Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические и функциональные свойства антимикробных белков нейтрофилов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические и функциональные свойства антимикробных белков нейтрофилов"

РГ6 од

2 9 МАЙ 1995

Ни правах рукописи

КОКРЯКОВ Владимир Николаевич

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА АНТИМИКРОБНЫХ БЕЛКОВ НЕЙТРОФИЛОВ

03.00.04 - биохимия 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание унсиой стспаш доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в отделах патологической анатомии и общей патологии и патологической физиологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор - академик РАМН Б.И.ТКАЧЕНКО),. в лаборатории этимологии Санкт-Петербургского Государственного Университета и Калифорнийском Университете Лос-Анджелеса.

Научные консультанты: академик РАМН И.П.АШМАРИН член-корр.РАМН Е.А.КОРНЕВА

Официальные оппоненты: член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.С.ГАЙЦХОКИ доктор медицинских наук, профессор Н.Н.ПЕТРИЩЕВ доктор биологических наук Л.П.РЫБАКОВА

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и

биохимии им. И.М.Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Защите диссертации состоится "22' 1995 г.

в часов на заседании диссертационного совета Д 001.23.01 при

Научно-исследовательском, институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке исследовательского института экспериментальной медицины по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

Автореферегразослан " " )995г>

Научно-РАМН

Ученыб секретарь диссертационного совета, доктор биологических.наук

Л.В.Пучкова

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Олной из актуальных мёдтш-биоло-гических проблей является изучение структурно-функциональных свойств антимикробных белков и полипептидов гранулярного <ли-зосомного) аппарата нейтрофилов, которые представляют молекулярную основу реализации ряда з'ащитаых реакций организма при Фагоцитозе, воспалении и стрессе. История и-.учения клеточ-но-молекулярных механизмов естественной резистентности ор" г-низма человека и животных к инфекции (Зильбер, 1958; Адо, lí>ol; Ашмарин с соавт., 1972; ПигареЕскип , 1978: Войно--Ясенецкий. 1981; МаянскиЯ А., Маянский Д., 1983; Klebanoi'f. Clark. 1978; Spitznagel, 1984; Spitznagel, Shafer, 1985) свидетельствует о том, что уже на первых этапах развития этого направления исследований был поставлен вопрос о природе и свойствах антимикробных веществ лейкоцитов, в том числе и ло-.кализованных в нейтрофилах (Hankln, 1891; Buchner, 1894; Schattenfroh, 1897).. В значительной степени проведение этих работ было стимулировано фагоцитарной теорией иммунитета, выдвинутой в 1883 году И. И. Мечниковым (1892). в исследованиях школы которого была обоснована ключевая роль микрофагов (в современной терминологии - нейтрофилов) и макрофагов в ?орми-ровани невосприимчивости к инфекционным болезням бактериальной и грибковой этиологии. Им же была сформулирована концепция о цитазах - бактерицидных соединениях лейкоцитарного происхождения, обеспечивающих инактезацию и переваривание фагоцитированных микроорганизмов (Мечников. 1903). Необходимо, однако, отметить, что все указанные работы носили преимущественно феноменологический характер до тех пор, пока A. Petterson в ;905 году не выделил из лейкоцитов гноя челооека антимикробные субстанции, которые по заключению автора представляли смесь щелочных протеинов,родственных по ряду свойств протаминам рыб.

Продолжение этих исследований имело место только через 50 лет и было по времени и идеологически сопряжено с открытием и доказательством функциональной роли лизосом в клетках (De Duve et al. 1955). в том числе и лейкоцитах •гранулоцитарного ряда (Roblnsaux. Frederic, 1955; Cohn, Kirsch, 1960). Антимикробные свойства фагоцитов пытались связать с активностью кислых гид-ролаз лизосом этих клеток. Однако уже в первых работах отсго направления было продемонстрировано, что бактерицидная активность препаратов "лейкин" (Scarnes, Watson, 1956) и "фагоци-

тин"(Hirsch. 1956), полученных из нейтрофилов кролика, обусловлена присутствием в них белковых, компонентов, являющихся по своим электрохимическим свойствам поликатионами и, по-видимому, не относящихся к ферментам. Строгое доказательство эти наблюдения получили в исследованиях другой группы американских ученых (Zeya. Spitznagel. 1963, 1966). которые из смеси кислото-растворимых белков гранул (лнзосом) нейтрофилов кролика и морской свинки выделили, очистили и охарактеризовали по физико-химическим свойствам группу катионных белков и полипептидов с молекулярной массой менее 10 кДа. В модельной системе in vitro ими были продемонстрированы микробоцидные свойства этих белков, отсутствующие у паралельно изученных кислых гидролаз (кислая фосфатаза, РНК-аза, ДНК-аза.ß-глюкуронидаза ) лейкоцитов (Zeya et al. 1966). Следует отметить, что этим биохимическим исследованиям предшествовали морфологические, в которых с использованием красителя прочного зеленого, селективно выявляющего основные по природе биополимеры, была установлена транслокация лизосомных катионных белков на поверхность фагоцитиро--ванных микроорганизмов (бактерии, грибы),•сопровождающаяся потерей жизнеспособности последними (Spitznagel, Chi, 1963). В своей совокупности эти наблюдения дали основание авторам рассматривать низкомолекулярные лизосомные катионные белки (полипептиды) нейтрофилов, которые позднее были названы дефенсинами (Ganz et al., 1985), в качестве специализированной группы веществ. проявляющих в отношении фагоцитированных микробов цито-токсическую активность. В нашей стране работы в этом направлении исследований были инициированы профессорами И.П.Ашмариным (Ашмарин и др., 1972, 1977) на кафедре биохимии Ленинградского Государственного университета и В.Е. Пигаревским (Пигаревский, 1969, 1975) в НИИ экспериментальной медицины АМН СССР, коллекторы которых плодотворно сотрудничали в рамках рассматриваемой проблемы более 20 лет.

Существенный вклад в изучение антимикробных факторов нейтрофилов сделал з этот период S.Klebanoff (1967, 1968, 1970), который первым продемонстрировал бактерицидную активность гранулоцитарного фермента - миелопероксидазы в составе системы, включающей в себя кроме энзима, перекись водорода и один из кофакторов (J", СГ.Вг", SCK"). Начальные сведения о локализации в нейтрофилах лактоферрина (Masson et al.. 1970),наряду с уже известными данными о присутствии в них другого антимикробного белка - лизоцима (Cohn, Hirsch.1960). до-

подняли общую картину представлений о природе основных компонентов "микробоцидной- системы, гранул (лизосом) нейтрофилов. которая сложилась в период, предшествующий "началу"'настоящей-ра----------

боты в 1974 году.

Вместе с тем ряд вопросов рассматриваемой проблемы оставались открытыми. Отсутствовали углубленные сведения о структурных и функциональных свойствах большинства представителей тог.: или иного гомологического ряда антимикробных белков (миелопе-роксидаза, лактоферрин. эластаза, катепсин С, дефенсины). Практически неизвестны были закономерности функционального взаимодействия рассматриваем: бслк"? при фагоцитозе и воспалении. определяющие защитную направленность этих процессов Совсем не исследованы были особенности развития этого звена защиты организма от инфекций в ранний постнаталышй период его онтогенеза. Изучение этих вопросов имеет весьма важное значение не только для понимания природы механизмов, лежащих в основе формирования неспецифической антимикробной резистентности организма человека и животных, но и открывает новые перспективы в регуляции защитных процессов, обусловленных функционированием нейтрофилов и их отдельных физиологически активных ве ществ.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении физико-химических и. функциональных свойств основных антимикробных " белков (миелопероксидаза. лактоферрин, дефенсины) нейтрофилов и обосновании их важной роли в формировании неспецифической резистентности организма человека и животных. Исходя из этого, были выдвинуты следующие конкретные задачи:

1. Разработать новые и модифицировать известные методы получения высокоочищенных препаратов миелопероксидаз, лактоферри-нов. дефенсинов и структурно-родственных им полипептидов из нейтрофилов человека, свиньи, коровы, кролика, крысы и ку-- 'рицы.

2. Провести поиск и изучение физико-химических и функциональных свойств антимикробных полипептидов из лейкоцитов свиньи и курицы, структурно родственных дефенсинам.

3.Исследовать физико-химические свойства миелопероксидаз человека. свиньи, коровы, кролике и крысы (спектр поглощения, молекулярную массу, наличие субъединиц, пептидные карты, аминокислотный состав, кинетические параметры). Провести сравнение изученных характеристик между ферментами из раз-

ных источников для определения их общих и индивидуальных свойств.

4.Осуществить физико-химический и функциональный анализ лак-тоферринов человека, свиньи, коровы и кролика (гомогенность. молекулярная масса, пептидные карты, аминокислотный состав) из разных клеточно-тканевых источников организма с целью обоснования представления о структурной идентичности лактоферринов нейтрофилов и молока.

5.В модельной системе in vitro изучить антистафилококковые свойства миелопероксидазной системы и лактоферрина с целью ■ оценки вклада рассматриваемых белков в микробоцидную активность нейтрофилов.

6.Изучить спектр антимикробных белков нейтрофилов в раннем постнатальчом развитии человека, кролика и крысы.

7.Осуществить комплексное морфобиохимическое изучение механизмов феномена резорбтивной клеточной резистентности. 8. Осуществить изучение функциональных свойств дефенсинов и родственных им полипептидов (антимикробная активность In . vitro , влияние на резистентность к вирусной инфекции in vivo, некоторые механизмы гемостаза и глюкокэртикоидную реакцию при стрессе).

Научная новизна. Открыта новая группа антибиотических полипептидов лейкоцитов свиньи, сочетающая в своей структуре черты дефенсина кролика с кортикостатическими свойствами (КРЗа) и антимикробного полипептида из гемоцитов подковообразного краба -тахиплезина. Из лейкоцитов свиньи выделен и секве-нирован белок богатый пролином и фенилаланином (профенин), который избирательно инактивирует грамотрицательную бактерию E.coll в условиях In vitro. Представлена структура универсального антимикробного белка лейкоцитов свиньи, обогащенного про-лшш и аргинином (РКЗЭх), гомолог которого ранее был выделен из слизистой тонкого кишечника этогр же вида животных.

Впервые осуществлено определение первичной структуры трех антимикробных полипептидов дефенсиновой природы (галлинацинов) из гетерофилов птиц.

Впервые в мировой литературе представлены сведения о некоторых физико-химических свойствах миелопероксидаз коровы и ■кролика. Осуществлено систематическое сравнительно-биохимическое изучение структурных и кинетических параметров миелопероксидаз человека, свиньи, коровы, кролика и крысы, на основании которого можно говорить об их заметном сходстве в анализируе-

- 7 -

мок ряду гомологических белков.

Впервые выделенылактоферрины из нейтрофилов свиньи и коровы, проведено сравнительное изучение"рядаlix" физико-химичес------------

ких свойств. Продемонстрирована структурная тождественность лактоферринов из молокз и нейтрофилов свиньи.

Впервые продемонстрированы в модельных системах in vitro синергические антимикробные эффекты кислородзависимой миелопе-роксидазной системы, с одной стороны, и лактоферрина и де-фенсинов - с другой, которые отражают некоторые возможные механизмы взаимодействия анализируемых белков при инактивации микроорганизмов е процессе фагоцитоза.

Епзрвые в комплексных , мсрфобиохимических исследованиях выявлены возрастные дефицита лизосомных антимикробных белков (ми^лопероксидаза, катепсин G, эластаза) нейтрофилов человека, кролика и крысы, которые следует рассматривать в качестве одного из факторов риска развития инфекционных заболеваний в ранний постнатальный период онтогенеза животных.

Расшифрованы некоторые биохимические стороны феномена резорбтивной клеточной резистентности как одного из механизмов защиты организма от инфекции, в основе которого лежит поглощение катионных белков нейтрофилов макрофагами.

Впервые изучен ряд функциональных активностей дефеж-янов, который позволяет оценивать их не только как эффективные антибиотические вещества. " ко и соединения, обладающие кортикоста-тическими, иммунопротектавньми и гемостатическими свойствами.

Впервые продемонстрирована диагностическая значимость изучения кислоторастворимых белков молока при маститах человека и крупного рогатого скота.

Теоретическое значение работы определяется тем. что на основе данных, полученных в настоящем исследовании, сформулировано положение об антимикробных белках нейтрофилов с катипн-ным характером заряда их молекул (миелопероксидаза, лактчфер -рин; бактерицидный проницаемость-увеличивающий протеин, эластаза, катепсин G. лизоцим, дефенсины и структурно-родс-твеннье им полипептиды) как физиологически активных веществах, участвующих в реализации и обеспечивающих взаимодействие защитных реакций разного рода: фагоцитарных, воспалительных, стрессиндуцированных и иммунологических.

Практическое значение работы.

Комплекс методов препаративной белковой химии, разработанный в ходе работы, может быть использован в лабораторных

- - 8 -

условиях с целью получения высокоочищенных препаратов антимикробных белков нейтрофилов.

Впервые получено строгое биохимическое доказательство объективности данных, получаемых при исследовании микробоцид-ного потенциала нейтрофилов с использованием морфологического метода -лизосомально-катионного теста.

Предложены новые экспресс-методы диагностики мастита человека и крупного рогатого скота, защищенные авторскими свидетельствами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Открыта новая группа антимикробных полипептидов из нейтрофилов свиньи - протегрины, которые сочетают в своей структуре признаки кортикостатических дефенсинов кролика и полипептида из гемоцитов подковообразного краба - тахиплезина.

2. Из нейтрофилов свиньи выделен и секвенирован белок богатый пролином и фенилаланином (профенин). избирательно действующий In vitro на грамотрицательную бактерию Е. coll.

3. Антибиотические полипептиды гетерофилов кур (галлинацины) по своей первичной структуре относятся к группе р-дефенсинов.

4. Лактоферрины нейтрофилов и молока одного вида млекопитающих (человек, свинья, корова) идентичны по ряду своих физико-химических свойств (электрофоретическая подвижность, ' спектральные характеристики, способность связывать железо, аминокислотный состав, пептидные карты). Установлена заметная структурная гомология лактоферринов человека, свиньи и коровы, триптические гидролизаты которых имеют 37 общих пептидов.

5. Сравнительно-биотическое изучение некоторых кинетических и структурных параметров миелопероксидаз человека, свиньи, коровы, кролика и крысы свидетельствует об единообразии ряда свойств (молекулярная масса, субъединичная организация молекул, спектральные характеристики) в анализируемом ряду гомологичных белков.

6. .В нейтрофилах новорожденных людей и животных (кролик, крыса) установлен дефицит основных антимикробных белков (миелопе-роксидаза, катепсин G, эластаза), который может быть одной из причин их функциональной неполноценности в ранний постнаталь-ный период онтогенеза.

-7. В модельных системах In vitro продемонстрировано синерги-ческое антимикробное действие миелопероксидазной системы, лактоферрина и дефенсинов', которое отражает некоторые механизмы взаимодействия анализируемых белков при инактивации микро-

- 9 -

организмов в процессе фагоцитоза и воспаления.

8:"Наличие-у - дефенсйнов— свойств ___ универсальных, антимикробных

молекул, наряду с их способностью повышать"резистентность т--------------

вотных к вирусной инфекции, нормализовывать свертываемость крови, оказывать кортикостатическое и иммунопротективное -действие дает основание предполагать участие этих полипептидов в сочетанной регуляции ряда защитных реакций организма.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и представлялись на 2 и з Всесоюзных симпозиумах по медицинской энзимологии. Москва, 1975, Астрахани 1979; на 1. 2 и з Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции лизосом", Москва. 1976. Новосибирск, 1980. Тбилиси, 1986; на Всесоюзном симпозиуме "Окислительные ферменты животной клетки". Горький, 1978; на 4 Всесоюзном биохимическом съезде, 'Ленинград, 1979; на 3 Всесоюзной конференции по патологии'клетки, 1982; на 7 Всесоюзном съезде патологоанатомов, Ташкент, 1983; на 9 и 10 международных симпозиумах по листериозу. Нант (Франция). 1996,. Печ (Венгрия), 1988; на 7 Всесоюзном симпозиуме по физиологии и биохимии лактации, Алма-Ата. 1986; на 4 Всесоюзном съезде патофизиологов, Кишинев; 1989; на 1 и 2 Международном конгрессе КИМ (Италия). Флоренция. 1990. Лаэстум, 1993; на конференции посвященной 100-летию НИИЭМ, Ленинград, 1990; на 1 Международном конгрессе патофизиологов. Москва. 1991; на 1 съезде иммунологов России, 1992;" на 1 Балтийской конференции по психосоматике и психотерапии. Киль (Германия). 1992; на 7 симпозиуме американского общества исследователей белков. Сан-Диего,1993, на 1 Международном конгрессе по стрессу, Бетесда (США), 1994. Публикации.По теме диссертации опубликовано 85 печатных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ¿¿¿"страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,/С глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. В диссертации /6 таблиц и рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использованы кролики обоего пола породы "Шиншилла", белые беспородные крысы и мыши-самцы линии СБА, полученные из питомника РАМН "Рапполово".

Препараты дефенсйнов Человека, крысы и кролика получали

из лейкоцитарной фракции крови (дефенсины человека) или из нейтрофилов перитрнеального экссудата (дефенсины крысы и кролика) с использованием схемы очистки, предложенной Selsted et al (1984)..- Кроме того, нами была предложена схема сочетанного получения лактоферринов, миелопероксидаз и дефенсинов, включающая экстракцию белков из лейкоцитарной массы 0,3% раствором цетилтриметиламмонийбромида, последующую ионообменную хроматографию на колонке с карбоксиметил-целлюлозой (СМ-32,' "Whatman", Англия), забуференной 0.02 M На-ацетатным буфером pH 4.5. содержащим 0.1 M NaCl, проводя элюцию белков тем же буфером с линейным градиентом NaCl от 0,2 до 1.2 M (Кокряков с со-авт.,- 1982, 1988). Индивидуальные фракции дефенсинов получали ' с помощью обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на колонке с "Vydac С-18" с использованием градиента концентрации ацетонитрила от 0 до 60% в 0,1% трифто-руксусной кислоте(ТФУ).

Протегрины, профенины и белок PR39X получали из лейкоцитарной фракции крови свиньи, проводя экстракцию 10% уксусной кислотой, затем с помощью ультрафильтрации через фильтр YM-5 ("Amicon") отделяли низкомолекулярную фракцию, которую далее наносили на колонку с биогелем Р-10 ("Bio Rad"), уравновешенную 5% уксусной кислотой. Фракции, содержащие исследуемые вещества, объединяли, концентрировали и разделяли с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке с "Vydac С-18" с использованием градиента ацетонитрила от 0 до 60% в 0,1% ТФУ (Kokryakov et al.. 1993; Har-wlgetal.. 1995).

:Активность пероКсидаз определяли по методу S.Klebanoff (1965). За единицу активности принимали изменение оптической плотности исследуемого образца при 460 НМ на 0.001 в течение 1 мин. при 20° С (о-дианизидиновая единица; о.д, е. ).

Эстеразную активность эластазы определяли по гидролизу n-нитрофенилового эфира третичного бутокси-Ь-аланина (Visser, Blaut. 1972). а катепсина G - по гидролизу этилового эфира бензоил-тирозина (Hummel, 1959). • .

Электрофорез полученных препаратов в полиакриламидном геле в кислой буферной системе проводили методом S.Panyim, R.СпаШеу (1969),- а в присутствии додецилсульфата натрия ШИа) - методом U. Laemmll (1970).

Пептидные карты миелопероксидаз и лактоферринов получали методом А. А.Мюльберга с соавт. (1970).

Аминокислотный состав препаратов белков и пептидов опре-

- И -' ■

деляли методом D. Spackman et al. (1958) на аминокислотном ана-~ лизаторе 3201r"LKB",.-Швеция_______________________

Первичная структура протегринов, профенина и~*белка~ PR39Y ~ была определена методом автоматической деградации пептидов по Эдману на установке Porton Model 2090 в специализированной лаборатории Калифорнийского университета (Лос-Анджелес. США).

Изучение характера связывания ЛФ.с железом проводили по методу P.Azarl и R.BauRh (1967). а железо в препаратах определяли батофенантроляновым реагентом с помощью теста для определения железа в сыворотке крови ("Boeringer" Mannhein. ФРГ).

Литискзпротки к миелопсрокспдазам я лактоферринам получали иммунизацией кроликов по схеме К.Pryzwwnsfcy с сй'авт. (1978). Двойную радиальную иммунодиффузию в геле агарозы проводили по методу O.Ouchterlony (1967).

Антибактериальное действие миелопероксидазы, лактоферрина и дефенсинов изучали в отношении 18-20 часовой культуры стафилококков. ^помещенных в 0,1 М Na-ацетатный буфер, pH 5.5. Микробные клетки подвергали воздействию антимикробных белков в течение 1 часа при 37°с. Количество колониеобразующих микробных единиц определяли путем высева разведенной суспензии обработанных клеток и подсчета числа колоний на чашках Петри с желточно-солевым агаром. В части экспериментов антимикробную активность лейкоцитарных белков исследовали с помощью метода радиальной диффузии в агарозном геле (Lehrer et al., 1991).

Прямое антивирусное действие дефенсинов человека и кролика определяли путем добавления препаратов в соответствующей концентрации к суспензии вируса простого герпеса ВПГ-1. штамм Л-2 в среде Игла, совместной их инкубации в течение 1 часа при 37° С и после/"/ющего определения титра вируса в культуре клеток. Нер-2. •

Глюкокортикоидную реакцию у мышей вызывали введением адре-нокортикотропного гормона в дозе 0,02 ЕД/г либо стрессорным воздействием (ротация, иммобилизация в сочетании с холодом).

Кортикостерон в сыворотке животных определяли по методу Гончарова с соавт.(1977).

Гуморальный иммунный ответ у мышей ■ на внутрибрюшинное введение эритроцитов барана в дозе 5 х 108 клеток оценивали по числу антителообразующих клеток в • селезенке (Jerne, Nordin. 1963) и количеству антител в сыворотке крови методом прямой гемагглютинации (Вязов. Ходааева. 1973).

Влияние дефенсинов кролика на функциональное состояние

противосвертывающей системы крови изучали в совмеспшх исследованиях с сотрудниками МГУ им. М.В.Ломоносова д.б.н. Л.А.Ля-пиной и к.б.н. М.В.Кондашевской.В образцах нитратной плазмы крови крыс определяли суммарную фибринолитическую активность и неферментативный -фибринолиз (Кудряшов с соавт.. 1974), концентрацию фибриногена (Biüwell, 1953), уровень гепарина (Шес-таков, Ильин, 1974), показатели Tj, Т2 и Т коагулограмм плазмы на коагулографе Н-33.

Данные экспериментов обрабатывали с помощью методов вариационной статистики. Достоверность различий между группами (Р) оценивали по t-критерию Стьюдента (Плохинский. 1980) или по U-критерию Вилконсона-Манна-Уитни (Гублер, Генкин.1973).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ Н ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и анализ физико-химических и функциональных свойств дефенсииоподобных полипептидов из лейкоцитоз свиньи г протегринов. ,

Лизосомные катаонные белки нейтрофилов (Zeya, Spitznagel. 1963,1966). позднее названные дефенсинами (Ganz et al.,1985). являются антимикробными молекулами, в значительной степени определяющими защитную направленность фагоцитарного процесса. Именно -этим обстоятельством был обусловлен выбор нами такого объекта исследования как нейтрофилы свиньи, поскольку в литературе отсутствовали сведения о дефенсииоподобных полипептидах из лейкоцитов этого вида животных.

Визуальное сравнение электрофореграмм кислоторастворимых белков нейтрофилов свиньи и кролика однозначно свидетельствовало -о присутствии в спектре первых полипептидов электрофоре-тически сходных с дефенсинами (Рис. 1). Фракционирование ультрафильтрата кислотного экстракта через УМ-5 на биогеле Р-10 позволило получить широкий спектр антимикробных соединений. среди которых нас заинтересовали в первую очередь три низкомолекулярных дефенсииоподобных полипептида, которые инак-тивировали в условиях in vitro три тест-микроба: Escherichia coli, Listeria monocytogenes и Candida albicans.

Дефенсиноподобные полипептиды лейкоцитов свиньи были далее разделены на 3 индивидуальных компонента высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке Vydac С18 . Аминокислотный анализ очищенных полипептидов однозначно свидетельство-

вал об определенном сходстве ят^х соединений с дефенсиками: "они богаты-аминокислотами-аргинином (27^33 мол%)# и цистеином (21-25 мол%). Однако их молекулярные массы (~2кДаГв~1/5-2 раза меньше таковых дефенсинов и близки к молекулярной массе антимикробного полипептида из гемоцитоз подковообразного краба -тахиплезина (Nakamura et al..3988).

Первичная структура полипептидсв, названных по предложению проф. Lehrer протегринами (protegrlns: от латинского protegere. т.е. защищать, прикрывать), была установлена методом автоматической деградации белков по Эдману на установке Pcrtc^ Model 2090 (Рис.2). Очевидна принадлежность трех выделенных компонентов к одной группе веществ; протегрин PG-1 (наиболее подвижный в кислой электрофоретической среде

¿Щ

IiШ

2.

7.;

Рис.1. Электрофоретический анализ белков лейкоцитов свиньи и

кролика в кислой среде ( 6,25 М мочевина, 15% акряла-

мид). 1 - кислотный экстракт из лейкоцитов сниньи: 2 -

Ш-5 фильтрат; 3 - высокомолекулярная фракция, задержавшаяся при фильтрации через УМ--5: •4 - фракция 76 с

колонки с биогелем Р-Ю; • 5 - фракция 11: & - фракция 78; 7 - фракция 79; 8 - см^сь равных объемов фракций 76-78; 9 - суммарная фракция дефенсинов кролика; 10 -кислотный экстракт из нейтрофилов кролика.

HNP-1 ACYCRIPACIAGERR YGTCIYQGRLWAFCC

PG-1 RGGRLCYCRRRFCVC. VGR

PG-2 R G G R L С Y.CLR R R F С I С V

PG-3 - R G G G L С Y С R R R F С V С V G R

NP-3a GICACRRRFCPNSERF SGYCRVNGARYYRCCSRR

TP-1 К W С F- R V.C Y R G I С Y R R С R-NHZ

Рис. 2. Первичная структура протегринов (PG-l. PG-2 и PG-3) в сравнении со структурами дефенсина человека HNP-1, де-фенсина кролика NP-За и тахиплезина (ТР-1). компонент) и PG-3 (наименее подвижный при электрофорезе компонент) содержат по 18 аминокислотных остатков к практически идентичны, -за исключением 4 остатка, который в молекуле первого представлен аргинином, а второго - глицином. Протегрин PG-2 короче PG-1 на 2 аминокислотных остатка и в положении -14 содержит изолейцин вместо валина. Четыре остатка цистеина образуют два дисульфидах мостика, поскольку свободные SH-rpyn-пы не определяются в пептидах реагентом Эллмака.

Сравнение первичной структуры протегринов со структурами дефенсинов кролика, человека и тахиплезина выявляет заметное сходство отдельных участков молекул свиных полипептидов с кроличьими. Максимальная степень структурной гомологии выявлена между протегрином -PG-3 (G4 LCICRRRFC13) и кроличьим де-фенсином NP-За (G1ICACRRRFC10), известным в литературе также t

как кортикостатин-1 (CS-l) (Zhu et al.,1988). Это дает основание предположить наличие у них сходных функциональных свойств.

Изучение антимикробных свойств протегринов показало, что все три компонента были активными в условиях In vitro против 3-х тест-микроорганизмов, причем.сила их антимикробного действия была сравнима с таковой кроличьего дефенсина NP-1 (Рис.З). Несколько меньшей антимикробной активностью обладала фракция PG-2.

Несмотря на общность ряда структурных и функциональных свойств, дефенсины и протегрины принадлежат к разным группам полипептидов. Об этом свидетельствуют и имеющиеся в литературе сведения о структуре генов, ответственных за синтез дефенсинов (Jilchaelson et al.,1992) и протегринов (Zanettl et al.,1993).

Рис. 3.Антимикробная активность протегринов в сравнении с активностью дефенсина кролика НР-1 и дефенскном человека НМР-1 По оси абсцисс - концентрация ттолипептидов в мкг/мл: по оси ординат - единицы антимикробной активности

. - 16 -

которые организованы принципиально различно.

2. Антимикробный белок лейкоцитов свиньи, обогащенный пролином и аргинином

Методом наложения геля нами было установлено, что в спектре белков ультрафильтрата YM-5 присутствует компонент с универсальной антимикробной активностью, имеющий молекулярную массу около 4 кДа. который был выделен нами при хроматографии на колонке С-18. Аминокислотный анализ очищенного белка выявил высокое содержание в нем пролина и аргинина. Микросиквенс показал практически полную идентичность структуры нашего антимикробного белка с протеином PR 39, выделенным шведскими исследователями из слизистой тонкого кишечника свиньи (Agerberth et al..1991)(Рис.4).

PR-39: RP.RPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP PR-39X: RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIIPGFPPRFPPRFP

Рис.4.Сравнение первичной структуры белка PR-39 и белка из лейкоцитов свиньи (PR-39X)

Различие касалось -только позиции 27. в которой вместо пролина (PR 39) в нашем белке выявлен изолейцин. Есть основания, по-видимому, говорить о группе белков с универсальными антимикробными свойствами, клеточная локализация которых обусловлена их участием в обеспечении антимикробного барьера организма (нейтрофилы, клетки эпителия слизистой тонкого кишечника). Эти белки в отличие от дефенсинов и протегринов не содержат цистеина. это линейные молекулы. Однако, их антимикробная активность в стандартных условиях in vitro не ниже таковой протегринов и дефенсинов. Все это свидетельствует о том, что в процессе эволюции возникали и отбирались параллельно несколько групп анитибиотических веществ белково-пептидной природы, взаимодействие (кооперация) между которыми обеспечивали эффективность неспецифической антимикробной защиты животных и их выживание в условиях постоянного соприкосновения с патогенной микрофлорой.

~ - 17 -*

3. Белок лейкоцитов свиньи, избирательно шактивирующий _______ :____________ _ Е. coli

При фракционировании белков и лолипептидоз ультрафильтрата через УМ-5 на биогеле Р-10 наш была зачалена группа роде твенных по Физико-химическим и антимикробным свойствам кемпо-нентов с молекулярной массой в пределах от 7 до 9 кДа, которые по данным ВЭЖХ на Vydac CIS характеризовались высокой степенью гидрофобнссти, т.к. выходили с колонки при высоких концентрациях ацетонитрила (48-50%). В состав этой фракции было, как правило, 2-3 основных компонента, которые легко разделяли препаративным электрофорезом по катоду llarvlg et al. (¡993)..

Аминокислотный анализ одного из этих компонентов свидетельствует о высоком содержании ' ь нем .аминокислот пролина (53.2 мол%) и фенилаланина (19.0 молй), что послуаило основанием для названия его профенином (prophenln). По данным электрофореза в среде с ДСЛа его молекулярная масса оценивалась около 7 кДа, однако по результатам масс-спектрометрического анализа ее значение равно 8683.0 Да. Микросиквенс бэлка выявил его необычные структурные особенности (Рис.5): наличие многократно повторяющегося блока из гидрофобных аминокислот (FPPP) к 4-х кратное повторение блока из десяти аминокислот (декамера): RFPPPNFPGP. Оценка антимикробной активности белка выявила его избирательную активность в отношении грамотрицательной бактерии Е. coli, слабое действие на L.monocytogenes и отсутствие действия на гриб Candida albicans. Есть основания предполагать. что селективность повышенного действия профенина-1 в отношении Е.coll обусловлена структурой его декамера. сочетающего свойства слабо основной и сильно гидрофобной молекулы и в силу этого активно взаимодействующего с липополисахаридом (эндотоксином) наружной мембраны бактерии. Обоснованность этого положения требуется еще доказать экспериментально. A1 F Р Р Р N V Р G Р10 RUF PPPHFPGP20 R^F Р Р Р 8 F Р G Р3» R31F PPPHFPGP40 gtip PPPMFPGP50

p51FpppIFpCp60

F P P P P P F R P70 P71PFGPPRFP

Рис. 5. Первичная структура профенина

- 18 -

Клонирование гена открытого нами белка в лаборатории профессора Lehrer и словенскими исследователями (Pangercar et al.. 1993) подтвердило результаты сиквенса.

4. Дефенсины псевдоэозинофилов (гетерофнлов) домашней курицы (Callus gallus).

Первые сведения об антимикробных пептидах гетерофнлов кур (клеток, структурно и функционально гомологичных нейтрофилам млекопитающих) были получены американскими исследователями еще в 70-е годы (Brune, Spltznagel, 1973). Было установлено, что в их гранулярном аппарате содержится по меньшей мере три низкомолекулярных основных полипептида, инактивирующих в условиях In vitro Escherichia coll, Serratla marcescens и Staphylococcus albus. Первичная структура этих пептидов оставалась нерасшифрованной. Мы заинтересовались этой группой веществ в процессе изучения резистентности кур породы Бройлер-6 к инфекции и зависимости ее от белкового спектра псевдоэозинофилов В совместных исследованиях с сотрудниками ВНИИВП (руководитель работ д.б.н. Л. С.Колабская) нами была установлена интересная закономерность во взаимодействии хозяин-паразит: резистентность кур к.инфекции находилась в прямой зависимости от содержания в их гетерофилах дефенсиноподобных.пептидов. Группы животных с отсутствием рассматриваемых веществ характеризовались сниженной резистентностью к инфекции, в этих партиях наблюдался максимальный падеж птицы. Нами совместно с лабораторией профессора R. Lehrer (UCLA, USA) было осуществлено выделение и изучение структурИо-функциональных свойств рассматриваемых пептидов.

Кислотный экстракт из эксудатных псевдоэозинофилов кур фракционировали гель-фильтрацией на акрилексе Р-10. Фракцию с дефенсиноподобными пептидами разделяли путем сочетанного применения методов' ОФ ВЭЖХ и препаративного электрофореза в поли-акриламидном геле. Удалось получить в высокоочищенном виде три пептида. Секвенирование пептидов выявило следующие особенности их структуры: высокое содержание остатков лизина-и аргинина, наличие шести остатков цистеина, образующих три дисульфидных мостика (Рис.6).-

■Gal la: GRKSDCFRKNGFCAFLKCPYLTLISGKCSRFHLCCKRIVi Gal 1: GRKSDCFRKSGFCAFLKCPSLTLISGKCSRFYLCCKRIW Gal 2: LFC—KGGSCHFCGCPSHLIKVGSCFGFRSCCKWPWNA

Рис. 6. Первичная структура галлинацинов кур

- 19 -

Галлинацины. как были названы рассматриваемые полипептиды, следует отнести-к-группе-0-дефенсин£в - антибиотических соединений. выделенных впервые из эпителия трахеи (Dlamona-et------

а1.,1991) и нейтрофилов коров (Selsted et а1.,1993). Эти пептиды оказались очень активными антибактериальными и, в меньшей степени, антигрибковыми веществами. В свете этих'данных становится понятным почему их дефицит в гетерофилах кур приводит к снижению резистентности животных к инфекции.

5. Физико-химические и структурные свойства лактсферринов нейтрофилов и колока

Лактоферрин (ЛФ) - маркерный белок специфических гранул нейтрофилов человека и животных (Bagglollnl et al., 1970). В немногочисленных работах по изучению ЛФ, выделенных из нейтрофилов человека (Masson et al.,1969), кролика (Bagglollnl et al.,1970). морской свинки (Torres et al., 1979) представлены преимущественно первоначальные сведения об их некоторых физико-химических свойствах, которые не позволяли однозначно ответить на вопрос о степени структурного родства этих белков из_ молока и лейкоцитов. О настоящей работе проведено сравнительное исследование физико-химических параметров ЛФ из нейтрофилов и молока человека, свиньи и коровы с целью оценки степени структурной гомологии анализируемых белков.

Использованные методы выделения и очистки ЛФ из нейтрофилов и молока человека и некоторых видов млекопитающих обеспечивают получение высокоочищенных препаратов, что было установлено на основании их электрофоретического анализа в помакриа-мидном геле при кислых значениях рН и с ДСйа. Все исследованные ЛФ являются белками, состоящими из одной полипептидной цепи и содержащими углеводные компоненты (от 12 до 14 гексог входит в состав их.молекул). Молекулярные массы ЛФ человека из обоих источников определены в пределах 76000+1500 Да. ЛФ коровы - 75500+1500. ЛФ свиньи - 75000+1500 Да.

Основным свойством выделенных белков, которое позволяет идентифицировать их как ЛФ. является способность анализируемых препаратов связывать железо в присутствии бикарбонатных ионов (Masson, 1970) с образоьанием комплексов, окрашенных в красный цвет и имеющих максимум поглощения при 470 нм. Величины зкс-тинкции 1% растворов ЛФ человека - 0,500+0.010, ЛФ коровы -0,470+0,010, ЛФ свиньи - 0,410+0.010.

-20-

Данные аминокислотного анализа ЛФ из разных источников приведены в таблице 1.. С учетом того, что погрешность определений на аминокислотном анализаторе составляет 5%. можно утверждать. • что аминокислотные составы ЛФ молока и нейтрофилов человека, как и соответствующие значения для пар гомологичных белков свиньи и коровы достоверно друг от друга не отличаются. Достоверное различие между аминокислотными составами ЛФ человека и свиньи выявлено только в содержании четырех аминокислот (глутаминовой, аргинина, изолейцина и тирозина), что отражает видоспецифические особенности сравниваемых белков. Можно отметить высокий уровень содержания в ЛФ ароматических аминокислот (на долю тирозина, фенилаланина и триптофана приходится до 12. мол%), наличие которых, по-видимому, обусловливает высокую степень антигенности этих белков. ^ .

Таблица 1

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ ЛАКТОФЕРРИНОВ (мол%)

ИСТОЧНИК .

АМИНОКИСЛОТА -:---:-

ЛФ человека ЛФ свиньи ЛФ коровы ЛФ кролика

- м Н м Н К Н Н ,.

Аспарагиновая 9,8 10,3 9.1 ■ 9,3 ■ 9.1 9,15 8,8

Треонин . 3.7 .3,5 3.7 3,6 4.2 4,1 4.6

Серин 4.7 ■ 4.5 4.5 4.4 .4.5 4.6 4.8

Глутаминовая 11,5 11.5 13,5 13.7 11.0 10.9 7.8

Пролин 4.2 4,4 4, 04 3.8 4.1 4.1 5.6

Глицин 4,0 3.8 3.9 3.6 3.2 3.3 3,7

Алании 4.95 . 4,9 4.9 4.9 5.2 5,1 4.8

Валин 5.1 4.9 5.3 5.1 5.1 5,15 5.4

Метионин 0,8 1.0 1.1 1.0 0.8 0,85 -

Изолейцин 2,1 2.1 2.8 . 2.9 2,1 2, 05 1,9

Лейцин 8,0 8.2 7.9 8.0 8.4 8,6 .7,0

Тирозин 4,05 4.1 4.5 4.6 4.3 4,3 4,1

Фенилаланин 5.1 5.15 5.4 5,4 4.7 4.9 3,8

Гистидин 1.35 1.37 1.3 1.2 1,6 1.55 2,0

Лизин 6,7 6,5 7.1- 7,0 7.6 7,5 5,3 '

Аргинин 8.1 8.4 7.0 7.1 6.4 6.5 7,2

М - лактоферрин из молока; Н - лактоферрин из нейтрофилов

- 21 -

Методом пептидного картирования триптических гидролизатсв ЛФ~ из нейтрофилов и молока-человека. и свиньи установлена полная тождественность пептидов сравниваемых белков,' выделенных из одного видового источника. Совокупность представленных в настоящей работе данных позволяет заключить, что иммунохими-ческая идентичность лактоферринов молока и нейтрофилов отражает структурную тождественность сравниваемых белков,. выделенных из различных клеточно-тканевых источников человека и сеиньи.

Метод диагностики воспалительных заболеаний молочной железы

В ходе разработки способов выделения ЛФ из молока нами были выявлены качественные изменения в спектре кислотораство-римых белков человека и коров, которые позволили диагностировать воспалительные заболевания молочной железы, однозначно детектировать начальную стадию заболевания, а также дифференцировать их от застоя молока. Способ основан на анализе качественных изменений в спектре кислоторастворимых белков молока после электрофоретичегжого разделения в полиакриламидном геле. Лабораторные и клинические исследования проб молока рожениц показали, что элелтрофоретнческие спектры кислоторастворимых белков молока здоровых женщин и с субклиническими формами мастита качественно отличаются. При субклинической ферме воспаления молочной железы по сравнению'с нормой на электрофо-реграммах выявляется дополнительная катодная полоса с ЯТ = 0,47-0,49. Подобные закономерности в изменении белкового спектра молока выявлены у коров. У животных с маститом детектируется дополнительная высокоподвижная катодная полоса с ЛГ = 0,43-0,44, отсутствующая у здоровых особей.

6. Изучение физико-химических свойств миелопероксидаз

• В силу того, что пероксидазы лейкоцитов являются гемсо-держааыми энзимами, их принадлежность к рассматриваемому классу

белков определяли спектрофотометрическим и ферментные способами. Полученные нами спектры поглощения конечных препаратов миелопероксидаз из нейтрофилов человека, свиньи, коровы, кролика и крысы были практически идентичными и характеризовались в видимой области абсолютным максимумом в зоне полосы Соре (430 нм). умеренным при 500 и 570 нм и незначительным при 625 и 690 нм. Величина RZ Ше1гЛеП гаЫ, нем.). определяемая как отно-

- 22 - • шение: поглощения препарата при длине волны 430 нм к абсорбции при ,280 нм, колеблется, для высоко очищенных препаратов миелопе-роксидаз в пределах 0,75-0,8.

Поскольку миелопероксидазы относятся к группе окислительно-восстановительных ферментов, которые катализируют окисление перекисью водорода (Н£02) различных по химической природе веществ - доноров электронов (АН2:фенолы, ароматические амины, органические кислоты, анионы галогенов и др.), постольку для их выявления используются различные субстраты, дающие после окисления окрашенные продукты. В нашей работе в качестве такого субстрата использован о-дианизидин (К1еЬапоГГ.1965). Изучение зависимости скорости реакции, катализируемой миелоперокси-дазами. от величины рН и концентрации компонентов реакции (Н202 и о-динизидин) проводили при 0.5-1,0 нМ концентрации ферментов в интервале времени регистрации равном 15 секундам. Это связано с тем. что скорость пероксидазной реакции при постоянной оптимальной концентрации субстратов характеризуется линейной зависимостью в интервале 0,25-2,5 нМ концентраций ферментов именно в течение первых секунд. При увеличении времени регистрации до 1 мин наблюдается отклонение скорости от прямой пропорциональности. Профиль кривых зависимости скорости реакции от концентрации Н202 для всех сравниваемых миелоперок-сидаз обладает сложным характером, не подчиняющимся гиперболической зависимости Михаэлиса-Ментен. Кривые имеют узкую зону высокой скорости реакции при 0,05-0,12 нМ концентрациях Н202. Быстрое снижение скорости реакции в области концентраций этого субстрата, превышающих 0.1 нМ. является, по-видимому, следствием как субстратного торможения за счет перевода фермента в малоактивное состояние, так и того, что в этой области ферменты начинают осуществлять каталазную реакцию (А^ег.1943). Зависимость скорости реакции от концентрации о-дианизидина для миелопероксидаз представляет собой, типичную гиперболическую кривую, хорошо описываемую уравнением Михаэлиса-Ментен, однако расчет Км в отношении этого субстрата затруднен, вследствие того, что используемые концентрации второго субстрата (Н202 ) не являются насыщающими. Аналогичные кинетические свойства установлены для фермента из нейтрофилов мыши (Стефанов, Шафран, 1976). Оптимум рН для миелопероксидазного окисления орто-дианизидина находится в области 5,8-6,2 для сравниваемых ферментов. Это, по-видимому; не случайно, так как именно в таких условиях функционируют миелопероксидазы в фаголизосомах фаго-

цитирующих нейтрофилов (Mardell. 1970; Cech, Lehrer.1984). Заметное совпадёниЕГ рассматриваемых кинетических свойств - ферментов позволило предположить наличие у них структурного сходства, степень которого была оценена нами в следующем разделе работы.

По данным гель-фильтрации через сефадекс Г-200, молекулярная масса исследуемых нами миелопероксидаз находится в пределах 140.-150.000 Да. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ÄCNa выяьил два основных (2-й и 4-й) и два дополнительных (1-й и 3-й) компонента у ссех сравниваемых белков. В анализе этих данных мы руководствовались результатам работы Harrison et al. (1977),в которой впервые при анализе структуры миелопероксидазы собаки было установлено, что в состав фермента входят две тяжелые (М=57500 Да) и две легкие (М=10500 Да) субъединицы. Возможно, что выявленный нами высокомолекулярный компонент I с М=67-75 кД представляет протомер, - состоящий из тяжелой (компонент 2 с М=55-60 кД) и легкой (компонент 4 с М=11-15 кД) субъединиц. В состав холофермента по современным представлениям входят два протомера (Naussef et а] ,1988), в, составе тяжелых субъединиц которых содержится по одному гем^ (Wu. Schultz,1975; Souo et al.,1990). Компонент с молекулярной массой около 40 кДа, выявленный в препаратах миелопероксидаз и другими авторами (Zakl et al. ,1989),. представляет собой, фрагмент тяжелой субъединицы, образующийся в результате обработки белка додецилсульфатом натрия. Этот компонент не является примесным, так как при электрофорезе в кислой среде препараты миелопероксидаз содержат только по одной высокомолекулярной фракции. Таким образом, данные гельфильтрации и различных вариантов электрофореза позволяют оценивать молекулярную массу холофермента миелопероксидаз в пределах 140-150 кДа, что характерно для энзимов из других видовых источников (собака, мышь, морская свинка, лошадь). ;

Данные анализа аминокислотного состава МПО , сравниваемых видое приведены в таблице 2. Их сопоставление однозначно свидетельствует о принадлежности рассматриваемых белке: к одному гомологическому ряду. Следует обратить .внимание на то. что суммарное содержание дикарбоновых аминокислот (аспарагиновая. глутаминовая) в белках этой группы превышает таковое основных (аргинин, лизин, гистидан). Однако, по поведению на ионоебмен-никах и при электрофорезе миелопероксидазы характеризуются как катионные белки с изоточкой при pH более 10 (Maehly. 1955).

Высокое содержание аммиака, выявленное нами и другими авторами (üdajima, Yamazakl,1972), может свидетельствовать об амидиро-вании части свободных карбоксильных групп в белковой цепи. Это предположение получило подтверждение после расшифрования первичной структуры , миелопероксидазы человека (Johnson et al.,1987), осуществленного на основе знания последовательности нуклеотидов в соответствующей кДНК.

Таблица 2

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ ШЕЛ0ПЕР0КСИДАЗ • (количество остатков на молекулу с молекулярной массой 150 кДа)

Аминокислота Фермент из нейтрофилов

человека свиньи коровы кролика крысы

Аспарагиновая 136 149 . 143 137 .144

Треонин ■ 69 70 • 61 84 84

Серии 63- ■ 65 - 60 62 66

Глутаминовая 129 126 127 120 122

Пролин 106 106 . 108 101 105

Глицин 80 84 74 87 80

Алании 78 82 86 85 81

Валин ■ 51 56 57 64 59

Метионин 28 25 26 27 25

Изолейцин 48 47 51 57 59

Лейцин 130 141 144 137 151

Тирозин 27 38 : 39 27 28

Фенилаланин 55 58 62 63 55

Гистидин 14 14 16 18 20

Лизин 43 48 50 21 48

Аргинин 120 125 126 127 ' 120

- 25 -

7. Изучение антимикробной активности лактоферрина и^миелопероксидазы в модельной системе in vitro

Интерес к исследованию антимикробных свойств выделенных и изученных наш белков нейтрофилов диктуется необходимостью выяснения их роли б формировании резистентности организма к инфекции. Значительное снижение резистентности организма к бактериальной инфекции наблюдается в случаях с наследственно обусловленным отсутствием или дефицитом специфических гранул нейтрофилов и их основного компонента - лактоферрина (Spltzna-gel et al. . 1972 Strauss et al.. 1974: Komlyama et al.. 1979). Подобная же морфобиохимическая и функциональная особенность нейтрофилов встречается при острой и хронической гранулоцитар-ных лейкемиях (Odeberg et al.,1976) и ожоговой болезни (Davis et al.,1980) у людей. Во всех рассмотренных примерах функциональная неполноценность нейтрофилов обусловлена в значительной степени отсутствием или недостаточностью в них лактоферрина. Это тем более парадоксально, что сам по себе этот.белок обладает слабой микробоцидной активностью (Arnold et al.', 1977, 1930) и его действие на микроорганизмы оценивается большинством исследователей (Masson, 1970; Reiter. 1983) как микробоста-тическое. Возможно, что лактоферрнн, будучи слабым цитотокси-ческим агентом, в составе фаголизосом вступает в разнообразные кооперативные взаимодействия с другими антимикробными вещее,т -вами, в том числе с миелопероксидазой, которые определяют эффективность умерщвления фагоцитированных бактерий и грибов.

С целью проверки выдвинутого предположения мы провели работу по моделированию некоторых сторон такого взаимодействия в условиях In vitro, которые по ряду своих параметров (кислое значение pH среды, наличие перекиси водорода и йодида) аналогичны содержимому фаголизосом. В этих условиях аполактоферрин свиньи - форма белка, лишенная железа, в которой он. по-видимому, преимущественно находится в нейтрофилах (Bullen, Armstrong,1979), в концентрации 20 мкг/мл инкубационной пробы не проявляет бактерицидной активности в отношении стафилококковой культуры (Табл.3). Повышение концентрации белка до 1 мг/мл практически не сказывается на жизнеспособности бактерий. Этот факт находится в полном соответствии с литературными данными (Arnold et al..1980).

Следующий этап работы состоял в выяснении характера воздействия на стафилококки АЛФ и миелопероксидазной системы

нейтрофилов свиньи при их совместном испытании. При таком сочетании лейкоцитарных белков воспроизводятся отдельные стороны их кооперативного антимикробного действия в фаголизосомах после слияния с ними содержимого специфических и азурофильных гранул. Микробоцидное действие МПО-системы изучено хорошо (К1е-banoff, 1967,1968). Его интенсивность в значительной мере за-

Таблица 3

- ВЛИЯНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ВЕЩЕСТВ НЕЙТРОФИЛОВ СВИНЬИ НА СТАФИЛОКОККИ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Количество колоние-Состав инкубационной пробы образующих микробных

единиц (М±м)х10"4

1. Буфер (основной контроль) 170 + 19

2. Буфер, Н20г,. NaJ ..... 168 + 14

3. Буфер, Нг0г, NaJ, АЛФ 167 ± 12

4. Буфер. Нг0г. NaJ, МПО 120 + 9

5. Буфер, Аг Ог.\ NaJ.-АЛФ, МПО 0,145 ± 0.02

6. Буфер, NaJ, ДЛФ, МПО - 166 + 12

7. Буфер, Н20г. АЛФ, МПО 168 + 12

8. Буфер,- 0, IMNaCl, Нг02, NaJ, АЛФ, МПО 167 ± 9 ■

9. Буфер, НгОг. NaJ, СОД. АЛФ, МПО' 0,139 + 0.05

10. Буфер, Н20г, NaJ. Каталаза, АЛФ, МПО 168 + 9

И. Буфер, Н20г. NaJ. ЛФ. МПО 131 ± 7

12. Буфер, Н20г, NaJ, АЛФ. МПО. аскорбат 161 + 12

Буфер - 0,1 М Ка-ацетатный буфер рН 5,5. Конечные концентрации ингредиентов в мл инкубационной среды: Н20г - 5'нМ; Ш -0.1 мкМ; АЛФ и ЛФ - 20 мкг; МПО - 0,05 мкг; СОД - 5 мкг; ката-лаза - 60 мкг; аскорбат - 1 мкМ

висит от концентрации отдельных ингредиентов системы и в первую очередь - фермента. Наж были подобраны такие соотношения компонентов МПО-системы, при которых ее стафилоцидный эффект был незначителен. Совместное испытание в тест-системе АЛФ й МПО-системы выявило существенный синергический бактерицидный эффект. Наблюдается уменьшение количества колониеобразующих микробных единиц на три порядка по сравнению с вариантами раздельного испытания анализируемых белков. Бактерицидное действие зависит от наличия всех веществ, составляющих кооперативную систему, так как исключение любого из них практически

полностью" снимает'синергический 'эффект.--------------------------------------------------------

Как можно объяснить наблюдаемый феномен? По-видимому, аполактоферрин, сорбируясь на клеточной оболочке стафилококков, вступает в молекулярное взаимодействие с белками, в состав которых входят Fe3*, Cu2+, Kn2*, Kg2", Zn2+. Среди них есть микробные супероксиддиечутазы и каталаза, которые вследствие потери важных металлов католического центра инактивируют-ся. Это приводит к обогащению области поверхностных структур бактерии супероксидом (0J) и продуктом его спонтанной дисмута-иии - перекись» водорода Шг0г). Постоянная туодукиия окислителя в этих условиях поддерживает на более высоком уровне активность миелопероксидазной системы, что находит свое отражение в заметной гибели.стафилококковых клеток.В пользу обоснованности выдвигаемого механизма синергизма антимикробных белков свидетельствует чувствительность системы к экзогенной ка-талазе и независимость от супероксиддисмутазы. Повышение ионной силы инкубационной среды до 0,2 отменяет синергический эффект, так как препятствует сорбции АЛФ на поверхности стафилококковых клеток. Неактивна система при добавлении в среду насыщенного железом лактоферрина и аскорбиновой кислоты - ловушки супероксидных анионов (Scm et al.,1983). Есть основания считать, что установленное нами кооперативное антимикробное действие белков является не только лабораторным феноменом, но и отражает объективно существующие закономерности взаимодействия гранулярных факторов при фагоцитозе и воспалении. В свете згих экспериментальных данных становится понятной роль лактоферрина в обеспечении полноценной микробоцидной функции нейт-рофилов как компонента, создающего условия для пролонгированного действия ШО-системы.

8. Возрастные дефициты антимикробных белков нейтрофильных гранулоцитов

Общеизвестны факты низкого уровня сопротивляемости ор ганизма новорожденных инфекциям и вследствие этого склонность к септическому течению заболеваний у детей в ранний постна-тальный период онтогенеза (Miller,1971; Hill, 1937; Mirchell, 1989). По мнению этих авторов недостаточность хемотаксиса нейтрофилов и незавершенный характер фагоцитоза, осуществляемого ими, являются одними из ведущих причин сниженной резистентности новорожденных к инфекции. В то же самое время нет-

торые конкретные механизмы "полома" фагоцитоза в этих условиях остаются невыясненными. Это побудило нас провести комплексное морфобиохимическое и функциональное исследование с целью определения роли катионных белков в обеспечении фагоцитарной функции нейтрофилов человека и. животных в ранний постнатальный период их развития.

Результаты сравнительного биохимического определения общего кислоторастворимого белка, миелопероксидазы. эластазы и катепсина й в нейтрофилах пуповинной крови новорожденных и взрослых доноров свидетельствуют о дефиците этих соединений в клетках детей. Так, содержание в них миелопероксидазы, катепсина й и эластазы было соответственно снижено в 3, 5, 4 и 5 раз по сравнению с аналогичными показателями нейтрофилов доноров. Параллельная оценка содержания гранулярных катионных белков с использованием лизосомально-катионного теста (Пигаревс-кий, 1979; Пигаревский. Мазинг, 1981) соответствует данным этого анализа.

Подобная же закономерность увеличения количества катионных белков в нейтрофилах от первых дней рождения до периода половозрелости'^ установлена нами при обследовании белых беспородных крыс и кроликов породы "Шиншилла" (Табл.4). Необходимо отметить, что дефициту гранулярных катионных белков нейтрофилов кролика соответствовали низкие значения такого важного функционального показателя их активности как завершенность фагоцитоза (антибактериальная активность катионных белков). Последнее обстоятельство является, по-видимому, одной из возможных причин генерализации листериозного инфекционного, процесса у животных 7-и дневного возраста, который у половозрелых особей протекает локально благодаря полной инактивации бактерий в фагоцитах очага повреждения (Пигаревский с соавт.,1990).

Таким образом, нами установлен временный (преходящий) дефицит антимикробных белков нейтрофилов в период раннего пост-натального развития человека и животных (кролик, крыса), который может составлять причину функциональной неполноценности фагоцитов и быть расценен как один из факторов риска к развитию инфекционных заболеваний и септических осложнений. В дополнение к этому, благодаря сопряженно проведенным биохимическому и морфологическому анализам, впервые получены строгие доказательства объективности данных цитохимического определения содержания катионных белков нейтрофилов при использований лизосомально-катионного теста (Пигаревский. 1979).

Таблица 4

Показатели содержания- катионных белков и функциональной

активности нейтрофилов кролика

Исследуемый Возраст животных

показатель 7 14 21 28 60

дней дней дней дней дней

Общий киолотораство- 15 22 30 62 65

римнй белок мг/109 клеток

Миелопероксидаза

мг/109 клеток 0. 098 0,192 0,210 0,417 0, 56!

Эластаза

% /109 клеток 46 68 70 83 100

Фагоцитарное число % ; 76 69' 62 61 70

Фагоцитарный индекс

число микробов/клетку 5.2 3.8 3,4 3,3 6

Антибактериальная ак-

тивность катионных

белков * 30 26 38 52 75

* Результаты получены к. б. н.. с.н.с. Ю. А.Мазингом

9. К вопросу о некоторых механизмах формирования резорбтивной клеточной резистентности

Гипотеза о резорбтивной клеточной резистентности как особой форме антимикробной защиты организма человека и животных была выдвинута профессором В.Е. Пигаревским (1978) на основании результатов работ по исследованию морфодинамики воспалительных очагов повреждения при инфекционной патологии. Морфологический анализ органов и тканей при хламидиальной (Пигаревский, Толы-беков, 1976) и псевдотуберкулезной (Мазинг, 1983) инфекциях показал, что макрофаги в процессе своей жизнедеятельности преходят стадию поглощения продуктов распада нейтрофилов (ядра, хроматин, гранулы и их отдельные белковые компоненты), благодаря чему они становятся резистентными к микробному паразити-рованию. Опыты по инактивации этих возбудителей In vitro ядерными гистонами (Пигаревский и др.,1975) и гранулярными катион-ными белками нейтрофилов (Кокряков с соавт., 1977) частично

• - 30 -

свидетельствовали в пользу выдвинутой концепции.

С целью дальнейшего обоснования биологической значимости рассматриваемого явления и расшифрования его конкретных морфо-биохимических механизмов нами было проведено комплексное исследование с использованием в качестве основного объекта изучения перитонеальных макрофагов кролика, выделенных из очага асептического воспаления на разных сроках после его индукции. Такое воспаление характеризуется надежно воспроизводимой во времени динамикой смены лейкоцитарных популяций. В первые 4-8 часов после введения в брюшную полость индуцирующего раствора крахмала наблюдается интенсивный выход туда из крови нейтрофилов. До 36 часов этот тип клеток является, преобладающим в эксудате. В дальнейшем происходит закономерная смена клеточных популяций в очаге воспаления и к 46 часам^макрофаги составляют уже не менее 90% клеток эксудата, причем около 50% из них содержат морфологически индентифицируемые остатки ядер и гранул нейтрофилов.В последующие трое суток наблюдается постепенное исчезновение компонентов нейтрофилов из макрофагов. в результате их переваривания в гранулярном аппарате последних. Подобная динамика клеточных реакций в очаге воспаления позволяет получать макрофаги с различным содержанием резорбированных антимикробных белков (миелопероксидаза,лактоферрин,дефенсины и др.) нейтрофилов и использовать их в витральных тест-системах.

Мы изучали соотношение функциональной активности (фагоцитарное число и индекс, дыхательный взрыв) и количества миело-пероксидазы гранулоцитарного происхождения в перитонеальных макрофагах кролика, выделенных из организма на разных- сроках развертывания асептического воспаления (Табл.5). Установлена четкая коррелятивная связь между показателями функциональной активности макрофагов и содержанием в них миелопероксидазы, которое максимально в 2-х суточных клетках. Можно допустить, что именно с увеличением количества антимикробных белков нейтрофилов в вакуолярном аппарате макрофагов связано повышением их биопотенциала по сравнению с исходными интактными клетками. Подобный эффект наблюдали зарубежные исследователи (Ьоскз1еу; К1еЬапо1Т.1983) при добавлении миелопероксидазы в инкубационную среду культуры макрофагов с фагоцитированными простейшими.

Таблица 5

Показатели функциональной активности и содержания антимикробных белков макрофагов

Содержание Фагоцитарная актив- Процент

миелоперокси- ность клеток в отно- НСТ-пози-

Объект дазы в мг/109 шении Staph, epiderm. тивных

исследования клеток - клеток

ФЧ(%) ФИ

НЕПТРОФИЛЫ 0, 565 _ - -

Резидентные

перитонеальные

макрофаги 0,03 25+1,3 3,2+0, И 10+0,8

2-х суточные

перитонеальные

макрофаги 0,28 49+1,0"* 4,1+0,12* 31+1,1**'

3-х суточные

перитонеальные ■ -

макрофаги 0, 231 34+1,1" 4,0+0,09* 24+1,2" *

4-х суточные

перитонеальные

макрофаги 0, 15 30+1.2* 3, 2+0, 11 19±1, 3''

5-ти суточные

перитонеальные

макрофаги 0,05 28+1.3 2,3+0, 15 14+1.1*

* - р < о, 05 ** - р < о, 01 *** - р < 0,001 по сравнению с соответствующими показателями резидентных перитонеальных макрофагов

Таким образом, совокупность приведенных экспериментальных данных свидетельствует в пользу выдвинутой В.Е.Пигаревским (1978) гипотезы о резорбтивной клеточной резистентности как об одном из механизмов осуществления неспецифических защитных ре-ак!Щй в организме человека и животных.

10. Изучение функциональных свойств дефенсннов и структурно-родственных им полнпептидов

Открытие в нейтрофилах лизосомных полипептидов с микробо-цидаыми свойствами {2еуа, БрИгпаяе], 1963,1966) привело к ка-

• - 32 -

чественным изменениям во взглядах на природу факторов, определяющих цитотоксическую (киллерную) функцию фагоцитов. Установление первичной структуры и механизмов антимикробного действия дефенсинов (Lehrer et al., 1993) послужило обоснованием представления об их ключевой роли в обеспечении завершенности фагоцитоза при инфекционной патологии (Пигаревский,1982.1983; Spitznagel,1984; Lehrer et al., 1991).

В нашей работе проведено изучение как антимикробных, так и ряда других функциональных свойств дефенсинов, которые реализуются в организме человека и животных в норме и патологии.

10.1. Антистафилококковая активность дефенсинов

Бактерицидные свойства суммарной фракции дефенсинов в отношении нескольких штаммов стафилококков разной степени пато-генности изучены нами в системе in vitro при значении pH, имеющем место в фаголизосомах фагоцитирующих нейтрофилов кролика (Jensen, Bainton,1973). Из представленных в таблице 6 данных вытекает, что дефенсины кролика эффективны в используемых концентрациях в отношении авирулентного штамма (9198). В то же самое время дефенсины человека в этих условиях не проявляют практически никакой антибактериальной активности. Последний факт хорошо согласуется •с литературными данными (Ganz et al., 1985), которые свидетельствуют о низкой чувствительности стафилококков к действию дефенсинов человека в среде, лишенной глюкозы.

Нами впервые было изучено ' совместное антимикробное действие дефенсинов и миелопероксидазы кролика. Не приходится сомневаться в том, что в условиях In vivo анализируемые вещества действуют на микробные клетки одновременно, поэтому в нашем эксперименте мы частично моделировали естественные ситуации их взаимодействия. Показано, что при сочетанном действии рассматриваемых белков на стафилококки имеет место синергизм, а не простая сумма антимикробных эффектов миелопероксидазы и дефенсиноз. Причем в этих условиях повышается чувствительность к действию 'антимикробных белков даже высокопатогенного для мышей штамма стафилококков (5/2-бп-б).

Впервые выявленный нами синергизм антистафилококкового действия миелопероксидазной системы, дефенсинов и лактоферрина позволяет понять гораздо более высокую эффективность стадии

Таблица 6

Влияние антимикробныхбелков нейтрофилов на стафилококковые клетки

Штамм Кол-во колониеобразующих микробных единиц х 10"1

стафилококка --

контроль дефенсины дефенсины М П 0- дефенсины кролика человека система кролика 50мкг/мл 5Смкг/мл + М П 0-

система

5/2-бп-б коагулазо-

образующий 173+17 171+12 172j:14 170+10 14.5+2.3* .вирулентный

9198 коагулазо-

яегативный 168+19 1,3+0,05* 165+15 132+15* О Л 4+0, 02

авирулентный

МПО-система: миелопероксидазная система, состоящая из 0,05 мкг миелоиероксидазы, 5 нМ Н202 и 0,1 мкМ Nal; * - Р<0,05 по сравнению с контролем.

инактивации микроорганизмов в процессе фагоцитоза, чем можно было ожидать, если исходить только из активности отдельных Факторов. Подобный характер взаимодействия антимикробных белков представляется важным условием умерщвления инфекционных агентов и в значительной степени определяет завершенность фагоцитоза, осуществляемого нейтрофилами.

10.2. Антивирусная активность дефенсинов

Нейтрофилы играют важную роль в формировании резистент ности организма человека и животных не только к бактериальной и грибковой инфекциям (Пигаревский.1978: Войно-Ясенецкнй. 1981; А. Маянский, Д. Маянский,1983), но и некоторым формам вирусной (Rouse,1981). В частности, в герпетических очагах поражения представлены нейтрофилы, которые различными способами могут

предотвращать распространение■ вируса (Hill et al.,1975; Russell. Miller, 1977). Одним из возможных механизмов проявления антивирусной активности нейтрофилов может быть участие в этом процессе их антимикробных белков и полипептидов, в том числе и дефенсинов. Для проверки этого предположения нами было изучено в системе in vitro прямое антивирусное действие дефенсинов.

Суспензию вируса простого герпеса (ВПГ-1. штамм Л-2) перед внесением в культуру клеток Нер-2 инкубировали в течение 1 часа при +37° С с различными концентрациями суммарной фракции дефенсинов кролика и человека. Затем обработанной суспензией вируса инфицировали культуру клеток Нер-2. О характере действия дефенсинов на вирус судили по' снижению цитопатогенного действия, которое оказывает вирус, репродуцируясь в клетках Нер-2. Установлено дозозависимое снижение титра вируса герпеса после его контакта с анализируемыми дефенсинами на 1,0-3,0 lgTUfl50 при воздействии препарата кролика и на 0,5-1,5 lgTim50 - препарата человека. Эти наблюдения хорошо согласуются с литературным. данными (Lehrer et al.,1985; Daher et al.,1986).

Экспериментальная герпетическая инфекция на мышах линии СБА являлась следующей модельной системой, на которой исследовались защитные свойства дефенсинов. С этой целью мышей заражали интрацеребрально вирусом, герпеса в дозе 2ЛД50 /0,02 мл. Дефенсины испытывали по лечебно-профилактической" схеме и одноразовой концентрации белка равной 100 мкг/животное, которые оказались оптимальными в результате предварительно проведенных экспериментов. У мышей вследствие инфицирования в мозг развивается энцефаломиелит разной степени тяжести. Причем по данным полученным в нашей лаборатории (Насыров с соавт., 1989), максимальная продукция вируса в клетках организма-хозяина имеет место на 3-4 сутки инфекционного процесса. Поэтому именно • в эти сроки нами- внутрибрюшинно вводились дефенсины инфицированным животным. В результате проведенных опытов получены доказательства защитного действия дефенсинов при экспериментальной герпетической инфекции у мышей, более выраженного в случае использования кроличьих препаратов по сравнению с человеческими (процент выживания животных составил 75-80 против 65-70). Механизмы установленного действия дефенсинов в условиях организма могут' быть различными: от прямого воздействия на вирус до модуляции активности клеток иммунной системы.

Принципиальная возможность использования дефенсинов в ка-

честве профилактико-терапевтических средств при инфекционной ------------патологии с-неизбежностью-ставит, вопрос-о-необходимости изучения их елияния на гомеостатические механизмы организма. Нами осуществлено исследование влияния парентерально введенных полипептидов на некоторое показатели эндокринной, иммунной и ге-мостатической систем экспериментальных животных.

10.3. Эффекты действия дефенсинов на глюкокортикоидную реакцию и иммунный ответ организма при стрессе

Парентеральное введение такого Физиологически актльксгс щелочного полипептида как дефенсин естественно может модулиро вать многие защитные и регуляторные процессы в организме. В этой связи определенный интерес представляли данные канадских ученых о способности отдельных фракций дефенсинов подавлять индуцированный адренокортикотропным гормоном (АКТГ) стероидо -генез в культуре клеток надпочечников крысы. Это свойство полипептидов авторы назвали кортикостатическим (Zhu et al., 1987, 1988). Ими же было впервые высказано предположение, чтЬ корти-костатическое действие дефенсинов может быть одним из молекулярных механизмов регуляции активности гипоталамопшофизарно-адренокортикальной системы (ГГАКС) на уровне надпочечник г* (Ваteman et al., 1989). Однако вопрос о реализуемости подобно!"'; модифицирующего функции надпочечников действия дефеноиноп уровне целостного организма оставался открытым.

С целью проверки этой гипотезы нами было исследовано вли яние экзогенных дефенсинов на некоторые показатели эндокринного и иммунологического статуса организма экспериментальных жи -вотных в условиях стресс- и АКТГ-индуцированной активности ГГАКС. Поскольку при этих воздействиях имеет место интенсификация продукции глюкокортикоидных гормонов надпочечниками, эти модели можно рассматривать как адекватные для изучения корти-костатической активности дефенсинов ln vivo.

На модели ротационного стресса (10 мин при 78 об/мин) нами было установлено, что дефенсины кролика, вводимые- внутриб рюшинно в дозах 20 нг/г и 2 мкг/г за 10 минут до начала стрес-сорного воздействия, вызывают у мышей снижение концентрации кортикостерона в крови в 2'и 6 раз, соответственно. Подавляющес-глюкокортикоидную реакцию действие дефенсинов было наиболее выражено через 30 минут после окончания стрессорного воздействия.

- 36 -

Сходные изменения в уровне кортикостерона в крови были получены при введении дефенсинов кролика крысам в период, предшествующий острому холодоеому воздействию (-20°С, 20 минут) на животных.. Содержание гормона у таких животных было почти в 2 раза ниже по сравнению с группой, подвергнутой только стрессу (62-72 нг/мл против 128-145 нг/мл).

Стереотипность гормональных сдвигов у исследованных животных под воздействием парентерально вводимых дефенсинов может свидетельствовать об единообразии морфобиохимических механизмов. вовлекаемых в формирование и модуляцию стресс-обуслов-ленных состояний. Вслед за канадскими исследователями можно допустить, что одной из возможных мишеней воздействия дефенсинов могут быть рецепторы АКТГ клеток коркового слоя надпочечников, конкурентное связывание полипептидов с которыми подавляет синтез и секрецию кортикостерона (Zhu et al.,1989).

В пользу этих представлений свидетельствуют наши данные о влиянии индивидуальных фракций дефенсинов кролика на характер АКТГ-индуцированной глюкокортикоидной реакции у мышей. Из шести использованных индивидуальных фракций дефенсинов кролика кортикостатическое действие проявили компоненты NP-За и NP-Зв (снижение уровня 'гормона в крови на 40% по сравнению с группой животных, которым вместо дефенсинов вводили физиологический раствор). Интересно, что именно эти дефенсины были наиболее активны как кортикостатины в культуральных условиях (Zhu et al.,1989: Zhu, Solomon, 1992).

Специальный интерес представляло изучение кортикостати-ческих свойств, открытых нами полипептидов из лейкоцитов свыьи - протегринов, структура которых характеризуется заметным сходством с фракцией NP-За дефенсинов кролика. На той же экспериментальной модели было установлено кортикостатическое действие Фракции PG-3 протегринов свиньи (снижение уровня кортикостерона в крови на 30"'), тогда как другие компоненты в использованных дозах оказались не эффективными. Интересно.что в структ^ном отношении именно PG-3 наиболее схож с NP-За. Поэтому полученные данные являются еще одним свидетельством в пользу существования закономерной связи между химической структурой' полипептидов и их функциональной активностью.

Кортикостатическое действие отдельных фракций дефенсинов и протегринов может иметь далеко идущие последствия для физиологии человека и животных. Глюкокортикоидные гормоны оказывают разнообразное и существенное влияние на формирование защитных

реакций организма,в том числе и иммунного ответа(Корнева, Шхи-----нек, 1988). Известно, что гиперпродукция глюкортикоидов надпочечниками является одной из причин стрессобусловленных дисфункций иммунной системы (Мипск е1 а]., 1.984; Ва1ешап е1 а!.. 1989). В свете полученных нами данных можно было предположить, что иммуносупрессивное действие некоторых видов стресса может быть отменено профилактическим введением дефенсинов. Наш на модели комбинированного стресса у мышей (последовательная им мобилизация животных сначала 1 час при +4°С, а затем в течение суток при комнатной температуре), который практически блокирует гуморальный иммунный отлит на эритроциты Сарана ( Табл.?),

Таблица 7

Влияние дефенсинов на уровень титров антител в сыворотке крови и число антителообразующих клеток (А0К/106 кл) в селезенке при стресс-индуцированной иммуносупрессии

у мышей

Нестресс-сирован-

ные иммунизированные мыши

Стресси-рованные

иммуни-

зиров.

мыши

Введение дефенсина кролика

20МКГ/г 2МКГ/г 20МКГ/г 2МКГ/г Нестрессированные Стрессированнке иммунизированные мыши

I II III IV V VI

-юег -

титров АТ 2,4 0,15 2.4*0 2, 7*о 3,2* 2,2*

П 7 7 7 7 4 5

АОК 49 1.7 85,7*0 67*о 53* 67 *

П 7 7 7 7 4 5

О - Р < 0,05 по сравнению с группой I

* - Р < 0.05 по сравнению с группой II п - количество животных в группе

была продемонстрирована способность препарата суммарных дефенсинов кролика отменять стресс-индуцированную иммуносупрессис (варианты V и VI). Необходимо подчеркнуть, что иммунопротек-тивное действие дефенсинов в условиях данного эксперимента может быть обусловлено не только их кортикостатическим влиянием

• - 38 -

на стероидогенную функцию надпочечников. Учитывая установленную хемотаксическую активность дефенсинов в отношении моноцитов. можно допустить, что одним из дополнительных механизмов выявленного эффекта может быть Функциональная мобилизация клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы (Terri to et al.,1989). Не исключено, что именно множественное действие дефенсинов в условиях организма обеспечивает защитный эффект этих полипептидов при герпетической инфекции у животных, впервые продемонстрированный нами.

В связи с рассмотренными экспериментальными и литературными данными можно предположить, что функциональная значимость нейтрофилеза при стрессе (Горизонтов и др.. 1983) не ограничивается превентивным усилением антимикробного барьера организма. В процессе мобилизации нейтрофилов и их миграции в ткани имеет место постоянная секреция физиологически активных веществ их лизосомного (гранулярного) аппарата во внеклеточную среду, в том числе и дефенсинов (Panyutlch et al.,1991). При этом последние уже в роли гуморальных факторов могут проявлять свои кортикостатические и иммунопротективные свойства, обеспечивая взаимодействие иммуннойси нейроэндокринной систем, направленное на формирование защитных, реакций при стрессе.

10.4. Влияние дефенсинов на некоторые показатели функционального состояния противосвертывающей системы организма крыс

Известна способность таких катионных белков, как тфота-минсульфат (Racanelll et al.,1985), тромбоцитарный фактор 4 (Niewlarowski, 1976), фактор из ткани селезенки (Ляпйна, Азие-ва.1985) вступать в электростатическое взаимодействие с гепарином и ингибировать в результате этого неферментативную фиб-ринолитическую активность крови, определяемую комплексными соединениями гепарина с протеинами и аминами - основными гуморальными агентами противосвертывающей системы (Кудряшов.1975; Ginsberg, Hlrsh, 1988).В свете этих данных представляло интерес' изучение влияния внутривенно введенных дефенсинов на функциональное состояние противосвертывающей системы организма в условиях. моделирующих некоторые патологические состояния гемостаза. ' Такой подход тем более обоснован, что наличие дефенсинов в плазме крови человека (Panyutlch et al., 1991) и кролика (Ни et al., 1993) доказано однозначно.

- 39 -

Дефенсины кролика, введенные в дозе 125 мкг/кг или 1,25

------- мг/кг-достоверно снижают_такие_показатели противосвертывающей

системы крови как неферментативный фибринолиз и уровень гепарина (вариант опыта 2). Будучи инъецированными в тех же д:зах на фоне активации функции противосвертывающей системы (вариант 4), полипептиды способствовали достоверному снижению суммарной фибринолитической активности плазмы в 1.4 раза в первом и 2,6 раза во втором случае по сравнению с вариантом 3, когда животным вводили тромбопластин (Табл. 8). При этом резко снижался неферментативный фибринолиз плазмы (в 1,7 и 4,4 раза, соответственно). Е пользу зтого свидетельствуй"' такко лунные «б уровне гепарина в крови. Повышение концентрации свертываемого тромбином фибриногена в этот период указывает на блокирующий эффект дефенсинов в отношении комплексов гепарина с белками плазмы и, в частности,- с фибриногеном. Дефенсин, по-видимому, разрывает связи между гепарином и белками крови, вследствие чего исчезает присущее комплексам гепарина антиполимеризацион-ное действие и концентрация фибриногена, свертываемого тромбином, увеличивается. Следовательно, дефенсин влияет в рассматриваемых условиях в основном на нёферментативный фибринолиз и антикоагулянтные свойства плазмы крови, обусловленные комплексными соединениями гепарина. На основании полученных данных можно заключить, что дефенсин может применяться в условиях чрез мерной активности неферментативного фибринолиза для нормализации свертывания крови в акушерской и хирургической практике.

Итак, сочетание в дефенсинах антимикробных, стресспротек-тизных и ингибирующих неферментативный фибринолиз свойств, позволяет рассматривать эти полипептиды в качестве перспективного- объекта дальнейшего углубленного исследования с целью создания новых лекарственных средств для медицины и ветеринарии.

Таблица 8

Биохимические показатели крови крыс после внутривенного введения дефенсина животным с активацией функции противосвертывагацей системы (М +»н)

Варианты Суммарная фибрино-. Неферментативный Уровень гепарина Концентрация фибри-

пт.™« литическая актив- фибринолиа ым ед/мл ногена, т$>

опыта ность.мм

А • Б А Б А Б А ' Б

I 49+4,8 4&+2,6 23,6+4,8 20,4+1,7 0,2+0,05 0,16+0,01 215+17,5 332+12,5

2 54+1,8 . 25+7,8 16+1,12 •12+0,9 0,15+0,05 - 225+28 , 1 ' - ^ о

3 86,2+6,9 88,4+13,8 56,4+4,4 62,4+3,0 0,26+0,02 0,24+0,02 74+11,5 146+9,6 1

4 61+8,8 34,2+4,6 34+7,6 14,4+3,8 0,16+0,02 0,21+0,02 152+12,5 216+18,0

Р<.0,05 Р<0,05 Р<0,05 Р<0,01 Р<0,01 Р<0,05 Р<0,01

1. Введение 0,85$ раствора ИаС1 и через 5 мин 0,85/6 раствора №аС1,

2. Введение 0,85;? раствора И&С1 и через 5 мин раствора дефенсина

3. Введение тромбопластина и через 5 мин 0,85% раствора КаС1

4. Введение тромбопластина и через 5 мин раствора дефенсина

Статистические показатели расчитаны относительно' соответствующих проб варианта 3. А - дефенсин в дозе 125 мкг/кг, Б - дефенсин в дозе 1,25 мг/кг

- 41 -ВЫВОДЫ

----------------1 _ разработана-универсальная процедура сочетанного- выделения и____________________

трехступенчатой очистки препаратов миелопероксидазы, лакто-феррина и дефенсинов из нейтрофилов человека и животных (крупный рогатьй скот, свиньи, кролика и крысы).

2. Открыта новая группа антибиотических полипептидов из лейкоцитов свиньи - протегрины,сочетающая в своей структуре свойства кортикостатического „озфенсина UP-За и тахиплегина - ни тимикробного полипептида из гемоцитов подковообразного краба

3. Из лейкоцитов свиньи выделен, очищен и секвенирован белок, 0ор«ТНЙ нр«,яин<»м И <!1ИНИЛНЛННИНоМ - КрофвпйН, USCüpa i СЛЬпи инактивирующий грамотрицательнуы бактерию Escherichia coli.

4. Определена первичная структура антимикробных полипептидов из гетерофилов кур - галлинацинов, которые относятся к группе ß-дефенсинов/

5. Выделены и охарактеризованы по физико-химическим и кинетическим параметрам миелопероксидазы коровы и кролика. Проведено сравнительно-биохимическое изучение структурных и ферментных свойств миелопероксидазы человека, свиньи,' коровы, кролика и крысы. По данным электрофореза в поликрнламидном геле с додецилсульфатом натрия и грльфильтрзции на сефадек-се установлено, что молекулярные массы сравниваемых ферментов находятся в пределах 140-150 кДа, а холоферментн состоят из двух пар субъединиц с молекулярной массой 55-60 и 11-15 кДа. Аминокислотный анализ сравниваемых белков однозначно свидетельствует об их принадлежности к одному гомологическому ряду.' Совокупность полученных данных свидетельствует о существенной структурной консервативности миело-пероксидаз изученных видов животных и человека.

6. Выделены и охарактеризованы по физико-химическим свойствам

лактоферрины нейтрофилов коровы, свиньи, кролика и человека. Осуществлено изучение их структурных и хелаторных свойств. Установлено сходство аминокислотных составов лак-тоферинов нейтрофилов "человека, коровы, свиньи и кролика, свидетельствующие об их принадлежности к одному гомологическому ряду белков. Методом пептидных карт выявлена значительная структурная гомология лактоферринов человека, свиньи и коровы, триптйческие гидролизаты которых содержа-; соответственно 68, 73 и 71 пептид, из которых 37 являются общими. Однако методом двойной иммунодиффузии не установлено общих антигенных детерминант у белков человека, свиньи и

- 42 -

коровы. ■

7. На основании анализа пептидных карт, аминокислотного состава. электрофоретических и иммунохимических сеойств установлена структурная идентичность лактоферринов нейтрофилов и молока изученных видов млекопитающих (человек, свинья).

8. В опытах In vitro впервые установлена синергическая антимикробная активность миелопероксидазной системы, с одной стороны, и дефенсинов и лактоферрина, с другой. Подобные взаимодействия антимикробных белков в фаголизосомах нейтрофилов обеспечивают эффективность киллерной функции фагоцитов.

9. Выявлен возрастной преходящий дефицит антимикробных белков (миелопероксидаза, эластаза. катепсин G) нейтрофилов человека, кролика и крысы в ранний постнатальный период их онтогенеза, который можно рассматривать в качестве одного из факторов риска к развитию инфекционных заболеваний и септических осложнений у новорожденных млекопитающих.

Ю. В комплексном морфобиохимическом исследовании получены данные в пользу гипотезы о резорбтивной клеточной резистентности как форме защитных механизмов организма против инфекции в период. \ предшествующий развитию иммунных реакций. Поглощение макрофагами антимикробных белков нейтрофилов приводит к усилению их функциональной активности.

И.Изучены антистафилококковые и противогерпетические свойства дефенсинов. Более сильными антибиотическими свойствами обладают дефенсины кролика нежели человека. На модели экспериментального герпетического процесса у мышей линии СВА выявлено свойство дефенсинов повышать резистентность животных к инфекции.

^.Продемонстрировано свойство дефенсинов кролика и крысы снижать АКТГ- и стрессиндуцированную глюкокортикоидные реакции у мышей, а также отменять стресс-обусловленную иммуносуп-рессию у экспериментальных животных.

13. Установлено свойство экзогенных дефенсинов кролика норма-лизовывать уровень неферментативной фибринолитической активности крови, обуславливаемый повышенным содержанием в ней гепарина и его комплексных соединений. Использование дефенсинов при повышенной свертываемости крови не создает состояния предтромбоза.

14. Разработан новый способ диагностики мастита у человека и крупного рогатого скота, основанный на электрофоретическом анализе молока млекопитающих.

- 43 -

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ГЕНЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ашмарин И. П., ЛнзловаС.Н., Кокряков ВЛ1.~""Нёрсёс0ва"ЛГС"."/" Ненова M.М., Петрова Т.А., Раменская Н.П. Комплексы катионных г>елков и энзимов лейкоцитов, обеспечивающие антибактериальное

действие. // Пат. Всео.симп. по медицинской энзимологии. - Душанбе.- 1974,- С. 20.

2. Голь'бсков А. С., Пигарепский В. Е.. Ашмарин К. Л., Кокряксв В.К. О роли продуктов распада лейкоцитов в повышении резистентности макрофагов к возбудителю орнитоза.// Бюлл. экспер.би-с". :: мед. - lïW -!.ХХХт Nr.~ С. 5*4-587.

3. Лпзлова С. Н., Кокрякоя b. Н., Ай-м.нрин й. П. Индиьилупльное и кооперативное действие лизосомальных факторов внутри и вне лейкоцита.// Структура и функции лизосом. Тез.докл. Международного симпозиума. - Москва,- 1976.- С.39-90.

4. Анатолий С.А.. Кокряков В.Н., Юнусова И.И., Веретелекко

B. Е.. Раменская Н.П., Волкова Л. П., Ашмарин И. П. Влияние катионных белков клеточного происхождения на выживаемость стафилококков.// ЗКМЭИ.- 1977,- N3.- С. 71-75.

5. Ашмарин К. П.. Кокряков г. 1!.. Лызлова С. К., Раменская Н. П.

Взаимодействие катионных белков гранул и миелопероксидазы лейкоцитов.// Вопр. мед. химии. - 1977. - ¡J4.~ С. 534-537.

6. Кокряков В.Н., Толыбекоь A.C.. Ашмарин И.П.. Пигаревекиг. Б.Е. О влиянии in vitro катионных белков лейкоцитов на активность возбудителя меиингопневмонии. // ЖМЭИ. - 1S7?. - N9.--

C.94-96.

7. Lyzlova S.N. Ana tolly S. A.. ZhekovaM.N.. KokryaRov V.K., PetrovaT.A., Ramenskaya N. P.. Ashmarln I. P. Myeloperoxidase from rabbit leucocytes: Isolation, properties and function. // FEES Meeting-Abstracts. Copenhagen.- 1977,- C. 50

6. Янковский О.Ю., Раменская Н.П.. Кокряков С. H., Слепенков C.B., Петрова Т.А., Лызлова С.Н., Пигаревский В.Е. Метод выделения пероксидазы из полиморфноядерных лейкоцитов кролика и коровы.// Вестник ЛГУ.- 1978,- N15.вып.3.- С.99-103.

9. Янковский OrЮ., Кокряков В.Н.; «ызлова С. Н. Физико-химические и кинетические характеристики миелопероксидазы нейтрофиль-ных лейкоцитов коров.// Укр. биохим.ж. - .1979.- Т. 51, N5. -С.492-496.

10. Кокряков В.Н. Структурно-функциональные особенности лизосом нейтрофилов.// Структура и функции лизосом. Тез. докл. II Всес. симп.- Новосибирск.- 1980,- С.84-85.

И. Кокряков В.H., Ротова Г.M., Мазинг Ю.А. Морфо-биохимичес-кие основы функциональной активности нейтрофилов млекопитающих.// Сб. Морфофункциональные аспекты неспецифической резистентности и демиелинизирующих заболеваний.- Л,- 1981.-С. 31-45.

12. Кокряков В.Н.. Борисов А.И.. Слепенков C.B.. Лызлова С.Н. Сравнительное исследование некоторых физико-химических свойств миелопероксидаз свиньи и коровы.// Биохимия.- 1982,-Т.47.ВЫП. 1,- С. 100-107.

13. Борисов А.И.. Кокряков В.Н.. Слепенков С.В., Яковлева М.Ф., Лызлова С.Н. Сравнение физико-химических свойств двух пероксидаз лейкоцитов- крови свиньи.// Вестник ЛГУ.- 1982,-N15,- С. 42-46.

14. Пигаревский В. Е., Кокряков' В. Н., Мазинг Ю. А. Цитохимия ферментных и неферментных катионных белков нейтрофилоцитов в норме и патологии.// III Всес. конф. по патологии клетки.- М.-1982,- Тез. докл.- С. 140-141.

15. Кокряков В.Н., Борисов А.И., Янковский O.D., Слепенков C.B.. Раменская.Н.П.,- Ротова Г.М., Лызлова Н.С. Структурные особенности миелопероксидаз млекопитающих.// Вопросы эволюционной физиологии. - Л.-Наука. - 1982.- Тез.сообщ.- С. 150.

16. Кокряков В.Н., Мазинг Ю. А.. Ротова Г.М. Антимикробная активность катионных белков полиморфноядерных лейкоцитов при воспалении. В кн. : "Воспаление, гиперчувствительность, иммунопатология".// Ташкент. Медицина.-1983.- Матер.докл. YII Всес. съезда патологоанатомов.- С.191-194.

17. Ротова Г.М., Кокряков В.Н., Слепенков С.В., Мазинг Ю.А., Пигаревский В.Е. Получение и некоторые физико-химические свойства лактоферрина нейтрофилов свиньи.// Биохимия.'- 1985,Т. 50. ВЫП. 9.- С. 1448-1452.

18. Кокряков В.Н., Ротова Г.М. Синергическое антимикробное действие миелопероксидазы и лактоферрина нейтрофилов свиньи.// ВИНИТИ,- 1985.-N 3519-85 Деп., Юс.

19. Лызлова С.Н., Кокряков В.Н.. Слепенков С.В.. Пигаревский В.Е. Структурно-функциональные особенности лизосомного аппара-' та нейтрофильных гранулоцитов.// Тез.докл. III Всес.' симп. с международным участием:"Структура и функции лизосом",- Москва.- 1986,- С. 124-125.

20. Пигаревский В.Е.. Мазинг Ю.А., Кокряков В.Н.. Селиверстова В. Г., Данилова М.А.. Алешина Г.М. Клиническая морфология лизо-ссм нейтрофильных гранулоцитов.// Тез. докл. III Всес. симп. с

международным участием:"Структура и функции лизосом." - И. - 1986.-_С.156-157.________________________________

21. Пигаревский В.Е.. МазингЮ. А.. Кокряков В. Н.. Суханова" H.H.. Селиверстова В.Г.. Алешина Г.Н. Эндогенные факторы риска к развитию аутоинфекционных заболеваний в раннем постнатальном развитии. // В сб.: "Частные вопросы онкоморфологии." -Л. Медицина. -"1987.- С. 119-121.

22. Краева Л.Н., Кокряков В.Н.. Чесноков И.Н.. Яковлева М.Ф., Лызлова С.Н. Некоторые свойства катепсина G и эластазы из нейтрофилов периферической крови свиньи.// Биохимия.- 1988.Т. 53. вып. 1. С. 655-66?.

22. Кокряков В.Н.. Алехина Г.М., Слепенков С.Н.. Яковлева М.Ф.. Пигаревский В.Е. О степени структурной гомологии лакто-Ферринов молока и нейтрофильных гранулоцитов.// Биохимия.-1988,- Т.53.вып. П.- С. 1837-1843.

24. Кокряков В.Н. Биохимические основы антимикробной активности нейтрофильных гранулоцитов. //В сб.: Клиническая морфология нейтрофильных гранулоцитов. - Л.¡Медицина. - 1988. - С.12-51.

25. Цыпленков П.В., Морозов В.И., Кокряков В.Н.. Рогоз'Кин В. А.

Иммунорадиометрический анализ киелопероксидази крцсг; // Укр. биохим. ж,- 1Э88,- Т.60.Ы6,- С. 72-75.

26. Кудряшов Б.А., Ашмарин И.П., ЛяпинаЛ.А., Кондашевская М. В., Кокряков В.Н., Азиева Л, Д., Пигаревский В.Е., Алешина Г.М. Функциональное состояние противосвертывающей систрмы при введении в кровоток дефенсина.// Физиол. журн. СССР,- 1988.-Т. 74. N12,- С. 1759.-1763.

27. Пигаревский В.Е., Кокряков В. Н., МазингЮ. А.. Селиверстова В.Г. Возрастные иммунодефицита системы нейтрофильных гранулоцитов. // Респ. сб. научн. трудов:"Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций." под ред. А. Н. Маянского. -Горький. - 1989.- С. 109-115.

28. Кокряков В. Н.. Пигаревский В. Е.. Алешина Г. М.. ШамоваО.В. Синергическое антимикробное действие катионных белков при Фагоцитозе. // Респ. сборник научн. трудов: "Моделирование и кли-ническая характеристика фагоцитарных реакций." под ред

A. Н. Маянского. - Горький. - 1989.- С. 98-103.

29. Кудряшов Б. А., Кондашевская М. В.. ЛяпинаЛ.А.. Кокрякоь

B. Н.. Пигаревский В. Е.. Алешина Г. М. Эффект многократного внутримышечного введения дефенсина на противосвертывающую систему и ангиоархитектонику скелетной мышцы.// ДАН СССР. - 1989. -Т. 304. N2.- С. 494-498.

30. Кудряшов Б.А.. Ляпина Л.А., Кокряков В.Н, Азиева Л.Д., Пи-, гаревский В.Е., Алешина Г. М.. Ашмарин И.П. Катионные белки из нейтрофилов как ингибиторы неферментативной фибринолитической и антикоагулянтной активности плазмы крови.// Вопр. мед. химии.- 1989,- N3.- С. 103-108.

31. Кокряков В.Н.. Пигаревский В.Е., Тарос Л.Ю.. Шамова О.В.. Селиверстова В.Г., Мазинг D.A., Зорин А.Д.. Энфенджан Л.П. Антивирусные свойства дефенсинов при экспериментальной герпетической инфекции. В кн.: Патоморфология опухолей и фоновых заболеваний.// Л, - Медицина.- 1989.- С. 122-124,

32. Кокряков В Н.. Осипова 0. Н., Пупкова Г, В., Павлюченко Т.А.; Пигаревский В.Е.- Способ диагностики мастита крупного рогатого скота.// А. С. N 1481941 от 22.01.1989.

33. Кокряков В.Н.. Спесивцев Ю. А., Пигаревский В. Е.. Кутушев Ф.X. Алешина Г.М., Андреев А.В. Способ диагностики мастита.//

A. С. N 1529124 ОТ 15.08.1989.

34. Кудряшов Б. А., Ашмарин И. П., Пигаревский В. Е.. Ляпина Л. А., Кокряков В.Н., Азиева Л.Д., Алешина Г.М. Ингибитор неферментативного фибринолиза. // АС Н 1542239 от 8.10.1989.

35. Lesnlkova Ц.Р., Kokryakov V. N., Shkhlnek Е."К. Effect of low molecular weight catlonlc protein (LMWCP) from rabbit neutrophils on stress-Induced reactions of glucocorticoid hormones and spleen lymphocytes activity.// I st Intern, congress ISNIM.- Florence, Italy.- 1990.- Abstracts. P.603.

36. Пигаревский В.E., Мазинг Ю.А., Кокряков В.Н. Возрастные иммунодефицита системы нейтрофильных гранулоцитов.// Арх. пат. - 1990.- N6.- С. 43-46.

37. Кокряков В.Н. Катионные белки лизосом нейтрофильных гранулоцитов при фагоцитозе и воспалении.// Вопр. мед: химии.-1990,- Мб, - С. 13-16.

38. Кокряков В.Н.. Мазинг Ю.А., Данилова М.А., Алешина Г.М., Новикова Н.С., Шамова О.В., Кузьмин В.0. Катионные белки нейтрофильных гранулоцитов при фагоцитозе- и воспалении.// В кн.: Проблемы медицины и биологии сегодня и завтра.- Л. 1990.-С. 59-61.

39. Кутушев Ф. X., Спесивцев Ю. А., Кокряков В. Н.. Пигаревский

B.Е.. Андреев А.В..Алешина Г.М. Новый способ ранней диагностики лактационного мастита.// Вестн. хирургии,- 1990,- N11.-

C. 149-150.

40.Lesnlkova М.Р.. Kokryakov V.N.. Sckhinek Е.К. Effect of low molecular weight catlonlc protein iLMWCP) from rabbit neutrop-

hlls on the level of glucocorticoid hormones and activity of

-spleen--lymphocytes.-// -Proceedings---international-Soclty- from------------

Pathophysiology I. Abstracts Moscow.- 1991,- C. 194-195. 41.Часовникова Л.В., Формазюк B.E., Сергиенко В. И.. Кокряков В.Н. Взаимодействие миелопероксидазы со смешанными монослоями из лецитина и холестерина.// Бюлл. экспер. биол. и мед.-1991,- Т. Ill, N 2,- С. 146-148.

42. Часовникова Л. В.. Формазюк В. Е., Сергиенко В. И., Кокряков В.Н., Беликова Т. В.. Владимиров 10. А. Взаимодействие медиаторов воспаления (миелопероксидаза и дефенсина) со смешанными монослоями из липидов хрусталика и кристаллинов.// Биофизик* -1991,- Т. 36, N5,- С. 879-884.

43.Ляпина Л. А., Кондашевская М. В., Кокряков В.Н., Шамова О.В. Взаимодействие гепарина с неферментным катионным белком из нейтрофилов - дефенсином.// Вопр. мед. химии,- 1992,- Т.38, вып. 1.- С. 39- 42.

44.Шамова О.В., Лесникова М.П., кокряков В.Н.. Шхинек Э.К., Корнева Е. А. Действие дефенсинов на уровень кортикостерона в крови и иммунный ответ при стрессе.// Бюлл. экспер. 'биол. и мед.- 1993,- Т. 115. N6,- С. 646-649.

45. Harwig S. S., Kokrykov V. N.. Swiderek К.М.. Panyutlch Е., TanL. Aleshlna G.M.. ShamovaO.V., Lee T. D.. Lehrer R. I. Galllnacins: cystelne-rlch antimicrobial, peptides of avian leukocytes.// Protein Science.-1993.-Vol. 2, suppl. 1.-P. 256-S.

46.Kokryakov V.N., Harwig S.S.L., Panyutlch E.A., Shevchenko A.A., Aleshlna G.M., ShamovaO.V., Korneva H. A., Lehrer R.I. Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides combine features of cortlcostatic dsfensins and tachypleslns.// FEBS Lett.-1993,- Vol.327, N2,- P. 231-236.

47.Mirgorodskay O.A.. Shevchenko A.A., Kamal M. Abdalla, Cher-nuschevlch I.V.. Egorov Т., Musollamov A., Kokryakov V.N.. Shamova O.V. Primary structure of three catlonic peptides from porcine neutrophils. Sequence determination by combine-1 usage of electrospray Ionization mass spectrometry and Edman degra- . datlon. // FEBS Lett.-1993.-Vol. 330, N3. P. 339-342.

48.Shamova 0. V.. Lesnlkova M.P., Aleshlna G.M., Kokrykov V.N. The effect of defensin application on the stress-induced immunosuppression.// In: 2nd International Congress ISNIM, Paestu-: (Salerno), Italy.-1993.-P.153.

49. Harwig S.S.L., Swiderek K.M.. Kokryakov V. N., LeeT.D.. Lehrer R. I. Primary structure cf galllnacln-l an antlmlcrobl-

al p-defensln from chicken leukocytes.// In: Techniques In Protein Chemistry V.- 1994.- ed. Crabb J. Academic Press. -P.81-89.

50.Korneva E.A., ; Kokryakov V.N., Rybaklna E.G., Fomicheva E.E., Shamova O.V., Shanln S.N. Stress-induced disfunction of the immune system and their rehabilitation.// In: International Journ. of immunorehabllltatlon.- 1994.- N1.- P. 181-182.

51.Korneva E.A.. Kokryakov V.N., Rybaklna E.G., Fomicheva E.E., Shamova O.V.. Shanln S.N. Interleukin-1 and defenslns in the realization of stress and stress-induced lmmunodlsorders.// In: First World Congresson Stress, Bethesda, USA. Program and Abstracts. -1994. -P. 56.'

52.Harwig s.S.L.. Swlderek K. M.. Kokryakov V. N., Tan L., Lee T.D., Panyutlch E. A., Aleshlna G.M., Shamova 0. V., LehrerR. I. Galllnaclns: Cystein - rich antimicrobial, peptides of chicken leukocytes.// FEBS Lett.- 1994.- Vol.342.- P.281-285.

53.Harwlg S.S.L., Kokryakov V.N., Swlderek K.M., Aleshlna G.M.. Zhao Ch., Lehrer R.I. Prophenin-1, an exceptionally pro-llne-rlch antimicrobial peptide from porcine leukocytes.//FEBS Lett.- 1995.- Vol,. 362, N i - P.65-69.

Подписано к печати 17.05.95. Формат 60x84 1/16. Бум. офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 277.

Малое предприятие "ТеплоКон" Санкт-Петербургской государственной академии холода и пищевых технологий. 191002, Санкт-Петербург, ул.Ломоносова, 9