. Presence of proteinase 3 in secretory vesicles: Evidence of a novel, highly mobilizable intracellular pool distinct from azurophil granules Text. / V. Witko-Sarsat, E.M. Cramer, C. Hieblot, G. J, Nusbaum, et al. // Blood. -1999. № 4. P.2487 - 2496.

185. Protective role of nitric oxide in Staphylococcus aureus infection of mice Text. / S. Sasaki, T. Miura, S. Nishikawa et al. //Infect. Immun. 1998. -P.1017-1022.

186. Protein kinase C5 is required for p47phox phosphorylation and translocation in activated human monocytes Text. / E.A. Bey, B. Xu, A. Bhattacharjee et. al. // J. Immunol. 2004. - Vol. 173. - P.5730-5738.

187. Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration Text. / R. Radi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2004. Vol. 101, №12. - P.4003-4008.

188. Rat neutrophil function, and leukotriene generation in essential fatty acid deficiency Text. / H. Gyllenhammar, J. Palmblad, B. Ringertz et al. // Lipids. 1988.-Vol. 23.-P.89.

189. Reaction of superoxide and nitric oxide with peroxynitrite: Implications for peroxynitrite-mediated oxidation reactions in vivo Text. / D. Jourd'heuil, F.L. Jourd'heuil, P.S. Kutchukian et al. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. -P.28799-28805.

190. Relations polynucleaires neutrophils et monocytes macrophages Text. / B. Descamps-Latscha, V. Witko-Sarsat //Rev. Fr. Allergol. - 1999. - Vol. 39.-P.241 -247.

191. Release of nitric oxide during T cell-independent proliferation pathway of macrophage activation, its role in resistance to Listeria monocytogenes Text. / K. P. Beckerman, H. W. Rogers, J. A. Corbett et al. //J. Immunol. -1993.-Vol. 150. P.888-895.

192. Romagnani, S. Lymphokine production by human T cells in disease state Text. / S. Romagnani // Annu. Rev. Immunol. 1994. - № 12. - P.227-257.

193. Schulz, K. Reevaluation of the Griess method for determining NO/NO*2 in aqueous and protein-containing samples / K. Schulz, S. Kerber, M. Kelm // J. Nitric Oxide.-1999.-Vol. 3, №3.-P.225-234.

194. Secretory leukocyte proteinase inhibitor is a major leukocyte elastase inhibitor in human neutrophils Text. / J.M. Sallenave, M. Si-Ta Har, G. Cox et al. // J. Leukoc. Biol. 1997. - Vol. 61. - P. 695 - 702.

195. Severe impairment in early host defense against Candida albicans in mice deficient in myeloperoxidase Text. / A.Y. Koyama, S. Nyui, K. et al. // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 1828-1836.

196. Smutzer, Gr. Research Tools for Nitric Oxide. A wide variety of reagents are available for nitric oxide research Text. / Gr. Smutzer // The Scientist. -2001.-Vol. 15, №6. P.23.

197. Spitznagel, J.K. Antibiotic proteins of human neutrophils Text. / J.K. Spitznagel // J. Clin. Invest. 1990. - Vol. 86. - P. 1381-1386.

198. Targeted disruption of the NF-IL-6 gene discloses its essential role in bacteria killing and tumor cytotoxicity by macrophages Text. / T. Tanaka, S. Akira, K. Yoshida et al. // Cell. 1995. - Vol. 80. - P.353 - 361.

199. The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils Text. / 0. Sorensen, K. Arnljots, J.B. Cowland et al. // Blood. 1997. - Vol. 90. -P.2796 -2803.

200. The protective role of endogenously synthesized nitric oxide in staphylococcal enterotoxin B-induced shock in mice Text. / S. Florquin, Z. Amraoui, C. Dobois et al. // J. Exp. Med. 1994. - Vol. 180. - P. 1153-1158.

201. The role of protegrins and other elastase-activated polypeptides in the bactericidal properties of porcine inflammatory fluids Text. / J.Shi, T. Ganz // Infect. Immun. -1998. Vol. 66. - P.3611-3617.

202. Three-dimensional solution structure of lactoferricin B, an antimicrobial peptide derived from bovine lactoferrin Text. / P.M. Hwang, N. Zhou, X. Shan et al. // Biochemistry. 1998. - Vol.37. - P.4288-4298.

203. TNF-alpha and IFN-gamma stimulate a macrophage precursor cell line to kill Listeria monocytogenes in a nitric oxide-independent manner Text. / P.J. Leenen, B.P. Canono, D.A. Drevets et al. // Infect, and Immun. 2001. -Vol. 69, №6,- P.4086-4093.

204. Vallance, P. Nitric oxide as an antimicrobial agent: does NO always mean NO? Text. / P. Vallance, I. Charles // Gut. 1998. - Vol.42. - P.313-314.

205. Ward, P.A. The acute inflammatory response and its regulation Text. / P.A. Ward // Arch. Surg. 1999. - Vol. 134. - P.666-669.

206. Webb, J. L. Effect of aghesion on inducible nitric oxide synthase (iNOS) production in purified human neutrophils Text. / J.L. Webb, J.M. Polak, T.J. Evans // Clin. Immunol. 2001. - Vol. 123. - P. 42 - 48.

207. Weiss, S.J. Tissue destruction by neutrophils Text. / S.J. Weiss / N. Engl. J. Med. 1989. - Vol. 320. - P.365-376.

208. Werner, E. GTPases and reactive oxygen species: switches for killing and signaling Text. / E. Werner // J. Cell Science. 2004. - Vol. 117. - P.143-153.

209. Wink, D.A. Chemical biology of nitric oxide: Insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide Text. / D.A. Wink, J.B. Mitchell // Free Radic. Biol. Med. 1998. - Vol. 25. - P.434-456.

210. Wright, C.E. The protective and pathological roles of nitric oxide in endotoxin shock Text. / C.E. Wright, D.D. Rees, S. Moncada // Cardiovasc. Res.-1992. Vol. 26. - P.48-57.

211. Yersenia pseudotuberculosis induced calcium signaling in neutrophils is blocked by the virulence effector YopH. Text. / Andersson K., Magnusson K.-E., Majeed M. O. Stendahl, et al. // Infec. and Immun. - 1999. - Vol. 67, №5. -P. 2567-2574.

212. Zamora, R. Inducible nitric oxide synthase and inflammatory diseases Text. / R. Zamora, V. Vodovotz, T. R. Billiar // Molec. Med. 2000. - Vol. 6, №5. - P.347-373.

213. Zhao, Y. X. Impact of interferon-g receptor deficiency on experimental Staphylococcus aureus septicemia and arthritis Text. / Y. X. Zhao, A. Tarkowski. // J. Immunol. 1995. - Vol. 155. - P.5736 - 5742.

Информация о работе

Охотина, Софья Владимировна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2007
ВАК 03.00.25

Диссертация

Сравнительная характеристика бактерицидных систем нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы